專利名稱：一種節(jié)桿菌突變株、利用該突變株生產(chǎn)乳糖酶的方法及用乳糖酶制備乳果糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種節(jié)桿菌突變株、對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)乳糖酶的方法及用該乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法。
背景技術(shù)：
乳果糖(Lactulose，4-0- β -D-galactopy-ranosyl-D-fructose)，又名乳酮糖，是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷鍵結(jié)合的二糖。1930年，Montgomery首次發(fā)現(xiàn)乳果糖，其后，乳果糖的結(jié)構(gòu)和生理功能研究進(jìn)展迅速。到目前為止，確定乳果糖主要的生理功用有 ⑴促進(jìn)雙歧桿菌增殖，調(diào)整腸道菌群平衡；⑵治療肝性腦病，降低內(nèi)毒素；⑶導(dǎo)瀉作用， 用于慢性便秘；(4)用于監(jiān)視腸壁的通透性；(5)預(yù)防結(jié)腸息肉術(shù)后復(fù)發(fā)；(6)增強(qiáng)機(jī)體免疫作用；(7)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝；(8)影響膽汁酸循環(huán)和內(nèi)分泌。目前，乳果糖的制備主要是利用乳糖在堿性介質(zhì)中異構(gòu)化，生成乳果糖的化學(xué)方法。但是采用堿性試劑為催化劑時(shí)，乳糖會(huì)降解生成半乳糖及己糖酸，并伴有顏色副產(chǎn)物產(chǎn)生，降低了乳果糖收率，造成產(chǎn)物分離困難。為此，國(guó)內(nèi)外研究人員將乳果糖生產(chǎn)的研究重點(diǎn)集中于不同催化劑的使用和分離方法的開發(fā)，例如US 4，957，564與JP 01-193281采用鋁酸鈉催化體系，并采用硫酸調(diào)節(jié)PH生成氫氧化鋁沉淀，通過(guò)去除沉淀進(jìn)而除去鋁離子。 CN1093410采用加熱溶解乳糖，然后保持沸騰，滴加堿溶液，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至4-4. 5，脫色，采用陰、陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽，然后真空濃縮、冷卻結(jié)晶可制得乳果糖漿。但是，產(chǎn)物得率低、工序復(fù)雜，成本高仍是化學(xué)法乳果糖制備中有待解決的問(wèn)題。與之相比，酶法乳果糖制備可以避免產(chǎn)物降解和有色副產(chǎn)物生成等問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外的研究尚處在起步階段。因此，開發(fā)可以進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化制備乳果糖的乳糖酶及其微生物生產(chǎn)菌種具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種可發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的微生物-節(jié)桿菌突變株，及利用該突變株生產(chǎn)乳糖酶的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，克服化學(xué)法乳果糖制備中產(chǎn)物易降解以及有色副產(chǎn)物難以去除的缺陷。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種節(jié)桿菌突變株，該菌株分類命名為ArthrcAacter sp. jnsb-2,目前該菌株保藏于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，登記入冊(cè)的編號(hào)是CCTCC M 209210， 保藏日期是2009年9月27日。該菌株具有下述性質(zhì)1、形態(tài)特征菌株在乳糖酵母膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落為淡黃色，電子顯微鏡下顯示細(xì)胞為桿狀，兩端鈍圓。2、生理生化特性(1)培養(yǎng)溫度在20-37°C。最適溫度為30°C。(2)明膠液化淀粉水解陽(yáng)性。(3)革藍(lán)氏陽(yáng)性。(4)乳糖發(fā)酵陽(yáng)性。(5) H2S 生成陰性。3、16S rDNA序列分析長(zhǎng)度138!3bp，序列與GenBank中的節(jié)桿菌屬16S rDNA具有較高的同源性，其中與 Arthrobacter sp. CDBU Arthrobacter sp. AGL 5、Arthrobacter sp. 2-12的相似性為99%。上述節(jié)桿菌突變株可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，利用其發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法為將菌株經(jīng)固體斜面活化、種子培養(yǎng)后再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基碳源可選用葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖或甘油中的任一種，其質(zhì)量體積比濃度為0. 2% -2% ； 氮源可選用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕或玉米漿中的一種或多種，其質(zhì)量體積比濃度為 0. 5-2.5% ；無(wú)機(jī)鹽可選用硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或氯化鐵中的一種或多種，其濃度為0. 05-23mmol/L ；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20_37°C培養(yǎng)12_30h ；后將生成的發(fā)酵液經(jīng) 5000rpm-8000rpm離心得到菌體，隨后經(jīng)破碎細(xì)胞、10000-12000rpm離心取上清液即為酶液。進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別優(yōu)選乳糖、玉米漿、氯化鐵。利用上述乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. 