專利名稱：赤潮異灣藻的檢測探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測海洋環(huán)境微生物的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，它涉及可用于檢測赤潮異灣藻的核苷酸序列和以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的核酸分子探針以及利用該分子探針檢測赤潮異灣藻的方法。
背景技術(shù)：
赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)是一種廣泛分布于世界近岸海域的有害藻類，也是我國近海常見的赤潮生物，曾經(jīng)有多次引發(fā)赤潮的報(bào)道。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地檢測赤潮異灣藻具有重要意義。
在分類學(xué)上，赤潮異灣藻屬于金藻門針胞藻屬。雖然傳統(tǒng)的從形態(tài)學(xué)上區(qū)分赤潮異灣藻并不十分困難，但由于這種方法操作煩瑣，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，當(dāng)樣品量多時(shí)工作量極大。因此，采用新方法新技術(shù)快速識(shí)別赤潮異灣藻極具現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前國內(nèi)外并沒有針對(duì)該藻從這方面進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測赤潮異灣藻的核酸分子探針以及利用該分子探針檢測赤潮異灣藻的方法，它可以從遺傳本質(zhì)上客觀、準(zhǔn)確地對(duì)該藻進(jìn)行檢測。具體包括1.提供用于赤潮異灣藻檢測的基因片段；2.提供基于前述基因片段的赤潮異灣藻的專一性遺傳標(biāo)記，即核酸分子探針；3.提供利用這些遺傳標(biāo)記進(jìn)行快速檢測赤潮異灣藻的方法；4.提供利用這些遺傳標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行快速檢測和定量計(jì)數(shù)赤潮異灣藻的方法。
本發(fā)明的理論基礎(chǔ)是核糖體基因及其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列多態(tài)性以及5’核酸酶檢測法。本發(fā)明的發(fā)明人首先測定了一株分離自大連灣的赤潮異灣藻的rDNA及ITS區(qū)總長約3000個(gè)堿基對(duì)的序列，通過與國際互聯(lián)網(wǎng)(Genbank)中所有已經(jīng)公開的rDNA及ITS區(qū)序列比較發(fā)現(xiàn)，如SEQ ID NO.1所示的赤潮異灣藻rDNA和ITS序列與其它生物的相應(yīng)區(qū)域的序列有很大差別。為此發(fā)明人以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出H.akashiwoprimer1、H.akashiwo primer2和H.akashiwo probe三個(gè)核酸分子探針。用這三個(gè)探針，發(fā)明人建立了快速、準(zhǔn)確檢測和定量計(jì)數(shù)赤潮異灣藻的分子生物學(xué)方法。
本發(fā)明所提供的用于赤潮異灣藻檢測的rDNA和ITS的序列及結(jié)構(gòu)特征如序列表中SEQ ID NO.1所示。該序列可用如實(shí)施例1的方法得到；或者按該序列的核苷酸組成和順序，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上按常規(guī)方法合成得到。
本發(fā)明所述的赤潮異灣藻的其中專一性核酸分子探針是以SEQ ID NO.1所示序列為基礎(chǔ)，通過Internet(因特網(wǎng))與國際分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中的其它所有藻類的相應(yīng)序列比較后，用常規(guī)的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)而成的。它們的序列組成及其結(jié)構(gòu)特征分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，序列SEQ ID NO.1中下劃線標(biāo)出了它們的具體位置。SEQ ID NO.2所示的核酸探針(H.akashiwo primer1)是H.akashiwo的18s rDNA區(qū)域中的一段由24個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。SEQ ID NO.3所示的核酸探針(H.akashiwo primer2)是H.akashiwo的18s rDNA區(qū)域中的一段由25個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明所述的赤潮異灣藻的兩個(gè)專一性核酸分子探針(H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2)可按照本發(fā)明已描述過的序列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀合成)。這兩個(gè)探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其它化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明所述的赤潮異灣藻的兩個(gè)專一性核酸分子探針具有較好的種特異性。以它們?yōu)橐粚?duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，結(jié)果只能從含有赤潮異灣藻的材料的DNA提取物中擴(kuò)增出大小為231bp的PCR產(chǎn)物。因此，以這兩個(gè)核酸分子探針為引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可以準(zhǔn)確、快速地檢測赤潮異灣藻，而且所需的樣品量很少。
