專利名稱：表達人源化抗體的非人轉基因動物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用轉基因非人哺乳動物響應抗原攻擊而衍生和選擇各種功能性親和力成熟四聚體免疫球蛋白(包含重鏈和輕鏈)庫的改進方法及其用途。具體地講，本發(fā)明涉及經(jīng)過工程改造使得其產(chǎn)生小鼠內(nèi)源κ和/或λ輕鏈免疫球蛋白的能力大大降低或者輕鏈與重鏈復合的能力降低、消除或被阻斷的非人哺乳動物， 優(yōu)選小鼠。本發(fā)明的非人哺乳動物產(chǎn)生小鼠功能性內(nèi)源重鏈的能力也下降。因此，其形成包含由所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力已大大降低或消除。本發(fā)明還披露了產(chǎn)生這類哺乳動物的方法以及利用這類哺乳動物使用免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因產(chǎn)生人四聚體抗體和雜交四聚體抗體的方法。在下面的說明中，所有氨基酸殘基的位置號根據(jù)由Kabat等人((1991)，美國公共衛(wèi)生署(US Public Health Services)出版物第91-3242號)設計的編號系統(tǒng)給出。
背景技術：
抗體抗體的結構是本領域眾所周知的。大多數(shù)天然抗體是四聚體，包含2條重鏈和2 條輕鏈。重鏈通過大致位于每條重鏈中部的鉸鏈結構域之間的二硫鍵彼此連接。輕鏈在鉸鏈結構域的N端側與各重鏈締合。每條輕鏈通常通過接近鉸鏈結構域的二硫鍵與其對應的重鏈結合。當抗體分子正確折疊時，每條鏈折疊成許多通過較為線性的多肽序列連接的獨特的球狀結構域。例如，輕鏈折疊成可變(\)結構域和恒定(Ck或(^)結構域。重鏈具有單個可變結構域Vh、第一恒定結構域(ChI)、鉸鏈結構域和兩個或三個另外的恒定結構域。重鏈的恒定結構域和鉸鏈結構域一起形成通常所稱的抗體重鏈恒定區(qū)。重(Vh)鏈和輕鏈可變結構域的相互作用導致形成抗原結合區(qū)(Fv)。重鏈的ChI結構域和輕鏈的Ck或。 結構域有利于重鏈和輕鏈的相互作用。一般而言，抗原結合既需要Vh又需要\，但研究已表明重鏈二聚體和氨基端片段在輕鏈不存在時保持活性(Jaton等(1968)Biochemistry， 7,4185-41卯)。通常循環(huán)λ輕鏈的比例低下，可能占血漿中復合成四聚體免疫球蛋白的全部輕鏈的 2-5% (Goldsby 等 Q003) Immunology，第 5 版，W. H. Freeman & Co NY)。體外操縱重鏈免疫球蛋白基因以構建新的抗體最早披露于二十世紀八十年代。 大多數(shù)早期抗體工程研究使用針對充分表征的抗原產(chǎn)生的重排小鼠免疫球蛋白μ基因 (IgM)。該抗體的特征是已知存在于Vh結構域的抗原結合特異性，因為不相關輕鏈的裝配和分泌顯示保持抗原結合(Neuberger 和 Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond.，A317， 425-432)。使用該系統(tǒng)顯示，可使用小鼠抗原特異性Vh結合結構域獲得包含與小鼠抗原特異性Vh結構域融合的人ε恒定效應子區(qū)的新抗體。所得雜交IgE保持抗原特異性，并顯示 IgE的預期效應子活性(Neuberger等(198 Nature，314，268-270)。重鏈工程的其它文獻實例包括編碼保持抗磷酸膽堿活性的小鼠Vh人/IgA或IgG抗體融合體的雜交小鼠-人抗體基因(Morrison等(1984)PNAS, 81,6851-6855)；包含小鼠Vh和人IgG( γ 3)恒定區(qū)的抗癌相關抗原17-1Α抗體(Sun等(1987) PNAS，84，214-218)；以及包含人IgG ( γ 1)恒定區(qū)和小鼠Vh結構域的抗人T細胞抗體(抗CD7)(參見Heinrich等(1989) J. Immunol.，143， 3589-97)。正常人B細胞在14號染色體上含有單個免疫球蛋白重鏈基因座，通過重排從中產(chǎn)生編碼重鏈的基因。在小鼠中，重鏈基因座位于12號染色體上。正常的重鏈基因座包含多個V基因區(qū)段、許多D基因區(qū)段和許多J基因區(qū)段。大多數(shù)Vh結構域由V基因區(qū)段編碼， 但是每個Vh結構域的C末端由D基因區(qū)段和J基因區(qū)段編碼。VDJ在B細胞中重排，接著親和力成熟，為每個Vh結構域提供其抗原結合特異性。對從包含單個V區(qū)段的重鏈免疫球蛋白得到的正常H2L2四聚體進行的序列分析表明，響應抗原攻擊的多樣性主要由VDJ重排和體細胞高變的組合引起(Xu和DaviesQOOO) Immunity，13，37-45)。超過50個的人V基因區(qū)段存在于人基因組中，其中只有39個具有功能。在正常的二倍體產(chǎn)抗體B細胞中，各細胞從一組重鏈和輕鏈抗體基因座產(chǎn)生抗體四聚體(H2L2)。由于稱為等位基因排斥的過程所致，另一組基因座的使用是非生產(chǎn)性的(Singh等(2003) J.Exp· Med.，197，743-750及其中的參考文獻)?，F(xiàn)可從響應抗原攻擊的轉基因小鼠中得到全人抗體(H2L2)。這類轉基因小鼠一般包含單個人重鏈免疫球蛋白基因座和分離的人輕鏈免疫球蛋白基因座。相應的內(nèi)源小鼠重鏈、κ輕鏈和任選λ輕鏈基因座編碼序列缺失或部分缺失。因此，在低本底的包含人重鏈和小鼠λ輕鏈的小鼠/人抗體的情況下只產(chǎn)生包含κ輕鏈的人抗體(W090/04036; W093/12227 ；W098/24893 ；US5877397、US5814318 和 US6162963)。已實現(xiàn)缺失所有內(nèi)源鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因的區(qū)段以完全排除內(nèi)源重鏈和輕鏈基因的表達，但技術上的難度仍然存在，特別是如果剔除所有λ輕鏈編碼序列被認為是必需的。已經(jīng)通過完全缺失所有功能性V和J基因區(qū)段以及λ基因座的Cl、C2和C3恒定區(qū)而達到剔除鼠λ輕鏈編碼序列，產(chǎn)生具有沉默λ輕鏈基因座的小鼠(參見EP 1399559)。一種不同的方法是通過破壞編碼鼠重鏈的基因的膜外顯子(membrane exon)來限制小鼠B細胞發(fā)育和免疫球蛋白分泌。因此，雖然內(nèi)源鼠重鏈基因由于在響應抗原攻擊時被轉錄并進行VDJ重排而具有功能，但是因為IgM從不在前B細胞的細胞表面上表達，所以進一步的發(fā)育受到抑制，導致對抗原攻擊非生產(chǎn)性的應答(Kitamura等(1991)Nature， 350,423-4 )，即使內(nèi)源小鼠κ和λ輕鏈基因兩者仍保持結構完整和功能性也是如此 (Tuaillon(2000)Molecular Immunology,37,221-231)。在內(nèi)源小鼠重鏈和輕鏈基因座保持功能的情況下，任何其它引入的免疫球蛋白重鏈轉基因也受等位基因排斥的調(diào)節(jié)，因此一些B細胞只功能性表達小鼠重鏈和輕鏈基因座，而其它B細胞只功能性表達人重鏈基因座和小鼠輕鏈基因座(Nussenzweig等(1987) Science, 236，816-819)。在任何單個非人轉基因動物中存在高度多樣化的表達抗體的B細胞群，所述抗體響應不同抗原攻擊而來源于可能所有免疫球蛋白基因座。采用已確立的雜交瘤技術，利用HAT選擇進行隨后的抗原特異性抗體的選擇(Davis等(1982) J. Immunol. Methods, 50,161-171)無法區(qū)分表達一種重鏈免疫球蛋白基因座的雜交瘤與表達另一種重鏈免疫球蛋白基因座的雜交瘤。免疫球蛋白重鏈轉基因中存在的調(diào)節(jié)元件包含必需的組織特異性增強子元件以確保以拷貝數(shù)依賴性方式進行B細胞特異性表達。5’內(nèi)含增強子和3’ LCR的存在確保了轉基因在B細胞成熟的所有階段都有活性(Guglielmi等Biochim. Biophys. Acta，1642，181-190)。在轉基因座中加入重鏈和輕鏈特異性LCR確保不僅表達是B細胞特異性的，而且不論整合入基因組的位點都進行表達(W090/10077, Mills等(1997) J. Exp. Med.， 186，845-858 和 Pettersson 等(1997) Immunobiol.，198，236-248))。因此，假若存在 LCR， 則每個轉基因不論其在基因組中的位置都具有功能。在存在于轉基因的LCR部分缺失的情況下，轉基因周圍的染色質在任何時間點只是部分對轉錄開放，導致位置效應鑲嵌表達(mosaic expression)，因此轉基因跨靶組織的表達水平受限(Festenstein等(1996) Science,23,271 (5252) :1123-5 ；Milot 等(1996)Cell,87(1)，105-14)。在小鼠背景中產(chǎn)生人免疫球蛋白的備選方法是用人的同源基因區(qū)段置換鼠免疫球蛋白基因區(qū)段。因此，如果只是小鼠V、D和J基因區(qū)段被人同源物置換，則在抗原攻擊后可形成包含人結構域和小鼠恒定(效應子)區(qū)的功能性小鼠/人雜交抗體 (W094/04667)。如果所有鼠基因區(qū)段都被人同源物置換，則在抗原攻擊后將產(chǎn)生完整的人免疫球蛋白(US6596541)。