0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖的質(zhì)量體積比濃度為 2-40%，果糖的質(zhì)量體積比濃度為-20% ；(2)水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)向步驟(1)的溶液中加入250-400U/L乳糖酶，在20_40°C反應(yīng)4_8h，進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，得到酶解液；(3)酶解液的后處理向步驟O)中得到的酶解液中加入無(wú)水乙醇，使其終濃度為40-70%，經(jīng)離心后取上清液經(jīng)60-65°C加熱濃縮后處理即可制得乳果糖漿。在利用乳糖酶進(jìn)行乳果糖合成中，對(duì)乳糖和果糖溶液的濃度沒(méi)有特殊要求，以配出的溶液粘度適合操作為準(zhǔn)，反應(yīng)溫度只要是能保持酶活性的均可，水解時(shí)間在4小時(shí)以上較好。上述合成乳果糖的酶解液可采用如下方法檢測(cè)在Agilent HP 1100 高壓液相色譜儀上，用 SHODEX SHlOll 8mmX 300mm 柱分析。 色譜條件為柱溫50°C ；流動(dòng)相0. 01mol/L H2SO4 ；流速0. 8mL/min ；示差折光檢測(cè)器檢測(cè)， 外標(biāo)法標(biāo)定，進(jìn)樣量為5 μ L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明采用節(jié)桿菌的乳糖酶將乳糖和果糖合成乳果糖，與現(xiàn)有的化學(xué)法制備乳果糖相比，反應(yīng)條件溫和，沒(méi)有有色副產(chǎn)物生成。將本發(fā)明得到的處理后的酶解液按所述檢測(cè)
4方法檢測(cè)，結(jié)果表明，產(chǎn)物主要是乳果糖，產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明篩選得到的微生物菌株-節(jié)桿菌突變株，用其產(chǎn)生的乳糖酶制備乳果糖， 反應(yīng)條件溫和，沒(méi)有有色副產(chǎn)物生成，產(chǎn)物純度高，易純化。菌株培養(yǎng)條件粗放，產(chǎn)酶周期短，操作方便。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明的節(jié)桿菌突變株ArthrcAacter sp. jnsb-2可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，具體如下(1)培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCll %，pH 7. 0，瓊脂2%，121°C滅菌20min。種子培養(yǎng)基蛋白胨1%、酵母提取物0. 5%、NaCll%，pH 7. 0，121°C滅菌20min。 發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖 2%，酵母膏 1. 4%, FeCl3 1. 5mmol/L, ρΗ7· 0，121°C滅菌 20min。(2)菌種發(fā)酵培養(yǎng)將節(jié)桿菌突變株ArthrcAacter sp. jnsb-2固體斜面活化Mh，然后接一環(huán)此菌至種子培養(yǎng)基，30°C恒溫培養(yǎng)12h，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。將上述種子菌懸液以10% (ν/ν)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25°C恒溫培養(yǎng)Mh，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。(3)將發(fā)酵液以8000rpm離心IOmin收集細(xì)胞，用同體積磷酸緩沖液(lOmmol/L， pH7. 0)重懸，經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，12000rpm，離心lOmin，取上清即為酶液。實(shí)施例2與實(shí)施例1基本相同，其不同之處在于步驟(1)中所用發(fā)酵培養(yǎng)基為乳糖1%，玉米漿2. 2%，氯化鐵1. 5mmo 1/L ；步驟 (2)中接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件為30°C恒溫培養(yǎng)18h，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。步驟⑶中發(fā)酵液以5000rpm離心15min收集細(xì)胞，用同體積磷酸緩沖液 (10mmol/L, pH7. 0)重懸，經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，lOOOOrpm，離心15min，取上清即為酶液。實(shí)施例3與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母 0.5%, KH2PO4 20mmol/L, MgSO4. 7H20 2. 7mmol/L ；步驟(2)中接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件為 37°C恒溫培養(yǎng)12h，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。實(shí)施例1-3均為利用節(jié)桿菌突變株生產(chǎn)乳糖酶的方法，其中對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽沒(méi)有特別的限定，菌種的培養(yǎng)條件粗放，操作方便。實(shí)施例4利用本發(fā)明的經(jīng)節(jié)桿菌突變株生產(chǎn)得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. 0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為200g/L，果糖濃度為100g/L ；
