專利名稱：一種蛹蟲草固體培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蛹蟲草固體培養(yǎng)的產(chǎn)物中提取類胡蘿卜素的方法。
背景技術(shù)：
在食品安全日益引起關(guān)注的今天，天然食用色素以其色澤自然、安全無毒越來越受到人們的重視。天然類胡蘿卜素(Carotenoid)是由八個異戊二烯組成的萜類化合物，涵蓋了從亮黃色到暗紅色的范圍。除了能為食品添色外，還具有較高的營養(yǎng)和保健價值。幾乎所有類胡蘿卜素均有抗氧化、增強免疫力、防止紫外線損傷、抗心血管疾病和抗癌等功能，
胡蘿卜素、α-胡蘿卜素還是維生素D的前體等。類胡蘿卜素作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑，已經(jīng)得到美國食品藥品管理局、歐洲共同體、世界衛(wèi)生組織等國際組織的認可。類胡蘿卜素可以由植物、藻類、光合細菌及某些非光合細菌、真菌合成。由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素具有不受環(huán)境條件限制、便于工業(yè)化生產(chǎn)、提取工藝簡單等優(yōu)點，近年來引起國內(nèi)外的普遍重視。目前已發(fā)現(xiàn)能合成胡蘿卜素的真菌主要有三 ？1 ^β (Blakeslea trispora) > Ji ^ (Phycomyces blakesleeanus) > Il f^ BJ (Rhodotorula)、土生假絲酵母(Candida humicola)、白球擬酵母(Torulopsis Candida)等等。但是由于成本的劣勢，只有很少一部分實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，亟需尋找新的適合類胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)的微生物資源。蛹蟲草[Cordyc印s militaris (L. ) Link]又稱北蟲草、北冬蟲夏草，是真菌寄生于鱗翅目等昆蟲的蟲體上形成的蟲菌復(fù)合體，是一種具有滋補作用的中藥和營養(yǎng)品。生物分類上隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、 蟲草菌科(Cordicipitaceae)、蟲草屬[Cordyc印s (Fr. ) Link]。蛹蟲草具有多種藥理功效， 當前，它已經(jīng)在東亞地區(qū)被廣泛作為滋補品及藥用菌使用，我國衛(wèi)生部于2009年3月16日正式將其列為了新資源食品(中華人民共和國衛(wèi)生部公告2009年第3號http://WWW. moh. gov. cn/publicfiles/business/htmlfiles/zwgkzt/pgg/200903/39591.htm)。目前對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的研究較少，2006年付鳴佳申請了專利“從蛹蟲草中發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝”(中國專利申請?zhí)?00610018 . 4)，該專利為利用蛹蟲草菌進行液體靜止發(fā)酵，收集發(fā)酵液液面上的菌絲體用乙醇進行提取，存在菌絲體得率和類胡蘿卜素提取率偏低的缺點。隨著蛹蟲草栽培的工業(yè)化，產(chǎn)生了大量的培養(yǎng)基殘渣，因此，如何實現(xiàn)蛹蟲草子實體的深層次開發(fā)和綜合利用顯的尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛹蟲草固體培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法。本發(fā)明所提供的蛹蟲草固體培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，包括下述步驟1)將蛹蟲草菌(Cordyc印s militaris)進行固體培養(yǎng)，收集培養(yǎng)產(chǎn)物；2)將所述培養(yǎng)產(chǎn)物進行破壁處理，離心，收集沉淀；3)將所述沉淀用有機溶劑進行抽提，過濾，得到類胡蘿卜素粗提液，除去所述類胡蘿卜素粗提液中的有機溶劑，得類胡蘿卜素粗品。其中，所述培養(yǎng)產(chǎn)物具體可為蛹蟲草子實體和/或蛹蟲草菌絲體和/或培養(yǎng)基殘渣。本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)過程分為菌絲體生長階段和子實體生長階段，所述菌絲體生長階段的培養(yǎng)條件為16-20°C，避光培養(yǎng)7-20天；所述子實體生長階段的培養(yǎng)條件為18-25°C，光照培養(yǎng)15-50天。上述子實體生長階段的光照培養(yǎng)為自然光照射培養(yǎng)或不連續(xù)燈光照射(光照強度為50-1200LUX，每日照射4-12小時)培養(yǎng)。所述固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為谷物培養(yǎng)基，所述谷物培養(yǎng)基由質(zhì)量份數(shù)比為 1:1-1: 1.5的谷物和營養(yǎng)液組成，所述谷物選自下述至少一種大米、小米、玉米渣、大麥和小麥。