觀察到該方法的一個優(yōu)勢是，如果只交換編碼區(qū)，則所得到的轉基因保留所有小鼠調(diào)節(jié)元件，從而確保了對抗原攻擊的最大程度的應答。該方法根據(jù)轉基因的最終結構，提供高血清效價的高親和力人抗體或小鼠/人雜交抗體。然而，實際上，通過同源重組置換小鼠基因組中所有單獨的V、D和J區(qū)段是一項長時間的艱巨任務。同樣， 構建包含所有39個功能性人V、D和J區(qū)段與恒定(效應子)區(qū)的重鏈轉基因在技術上非常費力。因此，在本領域中仍需要不依賴于基因組DNA大量區(qū)段缺失或多重缺失的方法， 這允許(i)簡化小鼠的產(chǎn)生，該小鼠在響應抗原攻擊時以B細胞特異性的方式表達內(nèi)源重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因的能力大大降低，或者在抗原攻擊后在B細胞中表達內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈基因，但是編碼缺乏裝配成為功能性免疫球蛋白四聚體的能力的免疫球蛋白重鏈和輕鏈蛋白，導致對抗原攻擊的非生產(chǎn)性應答；(ii)用于構建并B細胞特異性表達多個重鏈轉基因座的可再現(xiàn)的簡化方法，所述重鏈轉基因座盡管可總共包含所有39 個人V基因區(qū)段，但各自包含優(yōu)選的較小的V基因區(qū)段群，各與所有D和J基因區(qū)段以及一些或全部恒定(效應子)區(qū)組合，其功能性表達是抗原依賴性的，并且最終由等位基因排斥確定；以及(iii)具有這樣的能力選擇排除表達殘余內(nèi)源小鼠免疫球蛋白的雜交瘤，并選出表達和分泌裝配的包含存在于重鏈轉基因座上的完整V區(qū)段庫的免疫球蛋白四聚體的雜交瘤，或者選出表達存在于與另一重鏈轉基因座相對的重鏈轉基因座上的一亞組V基因區(qū)段的雜交瘤。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明第一個方面，提供含有內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座的非人哺乳動物，每個基因座可重排使得在抗原攻擊后在B細胞中形成并表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是所述基因座已經(jīng)突變使得形成包含從所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力已大大降低或消除。在非人哺乳動物中，可通過將移碼突變、多肽編碼序列和/或一個或多個終止密碼子引入某內(nèi)源基因座或各內(nèi)源基因座中，使內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座的至少一個已發(fā)生突變。突變優(yōu)選為插入小于50個核苷酸。在非人哺乳動物中，可通過剔除某基因座或各基因座的部分或全部LCR，使內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座的至少一個的表達已大大減少。優(yōu)選引入位于內(nèi)源κ輕鏈基因座上。備選地，引入位于內(nèi)源λ輕鏈基因座上。在另一備選中，引入位于內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源λ輕鏈基因座上。引入還可位于內(nèi)源重鏈基因座上。在進一步的備選中，引入可位于內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。在又進一步的備選中，引入可位于內(nèi)源λ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。在更進一步的備選中，引入可位于內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。優(yōu)選在內(nèi)源κ輕鏈基因座上有如上限定的引入，并且在內(nèi)源λ基因座上有部分或完整的如上限定的LCR缺失。如有需要，可使內(nèi)源重鏈基因座突變，使得發(fā)生重鏈基因重排、mRNA轉錄和蛋白質合成，但是阻斷B細胞活化。優(yōu)選如上定義的非人哺乳動物包含含有一個或多個異源κ輕鏈基因座和相關B 細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。非人哺乳動物還可包含含有一個或多個異源λ輕鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。在如上定義的非人哺乳動物中，含有異源輕鏈基因座的轉基因可包含顯性選擇標記基因。如上定義的非人哺乳動物還可包含含有一個或多個異源重鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。如有需要，非人哺乳動物可包含兩個或更多個含有兩個或更多個不同的異源重鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。在非人哺乳動物中，含有異源重鏈基因座的某轉基因或每個轉基因可包含顯性選擇標記基因。在非人哺乳動物中，每個異源重鏈基因座可包含CTCF結合位點。優(yōu)選非人哺乳動物包含含有異源κ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。備選地，非人哺乳動物可包含含有異源λ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。在進一步的備選中，非人哺乳動物可包含含有異源κ輕鏈基因座的轉基因、含有 λ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。優(yōu)選每個異源基因座整合了關聯(lián)LCR。每個異源基因座優(yōu)選為人基因座。然而，每個異源基因座可以是包含來源于多于一種物種的可變區(qū)和恒定區(qū)的雜交基因座，例如包含人可變區(qū)和大鼠或鼠恒定區(qū)的雜交基因座。非人哺乳動物可包含含有不同群的不同異源重鏈基因座的轉基因群，其中每個轉基因群包含不同的顯性選擇標記基因。備選地，非人哺乳動物可包含含有異源輕鏈基因座的轉基因和含有異源重鏈基因座的轉基因，其中含有異源輕鏈基因座的轉基因和含有異源重鏈基因座的轉基因各自包含不同的顯性選擇標記基因。非人哺乳動物優(yōu)選為嚙齒動物，例如小鼠。按照第二個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生抗原特異性異源單克隆抗體的方法，所述方法包括(a)用抗原對前述權利要求中任一項的非人轉基因哺乳動物進行免疫；(b)從免疫的轉基因哺乳動物的B細胞制備分別產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；(c)任選地，通過使用存在于包含異源免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因座的轉基因上的顯性選擇標記基因來選擇至少一種表達異源抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；以及(d)選擇至少一種產(chǎn)生與抗原特異性結合的抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系。按照本發(fā)明又一個方面，提供由雜交抗體得到哺乳動物(優(yōu)選人)的抗體的方法， 所述方法包括(a)進行上述方法；(b)選擇至少一種產(chǎn)生特異性結合抗原并包含選定物種的Vh和\結合結構域的抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；(c)對Vh和Vl結構域進行克隆和測序；(d)使選出的包含Vh和\結合結構域編碼序列的序列與來自同一物種的選定的恒定效應子結構域再克隆；和(e)在選定的細胞類型中使用表達載體共表達再克隆的編碼所需物種的重鏈和輕鏈多肽的序列。按照本發(fā)明又一個方面，提供用于產(chǎn)生如上定義的非人哺乳動物的方法，所述方法包括使哺乳動物祖細胞中的內(nèi)源重鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和任選內(nèi)源λ輕鏈基因座突變，并由所述祖細胞產(chǎn)生哺乳動物，其中突變使得在哺乳動物中，每個基因座可以重排，使得在抗原攻擊后在B細胞中形成并表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是形成包含由所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力已大大降低或消除。優(yōu)選祖細胞為非人胚胎干細胞。非人哺乳動物優(yōu)選為嚙齒動物，例如小鼠。本發(fā)明還提供使用如上定義的非人哺乳動物或方法得到的優(yōu)選人的抗原特異性異源功能性免疫球蛋白四聚體作為藥物、診斷劑或試劑的用途。本發(fā)明的發(fā)明人通過開發(fā)用于產(chǎn)生非人哺乳動物(特別是小鼠)的簡化方法，預料不到地克服了現(xiàn)有技術的局限，其中通過由優(yōu)選在κ恒定區(qū)和/或λ恒定區(qū)中導致移碼或mRNA翻譯過早終止的小插入事件引起恒定區(qū)非功能性，或者通過部分或全部剔除關聯(lián)內(nèi)源LCR，使內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因的功能性表達大大減少。