以SEQ ID NO.1所示的序列為基礎(chǔ)，通過Internet(因特網(wǎng))與國際分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中的其它所有藻類的相應(yīng)序列比較后，本發(fā)明的發(fā)明人還設(shè)計(jì)出了赤潮異灣藻的兩個(gè)專一性核酸分子探針，其序列組成和結(jié)構(gòu)特征如SEQ ID NO.4所述(名稱為H.akashiwo TaqMan Probe)；其在序列H.akashiwo18s rDNA中的位置如SEQ ID NO.1所示。它是H.akashiwo的18s rDNA區(qū)域中的一段由24個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。該探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。將該序列的5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)等標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)如TAMRA或Dabcyl等標(biāo)記后即可用于對(duì)赤潮異灣藻進(jìn)行定性和定量分析的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)反應(yīng)。
以H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2赤潮異灣藻的兩個(gè)專一性核酸分子探針作為引物，以標(biāo)記好的H.akashiwo TaqMan Probe(5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)如FAM等標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)如TAMRA或Dabcyl等標(biāo)記)為TaqMan探針，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)明了一種可同時(shí)對(duì)赤潮異灣藻進(jìn)行定性檢測和定量計(jì)數(shù)的分析方法，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)反應(yīng)。這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出限低，靈敏度高。


圖1為赤潮異灣藻核糖體DNA(rDNA)及轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)(ITS)在染色體上的排列順序。其中18s rDNA區(qū)域?yàn)楸景l(fā)明所涉及的核苷酸序列存在的區(qū)域。圖中，SSU為小亞基，LSU為大亞基，ITS為轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)。
圖2為PCR結(jié)果。其中，所用引物為H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2；各電泳道所對(duì)應(yīng)的藻種為Lane2.赤潮異灣藻；Lane3.旋鏈角毛藻；Lane4.柔弱角毛藻；Lane5.微型角毛藻；Lane6.纖細(xì)角毛藻；Lane7.米氏裸甲藻；Lane8.裸甲藻；Lane9.尖刺偽菱形藻；Lane10.塔瑪亞歷山大藻；Lane11.圓海鏈藻；Lane12.新月菱形藻；Lane13.中肋骨條藻；Lane14.膜質(zhì)周形藻；Lane15.直鏈藻；Lane16.H2O；Lane1，17.DNA標(biāo)記DL2,000(從上到下各條帶大小依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
圖3和圖4為各稀釋度DNA溶液在PCR過程中的熒光信號(hào)曲線。其中，圖3為原始圖，圖4為分析所得，圖中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。從左至右各曲線對(duì)應(yīng)的赤潮異灣藻細(xì)胞濃度(個(gè)細(xì)胞/μlDNA)依次為2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102，每個(gè)濃度分別上樣三次。
圖5為RQ-PCR定量計(jì)數(shù)赤潮異灣藻的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1.用于檢測赤潮異灣藻的核苷酸序列的制備本發(fā)明所用的赤潮異灣藻分離自大連灣天然海水樣品。通過反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的F/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件光照/黑暗周期為12h/12h，光照強(qiáng)度為4000 Lx，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃。
用0.45μm的微孔濾膜或10000r/min離心收集處于對(duì)數(shù)生長期的赤潮異灣藻藻細(xì)胞，用TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl(二羥甲基氨基甲烷鹽酸)pH8.0，1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)pH8.0)洗下約20mg藻體，加入2倍體積的預(yù)熱至55℃的抽提緩沖液(3％(w/v)CTAB(十六烷基-三甲基-溴化銨)，1％(w/v)sarkosyl(十二烷酰肌氨酸鈉)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl pH8.0，1％(v/v)α-巰基乙醇)，55℃處理1小時(shí)，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘，取上相；向上相中加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)，重復(fù)上步一次；之后的操作同常規(guī)的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE buffer溶解。