所述營養(yǎng)液選自下述a)或b)，所述a)按照下述方法制備得到將200g馬鈴薯煮汁，加入葡萄糖5-40g，用水定容至1000ml，即得；所述b)按照下述方法制備得到馬鈴薯200g煮汁，加入葡萄糖5-40g、酵母膏l(xiāng)-10g，用水定容至1000ml，即得。本發(fā)明中，所述步驟2、中破壁的方法具體可為液氮研磨和/或酸熱法。所述步驟3)中的有機溶劑選自下述至少一種丙酮、甲醇和乙醇。所述步驟3)中所述沉淀與所述有機溶劑的配比可為Ig 5ml_20ml，并且該有機溶劑可回收重復(fù)利用；所述抽提的次數(shù)具體可為1-3次。上述方法還包括將得到的類胡蘿卜素進行初步純化的步驟；所述純化的方法選自下述任一種1)將所述類胡蘿卜素用無水乙醇溶解，真空干燥得類胡蘿卜素，幻將所述類胡蘿卜素用無水乙醇溶解，將無水乙醇溶液置于-20°C至-40°c，使類胡蘿卜素析出，得類胡蘿卜素。本發(fā)明提供了一種從蛹蟲草固體培養(yǎng)的產(chǎn)物(包括菌絲體、子實體和培養(yǎng)基殘渣)中提取類胡蘿卜素的方法。該方法生產(chǎn)的類胡蘿卜素得率高，每克ml鮮培養(yǎng)產(chǎn)物能提取得到60-700 μ g類胡蘿卜素；且所得到的蛹蟲草類胡蘿卜素呈現(xiàn)鮮亮的橙黃色，為天然產(chǎn)物。另外，本發(fā)明中固體培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基原材料來源豐富，價格低廉，無需特殊的設(shè)備， 同時使培養(yǎng)基殘渣得到了開發(fā)利用。


圖1為本發(fā)明提取純化類胡蘿卜素的工藝流程圖。
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實施例中類胡蘿卜素的提取按照圖1所示的流程圖進行。實施例1、從蛹蟲草固體培養(yǎng)的子實體中提取類胡蘿卜素的方法(1)菌株活化將蛹蟲草菌1065(保藏編號CGMCC 5. 1973)接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上活化，培養(yǎng)溫度20°C，培養(yǎng)時間10天。(2)菌種培養(yǎng)用步驟(1)的菌絲體，在無菌條件下接種到PDA液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g煮汁，葡萄糖20g，定容至1000ml)中，培養(yǎng)溫度20°C，培養(yǎng)方式為利用漩渦式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(3)固體培養(yǎng)將步驟( 中活化的液體菌種接入大米培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。先在溫度20°C的條件下，避光培養(yǎng)10天；然后自然光照射，18-25°C培養(yǎng)40天，收獲蛹蟲草子實體。所述大米培養(yǎng)基的配方為IOOg大米，150ml營養(yǎng)液，將所述大米和營養(yǎng)液混合后121°C滅菌1小時，即得所述大米培養(yǎng)基，所述營養(yǎng)液組成為馬鈴薯200g煮汁，葡萄糖20g，定容至1000ml。(4)類胡蘿卜素提取將收獲的新鮮子實體IOg加液氮研磨，酸熱法破壁(150mllM 鹽酸室溫浸泡30min，沸水％iin，立即冰上冷卻)，5000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌離心。然后用IOOml丙酮抽提，重復(fù)三次，合并濾液，得到類胡蘿卜素粗溶液。真空濃縮除去丙酮，用無水乙醇溶解，真空干燥得類胡蘿卜素干品6. 863mgo實施例2、從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘渣中提取類胡蘿卜素的方法(1)菌株活化將蛹蟲草菌1065(保藏編號CGMCC 5. 1973)接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上活化，培養(yǎng)溫度20°C，培養(yǎng)時間10天。(2)菌種培養(yǎng)用步驟⑴的菌絲體，在無菌條件下接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度20°C，培養(yǎng)方式為利用漩渦式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(3)固體培養(yǎng)將步驟( 中活化的液體種子接入大米培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。先在18°C避光培養(yǎng)10天，然后自然光照射，18-25°C培養(yǎng)40天，收獲蛹蟲草子實體后得到培養(yǎng)基殘渣。所述大米培養(yǎng)基的配方為100g大米，150ml營養(yǎng)液，將所述大米和營養(yǎng)液混合后121°C滅菌1小時，即得所述大米培養(yǎng)基；所述營養(yǎng)液組成為馬鈴薯200g煮汁，葡萄糖20g，酵母膏2g，定容至IOOOml。(4)類胡蘿卜素提取將收獲的新鮮大米培養(yǎng)基殘渣IOg液氮研磨，酸熱法破壁 (150ml IM鹽酸室溫浸泡30min，沸水％iin，立即冰上冷卻)，5000rpm離心lOmin，棄上清， 沉淀用蒸餾水洗滌離心。用IOOml乙醇抽提，重復(fù)三次，合并濾液，得到類胡蘿卜素粗溶液。 真空濃縮除去乙醇，用無水乙醇溶解，無水乙醇溶液置于-20°C，使類胡蘿卜素結(jié)晶析出得 0. 695mg類胡蘿卜素結(jié)晶。