(2)水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)向步驟(1)的溶液中加入300U/L乳糖酶，在37°C反應(yīng)他，進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)， 得到酶解液；(3)酶解液的后處理向步驟(2)中得到的酶解液中加入無(wú)水乙醇，使其終濃度為60%，12000rpm，離心 lOmin，上清液經(jīng)60°C加熱濃縮。經(jīng)檢測(cè)，乳果糖含量為19g/L 。實(shí)施例5利用本發(fā)明的經(jīng)節(jié)桿菌突變株生產(chǎn)得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. O的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為60g/L，果糖濃度為30g/L ；(2)水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)向步驟(1)的溶液中加入250U/L乳糖酶，在40°C反應(yīng)4h，進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)， 得到酶解液；(3)酶解液的后處理向步驟(2)中得到的酶解液中加入無(wú)水乙醇，使其終濃度為70%，12000rpm，離心 lOmin，上清液經(jīng)60°C加熱濃縮。經(jīng)檢測(cè)，乳果糖含量為9g/L。實(shí)施例6利用本發(fā)明的經(jīng)節(jié)桿菌突變株生產(chǎn)得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為(1)底物溶液的配制用pH 5. 5-8. O的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為400g/L，果糖濃度為200g/L ；(2)水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)向步驟(1)的溶液中加入400U/L乳糖酶，在30°C反應(yīng)他，進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)， 得到酶解液；(3)酶解液的后處理向步驟(2)中得到的酶解液中加入無(wú)水乙醇，使其終濃度為40%，12000rpm，離心 lOmin，上清液經(jīng)65°C加熱濃縮。經(jīng)檢測(cè)，乳果糖含量為45g/L。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種節(jié)桿菌突變株，其特征在于，該菌株分類命名為ArthrcAactersp. jnsb-2，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC M 209210。
2.一種如權(quán)利要求1所述的節(jié)桿菌突變株的應(yīng)用，其特征在于，所述的節(jié)桿菌突變株應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶。
3.一種利用如權(quán)利要求1所述的節(jié)菌突變株生產(chǎn)乳糖酶的方法，將菌株經(jīng)固體斜面活化、種子培養(yǎng)后再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基碳源可選用葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖或甘油中的任一種，其質(zhì)量體積比濃度為0.2%-2%;氮源可選用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕或玉米漿中的一種或多種，其質(zhì)量體積比濃度為0. 5-2. 5% ；無(wú)機(jī)鹽可選用硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或氯化鐵中的一種或多種，其濃度為0. 05-23mmol/L ；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20-37°C培養(yǎng)12-30h ；將生成的發(fā)酵液經(jīng)5000-8000rpm離心得到菌體，隨后經(jīng)破碎細(xì)胞、10000-12000rpm離心取上清液即為酶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用節(jié)桿菌突變株生產(chǎn)乳糖酶的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別優(yōu)選乳糖、玉米漿、氯化鐵。
5.一種用乳糖酶制備乳果糖的方法，其特征在于，用乳糖酶作為催化劑，以乳糖和果糖為底物制備乳果糖；(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖的質(zhì)量體積比濃度為 2-40%，果糖的質(zhì)量體積比濃度為-20% ；(2)水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)向步驟(1)的溶液中加入250-400U/L乳糖酶，在20-40°C反應(yīng)4_8h，進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，得到酶解液；(3)酶解液的后處理向步驟O)中得到的酶解液中加入無(wú)水乙醇，使其終濃度為40-70%，經(jīng)離心后取上清液經(jīng)60-65°C加熱濃縮后處理即可制得乳果糖漿。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種節(jié)桿菌突變株Arthrobacter sp.jnsb-2，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)乳糖酶的方法及用該乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法。本發(fā)明以節(jié)桿菌突變株jnsb-2作為菌種，保藏號(hào)為CCTCC NOM 209210，采用碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制得乳糖酶，該乳糖酶可以作為催化劑，以乳糖和果糖為底物，酶法轉(zhuǎn)化制備乳果糖。利用本發(fā)明的菌株發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，培養(yǎng)條件粗放、產(chǎn)酶周期短、操作方便；同時(shí)利用上述乳糖酶采用酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乳果糖，克服化學(xué)法乳果糖制備中產(chǎn)物易降解以及有色副產(chǎn)物難以去除的缺陷，產(chǎn)物純度高。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102168028SQ20101011474
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者劉莉, 唐蕾, 孫慧慧, 張建華, 楊瑞金, 毛忠貴 申請(qǐng)人:江南大學(xué)