這與需要通過完全或部分缺失一些或所有輕鏈基因編碼序列而使內(nèi)源免疫球蛋白輕鏈基因功能性沉默的備選策略截然不同。所述策略同樣可很好地應用于免疫球蛋白重鏈基因座。因此，例如，LCR的完全或部分缺失將引起重鏈基因表達大大減少。優(yōu)選在μ C區(qū)的ChI結構域，但備選在所有免疫球蛋白同種型恒定區(qū)的ChI區(qū)中引入導致移碼或mRNA翻譯過早終止的序列，將大大減少、 消除或阻斷與輕鏈形成免疫球蛋白四聚體。同樣，如前所述，如果通過mRNA翻譯的過早終止體內(nèi)阻斷IgM在前B細胞的細胞表面上的表達，則抑制進一步的發(fā)育，導致對抗原攻擊的非生產(chǎn)性應答(Kitamura等(1991)Nature，350，423-似6)。引入重鏈免疫球蛋白轉基因拯救了 B細胞膨脹，包含轉基因編碼的重鏈和內(nèi)源鼠輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體在血漿中循環(huán)。因此，內(nèi)源輕鏈基因座和/或重鏈基因座產(chǎn)生相互作用并形成功能性免疫球蛋白四聚體的重鏈和輕鏈的能力在引入移碼突變后可消除或大大降低，因為移碼突變導致無關蛋白序列的合成，并一般伴有由存在異讀框終止密碼子引起的蛋白質合成過早終止。這可通過在負責形成功能性免疫球蛋白四聚體的重鏈或輕鏈多肽序列中或上游插入外源DNA或者少量缺失DNA來實現(xiàn)。優(yōu)選的方法是插入新的序列。所設計的在氨基酸編碼序列中引起移碼、導致編碼mRNA的翻譯過早終止的有效插入事件，可限于單個核苷酸的引入。因此，編碼區(qū)內(nèi)插入一個或多個核苷酸(nucleocleotide)可導致移碼。備選地，編碼其它肽且包含終止密碼子的序列的框內(nèi)插入也將導致截短蛋白的合成(US5591669)。靶向插入事件也可包括引入選擇標記基因和其它功能體，條件是保留所有內(nèi)源序列，且所得融合蛋白破壞免疫球蛋白四聚體的形成，或者一個或多個框內(nèi)終止密碼子的存在引起mRNA 翻譯的過早終止，導致不能形成功能性免疫球蛋白四聚體的截短蛋白的合成。優(yōu)選插入事件位于免疫球蛋白κ輕鏈恒定區(qū)。任選插入事件位于免疫球蛋白κ 和/或λ輕鏈恒定區(qū)。實際上，插入可包含任何重組酶識別位點，例如Iox位點。僅此就可導致移碼。加入確保移碼的其它核苷酸或者一個或多個終止密碼子的密碼子，也可提高插入序列在破壞重鏈和輕鏈通過重鏈C0I結構域與輕鏈κ和/或λ恒定區(qū)的相互作用二聚化方面的效果。插入可包含單個核苷酸，優(yōu)選少于50個核苷酸。插入可以僅導致移碼， 但優(yōu)選設計為使得一個或多個終止密碼子引起mRNA翻譯過早終止。通過利用鄰接插入位點的支臂的同源重組進行插入。優(yōu)選在操作過程中，加入選擇標記，然后接著切割，只留下識別位點和基因組中原位插入的任何其它序列，例如Iox位點。對于本領域技術人員顯而易見的是，移碼和截短蛋白的合成還可通過在編碼序列中缺失一個或多個核苷酸以及加入包含終止密碼子的最小添加序列來實現(xiàn)。優(yōu)選插入或缺失事件發(fā)生在重鏈和輕鏈基因的恒定區(qū)，而不發(fā)生在內(nèi)源基因座的多個V、D和J區(qū)。優(yōu)選的選擇是κ輕鏈恒定區(qū)。因此，對于消除內(nèi)源免疫球蛋白基因重排或mRNA轉錄，不依賴大規(guī)?；蛉笔У牟呗?。相同的插入策略可用來通過重鏈同種型ChI區(qū)內(nèi)的目標插入事件而抑制內(nèi)源重鏈免疫球蛋白與輕鏈形成功能性四聚體復合物的能力。優(yōu)選采用與Kitamura等人(Kitamura 等(1991)Nature，350，423-426)所述的類似策略，在前B細胞階段阻斷內(nèi)源免疫球蛋白重鏈基因的表達，使得內(nèi)源重鏈不在B細胞表面上表達，并且阻斷由B細胞膨脹引起的生產(chǎn)性表達(productive expression)，同時，輕鏈與內(nèi)源IgM的功能性ChI的締合通過插入事件抑制，該插入事件導致翻譯編碼無法與免疫球蛋白重鏈進行功能性相互作用的輕鏈恒定區(qū)的κ和/或λ輕鏈mRNA，從而防止功能性內(nèi)源免疫球蛋白四聚體形成。假若內(nèi)源免疫球蛋白四聚體的功能性裝配在功能上受損，則具有Vh結構域的相關親和力成熟的B細胞膨脹將受限于并依賴于外源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的存在和表達。免疫球蛋白轉基因將以B細胞特異性方式參與所選擇的非人哺乳動物宿主的等位基因排斥過程，導致對抗原攻擊的生產(chǎn)性應答、B細胞膨脹和循環(huán)、轉基因編碼的抗原特異性免疫球蛋白四聚體。本發(fā)明還提供非人哺乳動物，其中通過剔除部分或全部λ輕鏈LCR使內(nèi)源λ輕鏈基因表達大大減少，通過剔除部分或全部κ輕鏈LCR使內(nèi)源κ輕鏈基因表達大大減少。 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過剔除部分或全部相關LCR，僅使內(nèi)源κ輕鏈表達大大減少，或者僅使λ輕鏈表達大大減少。內(nèi)源輕鏈基因座可保持功能性，因為它們可以重排，并被轉錄為功能性mRNA， 但是轉錄水平通過剔除一些或全部內(nèi)源LCR功能性而大大降低(W090/10077)。通過在小鼠ES細胞中靶向核酸酶超敏位點的基因，或者在ES細胞不存在時通過使用核移植(Soulter (1998) Nature，394，315-316)或來源于其它哺乳動物物種的iPS細胞(參見 Gottweiss. ^P Minger(2008)Nature Biotechnology,26,271-272)進行克隆，除去LCR功能性。備選地，可通過靶向誘變，例如鋅指核酸酶技術和DNA修復(例如 http://www. sigmaaldrich. com/life-science/functional-genomics-and-rnai/ζ inc-finger-nuclease-technology),實現(xiàn)重鏈或輕鏈的破壞。通過剔除部分或全部κ輕鏈LCR，可使內(nèi)源κ輕鏈基因表達大大減少，而在缺失或插入事件之后，可使λ輕鏈基因在功能上沉默。通過剔除部分或全部λ輕鏈LCR，可使內(nèi)源λ輕鏈基因表達大大減少，而在缺失或插入事件之后，可使κ輕鏈基因在功能上沉默。在LCR剔除或插入事件之后，可使內(nèi)源κ輕鏈基因在功能上沉默。本發(fā)明還提供非人哺乳動物，其中通過剔除部分或全部κ輕鏈LCR和/或剔除部分或全部λ輕鏈LCR，使內(nèi)源κ輕鏈基因表達和內(nèi)源λ輕鏈基因表達的任一種或兩種大大減少。通過剔除部分或全部λ輕鏈LCR，可使內(nèi)源κ基因在功能上沉默且使內(nèi)源λ基因活性大大降低。通過剔除部分或全部κ輕鏈LCR，可使κ輕鏈基因表達大大減少，并且使λ基因表達在功能上沉默?？赏ㄟ^剔除κ鏈LCR而大大減少或者通過缺失或插入事件而在功能上沉默僅內(nèi)源κ輕鏈基因表達。上述內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因表達在功能上沉默或者內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因表達大大減少的非人哺乳動物，其內(nèi)源重鏈基因表達也可減少或在功能上沉默。按照一個實施方案，在本發(fā)明的非人哺乳動物中，內(nèi)源重鏈基因表達在缺失一些或全部包含LCR 的核酸酶超敏位點后減少，或者在缺失或插入事件之后在功能上沉默。優(yōu)選在前B細胞階段阻斷內(nèi)源重鏈基因的表達，使得內(nèi)源重鏈不在B細胞表面上表達，并且采用與Kitamura 等人(Kitamura等(1991) Nature，350，423-426)所述類似的策略，阻斷由B細胞膨脹引起的生產(chǎn)性表達。上述非人哺乳動物另可包含一個或多個包含異源重鏈和輕鏈基因座及相關的B 細胞特異性調(diào)節(jié)元件(優(yōu)選包含關聯(lián)LCR)的轉基因。在本發(fā)明的上下文中，術語“異源(的)”是指對于其所位于的哺乳動物而言不是內(nèi)源的本文所述核苷酸序列或基因座。因此，非人哺乳動物可包含含有異源κ輕鏈基因座和相關的B細胞特異性調(diào)節(jié)元件(優(yōu)選包含LCR)的轉基因和/或含有異源λ輕鏈基因座和相關的B細胞特異性調(diào)節(jié)元件(優(yōu)選包含LCIO的轉基因。關聯(lián)LCR的存在不是B細胞特異性表達所必需的。在基因座內(nèi)包含關聯(lián)LCR確保高水平轉基因表達發(fā)生在每個整合位點，而不依賴于只有一些整合事件偶爾發(fā)生在B細胞中活躍轉錄的染色質區(qū)內(nèi)的隨機整合事件。關聯(lián)LCR的使用顯著減少篩選抗體表達所需要的轉基因動物的數(shù)量，并允許插入多于一個的基因座，確保插入的所有基因座可以B細胞特異性方式按基本正常的水平表達。因此，LCR技術的應用，結合等位基因排斥機制可將內(nèi)源免疫球蛋白基因與多個競爭轉基因區(qū)分開來的出人意料的觀察結果，開啟了包含一個或多個免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因座的轉基因非人哺乳動物的裝配途徑，每個因座的V基因的復雜性比內(nèi)源基因的低，而且與內(nèi)源基因座(l_2Mb)相比，包含相對易處理的DNA斷片 (< 300Kb)以進行體外裝配。