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲草固體培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，包括下述步驟1)將蛹蟲草菌(Cordyc印Smilitaris)進行固體培養(yǎng)，收集培養(yǎng)產(chǎn)物；2)將所述培養(yǎng)產(chǎn)物進行破壁處理，離心，收集沉淀；3)將所述沉淀用有機溶劑進行抽提，過濾，得到類胡蘿卜素粗提液，除去所述類胡蘿卜素粗提液中的有機溶劑，得到類胡蘿卜素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)產(chǎn)物為蛹蟲草子實體和/或菌絲體和/或培養(yǎng)基殘渣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)過程分為菌絲體生長階段和子實體生長階段，所述菌絲體生長階段的培養(yǎng)條件為16-20°C，避光培養(yǎng)7-20天； 所述子實體生長階段的培養(yǎng)條件為18-25°C，光照培養(yǎng)15-50天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述菌絲體生長階段的光照培養(yǎng)為自然光照射培養(yǎng)或不連續(xù)燈光照射培養(yǎng)；所述不連續(xù)燈光照射的光照強度為50LUX-1200LUX， 每日光照4-12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為谷物培養(yǎng)基，所述谷物培養(yǎng)基由質(zhì)量份數(shù)比為1 1-1 1.5的谷物和營養(yǎng)液組成，所述谷物選自下述至少一種大米、小米、玉米渣、大麥和小麥；所述營養(yǎng)液選自下述a)或b)，所述a) 按照下述方法制備得到將200g馬鈴薯煮汁，加入葡萄糖5-40g，用水定容至1000ml，即得； 所述b)按照下述方法制備得到馬鈴薯200g煮汁，加入葡萄糖5-40g、酵母膏l(xiāng)-10g，用水定容至1000ml，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中破壁的方法為液氮研磨和/或酸熱法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中的有機溶劑選自下述至少一種丙酮、甲醇和乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟⑴中所述沉淀與所述有機溶劑的配比為Ig 5-20ml，所述抽提的次數(shù)為1-3次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將得到的類胡蘿卜素進行純化的步驟；所述純化的方法選自下述任一種1)將所述類胡蘿卜素用無水乙醇溶解，真空干燥得純化的類胡蘿卜素，幻將所述類胡蘿卜素用無水乙醇溶解，將無水乙醇溶液置于_20°C至_40°C，使類胡蘿卜素析出，得純化的類胡蘿卜素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述蛹蟲草菌(Cordyc印S militaris)為蛹蟲草菌1065，其保藏號為CGMCC 5. 1973。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛹蟲草固體培養(yǎng)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法。該方法包括下述步驟1)將蛹蟲草菌(Cordyceps militaris)進行固體培養(yǎng)，收集培養(yǎng)產(chǎn)物；2)將所述培養(yǎng)產(chǎn)物進行破壁處理，離心，收集沉淀；3)將所述沉淀用有機溶劑進行抽提，過濾，得到類胡蘿卜素粗提液，除去所述類胡蘿卜素粗提液中的有機溶劑，得到類胡蘿卜素。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的類胡蘿卜素得率高，每克鮮培養(yǎng)產(chǎn)物能提取得到60-700μg類胡蘿卜素；且所得到的蛹蟲草類胡蘿卜素呈現(xiàn)鮮亮的橙黃色，且為天然產(chǎn)物。另外，本發(fā)明中固體培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基原材料來源豐富，價格低廉，無需特殊的設(shè)備；同時使生產(chǎn)中的培養(yǎng)基殘渣得到了開發(fā)利用。
文檔編號C12R1/645GK102234676SQ20101016895
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者姚一建, 董彩虹 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所