專利名稱：通過過表達琥珀酸脫氫酶增加甲硫氨酸生產(chǎn)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)經(jīng)修飾用于增強涉及琥珀酸脫氫酶合成的基因表達的微生物用于改善甲硫氨酸生產(chǎn)的工藝。將所述微生物以增加甲硫氨酸/碳源得率的方式進行修飾。還請求保護從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸。
現(xiàn)有技術琥拍酸脫氫酶(琥拍酸氧化還原酶 ，SQR)是克雷伯氏循環(huán)(Krebs cycle)和需氧呼吸鏈二者的功能成員。SQR催化細菌細胞質(zhì)中琥珀酸鹽至延胡索酸鹽的氧化，具有泛醌在膜中的伴隨還原。在大腸桿菌(E. coli)和其他細菌中，該酶包含4個亞基。2個疏水亞基SdhC和SdhD將2個親水和催化亞基SdhA和SdhB錨定至內(nèi)膜表面。5種獨特輔因子涉及琥珀酸鹽至延胡索酸鹽的氧化。在SdhA中，存在共價附著的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)分子，以通過氫化物轉(zhuǎn)移機制催化琥珀酸鹽氧化。電子隨后個別地通過電子轉(zhuǎn)移亞基(SdhB)進行轉(zhuǎn)移，所述SdhB含有[2Fe-2S]、[4Fe_4S]和[3Fe_4S]簇。醌結(jié)合位點由來自SdhC、SdhD和SdhB的殘基形成，允許泛醌還原成泛醇(ubiquinole)。該酶還含有夾在SdhC和SdhD之間的血紅素b分子,其不是酶功能必需的(Yankovskaya等人2003, Science 299,700 ；Cheng 等人 2008Biochemistry 47,6107)。氨基酸L-甲硫氨酸是以大量(600000t/an)生產(chǎn)的重要飼料添加劑。生產(chǎn)專一地依賴于化學生物合成，并且需要原油衍生的前體。隨著對這些不可再生資源價格越來越大的壓力，可持續(xù)性工藝得到越來越多的注意。甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)因此已成為該化學工藝在經(jīng)濟上可行的替代者。通過發(fā)酵進行的甲硫氨酸生產(chǎn)需要幾個前體提供途徑的修飾。3個主要途徑促成甲硫氨酸生物合成。天冬氨酸鹽充當碳骨架的前體，半胱氨酸充當硫供體，并且亞甲基-THF充當末端甲基的供體。此外，天冬氨酸鹽衍生的高絲氨酸通過琥珀酰-CoA的活化是甲硫氨酸生物合成中的第一個步驟所需的。琥珀酰-CoA在克雷伯氏循環(huán)中生產(chǎn)，并且因此克雷伯氏循環(huán)酶的表達增加可以增加甲硫氨酸生產(chǎn)。然而高克雷伯氏循環(huán)活性已顯示為氨基酸生產(chǎn)的缺點，并且減少克雷伯氏循環(huán)酶例如異檸檬酸脫氫酶的活性對于氨基酸生產(chǎn)可以是有利的(W02007017710Metabolic Explorer, W02009133063Evonik Industries)。WO 2009078973 (Glycos Biotechnology)和 EP 1106684(Evonik Industries)公開了 sdh基因的缺失增加氨基酸和工業(yè)上感興趣的其他代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。根據(jù)這種技術應當理解減少sdh基因的表達將降低克雷伯氏循環(huán)活性并因此降低C02生產(chǎn)，這繼而又應對產(chǎn)物得率具有正面影響。存在增加由可再生碳源生產(chǎn)的甲硫氨酸得率的需要。與現(xiàn)有技術的教導(琥珀酸脫氫酶的活性減少增加產(chǎn)物得率)相反，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶的表達增加增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在發(fā)酵工藝中增加甲硫氨酸生產(chǎn)的方法，其包括步驟在包含碳源和硫源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)修飾用于甲硫氨酸的改善生產(chǎn)的微生物，和從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸，其中所述微生物通過增強編碼琥珀酸脫氫酶(Sdh)的一種或多種基因的表達來進一步修飾。