專利名稱：修飾的顯示增加的蛋白酶抗性的促紅細(xì)胞生成素(epo)多肽及其藥物組合物的制作方法
修飾的顯示增加的蛋白酶抗性的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽及其藥物組合物相關(guān)申請(qǐng)要求2008年5月四日提交的題為"Modified Erythropoietin (EPO) Polypeptides that Exhibit Increased Protease Resistance and Pharmaceutical Compositions Thereof"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/130，376的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)的申請(qǐng)人為Thierry Guyon， Giles Borrelly,Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega。允許時(shí)，上述申請(qǐng)的主題以其全文援引加入。本申請(qǐng)涉及2007年11月沘日提交的題為“MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF，，的美國(guó)申請(qǐng) 11/998，387，申請(qǐng)人為 Thierry Guyon,Giles Borrelly, Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega，本申請(qǐng)還涉及題為“MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的國(guó)際申請(qǐng) PCT/GB2007/004520，申請(qǐng)人為 Thierry Guyon, Giles Borrelly, Xavier Gallet, Lila Drittanti 禾口 Manuel Vega, 其均要求2006年11月洲日提交的題為美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/861，615的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還涉及2005年7月6日提交的題為“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES” 的美國(guó)申請(qǐng) 11/176，830，申請(qǐng)人 Rene Gantier, Thierry Guyon,Manuel Vega禾口 Lila Drittanti, 其公開為美國(guó)申請(qǐng)US 2006-0020116,其是2003年9月8日提交的題為“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES” 的美國(guó)申請(qǐng) 10/658，834 的繼續(xù)申請(qǐng)，申請(qǐng)人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti，公開為美國(guó)申請(qǐng) US-2004_013^77-A1。本申請(qǐng)也涉及 2005 年 8 月 2 日提交的題為 “RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING” 美國(guó)申請(qǐng) 11/196，067，申請(qǐng)人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,公開為美國(guó)申請(qǐng)US-2006-0020396-A1，其為2003年9月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)10/658，355的繼續(xù)申請(qǐng)， 申請(qǐng)人:Rene Gantier,Thierry Guyon,Hugo Cruz Ramos,Manuel Vega禾口Lila Drittanti, 題為"RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING”，公開為美國(guó)申請(qǐng) 2005-0202438。本申請(qǐng)還涉及2003年9月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)10/658，834，以及公開的國(guó)際 PCT 申請(qǐng) WO 2004/022593，申請(qǐng)人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti,題為“RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES”。本申請(qǐng)還涉及 2003 年 9 月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)10/658,355，以及國(guó)際PCT申請(qǐng)WO 2004/022747,申請(qǐng)人Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,題為 "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING”。上述申請(qǐng)的每一個(gè)的主題以其全文援引加入。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽。所述EPO多肽經(jīng)修飾以顯示與相應(yīng)的未修飾EPO多肽不同的物理性質(zhì)和活性。編碼這些多肽的核酸分子也在本發(fā)明提供。還提供了利用所述多肽進(jìn)行治療和診斷的方法。
背景技術(shù)：