例如，可將39個功能性人免疫球蛋白重鏈V基因區(qū)段克隆至兩個或更多個免疫球蛋白重鏈基因座上。每一個可包含不同的V基因區(qū)段，但卻具有共同的D和J基因區(qū)段及恒定(效應子)區(qū)。加入LCR確保了不論基因組內(nèi)的整合位點，每一個都以相同的方式表達。因此，與存在于技術上難以操作的單個大基因片段上的單個更復雜基因相比，以這種方式加入兩個或更多個小基因座提供相同的V基因復雜性。每個異源輕鏈基因座可包含\基因區(qū)段、J基因區(qū)段和輕鏈恒定區(qū)區(qū)段。優(yōu)選\ 和J基因區(qū)段及輕鏈恒定區(qū)區(qū)段來源于同一哺乳動物源，例如嚙齒動物、豬、牛、山羊或綿羊。優(yōu)選來源于人。備選地，異源輕鏈基因座可以是包含哺乳動物源(優(yōu)選人源)的可變結構域和來自不同哺乳動物的恒定(效應子)區(qū)的雜交基因座，該不同哺乳動物例如但不限于小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豬、山羊和牛。如果宿主哺乳動物是小鼠，則優(yōu)選恒定區(qū)來源于嚙齒動物，更優(yōu)選為小鼠或大鼠。這類異源輕鏈基因座包含優(yōu)選僅來自一個物種的\和J區(qū)段和來自另一個物種的輕鏈恒定區(qū)。如果預期雜交κ輕鏈轉基因，則&和J基因區(qū)段優(yōu)選來自提供重鏈V、D和J基因區(qū)段的相同物種，且優(yōu)選來源于人。κ輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)也同樣優(yōu)選來源于同一物種，但是該物種不同于提供可變結構域的物種，并且優(yōu)選來源于嚙齒動物，優(yōu)選來源于大鼠或小鼠。所預期的所有輕鏈轉基因的特征是，在抗原攻擊后，輕鏈以B細胞特異性方式重排，在轉錄和翻譯后，所得輕鏈能夠與在同一 B細胞中產(chǎn)生的轉基因來源的重鏈免疫球蛋白復合。免疫球蛋白四聚體的生產(chǎn)性表達引起B(yǎng)細胞膨脹和轉基因編碼的抗原特異性四價免疫球蛋白復合體在缺乏顯著水平的內(nèi)源免疫球蛋白四聚體時在血清中蓄積。如果內(nèi)源λ輕鏈表達在功能上未受抑制，則可檢測到低水平的包含內(nèi)源λ輕鏈的宿主抗體或雜交抗體。這些可在篩選雜交瘤上清液后棄去。在人中，有36個功能性κ \基因區(qū)段、5個叉基因區(qū)段和一個κ輕鏈恒定區(qū) (http://imRt. cines. fr)。優(yōu)選存在于本發(fā)明非人哺乳動物的轉基因上的異源κ輕鏈基因座包含一個或多個人\基因區(qū)段、所有人1基因區(qū)段和一個人κ輕鏈恒定區(qū)。任選人 κ輕鏈恒定區(qū)可置換為優(yōu)選大鼠或小鼠源的備選哺乳動物κ輕鏈恒定區(qū)。
存在于本發(fā)明非人哺乳動物的轉基因上的異源λ輕鏈基因座優(yōu)選包含鼠XLCR 及人λ輕鏈Vl和V2基因區(qū)段、人λ Jl、J2、J3和J4基因區(qū)段及人λ輕鏈C1、C2、C3和 C4恒定區(qū)區(qū)段(W090/10077和W02003/000737)。任選人λ輕鏈C1、C2、C3和C4恒定區(qū)區(qū)段可置換為優(yōu)選大鼠或小鼠源的備選λ輕鏈恒定區(qū)。存在于本發(fā)明非人哺乳動物的轉基因上的異源重鏈基因座優(yōu)選包含重鏈免疫球蛋白LCR(優(yōu)選為鼠源)、一個或多個人V基因區(qū)段，一個或多個J基因區(qū)段和一個或多個D 基因區(qū)段。優(yōu)選存在10個或更多個不同的人V基因區(qū)段及所有的人J和D基因區(qū)段?；蜃€可包含一個或多個人恒定(效應子)區(qū)，優(yōu)選μ和Y恒定區(qū)。任選人恒定效應子區(qū)可置換為來自其它非人哺乳動物的效應子區(qū)。如果非人哺乳動物宿主是小鼠或大鼠，則優(yōu)選恒定(效應子)區(qū)來源于大鼠或小鼠。與人的相比，小鼠和大鼠B細胞受體復合體(BCR)的跨膜結構域是100%保守的。因此，在抗原攻擊后，包含大鼠恒定(效應子) 區(qū)基因的抗體基因座的小鼠轉基因應發(fā)揮與包含小鼠恒定(效應子)區(qū)基因的基因座一樣良好的作用，并且可優(yōu)于包含人恒定(效應子)區(qū)基因的基因座(De Franco等(1995) Arm. NY Acad. Sci. ,766,195-201) 0轉基因可包含優(yōu)選小鼠或人源的重鏈、κ和λ輕鏈LCR。 在所有哺乳動物物種中起作用的LCR是已知的，并且可替代轉基因的人或小鼠LCR(Li等 (1999)Trends Genet. ，10，403-8)。如果預期產(chǎn)生完整人抗體，則克隆的來源于由雜交瘤表達的雜交抗體的人抗原特異性Vh和\結合結構域可與人恒定重鏈和輕鏈恒定區(qū)融合，因此得到任何種類的完整的人四聚體抗體。作為進一步的改進，每個免疫球蛋白κ和/或λ輕鏈基因座還可包含顯性選擇標記基因。摻入基因座的顯性選擇標記基因可具有相同或不同的作用機制。對于本發(fā)明的目的，可使用任何顯性選擇標記基因，條件是在選擇性或毒性攻擊存在下，該基因的表達為雜交瘤或來源于非人轉基因哺乳動物的轉化B細胞提供選擇性益處。通常，顯性選擇標記基因是原核來源的，并選自賦予有毒藥物抗性的基因，例如嘌呤霉素(Vara等(1986)NAR， 14,4617-4624)、潮霉素(Santerre 等(1984) Gene，30，147-156)和 G418 (Colbere-Garapin 等(1981) 150，1-14)，或者包括這樣的基因其消除對某些營養(yǎng)的需要，使得其表達將有毒物質轉化成必需氨基酸，例如將吲哚轉化為色氨酸或將組氨醇轉化為組氨酸(Hartmarm和 Mulligan, (1988)PNAS，85，8047-8051)。本發(fā)明這個方面的必要條件是，將顯性選擇標記摻入免疫球蛋白輕鏈轉基因座內(nèi)，并且與所需的免疫球蛋白輕鏈等位基因共表達，以確保B細胞特異性表達。備選地，可采用同源重組結合ES細胞或核移植方法，將藥物抗性基因插入內(nèi)源或外源(轉基因)免疫球蛋白基因座(te Riele 等(1992)，PNAS，89，11，5128-5132)。非人哺乳動物還可包含含有異源重鏈基因座和相關B細胞特異性LCR及調(diào)節(jié)元件的轉基因?？纱嬖诙嘤谝粋€的不同轉基因重鏈基因座，各包含LCR和調(diào)節(jié)元件。各包含一個或多個V基因區(qū)段、一個或多個D基因區(qū)段、一個或多個J基因區(qū)段和一個或多個恒定(效應子)區(qū)的重鏈基因座作為轉基因引入，各基因座包含關聯(lián)LCR。各基因座包含驅動B細胞特異性表達所必需的5’和3’調(diào)節(jié)元件。在響應抗原攻擊時，每個重鏈或輕鏈基因座以與內(nèi)源基因座基本相同的方式表達，導致轉基因編碼的抗原特異性親和力成熟的四聚體免疫球蛋白在小鼠血清中循環(huán)。優(yōu)選每個重鏈基因座包含一個或多個V基因區(qū)段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、45、50、60或更多個V基因區(qū)段，其可來源于任何脊椎動物物種，優(yōu)選非人哺乳動物。優(yōu)選不超過20個V基因區(qū)段存在于任何單個重鏈基因座上。在一個實施方案中，每個基因座可只包含一個V基因區(qū)段。在該實施方案的一個備選實施方案中，存在多個V基因區(qū)段，每個V基因區(qū)段不同于所有其它V基因區(qū)段。在這個實施方案中，任一個基因座上的V基因區(qū)段可全部來源于同一物種的生物，例如所有的V 基因區(qū)段可以來源于人。備選地，任一個基因座上的V基因區(qū)段可來源于不同物種的生物， 例如一些V基因區(qū)段來自人，其它則來自綿羊、牛、兔、駱駝(camelid)或甚至鯊魚。在第二個備選實施方案中，每個V基因區(qū)段與所有其它V基因區(qū)段相同。不論存在的V基因區(qū)段數(shù)目和性質，每個基因座上其余的D和J基因區(qū)段可與所有其它基因座上的區(qū)段相同或不同。因此設想非人哺乳動物可含有多個拷貝的重鏈基因座。這具有使在B細胞中發(fā)生生產(chǎn)性重排的可能性最優(yōu)化的優(yōu)勢，因此允許用于抗原識別的免疫球蛋白重鏈的最適產(chǎn)生。在另一個實施方案中，每個基因座包含多個V基因區(qū)段。優(yōu)選V基因區(qū)段來源于人。術語“V基因區(qū)段”涵蓋任何來源于脊椎動物的天然存在的V基因區(qū)段，包括但不限于鯊魚、嚙齒動物、駱駝和人。V基因區(qū)段必須能夠與D基因區(qū)段、J基因區(qū)段和編碼重鏈恒定(效應子)區(qū)的基因區(qū)段重組，以當重排核酸在B細胞中表達時產(chǎn)生能夠與κ或λ 免疫球蛋白輕鏈復合的免疫球蛋白重鏈抗體。V基因區(qū)段在其范圍內(nèi)還包括編碼天然或工程改造的同源物、衍生物或蛋白質片段的任何基因序列，其能夠與D基因區(qū)段、J基因區(qū)段和編碼重鏈恒定區(qū)的基因區(qū)段重組， 以當重排核酸在B細胞中表達時產(chǎn)生能夠與κ或λ免疫球蛋白輕鏈復合的免疫球蛋白重鏈抗體。V基因區(qū)段可來源于例如T細胞受體基因座。優(yōu)選本發(fā)明的多個重鏈基因座包含39種功能性人V基因區(qū)段及其改造變體的任何數(shù)目或組合。它們可在任何數(shù)目的基因座上，例如4個包含8個V基因區(qū)段的基因座加 1個包含7個V基因區(qū)段的基因座；7個包含4個V基因區(qū)段的基因座加1個包含3個V基因區(qū)段的基因座；或39個各包含1個V基因區(qū)段的基因座。將人V基因分成7個家族Vh1_Vh7，并將各個基因歸類到各自編號的家族內(nèi)。每個基因使用的頻率取決于特定免疫應答的不同需要。例如，與\5家族的基因相比，在響應細菌抗原時，可優(yōu)先使用乂』家族的基因。因此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，將已證實可用于產(chǎn)生針對特異性抗原的抗體應答的V基因區(qū)段群歸類為單獨的基因座，各自包含不同的顯性選擇標記基因。V基因區(qū)段可按照家族歸類，或者可按照各自的功能歸類。例如，如果％3家族的V基因顯示可用于產(chǎn)生針對細菌抗原的免疫應答，則它們可用于產(chǎn)生特別可用于產(chǎn)生針對細菌抗原的僅有重鏈的抗體的基因座。備選地，如果表明來自Vh5 家族的若干個別基因可用于產(chǎn)生針對細菌抗原的免疫應答，則它們可歸類在一起并用于產(chǎn)生特別可用于產(chǎn)生針對細菌抗原的抗體的基因座。