這一種或多種基因的表達是通過將編碼琥珀酸脫氫酶的所述基因的至少一個補充性拷貝插入微生物內(nèi)增強的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，進一步從培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸。本發(fā)明還涉及通過過表達琥珀酸脫 氫酶而對于甲硫氨酸生產(chǎn)最佳化的微生物，優(yōu)選腸桿菌科(enterobacteriaceae)、棒狀桿菌形細菌(coryneform bacteria)、酵母或真菌。在本發(fā)明的工藝中使用的這種微生物允許增加的甲硫氨酸/碳源得率增加。發(fā)明詳述生產(chǎn)甲硫氨酸的微生物本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)經(jīng)修飾的微生物用于在發(fā)酵過程中生產(chǎn)甲硫氨酸的方法。根據(jù)本發(fā)明，術語“培養(yǎng)”、‘發(fā)酵’或‘發(fā)酵過程/工藝’可互換使用，以指示在含有簡單碳源的合適生長培養(yǎng)基上的細菌生長。這種簡單碳源通過微生物代謝用于生產(chǎn)甲硫氨酸。本發(fā)明的另一個目的是用于在此類用于在發(fā)酵過程中生產(chǎn)甲硫氨酸的方法中使用的經(jīng)修飾的微生物。根據(jù)本發(fā)明，術語“微生物”指示細菌、酵母或真菌。優(yōu)選地，細菌選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地，微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的菌種。在最優(yōu)選的實施方案中，細菌選自大腸桿菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。本發(fā)明的微生物優(yōu)選包含編碼sdh酶的一種或多種內(nèi)源基因。術語“經(jīng)修飾用于甲硫氨酸的改善生產(chǎn)的微生物”指示這樣的微生物，與未經(jīng)修飾的微生物相比較，其經(jīng)過遺傳修飾用于改善通過代謝簡單碳源進行的甲硫氨酸生產(chǎn)。此類修飾可以對應于涉及甲硫氨酸生物合成途徑的基因的增強的、受調(diào)節(jié)的或減少的表達。本領域技術人員知道如何調(diào)節(jié)特定基因的表達。通常的修飾包括用遺傳元件轉(zhuǎn)化微生物，包括基因替換、啟動子的修飾、和用于表達異源或內(nèi)源基因的載體的引入。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾的微生物通過增強編碼琥珀酸脫氫酶的亞基之一的至少一種基因的表達加以修飾。優(yōu)選地，編碼琥珀酸脫氫酶的不同亞基的所有基因都是過表達的。琥珀酸脫氫酶一般是含有至少3個亞基的酶復合物。每個亞基由一種基因編碼。例如，棒狀桿菌屬菌種含有編碼琥拍酸脫氫酶的3種基因sdhA、sdhB和sdhC (Bussmann等人,2009,J. Biotechnol, 143 (3) , 173),而其他微生物例如大腸桿菌或釀酒酵母(S. cerevisiae)具有用于4個琥珀酸脫氫酶亞基的4種基因。這些sdh基因被組織在操縱子中。術語操縱子描述轉(zhuǎn)錄單位，其中幾個基因在多順反子信使RNA中轉(zhuǎn)錄(關于sdhA的大腸桿菌登記號P0AC41, sdhB P07014, sdhC P69054, sdhD P0AC44)。術語“增強”或‘增強的’或‘過表達的’或‘增加的表達’、‘增強的表達’或‘過
表達’在正文中可互換使用且具有相似含義。在這個背景中，這些術語描述由相應DNA編碼的酶促活性的細胞內(nèi)活性中的增加，例如通過增加基因的拷貝數(shù)，使用更強的啟動子或使用具有增加活性的等位基因且可能地組合這些手段。這些啟動子可以是誘導型的；它們可以是同源或異源的。本領域技術人員知道哪些啟動子是最方便的，例如啟動子Ptrc、Ptac、Plac (Dickson 等人，1975, Science 187 (4171), 27 ；de Boer 等人，1983, Proc NatlAcad SciU S A，80 (I)，21 ;Brosius 等人，1985，J Biol Chem，260 (6)，3539)或入啟動子cl(Ptashne M,1986,Blackwell Scientific,Cambridge,MA ；Ptashne M,2004,Cold SpringHarbor Lab Press ；Little J,2004,Richard Calendar, ed. Oxford University Press)是廣泛使用的。