臨床使用的治療性蛋白的有效遞送是對(duì)藥學(xué)科學(xué)的挑戰(zhàn)。一旦在血流中，這些蛋白通常在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)不同的生理過(guò)程從循環(huán)中清除，包括代謝以及利用正常蛋白清除途徑進(jìn)行的清理，諸如腎過(guò)濾(例如腎小球)或血中的蛋白裂解。一旦到達(dá)消化道腔內(nèi)，這些蛋白通常被腔內(nèi)蛋白酶消化。后者可以是影響蛋白半壽期的限制性過(guò)程，所述的蛋白用作治療劑，用于口服施用或皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射中。與這些施用途徑相關(guān)的問題是已知的并且已經(jīng)試圖利用多種策略來(lái)解決這些問題。此外，許多治療性蛋白是糖基化的，而制備糖基化治療性蛋白非常昂貴，高度可變并且很難進(jìn)行。這些蛋白的非糖基化形式的制備通常由于蛋白降解而不可能實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞因子家族是改善蛋白家族的施用和生物同化作用的臨床工作和研究的焦點(diǎn)， 其中包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)。重組制備的EPO多肽被認(rèn)可用于治療各種貧血，諸如腎衰、慢性感染、癌和AIDS導(dǎo)致的貧血等；但是，仍然非常需要更為穩(wěn)定的促紅細(xì)胞生成素用于治療。促紅細(xì)胞生成素的血漿半壽期相對(duì)較短(Spivak，J.L.和Hogans，B. B.，Blood 73(1) :90-99(1989) ；McMahon, F. G. , et al.，Blood 76(9) 1718-1722 (1990))，因此，治療性血漿水平會(huì)迅速降低，必須重復(fù)靜脈內(nèi)施用。由于天然存在的變體具有不良副作用以及施用、生物利用度以及短半壽期的問題，需要改善EPO的性質(zhì)以用作生物治療劑。因此，在本發(fā)明的目的中，一個(gè)目的是提供修飾的EPO多肽和其它治療性多肽，其具有改善的治療性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了配制為口服施用的藥物組合物。所述組合物含有修飾的治療性多肽或者所述修飾多肽的活性片段，其中所述修飾在所述活性片段中。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是糖基化的，部分糖基化的或去糖基化的(即未糖基化，如去除糖基化部分、抑制糖基化，以及在不糖基化所述多肽的宿主如細(xì)菌宿主中表達(dá)。所述治療性多肽或其活性片段是含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)、含有鑒別為蛋白酶抗性并稱為鑒別為蛋白酶抗性的掩蔽的is-HIT殘基的掩蔽殘基處含有一或多個(gè)氨基酸修飾的多肽，且所述治療性多肽或其活性片段與不含有所述一或多個(gè)氨基酸修飾的未修飾的治療性多肽或其活性片段相比顯示增加的蛋白酶抗性。所述掩蔽的is-HIT殘基可以是所述多肽糖基化位點(diǎn)0-25人之內(nèi)如 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 人之內(nèi)的is-HIT殘基。所述藥物組合物中的修飾的治療性多肽或其活性片段在掩蔽的is-HIT殘基處可以含有 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 或更多個(gè)氨基酸修飾。其在掩蔽的 is-HIT 殘基處可以含有 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19,20或更多個(gè)氨基酸修飾。在藥物組合物的一些實(shí)施方案中，所述修飾的治療性多肽或其活性片段含有至少2個(gè)氨基酸修飾，其中2個(gè)氨基酸修飾在被不同糖基化位點(diǎn)掩蔽的掩蔽is-HIT殘基處。
所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是細(xì)胞因子或其活性片段。細(xì)胞因子包括但不限于促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白細(xì)胞介素-1 β (IL-I)、白細(xì)胞介素2 (IL-2)、白細(xì)胞介素3 (IL-3)、白細(xì)胞介素4 (IL-4)、白細(xì)胞介素5 (IL-5)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素 9(IL-9)、干擾素-β (IFN-β)、干擾素-γ (IFN-γ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素(TPO)、 白血病抑制因子(LIF)、干細(xì)胞因子(SCF)、制瘤素M(OSM)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。這種治療性多肽的例子是選自包括 SEQ ID NO :2，237274，276，278，280，282，284，286，288， 290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一個(gè)、其活性片段、或序列如 SEQ ID NO :2， 237274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一所示的多肽的其他變體的等位基因變體、種的多肽的任意多肽。
當(dāng)所述修飾的治療性多肽或其活性片段是SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促紅細(xì)胞生成素(EPO)或其與具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示序列的多肽具有至少或至少大約 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或更高序列相同性的等位基因變體或種變體或其他變體。所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT殘基可以在在選自N24，N38, N83和SU6的一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)被糖基化掩蔽的殘基處。