取提取的DNA溶液1μl加入49μl的PCR反應(yīng)液中(在50μl的反應(yīng)體系中包括50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.5U聚合酶，正反向引物各3μM)進(jìn)行第一輪PCR。其中正向引物的序列是5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC，反向引物的序列為5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA?；靹蚝?，放入有熱蓋的PCR儀中。PCR程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5分鐘。將所得的PCR產(chǎn)物用Watson公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，取1μl加入如上所述的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行第二輪PCR。此輪PCR所用的引物分別是5’-CCTTTGTACACACCGCCC(正向)，5’-CACGGTACTTGTWYRCTATCGGT(反向)。PCR程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5分鐘。第二輪的PCR產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，割膠切下最亮的條帶克隆入pMD18-T載體，于XL1-Blue大腸桿菌中無性繁殖后，用M13/pUC(-20和M13/pUC(-48)引物對(duì)在商用的自動(dòng)測序儀上測序，從測出的序列中即可獲得如SEQ ID NO.1所示的核昔酸組成和排列。
實(shí)施例2.H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2的設(shè)計(jì)和合成通過與Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相應(yīng)區(qū)域的序列做比較，發(fā)現(xiàn)如SEQ ID NO.1所示的序列與其他生物的相應(yīng)序列有很大差別，為此發(fā)明人以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2兩個(gè)核酸分子探針。根據(jù)這兩個(gè)探針或其互補(bǔ)序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA合成儀上即可獲得如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。
實(shí)施例3.用常規(guī)PCR法檢測赤潮異灣藻本實(shí)施例選用了本實(shí)驗(yàn)室藻種庫幾株微藻作為參照藻，它們是分離自膠州灣的旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纖細(xì)角毛藻(C.gracile)、微型角毛藻(C.minimum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、諾氏海鏈藻(Thalassiosira nordenskioeldii)、尖刺擬菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、膜質(zhì)舟形藻(Navicula membranacea)、直鏈藻(Melosira sp.)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)，分離自大鵬灣的塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarens)、它們均通過反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)這些藻和提取這些藻及赤潮異灣藻的DNA。
取各種藻的DNA提取物1μl，按實(shí)施例1所述的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，以SEQ IDNO.2(H.akashiwo primer1)和SEQ ID NO.3(H.akashiwo primer2)所述的核苷酸序列作為正反向引物。PCR程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳后拍照，得到如圖2所示的結(jié)果。從圖2中可知，從赤潮異灣藻DNA模板中擴(kuò)增出一條大小為231bp的PCR產(chǎn)物；從其它藻的DNA模板基本未見到特異性擴(kuò)增。
因此，對(duì)于某待檢樣品，以其DNA提取物為模板，以H.akashiwo primer1和H.akashiwo primer2為引物，以本實(shí)施例所述的PCR程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果PCR產(chǎn)物中有大小為231bp的條帶，即可判定該樣品中有赤潮異灣藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為赤潮異灣藻。
本方法的優(yōu)點(diǎn)由于本方法使用的是赤潮異灣藻的專一性引物并通過PCR反應(yīng)對(duì)待測樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，因此該方法能非常準(zhǔn)確地檢測樣品中是否存在赤潮異灣藻，只要有相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，即可判定待檢樣品中有赤潮異灣藻存在，而且根據(jù)PCR產(chǎn)物量的多少，還可初步估計(jì)樣品中赤潮異灣藻的多少。同時(shí)本方法靈敏度很高只要有很少的待檢材料即可進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。
實(shí)施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探針的制備根據(jù)SEQ ID NO.4所述的序列，用FAM熒光物質(zhì)標(biāo)記其5’端，用TAMRA標(biāo)記其3’端。整個(gè)合成和標(biāo)記過程可在商用的探針合成和標(biāo)記儀上一次性完成。
實(shí)施例5.赤潮異灣藻的RQ-PCR檢測和定量計(jì)數(shù)取處于對(duì)數(shù)生長期(培養(yǎng)了1周)的赤潮異灣藻培養(yǎng)物計(jì)數(shù)，其細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，收集500ml培養(yǎng)物，于4℃10000r/min離心10min，小心吸棄上清，沉淀用TEbuffer溶解，再加入400μl預(yù)熱至55℃的抽提緩沖液(配方見實(shí)施例1)，55℃處理1小時(shí)，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入800μl氯仿異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；之后的操作完全按照Watson公司的植物葉DNA提取試劑盒的有關(guān)操作進(jìn)行，只是最后一步用40μl TE液從吸附柱上洗下DNA(每1μl DNA溶液對(duì)應(yīng)2.5×107個(gè)細(xì)胞)。