當基因被組織在操縱子中時，通過加入在單個啟動子的控制下的這些基因的一個補充性拷貝可以增強其表達。表達還可以通過用強于野生型啟動子的人工啟動子替換染色體野生型啟動子得到增強。本領域?qū)＜抑廊绾螠y定啟動子強度。為了增加基因的表達，它可以是染色體 (chromosomalIy)或染色體外(extrachromosomalIy)編碼的。基因的拷貝可以是染色體或染色體外加入的。在染色體方面(chromosomally)，可以存在在基因組上的一個或幾個額外拷貝，其可以通過本領域技術人員已知的重組方法引入?；蛟谌旧w外方面可以通過不同類型的質(zhì)?；蚣毦斯と旧w攜帶，其就其復制起點而言不同且因此其在細胞中的拷貝數(shù)不同。它們可以作為1-5個拷貝、約20個或高達500個拷貝存在，對應于具有緊密復制的低拷貝數(shù)質(zhì)粒(例如pSClOl、RK2)、低拷貝數(shù)質(zhì)粒(例如pACYC、pRSF1010)或高拷貝數(shù)質(zhì)粒(例如pSKBluescript II)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，sdh基因可以是使用染色體外表達過表達的。在本發(fā)明的這個實施方案中，sdh基因由細菌人工染色體攜帶。酶的表達可以通過穩(wěn)定或去穩(wěn)定相應信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1998,Biotechnol. Prog. 15,58)或蛋白質(zhì)(例如 GST 標簽,Amersham Biosciences)得到加強或減少。根據(jù)本發(fā)明，微生物含有基因的一個或幾個等位基因，其有待根據(jù)本發(fā)明增強。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，微生物攜帶編碼琥珀酸脫氫酶的基因的一個補充性拷貝。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，這些基因在細菌人工染色體PCC1BAC中克隆。在本發(fā)明的另一個實施方案中，微生物含有大腸桿菌的4種基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的一個補充性拷貝。在所述補充性拷貝中的基因可以被組織在操縱子中。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，微生物包含編碼大腸桿菌的琥珀酸脫氫酶的基因的至少一個額外拷貝。在本發(fā)明的描述中，基因和蛋白質(zhì)使用相應基因在大腸桿菌中的命名進行鑒定。然而，且除非另有說明，這些命名的使用根據(jù)本發(fā)明具有更一般的含義，且覆蓋在其他生物更具體而言微生物中的所有相應基因和蛋白質(zhì)。PFAM(比對和隱馬爾可夫模型(hidden Markov models)的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫；http: //www. sanRer. ac. uk/Software/Pfam/)代表蛋白質(zhì)序列比對的大集合。每個PFAM使得能夠顯現(xiàn)多重比對，看見蛋白質(zhì)結(jié)構域，評價在多種生物中的分布，獲得對于其他數(shù)據(jù)庫的訪問，且顯現(xiàn)已知蛋白質(zhì)結(jié)構。COGs (蛋白質(zhì)的肓向同源物組的簾http://www. ncbi. nlm. nih. rov/COG/)通過比較來自代表30個主要種系發(fā)生系的66個完全測序基因組的蛋白質(zhì)序列獲得。每個COG由至少3個系進行定義，其允許鑒定以前保守的結(jié)構域。鑒定同源序列及其同源性百分比的方法是本領域技術人員眾所周知的，并且特別包括BLAST 程序，其可以由網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/使用，使用在那個網(wǎng)站上指示的缺省參數(shù)。獲得的序列隨后可以使用例如程序CLUSTALW(http://www. ebi.ac. uk/clustalw/)或 MULTALIN(http://prodes. toulouse.