這種掩蔽的is-HIT殘基包括但不限于相應(yīng)于SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237的氨基酸殘基的殘基 R14, L16, L17, E18, K20, E21, E23, E31, L35, E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, P121, P122, D123, P129, L130, R131，D136，F(xiàn)138，R139，K140，L141，F(xiàn)142，R143和Y145或者在等位基因變體和種變體中的對(duì)應(yīng)殘基或其他殘基。掩蔽的is-HIT殘基被修飾的多肽的例子包括修飾的EPO多肽或活性片段，其中所述修飾是選自 R14H, R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I，如 K20Q, L80I, P90S, L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q,或K20Q，L80I, L93I，L93V和R139H和等位基因變體、種變體和其他變體中的對(duì)應(yīng)修飾的一或多個(gè)氨基酸修飾。例如，所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是修飾的ΕΡ0， 其中所述修飾選自 R139H ；L93I ；K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/ L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V,如 R139H, R139H/K20Q, K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/ R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V和R139H/L93I，和等位基因變體、種變體和其他變體中的對(duì)應(yīng)修飾。
所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以進(jìn)一步含有在非掩蔽is-HIT殘基處的一或多個(gè)氨基酸修飾以及增加所述多肽的蛋白酶抗性或改變所述多肽的另一種性質(zhì)或活性的其他修飾。當(dāng)所述修飾的治療性多肽或其活性片段是促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽時(shí)，舉例的非掩蔽is-HIT殘基可以選自相應(yīng)于SEQ ID NO :2或237的氨基酸殘基P2， P3, R4, L5, C7, D8, RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155，Y156，E159，R162，D165和R166，以及等位基因變體、種變體和其他變體中的對(duì)應(yīng)修飾。在非掩蔽is-HIT殘基處的舉例修飾包括P2A，P3S，P3A，R4H，R4Q，L5I，L5V，C7S， C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q，如 R4H ；F48I ； K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V 或 R4H，K52N, L153V和E159N，以及等位基因變體、種變體和其他變體中的對(duì)應(yīng)修飾。舉例的修飾的治療性多肽或其活性片段。這種修飾的治療性多肽或其活性片段的例子是具有選自 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/ R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ； L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/ K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/ L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/L93I/ R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/ R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ； R139H/E159N；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/ E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/ R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/ R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/ R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/ L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N 或 K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ； K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/ L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/ R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/K52N；K20Q/L801/Rl39H/E159N/ L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/Rl39H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/ L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N； R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N/ K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,和特別是 K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N,以及等位基因變體、種變體和其他變體中對(duì)應(yīng)修飾的修飾的那些。