在本發(fā)明上下文中，“免疫球蛋白重鏈基因座”涉及最小的微基因座，其編碼包含一個或多個V基因區(qū)段、一個或多個D基因區(qū)段和一個或多個J基因區(qū)段并與一個或多個編碼重鏈恒定(效應子)區(qū)的基因區(qū)段有效連接的Vh結構域。優(yōu)選抗體庫變化性的主要來源是通過選擇V、D和J基因區(qū)段以及通過V-D和D-J連接形成的⑶R3區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)勢是，在相同的轉基因非人哺乳動物中通過利用等位基因排斥來使用多個免疫球蛋白重鏈基因座，可使在重排V、D和J基因區(qū)段中得到的抗體庫和多樣性最大化。隨機選擇基因座之一開始重組，如果第一重組是非生產(chǎn)性的，則接著下一個基因座等等，直到從基因座之一產(chǎn)生生產(chǎn)性重組，這種等位基因排斥的過程可確保實際上所有存在于合并基因座上的V基因區(qū)段都可成為整個重組過程的部分。為了提高任何給定免疫球蛋白重鏈基因座上所有Vh基因區(qū)段生產(chǎn)性參與VDJ重排的概率，可將CTCF位點分散在Vh基因區(qū)段群之間。根據(jù)在B細胞中進行的距離測量以及在Vh區(qū)方向上和遍及Vh區(qū)的測量，免疫球蛋白基因座在其正常構象中似乎具有三維折疊結構(Jhunjhunwala等(2008)Cell，133， 265-279)。這類折疊或成環(huán)的結構解釋了不同的Vh區(qū)即使以距免疫球蛋白重鏈基因座的 D、J和恒定區(qū)完全不同的距離排列時可同等有效地使用的原因。最近也越來越清晰的是，在許多基因座上通過成環(huán)形成的折疊結構經(jīng)由稱為CTCF 的特定染色質結合蛋白介導。如誘變實驗證實的一樣，CTCF似乎直接參與染色質成環(huán)的形成(Splinter等QOO6)Genes Dev.，20，2349-2354)。更近期的研究表明，黏結蛋白這種將姐妹染色單體保持在一起的蛋白質復合體存在于CTCF結合位點上(Wendt等Q008) Nature,451, 796-801)。免疫球蛋白Vh區(qū)的許多CTCF位點的加入(Kim等(2007) Cell, 128, 1231-1245 ；Denger，Wong, Jankevicius 禾口 Feeney (2009) J. Immunol.，182，44-48)提高了轉基因免疫球蛋白重鏈基因座的Vh區(qū)可正確折疊并允許有效使用存在于該基因座上的所有不同的V基因區(qū)段的概率。包含異源重鏈基因座的每個轉基因還可包含顯性選擇標記。優(yōu)選顯性選擇標記不同于引入κ或λ輕鏈基因座內(nèi)的顯性選擇標記。對于本發(fā)明的目的，可使用任何顯性選擇標記基因，條件是在選擇性或毒性攻擊存在下，基因的表達為雜交瘤或來源于非人轉基因哺乳動物的轉化B細胞提供選擇性益處。通常，顯性選擇標記基因可以是原核來源的，并選自賦予有毒藥物抗性的基因，例如嘌呤霉素(Vara 等(1986) NAR，14，4617-4624)、潮霉素(Santerre 等(1984) Gene, 30, 147-156)和G418 (Colbere-Garapin等(1981) 150，1-14)，或者包括這樣的基因其消除對某些營養(yǎng)的需要，使得其表達將有毒物質轉化成必需氨基酸，例如吲哚轉化為色氨酸或組氨醇轉化為組氨酸(參見 Hartmann 和 Mulligan (1988)PNAS，85，8047-8051)。本發(fā)明的必要條件是，使顯性選擇標記(如使用的話)位于免疫球蛋白重鏈轉基因座內(nèi)，以確保B細胞特異性共表達。備選地，可采用同源重組結合ES細胞或核移植方法， 將藥物抗性基因插入內(nèi)源或外源(轉基因)免疫球蛋白基因座(例如te Riele, Robanus Maandag和 Berns(1992)，PNAS，89，11,5128-5132)?？蓪⑾嗤娘@性選擇標記基因摻入所有重鏈基因座內(nèi)。備選地，不同的重鏈基因座或重鏈基因座群可包含不同的顯性選擇標記基因。由于轉基因輕鏈基因座內(nèi)的功能性顯性選擇標記基因共表達，因此可以選擇不含表達內(nèi)源免疫球蛋白的細胞的來源于本發(fā)明表達四聚體抗體的轉基因小鼠的雜交瘤或轉化B細胞，優(yōu)選轉化的長壽漿細胞(Slifka等(1998) Immunity，8，363-372)。此外，與摻入輕鏈基因座中的顯性選擇標記相比，由于重鏈基因座內(nèi)不同顯性選擇標記的存在和共表達，因此也可選擇表達來源于轉基因重鏈基因座上存在的特定V區(qū)段群的抗體的雜交瘤或轉化B細胞系。例如，在κ輕鏈轉基因座內(nèi)加入嘌呤霉素抗性基因使得能夠選擇所有表達 κ輕鏈轉基因的細胞。備選地，在包含優(yōu)選的V基因區(qū)段的重鏈轉基因座中加入G418抗性基因使得能夠選擇所有表達優(yōu)選的V基因區(qū)段的細胞。具體地講，本發(fā)明提供產(chǎn)生抗原特異性異源單克隆抗體的方法，所述方法包括(a)用抗原對上述非人轉基因哺乳動物進行免疫；(b)從已免疫的轉基因哺乳動物的B細胞制備分別產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤或無限增殖化B細胞系；(c)通過使用存在于包含異源免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因座的轉基因上的顯性選擇標記基因，選出至少一種表達異源抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；和(d)選擇至少一種產(chǎn)生與抗原特異性結合的抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系。下面參照下列附圖的詳細描述，僅通過實施例對本發(fā)明進行描述。附圖圖IA 小鼠IgH基因座的3’端。該圖譜復印自IMGT數(shù)據(jù)庫(http://imRt. cines. f)。標尺以千堿基(kb)為單位。 綠色正方形為功能性Vh區(qū)段；紅色和黃色正方形為非功能性Vh區(qū)段；橙色正方形為Jh區(qū)段；藍色正方形為恒定區(qū)。未標出基因座3’端上的內(nèi)含IgH增強子和LCR。圖IB 使IgH失效的策略首行顯示具有包括編碼膜形式的IgM的2個外顯子在內(nèi)的不同外顯子的小鼠Cy 區(qū)。往左為基因座的J、D* Vh區(qū)，往右為從C δ開始的其它恒定區(qū)。尾行顯示重組后正常 Ml外顯子的部分氨基酸序列。DNA序列表示整合序列。終止密碼子用紅色表示，Spe I位點用紅色和藍色表示。圖IC =ES細胞中使Cy失效的重組該圖顯示通過覆蓋重組插入片段3’側的PCR分析而得到的ES細胞的兩個重組陽性克隆。較大的片段相當于在圖5B標出的位置上插入Ml外顯子中的neo選擇標記。圖ID :C μ敲除小鼠的FACS分析在Ml外顯子被終止密碼子和neo基因中斷后，將ES細胞引入胚泡得到嵌合體。將這些嵌合體培育成純合性，并分析血液中B細胞的存在情況。上兩圖表示使用B細胞標記 B220和⑶19對正常野生型小鼠和雜合中斷的Ml外顯子小鼠進行的FACS分析。下兩圖表示兩個純合小鼠，其未顯示B220+、⑶19+細胞，即無功能性B細胞。圖IE 培育成重組小鼠后neo的缺失使圖5D的小鼠與表達重組酶的小鼠雜交以缺失neo基因。右邊兩條泳道顯示高于親本動物的neo基因的長片段PCR產(chǎn)物，左側緊鄰的兩條泳道表示攜帶neo缺失和野生型等位基因的兩個雜合小鼠。左側相鄰的4條泳道為野生型小鼠，而最左一條泳道表示攜帶純合缺失的neo基因和失活的Ml外顯子的小鼠。