inra. fr/multalin/ cgi-bin/multalin. pi)加以利用(例如比對)，使用在那個網(wǎng)站上指示
的缺省參數(shù)。使用在GenBank上對于已知基因給出的參考，本領域技術人員能夠測定其他生物、細菌菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等中的等價基因。這個常規(guī)工作有利地使用共有序列完成，所述共有序列可以這樣測定與衍生自其他微生物的基因執(zhí)行序列比對，并且設計簡并探針以克隆另一種生物中的相應基因。分子生物學的這些常規(guī)方法是本領域技術人員眾所周知的，并且例如在Sambrook等人(1989Molecular Cloning a LaboratoryManual.第 2 版 Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York.)中聲明。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾的微生物可以進一步包含其他修飾以增強甲硫氨酸生產(chǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物另外包含編碼sdh酶的一種或多種基因的增強表達，增強甲硫氨酸生產(chǎn)的另外修飾。用于增加甲硫氨酸生產(chǎn)的修飾是本領域眾所周知的。這些修飾例如在引入本文作為參考的W02009/043803、W02007/077041、W02005/111202中描述。為了改善甲硫氨酸的生產(chǎn)，微生物可以顯示出選自下組的至少一種基因的表達增加 cysP，其編碼周質(zhì)硫酸鹽結(jié)合蛋白，如W02009/043803中描述的， cysU，其編碼硫酸鹽ABC轉(zhuǎn)運蛋白的組分，如W02009/043803中描述的， cysW，其編碼膜結(jié)合的硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，如W02009/043803中描述的， cysA，其編碼硫酸通透酶，如W02009/043803中描述的，*cysM,其編碼 0-乙酰絲氨酸硫化氫解酶(0-acetyl serine sulfhydralase),如W02009/043803 中描述的，*cysl和cysj，分別編碼亞硫酸還原酶的a和0亞基，如W02009/043803中描述的。優(yōu)選地，cysl和cysj是一起過表達的， cysl，其編碼亞硫酸還原酶，a亞基，如W02009/043803中描述的， cysH,其編碼腺苷酰硫酸還原酶，如W02009/043803中描述的， cysE，其編碼絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶，如W02007/077041中描述的， gcvT，其編碼四氫葉酸依賴性氨甲基轉(zhuǎn)移酶，如W02009/043803中描述的， gcvH，其通過編碼氨乙基的載體涉及甘氨酸切割，如W02009/043803中描述的， gcvP，其編碼甘氨酸脫氫酶，如W02009/043803中描述的， Ipd,其編碼硫辛酰胺脫氫酶，如W02009/043803中描述的， serA，其編碼磷酸甘油酸脫氫酶，如專利申請W02009/043803中描述的， serB，其編碼磷酸絲氨酸磷酸化酶，如專利申請W02009/043803中描述的， serC，其編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，如專利申請W02009/043803中描述的， glyA，其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，如W02009/043803中描述的， metF，其編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，如W02007/077041中描述的， metA等位基因，其編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，對于S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性，如W02005/111202中描述的， thrA或thrA等位基因，其編碼天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶，對于蘇氨酸具有減少的反饋抑制，如W02009/043803中描述的，
metH,其編碼B12依賴性高半胱氨酸_N5_甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶，如W02007/077041 中描述的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，微生 物可以顯示出下述基因中的至少一種的表達的抑制 pykA，其編碼丙酮酸激酶，如W02009/043803中描述的， pykF，其編碼丙酮酸激酶，如W02009/043803中描述的， purU，其編碼甲酰四氫葉酸脫甲酰酶，如W02009/043803中描述的， metJ，其編碼甲硫氨酸阻遏物，如JP 2000/157267中描述的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以使用編碼具有經(jīng)修飾的反饋抑制性質(zhì)的酶的下述經(jīng)修飾的基因-metA突變體，其編碼對于甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性的酶，如W02005108561中描述的 thrA突變體，對于蘇氨酸具有減少的反饋敏感性，如W02005108561中描述的。根據(jù)本發(fā)明，微生物可以通過使用改變的metB等位基因進一步修飾用于增加甲硫氨酸生產(chǎn)，所述metB等位基因優(yōu)選或?qū)Ｒ坏厥褂肏2S用于自0-琥拍酰高絲氨酸生產(chǎn)高半胱氨酸，如引入本文作為參考的專利申請W02004/076659中描述的。