配制為口服施用的藥物組合物中所述修飾的EPO多肽或其活性片段可以進(jìn)一步在糖基化位點(diǎn)N24，N38和N83的一或多個(gè)處包括或多個(gè)氨基修飾，其中所述修飾消除了在所述位點(diǎn)處的糖基化。這種修飾包括在選自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的殘基處的氨基酸置換和等位基因變體、種變體和其他變體中的對(duì)應(yīng)修飾。
本發(fā)明還提供了特定的修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽。在提供活性片段時(shí)，其中發(fā)生修飾。所述修飾的多肽可以被配制在藥物組合物中，包括用于口服和胃腸外施用或任何合適施用途徑的那些。所述修飾的EPO多肽和/或其活性片段可以用于治療易于用EPO治療的疾病或病癥。除了下文所述的修飾，本文提供的所述修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽還可以包括在糖基化位點(diǎn) N24，N38和N83的一或多個(gè)處的一或多個(gè)氨基修飾，其中所述修飾消除了所述位點(diǎn)處的糖基化，如選自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的氨基酸置換。
本文提供的所述修飾的EPO多肽包括長(zhǎng)度是160，161，162，163，164，165或166個(gè)氨基酸的那些多肽。所述未修飾的EPO多肽可以是具有或含有SEQ ID NO :2或237所示氨基酸序列的多肽，或可以是與具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的等位基因變體或種變體或其他變體。所述修飾的EPO多肽或其活性片段可以保留所述未修飾多肽的一或多種活性。所述修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修飾，其中所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；⒘蛩峄?、磷酸化、白蛋白化、氧化或與聚乙二醇(PEG)部分綴合的一或多種。所述修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修飾，其中所述額外的氨基酸修飾導(dǎo)致所述修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；⒘蛩峄?、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性發(fā)生改變。
本發(fā)明提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽、其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有一或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述在掩蔽的is-HIT殘基處的一或多個(gè)氨基酸修飾選自相應(yīng)于SEQ ID NO 2 或 237 所示殘基的 R14H，L16I, L16V, L17I，L17V，E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, P42S, D43Q, D43H, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, D123H, D136Q, D136H, D136N, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, R143H, R143Q和Y145H ；以及所述修飾的EPO多肽與不包含所述一或多個(gè)氨基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。所述在上述掩蔽的is-HIT殘基任一處的修飾可以是一種修飾。
本發(fā)明還提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有兩或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述兩或多個(gè)氨基酸修飾在掩蔽的is-HIT殘基處，選自相應(yīng)于SEQ ID NO 2 或 237 所示殘基的 R14H，R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I ；且所述修飾的EPO多肽與不包含所述兩或多個(gè)氨基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。這種多肽的例子是含有任一如下修飾的那些K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ； L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/ L80I ；R139H/L93V；R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V。
本發(fā)明還提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的EPO 多肽，其在EPO多肽、或其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有一或多個(gè)氨基酸修飾以及在非掩蔽的is-HIT殘基處的進(jìn)一步修飾，其中所述在掩蔽的 is-HIT殘基處的一或多個(gè)氨基酸修飾選自相應(yīng)于SEQ ID N0:2或237所示殘基的R14H， R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I，R131H， R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V,F142I，F(xiàn)142V，R143H，R143Q，Y145H和Y145I ；所述在非掩蔽的殘基處的一或多個(gè)氨基酸修飾選自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和R166Q ；且所述修飾的EPO多肽與不包含所述兩或多個(gè)氨基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。這種多肽和其活性片段的例子是含有選自如下修飾的任意多肽或片段:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N。