取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀釋，共6個(gè)稀釋度(各稀釋度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度依次為2.5×107個(gè)/μl、2.5×106個(gè)/μl、2.5×105個(gè)/μl、2.5×104個(gè)/μl、2.5×103個(gè)/μl、2.5×102個(gè)/μl)。然后分別取1μl DNA溶液加入49μl RQ-PCR反應(yīng)體系(10×聚合酶緩沖液(Ex Taq buffer)10μl；25mmol/L MgCl28μl；dNTP混和液(各2.5mmol/L)6μl；20mmol/L H.akashiwo primer1 1μl；20mmol/L H.akashiwoprimer2 1μl；20mmol/L H.akashiwo Probe 0.4μl，0.5U/μl聚合酶(Ex Taq)0.5μl，)，于Bioer Line-gene FQD-33A儀中，按PCR程序(94℃5分鐘(94℃15秒60℃50秒)50個(gè)循環(huán))反應(yīng)，并實(shí)時(shí)記錄熒光信號(hào)，得到如圖3所示結(jié)果。該圖顯示了各DNA溶液在PCR過程中的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)增加的變化曲線。根據(jù)RQ-PCR的原理，臨界線(Threshold)與各DNA溶液熒光信號(hào)曲線的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為該DNA溶液的CT值。從圖4可獲得各稀釋度DNA溶液的CT值。結(jié)合各DNA溶液的稀釋度、各項(xiàng)稀釋度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度和CT值，得到如表1所示的數(shù)據(jù)。
表1.各DNA溶液的稀釋度及其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度和CT值、實(shí)際用于RQ-PCR的細(xì)胞數(shù)

以用于RQ-PCR的實(shí)際細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫座標(biāo)，以相應(yīng)的CT值為縱座標(biāo)，即可繪制出如圖5所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線的方程式為y＝-3.0348x+36.09，其回歸系數(shù)為R2＝0.9973。
對(duì)于某一待測樣品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，測出其CT值。以其CT值即可在圖5的標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出該待測樣品的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而推算出其中赤潮異灣藻的細(xì)胞濃度。
本方法的優(yōu)點(diǎn)本方法能同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測，即通過該方法既可知道待檢樣品中是否有赤潮異灣藻存在，還可同時(shí)知道有多少該藻種存在。
本方法另一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，這是由實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法本身以及本方法擴(kuò)增的針對(duì)的靶片段所決定的。對(duì)于某一物種來說，核糖體基因在染色體上的拷貝數(shù)是恒定的，除有絲分裂外不會(huì)隨著細(xì)胞的生理狀態(tài)、生活環(huán)境的不同而改變，也就是說樣品中染色體DNA上核糖體基因的數(shù)量與樣品中細(xì)胞的數(shù)量是呈線性相關(guān)的，由于本方法擴(kuò)增的靶片段是染色體DNA上的核糖體基因，因此擴(kuò)增信號(hào)的強(qiáng)弱直接反映了待檢樣品中細(xì)胞數(shù)量的多少。
另外本方法操作過程簡單、省時(shí)，整個(gè)過程4個(gè)小時(shí)內(nèi)即可全部完成，因此可以用此方法快速、簡便、大批量定量檢測赤潮異灣藻，為海洋生態(tài)學(xué)和海洋環(huán)境監(jiān)測提供有效的手段。
序列表<110>中國海洋大學(xué)<120>赤潮異灣藻的檢測探針及檢測方法<160>4<210>1<211>1741<212>DNA<213>赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)<400>1attaagccat gcatgtctaa gtataaacga ctctatactg tgaaactgcg aatggctcat 60tatatcagtt atagtttatt tgatagtccc tactacttgg ataaccgtag taattctaga 120gctaatacat gcatcaactcccaactgctt cggcggacgg gatgtattta ttagatggaa 180accaataccg agttttctcg gtttttgtgg tgaatcatag taactgtgcg aatcgacttc240ggtcgatggt tcattcaagt gtctgcccta tcagcttcgg atggtagggt attggcctac 300catggcttta acgggtaacg gagaattggg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac 360ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgtaaattac ccaatcctga catagggagg 420tagtgacaat aaataacaat gctaggcttt taaagtccgg caattggaat gagaacaatt 480taaatccctt atcgaggaac cattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc 540cagctccaat agcgtatatt aaagttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt ggatttctgg 600tggaggtgat cggtcggcct cgcaaggggt ctgcacctgt atcgtccttt gccatccttc 660aggaaggcgc