上文公開的涉及甲硫氨酸生產(chǎn)的所有專利和專利申請引入本文作為參考。術語減弱的表達、阻遏的表達或減弱、抑制在正文中可互換使用，并且具有相似含義。在這個背景中，該術語指示基因表達的部分或完全抑制，則稱其是“減弱的”。這種表達抑制可以是基因表達的抑制、基因表達所需的啟動子區(qū)全部或部分的缺失、基因編碼區(qū)中的缺失、或野生型啟動子由更弱的天然或合成啟動子的交換。優(yōu)選地，基因的減弱基本上是那種基因的完全缺失，其可以由選擇標記基因替換，所述選擇標記基因促進菌株的鑒定、分離和純化。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，經(jīng)修飾的微生物過表達選自下組的至少一種基因cysP> cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA、metF、metA (具有減少的反饋敏感性)、thrA 和 metH。在本發(fā)明的另一個實施方案中，經(jīng)修飾的微生物具有選自由pykA、pykF、metj和purU組成的組中的至少一種基因的減弱表達。在本發(fā)明的另一個實施方案中，經(jīng)修飾的微生物過表達選自下組的至少一種基因cysP> cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA、metF、metA(具有減少的反饋敏感性)、thrA(優(yōu)選具有減少的反饋敏感性)和metH,并且阻遏選自由pykA、pykF、metJ和purU組成的組中的至少一種基因。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，微生物過表達基因cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE gcvT、gcvH、gcvP、metF met A (具有減少的反饋敏感性)、thrA(優(yōu)選具有減少的反饋敏感性)和metH.、serA、serB、serC、glyA,并且阻遏基因pykA、pykF、met J 和 purU。本領域技術人員將知道其他基因可能需要修飾，以最佳化甲硫氨酸生產(chǎn)。這些基因已在引入本文作為參考的W02007/077041和W02007/020295中特別加以鑒定。培養(yǎng)基
在本發(fā)明的方法中，將經(jīng)修飾的微生物在包含碳源和硫源的合適培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?！线m培養(yǎng)基’是適合于微生物培養(yǎng)和生長的培養(yǎng)基。此類培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵領域技術人員眾所周知的，取決于待培養(yǎng)的微生物。根據(jù)本發(fā)明，術語‘碳源’指示可 以由本領域技術人員使用以支持微生物的正常生長的任何碳的來源，其可以是己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、單糖、二糖、寡糖(例如蔗糖、纖維二糖或麥芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纖維素、甘油及其組合。特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄糖。另一種優(yōu)選的簡單碳源是蔗糖。用于L-甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)的硫源可以是下述中的任何硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、連二硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽、甲硫醇、二甲基二硫化物或其組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，硫源是硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。氮源可以是銨鹽或氨氣。甲硫氨酸的改善生產(chǎn)在本發(fā)明中，甲硫氨酸/碳源得率通過增強編碼琥珀酸脫氫酶的基因表達得到增力口。術語“甲硫氨酸/碳源得率”定義在發(fā)酵過程中獲得的甲硫氨酸數(shù)量除以已消耗的碳源數(shù)量。它可以以百分比g甲硫氨酸/g碳源或mol甲硫氨酸/mol碳源表示。術語“增強的”在這個背景中描述與不含指定修飾的微生物和/或不含修飾的培養(yǎng)基相比較可測量的增加。在優(yōu)選的實施方案中，增加是至少l%g/g、優(yōu)選至少2%g/g、更優(yōu)選4%。為了測量這種增加，必須測定消耗的葡萄糖和生產(chǎn)的甲硫氨酸的量。通過折射HPLC(refractrometric HPLC)或根據(jù)用于分批補料溶液的白利糖度(Brix)法,通過測定在生長培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度計算已消耗的碳源的數(shù)量。對于分批培養(yǎng)物，消耗的葡萄糖對應于從其中扣除在實驗結(jié)束時殘留葡萄糖的量的在實驗開始時殘留葡萄糖的量。對于分批補料發(fā)酵，消耗的葡萄糖的量對應于分批培養(yǎng)物中的葡萄糖、接種物中加入的葡萄糖和在分批補料階段過程中注入的葡萄糖的量的總和，從其中扣除在實驗結(jié)束時殘留葡萄糖的量。術語“獲得的甲硫氨酸”包括L-甲硫氨酸和可容易回收的甲硫氨酸衍生物NAM。在培養(yǎng)基中獲得的甲硫氨酸的數(shù)量在OPA/Fmoc衍生化后通過HPLC進行測量，使用L-甲硫氨酸(Fluka，Ref 64319)作為標準。NAM的量使用折射HPLC進行測定，使用NAM(Sigma，Ref01310)作為標準。甲硫氨酸回收在發(fā)酵后，回收且最終純化L-甲硫氨酸、其前體或其衍生的化合物例如N-乙酰甲硫氨酸。用于回收且純化所生產(chǎn)化合物的方法對于技術人員是眾所周知的。(W02005/007862,WO 2005/059155)。