本發(fā)明還提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽或其等位基因變體或種變體或其他變體中含有一或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述修飾選自K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80U/R139H/L93I ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/K52N/L80I/R139H ；K20Q/ L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/ L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/ R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N ；K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/ L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I ；K20Q/L93V ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
本發(fā)明還提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因變體、種變體或其他變體中含有兩或多個(gè)修飾，其中至少一個(gè)修飾是相應(yīng)于SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示氨基酸殘基的R4H。其他修飾可以選自 P2S, P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I，E62Q，E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q， D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q，E159H，E159N，D165H，R166H，和 R166Q，如 K20Q ；F48I ；K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ； D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；D136N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ；R139Q ；和 L153V 或 K20Q ； F48I ；K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ； K116N ；K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。舉例的 EPO 多肽和其活性片段是具有在如下處的修飾或具有相應(yīng)于如下的修飾的那些R4H/R150H ；R4H/R143H ； R4H/E159N；R4H/R139H；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/ K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/ D123N；R4H/D136N；R4H/P90S ；R4H/D165Q；R4H/D165H；R4H/D165N；R4H/K116N；R4H/R143H ； R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H 和 R4H/L93I/E159N。
本發(fā)明還提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在SEQ ID NO :2或237所示多肽的等位基因變體或種變體或其他變體中或在位置上具有修飾。
修飾的EPO多肽在EPO多肽或其等位基因變體或種變體或其他變體中包含一或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述修飾的EPO多肽選自R4H/R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/K20Q ；R4H/ F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N ；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/D123N ；R4H/ D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N；R4H/R143H；R4H/R166H； R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H；R4H/R143Q/R150H ；R4H/L93I/ E159N。
本發(fā)明還提供了編碼本文提供的修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽任一的核酸分子。本發(fā)明提供了含有所述核酸分子的載體和含有所述載體和或核酸分子的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和藻類細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了含有本文提供的修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽和/或所述核酸、載體和/或細(xì)胞任一的藥物組合物。所述藥物組合物可以配制為用于任何施用途徑，如用于口服、胃腸外、靜脈內(nèi)，皮內(nèi)、皮下、口腔、吸入、粘膜內(nèi)、直腸或局部施用。例如，所述組合物可以是液體、乳液、懸浮液、氣霧劑、片劑、錠劑或包囊的形式，如腸溶包衣的片劑或包囊。所述藥物組合物可以配制用于口服施用至胃腸道。