圖2 小鼠IgK基因座的圖譜該圖譜復印自IMGT數(shù)據(jù)庫(http://imRt. cines. f)。標尺以千堿基(kb)為單位。 綠色正方形為Vk區(qū)段；橙色正方形為Jk區(qū)段；藍色正方形為恒定區(qū)；黑色圓形為κ-增強子和紅色圓形為κ-LCR序列。圖3:小鼠Vk敲減通過LCR缺失使小鼠IgK基因座在功能上失活的方案通過同源重組將Iox新霉素抗性基因盒插入到ES細胞中置換3’ K_LCR(尾行)。 用ere重組酶(+ere)處理可除去Iox位點之間的所有序列，在κ基因座上留下單個Iox 位點(首行)。圖4 插入小鼠Ck使κ基因座失活?；蜃?首行)與圖3的相同。尾行表示Ck外顯子5’端上的序列(首行的藍色)，在堿基上方標出氨基酸編碼。開始的GG堿基對緊鄰剪接后的編碼氨基酸R的剪接受體位點。中間行表示插入34個堿基對Iox位點插入片段(藍色和紅色反向重復序列)，這使恒定區(qū)的密碼子使用是異讀框的，并產(chǎn)生下游終止密碼子(例如粗體加下劃線的TGA)。 黑色圓形為κ-增強子和紅色圓形為K-LCR序列。圖5:小鼠Ck插入基因座(首行)與圖3的相同。尾行表示Ck外顯子的5’端序列(第一行中的藍色)，堿基上標出氨基酸編碼。開始的GG堿基對緊鄰剪接后的編碼氨基酸R的剪接受體位點。中間行表示插入的含有Iox序列(藍色和紅色反向重復序列)和4個終止密碼子的46 個堿基對插入片段，這也使恒定區(qū)的密碼子使用是異讀框的，并產(chǎn)生下游終止密碼子(例如粗體加下劃線的TGA)。黑色圓形為κ-增強子和紅色圓形為K-LCR序列。圖6Α 小鼠Ck恒定區(qū)終止密碼子和移碼插入基因座(首行)與圖3的相同。尾行表示Ck外顯子部分序列(黑色)，堿基上標出氨基酸編碼。中間行表示Ck編碼區(qū)部分序列。其上一行表示插入含有Iox序列(藍色和紅色反向重復序列)、3個終止密碼子的44個堿基對的插入片段，這也使恒定區(qū)的密碼子使用是異讀框的，并產(chǎn)生下游終止密碼子(TAA)。黑色圓形為κ-增強子，紅色圓形為κ-LCR 序列，用于插入的Hpa I位點用紅色表示。圖6Β =ES細胞中使Ck失效的重組凝膠顯示了

圖13A所示ES細胞中對Ck重組的多個克隆插入位點進行PCR擴增的結果?？寺?51和623為陽性，將其注射入胚泡中以產(chǎn)生IgK陰性小鼠。圖7:人181；基因座。該圖譜復印自IMGT數(shù)據(jù)庫(http://imRt. cines. f)。標尺以千堿基(kb)為單位。 綠色正方形為功能性VK區(qū)段；紅色和黃色正方形為非功能性Vk區(qū)段；橙色正方形為Jk區(qū)段；藍色正方形為恒定區(qū)；黑色圓形為κ-增強子，紅色圓形為K-LCR序列。圖8 用于轉基因作用的雜交人/大鼠IgK基因座的產(chǎn)生基因座的3’端獲自含有小鼠κ3’增強子(黃色)的小鼠(黃色)。小鼠恒定編碼序列用大鼠的恒定編碼序列置換，包括其通過長片段PCR獲自大鼠基因組DNA (紅色)的 5’增強子。從Vk4-1下游直到人Jk序列的人區(qū)段獲自小鼠(黃色)以保持V區(qū)與J區(qū)的適當間隔。人Jk區(qū)段獲自覆蓋人基因座該部分的PAC(綠色)。綠色正方形為分別添加或作為區(qū)組(block)添加的Vk區(qū)段(參見正文)。存在于PAC載體上的嘌呤霉素抗性基因用紅色表示，黑色圓形為κ-增強子，紅色圓形為K-LCR序列。圖9 :Vh4重鏈基因座的圖譜在5’端含有新霉素選擇標記的該基因座用作構建人/小鼠雜交基因座的起始原料。按照W02008/035216中所述構建該基因座。標尺以千堿基為單位?；蜃?個Vh 區(qū)(1-46、3-53、3-23、3-11)、全部的人D區(qū)段、全部的人J區(qū)段和IgG恒定區(qū)以及3’人IgH LCR。圖10 :4個VhA/大鼠恒定區(qū)IgH基因座的產(chǎn)生存在于Vh4人基因座的CeuI位點(圖6)用于通過添加經(jīng)PCR由大鼠基因組DNA 擴增的大鼠恒定編碼區(qū)和轉換區(qū)來產(chǎn)生人/大鼠基因座。同樣，小鼠LCR區(qū)作為幾個片段由小鼠基因組DNA擴增，這些片段先克隆在一起產(chǎn)生完整的小鼠IgH LCR0、VH4基因座的 5’端含有4個Vh區(qū)段、全部的人D區(qū)段和全部人J區(qū)段(圖6)。所有人序列用藍色表示， 所有小鼠序列用淡綠色表示，大鼠序列用紅色表示，新霉素抗性基因用紫色表示。圖11 包含λ LCR的IgX增強子的缺失使用潮霉素抗性基因和殺稻瘟菌素S(blaStiCin S)抗性基因，采用標準置換型載體通過同源重組剔除λ基因座增強子，所述潮霉素抗性基因兩側是與鄰接增強子2-4的區(qū)同源的序列，所述殺稻瘟菌素S抗性基因兩側是與鄰接4-10增強子的區(qū)同源的區(qū)段。置換產(chǎn)生丟失增強子且表達減少的λ基因座。潮霉素抗性基因用紅色表示，殺稻瘟菌素S抗性基因用橙色表示。小鼠Va區(qū)段用綠色表示，J區(qū)段用黃色表示，恒定區(qū)用藍色表示。圖譜復印自IGMT數(shù)據(jù)庫。圖12 用于轉基因作用的人大鼠Vk基因座基因座與圖8的相同，但已將其它AVk區(qū)段添加入該基因座。所得基因座含有所有頻繁和中等頻繁使用的人Vk區(qū)段。綠色圓形和綠色線為鼠κ-增強子和內(nèi)含子；紅色正方形和圓形為大鼠κ -恒定區(qū)和增強子；藍色正方形為人Vh區(qū)段；深藍色為嘌呤霉素選擇標記。圖13Α 人大鼠雜交基因座的產(chǎn)生通過將Vh區(qū)連接在一起形成在SceI位點之間克隆的17個連續(xù)AVh區(qū)的多聯(lián)體， 來產(chǎn)生該基因座。將小鼠間隔區(qū)添加入含有所有人Dh和Jh區(qū)段的人40kb片段中以在Dh 與Vh區(qū)段之間保持適當距離。接著添加含有SceI位點的VH6-1區(qū)段。然后將多聯(lián)體添加至乂力-丨上。最后，將各種大鼠恒定區(qū)和小鼠LCR添加至3’側。所得基因座含有全部頻繁和中等頻繁使用的人Vh區(qū)段。圖13B 人/大鼠IgH基因座的起始構建體凝膠表示在添加Vh6_1后人大鼠IgH基因座構建第一步的結果。右邊的泳道表示 NotI消化的兩個克隆質粒。泳道(NotI χ MluI)表示泳道1的質粒在載體中具有正確朝向，而泳道2的質粒具有錯誤朝向。泳道1的質粒用于產(chǎn)生基因座的下一步驟中。圖13C:VH區(qū)段的多聯(lián)體凝膠表示Xhol/Sall消化的17個不同Vh區(qū)的多聯(lián)體。標記泳道含有用BstEII消化的λ噬菌體DNA。 圖14 轉基因人大鼠重鏈免疫球蛋白基因座
引入同一動物中的兩個重鏈基因座的實例。彼此的對立選擇通過等位基因排斥進行?？蓪⑵渌黇h區(qū)段添加至各基因座。備選地，可采用更多的重鏈基因座引入其它
段。顯然，可采用相同策略增加κ或λ輕鏈基因座的多樣性。圖15 人/大鼠λ轉基因輕鏈基因座圖顯示人/大鼠基因座的實例。其3’端獲自含有小鼠入3’1^0 (黃色)的小鼠 (黃色)。小鼠恒定編碼序列用通過長片段PCR從大鼠基因組DNA獲得的大鼠恒定編碼序列(紅色)替換。Va2-14下游直到人Jk序列的人區(qū)段獲自小鼠(黃色)，以保持V區(qū)和J 區(qū)之間的適當間隔。通過覆蓋人基因座該部分(藍色)的人PAC的長片段PCR獲得人Ja 區(qū)段。藍色正方形為分別添加或作為區(qū)組添加的Va區(qū)段。存在于PAC載體上的潮霉素抗性基因用紫色表示。
實施例在下面的實施例中，產(chǎn)生轉基因小鼠，其表達作為轉基因通過顯微注射引入受精卵(常規(guī)轉基因過程)的雜交人/大鼠重鏈和輕鏈基因座。對供卵小鼠進行修飾以不表達或非常低地表達內(nèi)源小鼠重鏈基因和小鼠輕鏈基因。小鼠中有κ鏈和λ鏈兩種輕鏈基因座，其中λ僅用于約2%的小鼠H2L2抗體。因此，實施例在具有IgH基因座且僅內(nèi)源κ基因座失活的小鼠中，或者在具有IgH和失活的κ基因座且剔除λ基因座的調(diào)節(jié)序列以更進一步地降低λ基因座的表達的小鼠中。用于構建重鏈和輕鏈基因座，在抗原攻擊后形成和篩選轉基因小鼠的方法基本上如前所述(Janssens 等(2006)PNAS，10，103(41)，15130-5 ;W02006/008548、 W02007/096779、GB0805281. 3 和 2008 年 6 月 11 日申請的要求 GB0805281. 3 的優(yōu)先權的 PCT 申請)，在所有重鏈基因座上保留ChI結構域的除外。用于獲得表達功能性異源免疫球蛋白基因座和/或具有工程改造的內(nèi)源基因座的脊椎動物(包括小鼠以外的哺乳動物)的通用方法參見W02006/047367。在下面的實施例中，在ES細胞中使用重組，并使用修飾的ES細胞產(chǎn)生具有所需性質的小鼠。然而，相同方法可在誘導性多能干細胞(iPS細胞)中進行，其然后用來產(chǎn)生小鼠(例如 Boland, Hazen, Nazor, Rodriguez, Gifford, Martin, Kupriyanov 和Baldwin (2009)，461,7260,91-4及其中的參考文獻)。備選地，在體細胞或體干細胞進行修飾，隨后改編(!^program)到iPS細胞中產(chǎn)生修飾小鼠。同樣，可將修飾的造血干細胞移植到缺乏B細胞的受體小鼠中以產(chǎn)生人抗體或人雜交抗體。實施例1在該實施例中，通過類似于Kitamura和Rajewsky發(fā)表的策略，使IgH基因座(圖 1A)失活，其差別在于將終止密碼子在Kitamura等人(Kitamura等(1991)Nature，350， 423-426)所述位置前一個氨基酸的位置上引ACli區(qū)。ES(或iPS)細胞用構建體轉染，該構建體將小鼠IgM基因第一膜外顯子的第二密碼子變?yōu)榻K止密碼子。這涉及包括用于轉染的neo選擇的常規(guī)步驟。將SpeI位點加入重組序列中，以能夠監(jiān)測成功重組(圖1B)。