ttcttgtatt aacttacggg ttgcgaactc ctgatctttt actgtgaaaa 720aattagagtg ttcaaagcag gcttaggccg ttgaatacat tagcatggaa taatgagata 780gggccttggt ggttttctat tttgttggtt tgcacgccaa ggtaatgatt aatagggata 840gttgggggta ttcgtattca attgtcagag gtgaaattct tggatttatg gaagacgaac 900tactgcgaaa gcatttacca aggatgtttt cattaatcaa gaacgaaagt taggggatcg 960aagatgatta gataccatcg tagtcttaac cataaactat gccgactagg gattggcggt 1020cgttacctag actccgtcag caccttccga gaaatcaaag tctttgggtt ccggggggag 1080tatggtcgca aggctgaaac ttaaagaaat tgacggaagg gcaccaccag gagtggagcc 1140tgcggcttaa tttgactcaa cacggggaaa cttaccaggt ccagacatag tgaggattga 1200cagattgata gctctttctt gattctatgg gtggtggtgc atggccgttc ttagttggtg 1260gagtgatttg tctggttaat tccgttaacg aacgagaccc ccgcctgcta aatagtgtcg 1320gtaatgcttc tgcattgccg tttctacttc ttagagggac tttcggtgac taaccgaagg 1380aagttggggg caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt cctgggctgc acgcgcgcta 1440cactgatgca tgcaacgagt aacgaccttt gccggaaggc acgggtaatc ttttgaacgt 1500gcatcgtgat agggatagat tattgcaatt attaatcttg aacgaggaat tcctagtaaa 1560cgcgagtcat cagctcgcat tgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcac 1620ctaccgattg aatgattcgg tgaaaatctc ggactttggc atggaacttt attgtgactt 1680gccgagggaa gttatttaaa cctcatcatt tagaggaagg tgaagtcgta acaaggtttc 1740c 1741<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2tatactgtga aactgcgaat ggct 24<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3agaaacttga atgaaccatc gaccg25<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4catcccgtcc gccgaagcag ttgg 2權(quán)利要求
1.一種赤潮異灣藻的檢測探針，其特征是該探針來源于如SEQ ID NO.1所示的赤潮異灣藻rDNA核苷酸序列中的兩段寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征是這兩個(gè)探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.2所示，序列為5’-tatactgtgaaactgcgaatggct，或其互補(bǔ)序列5’-agccattcgcagtttcacagtata。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.3所示，序列為5’-agaaacttgaatgaaccatcgaccg，或其互補(bǔ)序列5’-cggtcgatggttcattcaagtttct。
5.一種赤潮異灣藻的分子檢測方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3兩個(gè)核酸分子探針為一對(duì)PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無來檢測赤潮異灣藻。
6.一種赤潮異灣藻的快速檢測和定量計(jì)數(shù)方法，其特征是采用熒光定量PCR方法，以SEQ ID NO.2和3兩個(gè)核酸分子探針為PCR引物，以一條用熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列為TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示5’-catcccgtccgccgaagcagttgg，或其互補(bǔ)序列5’-ccaactgcttcggcggacgggatg。
8.按照權(quán)利要求7所述的用熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端用淬滅熒光基團(tuán)標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測環(huán)境微生物的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了赤潮異灣藻核糖體DNA(rDNA)和轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)(ITS)核苷酸序列，以及以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，以該核酸分子探針為一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可以準(zhǔn)確、快速地檢測赤潮異灣藻。本發(fā)明還公開了用這些探針采用熒光定量PCR技術(shù)來快速、準(zhǔn)確地檢測和定量計(jì)數(shù)赤潮異灣藻的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1699599SQ20051004229
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 甄毓, 何閃英, 蔡青松, 米鐵柱 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)