實施例實施例I :MG1655metA*l lPtrc-metH PtrcF-cysPUffAMPtrcF-cys JIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36_ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)和 MG1655metA*llPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*I-cysE-PgapA-metA*11)(pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)甲硫氨酸生產(chǎn)菌種已在引入本文作為參 考的專利申請W02009043803、W02007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述。I.載體 pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC 的構建為了增加在甲硫氨酸生產(chǎn)菌株中琥珀酸脫氫酶SdhCDAB的水平，4種基因sdhCDAB 與其自身啟動子一起在拷貝控制載體pCC lBAC-serB-glyA-serA-serC(具有來自Epicentre的pCClBAC載體)先前在專利申請W02009043803中描述)中克隆。為了這個目的，使用寡核苷酸sdhCDAB-F和sdhCDAB-IT02-R (在網(wǎng)站http//ecogene.org/ h的參考序列)，從MG1655大腸桿菌基因組中擴增sdhCDAB_TT02區(qū)域，具有作為大腸桿菌的rrnB基因的T1轉(zhuǎn)錄終止子的TT02 (Orosz等人，1991, Eur. J. Biochem. 201,653)。將所得到的PCR產(chǎn)物克隆到pSCB載體(Stratagene)中，通過測序加以驗證，并且將載體命名為 pSCB-sdhCDAB-TT02。sdhCDAB-FatgcgtGCATGCatctGGCGCCGAATTGGTCAATACTTCCACACTGTTAC具有-含額外堿基的區(qū)域(小寫情況)，-具有SphI和SfoI位點的區(qū)域(大寫加下劃線的情況)，-與sdhCDAB區(qū)域(從753931到753958)同源的區(qū)域(大寫粗體情況)sdhCDAB-TT02-RaagcgctGCATGCAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGTTTACGCATTACGTTGCAACAACATCG具有-含額外堿基的區(qū)域(小寫情況)，-具有SphI位點的區(qū)域(大寫加下劃線的情況)，-關于TT02序列的區(qū)域(大寫斜體情況)，所述TT02序列對應于大腸桿菌的rrnB基因的T1轉(zhuǎn)錄終止子序列，-與sdhCDAB區(qū)域(從757603到757629)同源的區(qū)域(大寫粗體情況)。為了將sdhCDAB_TT02基因轉(zhuǎn)移到載體pCClBAC中，用酶SphI限制性切割載體pSCB-sdhCDAB-TT02，并且將sdhCDAB_TT02區(qū)域克隆到受相同酶限制性切割的載體pCClBAC-serB-glyA-serA-serC 內(nèi)。將所得到的載體命名為 pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA—serA—serC。2 .菌株 MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ A pykF DpykA A purU(pME101-thrA*I-cy sE-P gapA-me tA*11)(pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)的構建隨后，通過電穿孔將質(zhì)粒pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll (先前在專利申請 TO2007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述)和 pCClBAC-sdhCDAB-IT02-serB-glyA-serA-serC 引入菌株 MG1655 metA*l lPtrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF A metJ A pykF DpykA A purU,得到菌株MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7-metF AmetJ A pykF DpykA A purU(pMElOl-thrA^l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)。3.菌株 M GI 6 5 5 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-merF Ametj ApykF DpykA A purU (pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll) (pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)的構建