隨后通過DNA印跡法篩選ES細胞以證實成功的重組克隆。這產(chǎn)生10個正確的重組體(例如圖1C)。這些當中，將3個注射到小鼠胚泡中獲得嵌合體，隨后培育嵌合體得到對于IgH突變?yōu)榧兒系男∈?。這類小鼠B細胞的FACS分析(B220對⑶19)表明，外周血中不存在B細胞(圖1D)。隨后將小鼠與表達重組酶的小鼠雜交除去neo基因(圖1E)。同樣，在ES細胞中通過重組使小鼠IgK基因座(圖2)失活或減少(圖2、3、4-6)。所得K失活小鼠與重鏈KO小鼠雜交。通過將3’ κ基因LCR替換為兩側是Iox位點的neo抗性標記，實現(xiàn)活性敲減(圖3)。任選用重組酶處理除去neo基因。備選 地，可在IgH KO細胞中直接敲除κ等位基因?？刹捎萌舾刹煌牟呗赃_到 κ失活?？赏ㄟ^使用ES細胞或iPS細胞中的同源重組將兩側是Iox位點的neo基因插入 Ck外顯子的5’端(圖4)，或者通過插入兩側是Iox位點的neo基因和編碼終止密碼子的其它序列(圖5和圖6A)，來實現(xiàn)κ基因活性的阻遏。重組的ES細胞用ere處理可使該序列為異讀框的(圖4)，或另含有新的終止密碼子(圖5-6A)。圖6B表示圖6A所示構建體轉染后在ES細胞中的重組結果，產(chǎn)生具有失活的一個Ck等位基因的2個ES細胞克隆(共獲得5個這樣的克隆)。用肌動蛋白驅動的重組酶質粒通過標準瞬時轉染用重組酶處理細胞，以剔除兩個Iox位點間的區(qū)。隨后通過常規(guī)方法使用該細胞產(chǎn)生小鼠，培育子代得到純合小鼠。這類小鼠包含B細胞，其中包含κ輕鏈的免疫球蛋白四聚體的裝配基本被破壞或完全阻斷。接下來，按照之前對于人Vh區(qū)段所述，將最常用的人IgK基因座基因(利用Ir數(shù)據(jù)庫評價httD: //imgt. cines. fr/ 參見圖7、8)通過標準PCR擴增，并亞克隆至 Xhol/Sall位點之間。這使得Vk區(qū)能夠多聚化，并將多聚體保持在XhoI和SalI位點之間。同樣，將包括3’ κ增強子的小鼠κ基因座的3’端與大鼠恒定(Ck)區(qū)和大鼠5’ 增強子克隆在一起(圖8)。接著，克隆入人Jk區(qū)與得自小鼠Vk和夂之間的區(qū)域(17kb) (圖2)以保持Vk區(qū)和Jk區(qū)之間的正常間隔。最后，通過常規(guī)方法(例如Janssens等 (2006)，同上)，將人Vk插入含有嘌呤霉素選擇標記的PAC (圖8)。在所示實施例中，將最常用區(qū)段(4-1、3-11、3-15、3_20和1_39)多聚化，并連接到含有人J區(qū)和小鼠增強子及大鼠Ck區(qū)的PAC載體中。這產(chǎn)生由puro抗性標記基因、人Vk區(qū)段和大鼠恒定(Ck)區(qū)組成的人-大鼠雜交基因座(圖8)。同樣，構建雜交人/大鼠IgH基因座。此外，就起始原料而言有許多可能性。在該實施例中，起始原料為含有4個人Vh區(qū)、全部的人Dh和Jh區(qū)段、2個人恒定區(qū)及人LCR的人 PAC (圖9和英國專利申請?zhí)?905023. 8)。后面的PAC在J區(qū)和恒定區(qū)之間具有獨特的CeuI大范圍核酸酶位點。為使得能夠容易地構建雜交基因座，使用該CeuI位點除去人3’端序列，并將這些替換為大鼠恒定區(qū)和轉換區(qū)(Cy、Cy3、CY1和CY2)。這些通過標準長片段PCR擴增自大鼠基因組DNA。最后，添加小鼠重鏈LCR。該調(diào)節(jié)序列以3個部分由小鼠基因組DNA擴增，并亞克隆到一起以恢復完整的LCR，并加至大鼠恒定區(qū)3’側(圖10)。因此，所得雜交IgH基因座含有neo選擇標記、人V、D和J區(qū)及大鼠恒定區(qū)與小鼠調(diào)節(jié)序列。隨后雜交基因座插入片段作為大的DNA片段從PAC中分離，并注射入來源于IgH/ IgK雜合或純合失效小鼠的小鼠受精卵，產(chǎn)生對于人/大鼠雜交IgH和IgK基因座是轉基因的小鼠。所有這些都通過常規(guī)方法進行(例如Janssens等(2006)，同上)。隨后培育雜交IgH和雜交IgK轉基因小鼠，得到對于內(nèi)源小鼠IgH和IgK表達而言是純合失效且對于人/大鼠雜交IgH和IgK表達而言為陽性的小鼠。隨后通過常規(guī)方法，對這些小鼠進行免疫產(chǎn)生抗原特異性雜交人/大鼠H2L2抗體。如果通過雜交瘤產(chǎn)生單克隆人/大鼠Ig，則嘌呤霉素和新霉素的雙重選擇確保只選出既含IgH又含IgK基因座的骨髓瘤融合體。本 領域技術人員應理解的是，可對該方法作各種變化以產(chǎn)生雜交轉基因小鼠，例如使用不同的載體、不同的選擇標記、不同的重組位置以使小鼠基因失活，或可在雜交基因座的實際(常規(guī))克隆策略中作出各種變化。可采用同一方法，使用來源于任何單一哺乳動物物種的免疫球蛋白DNA產(chǎn)生任何正常基因座或雜交基因座，或者使用來自兩個或更多個物種的DNA得到雜交基因座。實施例2本實施例基本上與實施例1相同，除了通過降低內(nèi)源小鼠Igx基因座的表達頻率更進一步提高獲得IgH/IgK H2L2抗體的高頻率。這可通過用選擇標記置換兩個IgA的調(diào)節(jié)區(qū)來實現(xiàn)(圖11)，在該情況下為潮霉素抗性基因和TK-BSD基因。后者使得能夠陽性選擇殺稻瘟菌素S抗性(Karreman, (1998)NAR, 26, (10)， 2508-2510)。標記的這種組合當置換調(diào)節(jié)區(qū)時，使得能夠在2種ES細胞重組中進行陽性選擇。重組在實施例1產(chǎn)生的ES細胞中進行，或者備選地，在正常ES細胞中平行進行，并且培育成上面實施例1中所述小鼠。所得轉基因小鼠含有雜交人大鼠IgH和IgK基因座，對于內(nèi)源小鼠IgH和IgK而言為陰性(或以非常低的水平表達CK)，并以非常低的水平表達IgA。在通過常規(guī)方法免疫和產(chǎn)生雜交瘤后，通過neo (圖10)和puro (圖8)選擇，選出只表達人大鼠雜交H2L2抗體的雜交瘤用于表達轉基因雜交基因座。實施例3實施例3類似于上述實施例，但是雜交IgK基因座通過添加較不常使用區(qū)段而延伸(圖12 ;VKl-9、l-33、2-30、2-28、l-27、l-5)。備選地，可另外添加突變/修飾的Vk 區(qū)段或Va區(qū)段。可通過采用上述相同的Xhol/Sall克隆策略進行其它區(qū)段的添加。對在該實施例中產(chǎn)生的小鼠進行免疫，允許在響應用抗原免疫時更大的復雜度。可通過添加其它Vk區(qū)段或使用所有上述\區(qū)段的組合，使\區(qū)的數(shù)目進一步改變。實施例4實施例4類似于上述實施例中所描述的方法，但在這里通過使用18個Vh區(qū)段和5 個大鼠恒定區(qū)產(chǎn)生雜交人/大鼠IgH基因座(圖13A;AVh 6-1、1-2、4-4、2-5、3-07、1-8、 4-39、3-15、1-18、3-23、3-30、3-33、3-48、4-34、3-49、3-53、4-59、1-69)。首先人基因座的中心70kb DJ區(qū)在5’端用來自小鼠IgH內(nèi)含子的8kb延伸，以保持Vh區(qū)段與D區(qū)之間的適當距離。接下來，將IOkb具有人工SceI大范圍核酸酶位點的第一 (6-1)克隆在小鼠內(nèi)含子序列的5’端(圖10B)。在單獨的質粒中，所有剩余的Vh區(qū)通過加插如上所述的XhoI/ Sail Vh區(qū)段而克隆在一起(圖10C)。還可以將更多Vh區(qū)段或已經(jīng)修飾/突變的Vh區(qū)段加入這些基因座中。還可包括CTCF位點。在所示實施例中，使用了 3個這類位點。它們通過包括上游CTCF位點的Vh區(qū)的長片段PCR獲得。此外，與圖10中的基因座相比，已加入了大鼠Ca。在該實施例中，免疫允許響應用抗原進行免疫時更大的復雜度，特別與實施例3 組合時。將Vh多聚體克隆到VH6-1DJ質粒中，之后加入大鼠恒定區(qū)完成基因座。在所有這些實施例中，通過加入V區(qū)段作為存在于同一小鼠中的其它重鏈或輕鏈轉基因座的一部分，將進一步提高應答的復雜度。由于所有基因座經(jīng)歷等位基因排斥(參見W02007/096779)，因此在抗原攻擊后，體內(nèi)僅選出優(yōu)選的重排，導致B細胞膨脹及抗體在血清積累。圖14表示可引入同一動物的2個重鏈基因座的實例，每一個可通過等位基因排斥而被利用。顯然，可加入更多的Vh區(qū)段(包括修飾的Vh區(qū)段)，或者可引入甚至更多的基因座以增加轉基因免疫庫的復雜度。還可利用對其它物種有特異性的V區(qū)段將該方法應用于這些物種實施例5在該實施例中，通過培育將人/大鼠IgX基因座加入攜帶上述實施例中所述的人 /大鼠IgH和/或IgK基因座的小鼠更進一步地增加人/大鼠雜交抗體的多樣性。人/大鼠雜交λ基因座的產(chǎn)生與前述實施例中對于人/大鼠IgK基因座所述非常相似。區(qū)別是由JX和CX區(qū)成對出現(xiàn)所引起的，因此將2個大鼠Ca區(qū)克隆至2個人Ja區(qū)(圖15)。通過克隆出現(xiàn)在該位置的正常小鼠序列，來保持Va和Ja區(qū)段之間的間隔(參見圖11)。在該實施例中，2個人Ja和大鼠Ca區(qū)段與4個人Va區(qū)段一起使用。綜合起來，這些包括超過80%的人IgX應答。調(diào)節(jié)序列(LCR，圖15)來源于小鼠以確保最佳表達，選擇標記被加至基因座的5’端。如上所述，將基因座作為限制片段分離，并注射到受精卵中以產(chǎn)生攜帶轉基因λ基因座的小鼠。在所有這些實施例中，可使用來自不同物種的VH、\、D、J和恒定區(qū)來產(chǎn)生其它單一物種抗體或雜交物種抗體。對本領域技術人員還顯而易見的是，一旦鑒定出抗原特異性抗體，則可通過完全常規(guī)的方法，將VhDJ和VJ區(qū)克隆至來自同一物種或來自不同物種的備選恒定區(qū)。