在本文所有實(shí)施方案中，包括藥物組合物和方法和修飾的多肽的如下實(shí)施方案可以選擇。當(dāng)所述修飾的治療性多肽是EPO時(shí)，其長(zhǎng)度可以是160，161，162，163，164，165或 166個(gè)氨基酸。所述未修飾的多肽可以是氨基酸序列如SEQ ID NO :2或237所示的EPO多肽。所述顯示增加的蛋白酶抗性的修飾的治療性多肽可以保留與修飾的治療性多肽在相同條件下的未修飾的治療性多肽的一或多種活性或其他性質(zhì)，包括當(dāng)所述未修飾的治療性多肽是完全糖基化的。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以對(duì)消化道的蛋白酶顯示增加的蛋白酶抗性。所述增加的蛋白酶抗性可以通過(guò)所述修飾的治療性多肽在其口服施用或存在于消化道中時(shí)來(lái)顯示。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以包括進(jìn)一步的修飾，包括例如羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；?、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化、或與聚乙二醇(PEG)部分綴合的一或多種。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以含有導(dǎo)致修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性發(fā)生改變的一或多個(gè)額外的氨基酸修飾。
所述藥物組合物可以配制為固體、液體、凝膠或其他形式。當(dāng)組合物配制為用于口服施用時(shí)，其可以配制為片劑或包囊，如腸溶包衣的片劑或包囊是腸溶包衣的。
本發(fā)明提供了治療方法，其中給對(duì)象施用本文提供的任意藥物組合物以治療易于用特定治療性多肽治療的疾病或病癥。所述組合物可以任何合適途徑施用，包括但不限于胃腸外，如皮下，以及口服至消化道或配制為經(jīng)口或鼻的粘膜施用。當(dāng)所述修飾的治療性多肽或其活性片段是修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)時(shí)，易于用EPO治療的疾病或病癥包括伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎癥的貧血；圍手術(shù)期手術(shù)；鐵超載病癥；異常止血；組織保護(hù)治療；神經(jīng)性障礙；和自體捐血。貧血可以是地中海貧血，鐮刀細(xì)胞貧血，早產(chǎn)兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植后貧血。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示表示為帶狀的促紅細(xì)胞生成素的兩個(gè)視圖(A和B)。3個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)NM，N38和N83以及被選用于修飾蛋白酶抗性的代表性相應(yīng)的殘基(分別為K20Q， R139H和L80I)通過(guò)填充圖中的空白來(lái)顯示。被選用于蛋白酶抗性的另外的殘基也通過(guò)填充圖中的空白顯示(例如，R4H，L153V，E159N)。
圖2是鑒別為蛋白酶抗性的非掩蔽和掩蔽的is-HIT殘基的卡通圖示。所述非掩蔽殘基在暴露于蛋白酶解的位點(diǎn)并且可以是被突變以賦予對(duì)蛋白酶解增加的抗性的位點(diǎn)。所述掩蔽殘基是通過(guò)糖基化被正常屏蔽的位點(diǎn)，但是在所述多肽去糖基化時(shí)變成暴露的。所述掩蔽殘基是可以被突變以賦予對(duì)蛋白酶解增加的抗性的位點(diǎn)，且在所述多肽去糖基化或部分糖基化時(shí)(例如糖基化位點(diǎn)突變時(shí)，在不能糖基化的宿主中表達(dá)和/或在體內(nèi)施用時(shí)暴露于葡糖苷酶)的狀態(tài)下對(duì)蛋白酶講解提供保護(hù)。所述圖是僅用來(lái)舉例的促紅細(xì)胞生成素(EPO)的卡通圖示，但是掩蔽和非掩蔽的is-HIT殘基可以在任何糖基化的治療性多肽中鑒別。
發(fā)明詳述 結(jié)構(gòu)概述 A.定義 B.促紅細(xì)胞生成素(EPO) C.修飾的EPO多肽顯示增加的蛋白酶抗性 1.蛋白酶抗性 a.絲氨酸蛋白酶 b.基質(zhì)金屬蛋白酶 C.通過(guò)去除蛋白酶解位點(diǎn)對(duì)蛋白酶解增加的抗性 d.修飾的EPO LEAD多肽顯示增加的蛋白酶抗性 2.Super-LEAD 3.其他EPO修飾 a.免疫原性 b.糖基化 C.額外或可選擇的修飾 D.通過(guò)治療性多肽的蛋白酶抗性修飾缺失的糖基化的補(bǔ)償 1.鑒別掩蔽殘基的方法 2.在掩蔽位點(diǎn)含有蛋白酶抗性修飾的EPO多肽 3.在掩蔽位點(diǎn)含有蛋白酶抗性修飾的其他治療性多肽 a.GM-CSF b.M-CSF C.G-CSF d.LIF e.白細(xì)胞介素1β f.白細(xì)胞介素2 g·白細(xì)胞介素3 h.白細(xì)胞介素4 i.白細(xì)胞介素5 j·白細(xì)胞介素6 k.制癌蛋白M 1.干細(xì)胞因子 m.干擾素β η.干擾素Y 4.治療性多肽的其他修飾 a.增加溶解度的修飾 E.進(jìn)化或修飾EPO多肽和其他修飾的治療性多肽的示例方法 1.非限制性理性誘變一維(ID)-掃描 2.二維QD)理性掃描(限制理性誘變) a.鑒別 in-silico HIT b.鑒別置換氨基酸 c.構(gòu)建突變蛋白和生物學(xué)測(cè)定 3.三維(3D)掃描 a.同源性 b.3D-掃描(結(jié)構(gòu)同源性)方法 4.Super-LEAD 禾口累力口定向誘變(additive directional mutagenesis) (ADM) 5.多重疊引物延伸 F.對(duì)蛋白酶解具有增加的抗性的EPO變體的評(píng)估 G.生產(chǎn)EPO多肽和其他治療性多肽 1.表達(dá)系統(tǒng) a.原核表達(dá) b.酵母 c.昆蟲和昆蟲細(xì)胞 d.哺乳動(dòng)物細(xì)胞 e.植物 2.純化 3.融合蛋白 4.多肽修飾 5.核苷酸序列 H.