通過電穿孔將質(zhì)粒pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll (先前在專利申請W02007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述)和 pCC lBAC-serB-glyA-serA-serC(先前在專利申請 W02009043803 中描述)引入菌株 MG1655 metA*lIPtrcietH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykFDpykA ApurU，得到菌株 MG1655 metA*llPtrc_metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7_metF AmetJ A pykF DpykA A purU(pME101-thr A*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCC IBAC-serB-glyA-serA-serC)。實施例2.菌株的評價菌株I M G I 6 5 5 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-TT07-glyA-serA-serC) o菌株 2 M G I 6 5 5 metA^l lPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)。生產(chǎn)菌株在小錐形瓶中進行評價。將5. 5mL預培養(yǎng)物在37°C在混合培養(yǎng)基(具有2. 5g. L—1葡萄糖的10%LB培養(yǎng)基(Sigma 25%)和90%基本培養(yǎng)基PC I)中生長16小時。將它用于接種50mL培養(yǎng)物至在培養(yǎng)基PCl中0.2的0D6。。。如果需要的話，將壯觀霉素和卡那霉素加入至50mg. L—1的終濃度和氯霉素至30mg. L—1的終濃度。培養(yǎng)物的溫度是37°C。當培養(yǎng)物已達到5 - 7的0D_時，在OPA/Fmoc衍生化后通過HPLC定量細胞外氨基酸，并且使用HPLC伴隨折射計檢測(有機酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS，來分析其他相關代謝產(chǎn)物。對于每種菌株，進行3次重復。表I :基本培養(yǎng)基組成(PCl)。
化合物濃度(g. L'1)^
ZnSO4. 7H200. 0040
CuCl2. 2H200. 0020
MnSO4. H2O0. 0200
CoCl2. 6H200. 0080
權利要求
1.一種用于在發(fā)酵工藝中生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，其包括下述步驟 -在包含碳源和硫源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)修飾用于甲硫氨酸的改善生產(chǎn)的微生物，和 -從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸， 其中所述微生物通過增強編碼琥珀酸脫氫酶的基因的表達來進一步修飾。
2.權利要求I的方法，其中所述琥珀酸脫氫酶包含至少三個亞基，每個亞基由一種基因編碼，所述基因各自的表達是增強的。
3.權利要求I或2的方法，其中所述編碼琥珀酸脫氫酶的基因的增強表達是通過將所 述基因的至少一個補充性拷貝插入所述微生物內(nèi)實現(xiàn)的。
4.權利要求I-3的方法，其中所述sdh基因的增強表達是通過將大腸桿菌的四種基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的至少一個補充性拷貝插入所述微生物內(nèi)實現(xiàn)的。
5.權利要求I- 4的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述硫源是硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、連二硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽或所述不同來源的組合。
6.權利要求I- 5的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
7.權利要求I- 6的方法，其包括從所述培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸的步驟。
8.權利要求I- 7的方法，其中所述微生物選自由細菌、酵母和真菌組成的組。
9.一種經(jīng)修飾用于在合適培養(yǎng)基中甲硫氨酸的改善生產(chǎn)的微生物，其中所述微生物通過增強編碼琥珀酸脫氫酶的基因的表達來進一步修飾。
10.權利要求9的微生物，其中所述琥珀酸脫氫酶包含至少三個亞基，每個亞基由一種基因編碼，所述基因各自的表達是增強的。
11.權利要求9或10的微生物，其中所述編碼琥珀酸脫氫酶的基因的增強表達是通過將所述基因的至少一個補充性拷貝插入所述微生物內(nèi)實現(xiàn)的。
12.權利要求11的微生物，其中所述sdh基因的增強表達是通過將大腸桿菌的四種基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的至少一個補充性拷貝插入所述微生物內(nèi)實現(xiàn)的。
13.權利要求12的微生物，其包含來自大腸桿菌的sdh操縱子的另外拷貝。
14.權利要求8- 13中任一項的微生物，其中所述微生物是選自下組的細菌腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和棒狀桿菌形細菌(Coryneform bacteria)。
15.權利要求14的微生物，其中所述微生物選自由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌(C. glutamicum)組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)經(jīng)修飾用于增強涉及琥珀酸脫氫酶合成的基因表達的微生物用于改善甲硫氨酸生產(chǎn)的工藝。微生物以增加甲硫氨酸/碳源得率的方式進行修飾。還請求保護從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸。
文檔編號C12P13/12GK102712941SQ200980163237
公開日2012年10月3日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權日2009年12月30日
發(fā)明者R.菲格 申請人:代謝探索者公司