權利要求
1.一種含有內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座的非人哺乳動物，每個基因座可重排使得在抗原攻擊后在B細胞中形成并表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是所述基因座已經(jīng)突變使得形成包含從所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力顯著降低或消除。
2.權利要求1的非人哺乳動物，其中所述內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座中的至少一個已通過將移碼突變、多肽編碼序列和/或一個或多個終止密碼子引入某內(nèi)源基因座或各內(nèi)源基因座而發(fā)生突變。
3.權利要求2的非人哺乳動物，其中所述突變是插入少于50個核苷酸。
4.權利要求1的非人哺乳動物，其中所述內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座中的至少一個的表達通過剔除某基因座或各基因座上的部分或全部LCR而顯著減少。
5.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源κ輕鏈基因座上。
6.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源λ輕鏈基因座上。
7.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源λ 輕鏈基因座上。
8.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源重鏈基因座上。
9.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。
10.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源λ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。
11.權利要求2或3的非人哺乳動物，其中所述引入位于內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源Κ 輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座上。
12.權利要求1的非人哺乳動物，其中在內(nèi)源κ輕鏈基因座上存在權利要求2或3限定的引入，而在內(nèi)源λ基因座上存在權利要求4限定的部分或完整的LCR缺失。
13.權利要求1-12中任一項的非人哺乳動物，其中所述內(nèi)源重鏈基因座突變，使得發(fā)生重鏈基因重排、mRNA轉錄和蛋白質合成，但B細胞活化被阻斷。
14.前述權利要求中任一項的非人哺乳動物，其包含含有一個或多個異源κ輕鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。
15.前述權利要求中任一項的非人哺乳動物，其包含含有一個或多個異源λ輕鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。
16.權利要求14或15的非人哺乳動物，其中含有異源輕鏈基因座的轉基因包含顯性選擇標記基因。
17.前述權利要求中任一項的非人哺乳動物，其包含含有一個或多個異源重鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。
18.權利要求17的非人哺乳動物，其包含兩個或更多個含有兩個或更多個不同的異源重鏈基因座和相關B細胞特異性調(diào)節(jié)元件的轉基因。
19.權利要求17或18的非人哺乳動物，其中含有異源重鏈基因座的某轉基因或每個轉基因包含顯性選擇標記基因。
20.權利要求17-19中任一項的非人哺乳動物，其中每個異源重鏈基因座包含CTCF結合位點。
21.權利要求14和16-19中任一項的非人哺乳動物，其包含含有異源κ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。
22.權利要求15-20中任一項的非人哺乳動物，其包含含有異源λ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。
23.權利要求14-22中任一項的非人哺乳動物，其包含含有異源κ輕鏈基因座的轉基因、含有λ輕鏈基因座的轉基因和含有一個或多個異源重鏈基因座的轉基因。
24.權利要求14-23中任一項的非人哺乳動物，其中每個異源基因座整合了關聯(lián)LCR。
25.權利要求14-24中任一項的非人哺乳動物，其中每個異源基因座是人基因座。
26.權利要求14-25中任一項的非人哺乳動物，其中每個異源基因座是包含來源于多于一種物種的可變區(qū)和恒定區(qū)的雜交基因座。
27.權利要求沈的非人哺乳動物，其中每個異源基因座是包含人可變區(qū)和大鼠或鼠恒定區(qū)的雜交基因座。
28.權利要求14-27中任一項的非人哺乳動物，其包含含有不同群的不同異源重鏈基因座的轉基因群，其中每個轉基因群包含不同的顯性選擇標記基因。
29.權利要求14-27中任一項的非人哺乳動物，其包含含有異源輕鏈基因座的轉基因和含有異源重鏈基因座的轉基因，其中含有異源輕鏈基因座的轉基因和含有異源重鏈基因座的轉基因各自包含不同的顯性選擇標記基因。
30.前述權利要求中任一項的非人哺乳動物，所述非人哺乳動物是嚙齒動物。
31.權利要求30的非人哺乳動物，所述非人哺乳動物是小鼠。
32.—種制備抗原特異性異源單克隆抗體的方法，所述方法包括(a)用抗原對前述權利要求中任一項的非人轉基因哺乳動物進行免疫；(b)由已免疫的轉基因哺乳動物的B細胞制備分別產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；(c)任選地，通過使用存在于包含異源免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因座的轉基因上的顯性選擇標記基因，選出至少一種表達異源抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；和(d)選出至少一種產(chǎn)生與抗原特異性結合的抗體的雜交瘤或無限增殖化B細胞系。
33.一種由雜交抗體得到哺乳動物優(yōu)選人的抗體的方法，所述方法包括(a)進行權利要求32的方法；(b)選出至少一種產(chǎn)生與抗原特異性結合的抗體并包含選定物種的Vh和\結合結構域的雜交瘤或無限增殖化B細胞系；(c)對Vh和\結構域進行克隆和測序；(d)使包含Vh和\結合結構域編碼序列的選定序列與來自同一物種的選定恒定效應子結構域再克隆；和(e)在選定的細胞類型中使用表達載體共表達編碼所需物種的重鏈和輕鏈多肽的再克隆序列。
34.一種用于產(chǎn)生權利要求1-31中任一項的非人哺乳動物的方法，所述方法包括使哺乳動物祖細胞的內(nèi)源重鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和任選內(nèi)源λ輕鏈基因座突變，并由所述祖細胞產(chǎn)生哺乳動物，其中突變使得在哺乳動物中，每個基因座可以重排，從而在抗原攻擊后在B細胞中形成并表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是形成包含從所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力已顯著降低或消除。
35.權利要求34的方法，其中所述祖細胞是非人胚胎干細胞。
36.權利要求34或35的方法，其中所述非人哺乳動物是嚙齒動物。
37.權利要求34或35的方法，其中所述非人哺乳動物是小鼠。
38.抗原特異性異源功能性免疫球蛋白四聚體、優(yōu)選人的所述四聚體作為藥物、診斷劑或試劑的用途，所述四聚體使用權利要求14-31中任一項的非人哺乳動物或權利要求32或 33的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供含有內(nèi)源λ輕鏈基因座、內(nèi)源κ輕鏈基因座和內(nèi)源重鏈基因座的非人哺乳動物，每個基因座可重排使得在抗原攻擊后在B細胞中形成并表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是所述基因座已經(jīng)突變使得形成包含從所述突變基因座產(chǎn)生的重排重鏈和輕鏈的功能性免疫球蛋白四聚體的能力大大降低或消除。
文檔編號C12N15/85GK102292445SQ200980151815
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者F·G·格羅斯維爾德, M·J·范哈佩倫, R·W·詹森斯, 羅杰·金登·克雷格 申請人:伊拉茲馬斯大學鹿特丹醫(yī)學中心, 羅杰·金登·克雷格