評(píng)估修飾的EPO多肽性質(zhì)和活性 1.體外測(cè)定 2.非人動(dòng)物模型 3.臨床測(cè)定 I.配制/包裝/施用 1.施用修飾的EPO多肽和其他修飾的治療性多肽 2.施用編碼修飾的EPO多肽或其他修飾的治療性多肽的核酸(基因治療) J.治療應(yīng)用 1.貧血 2.組織保護(hù)性治療 K.診斷應(yīng)用 L.組合治療 M.產(chǎn)品和試劑盒 N.修飾的EPO多肽和其他修飾的治療性多肽的抗體 0.實(shí)施例 A.定義 除非另有說(shuō)明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常見的含義。所有專利，專利申請(qǐng)，公開出版物，GenBank序列，網(wǎng)站以及其他公開材料除非另有說(shuō)明包含在此作為參考。如果本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)有多種定義，以本部分中為準(zhǔn)。描述URL或其他鑒定子或地址時(shí)，應(yīng)理解所述鑒定子可改變并且因特網(wǎng)上的具體信息隨時(shí)更新，相關(guān)信息可通過(guò)搜索因特網(wǎng)找到。其公開內(nèi)容可作為公眾所得的依據(jù)。
本發(fā)明中，“治療性多肽”是給動(dòng)物諸如人對(duì)象施用的多肽，用于治療疾病或病癥。 治療性多肽是本領(lǐng)域已知的，通常是具有體內(nèi)活性的多肽，諸如細(xì)胞因子(例如，促紅細(xì)胞生成素(EPO))，并可經(jīng)研究治療疾病或病癥(即緩解疾病或病癥的癥狀)。所述多肽可通過(guò)任何方法制備，由此包括但不限于，重組產(chǎn)生的多肽，合成產(chǎn)生的多肽，治療性多肽，其提取自細(xì)胞或組織和其他來(lái)源。從任何來(lái)源分離或制備的成熟治療性多肽長(zhǎng)度不同。治療性多肽的異源性根據(jù)所述治療性多肽的來(lái)源不同。由此治療性多肽指制備或分離的異源群體。 同源制備物將說(shuō)明其為同源的。治療性多肽還涉及它們的單體、二聚體或其他形式的多聚體。
人治療性多肽包括等位基因變體同種型，編碼核酸分子產(chǎn)生的合成分子，分離自人組織和細(xì)胞的蛋白，合成蛋白及其修飾形式。示例性未修飾的成熟人治療性多肽包括但不限于，未修飾的和天然(即野生型)治療性多肽和包含信號(hào)肽的未修飾的以及天然前體治療性多肽和/或原肽，以及多形性天然治療性多肽。其他示例性人治療性多肽是在N-或 C-末端截短的那些。
治療性多肽也包括治療性多肽的等位基因變體或種變體，以及其截短形式或片段，其中含有除增加蛋白酶抗性的修飾以外的修飾。治療性多肽包括來(lái)自不同物種的同源多肽，包括但不限于動(dòng)物，包括人和非人物種，諸如其他哺乳動(dòng)物。與人治療性多肽一樣， 非-人治療性多肽也包括足夠長(zhǎng)的治療性多肽的不同長(zhǎng)度或片段或部分或包括保持全長(zhǎng)成熟多肽的至少一種活性的適當(dāng)區(qū)域。
非-人治療性多肽包括治療性多肽，等位基因變體同種型，從核酸制備的合成分子，從非人組織和細(xì)胞分離的蛋白，以及其修飾的形式。非人來(lái)源的治療性多肽包括但不限于，牛，綿羊，豬，馬，鼠，野兔，犬，貓，禽和其他靈長(zhǎng)類，諸如黑猩猩和短尾猿來(lái)源的治療性多肽。
本發(fā)明中，“天然治療性多肽”指存在天然生物體中天然存在的基因編碼的治療性多肽，所述生物體包括人或其他動(dòng)物。天然治療性多肽包括編碼的前體多肽，其片段或加工的形式，諸如缺乏信號(hào)肽的成熟形式以及任何翻譯前或翻譯后加工或修飾的形式。天然治療性多肽還包括經(jīng)過(guò)翻譯后修飾的那些，所述修飾包括但不限于通過(guò)糖基化，羧化，羥基化，hasylation,氨甲?；蛩峄?，和磷酸化修飾的那些。
本發(fā)明中，非-糖基化的多肽是不具有糖基化的多肽(即不含附著于蛋白糖基化位點(diǎn)的碳水化合物部分)。非糖基化多肽通過(guò)在宿主諸如原核宿主中表達(dá)產(chǎn)生，所述的宿主不糖基化所述多肽，或通過(guò)消除所有糖基化位點(diǎn)(例如糖基化位點(diǎn)突變)產(chǎn)生。
本發(fā)明中，糖基化位點(diǎn)指多肽中可連接碳水化合物部分的氨基位置。通常糖基化蛋白含有一或多個(gè)氨基酸殘基，諸如精氨酸或絲氨酸以連接碳水化合物部分。
本發(fā)明中，完全糖基化的多肽是在該多肽中所有天然糖基化位點(diǎn)均被糖基化的多肽。
本發(fā)明中，去糖基化的多肽與天然糖基化蛋白相比糖基化減少，因?yàn)槠渲懈街嚯牡奶妓衔锊糠州^少，諸如由于通過(guò)突變?nèi)コ溯^少直到所有糖基化位點(diǎn)。去糖基化的多肽也包括其中一或多個(gè)碳水化合物部分通過(guò)化學(xué)或酶裂解去除或部分去除的多肽。
本發(fā)明中，天然糖基化位點(diǎn)指天然多肽天然生成時(shí)其中連接碳水化合物部分的氨基。
本發(fā)明中，“天然多肽”指生物體包括人或其他動(dòng)物中天然存在的基因編碼的多肽。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在相同條件下產(chǎn)生”指利用相同的生產(chǎn)方法產(chǎn)生每種多肽來(lái)制備兩或多種多肽。
本發(fā)明中，“促紅細(xì)胞生成素”多肽(EPO)指任何促紅細(xì)胞生成素多肽，包括但不限于，重組產(chǎn)生的多肽，合成產(chǎn)生的多肽，天然EPO多肽，從細(xì)胞以及組織提取的促紅細(xì)胞生成素多肽，所述組織包括但不限于腎、肝、尿和血液。促紅細(xì)胞生成素的其他名稱包括印oietin。促紅細(xì)胞生成素簡(jiǎn)稱包括EPO，hEPO (人促紅細(xì)胞生成素)，和rhuEP0(重組人促紅細(xì)胞生成素)。促紅細(xì)胞生成素包括不同物種的相關(guān)多肽，包括但不限于人或非人源動(dòng)物。人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)包括促紅細(xì)胞生成素，等位基因變體同種型，來(lái)自核酸的合成分子，分離自人組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)，及其修飾形式。示例性未修飾的成熟人促紅細(xì)胞生成素多肽包括但不限于，未修飾的野生型天然促紅細(xì)胞生成素多肽(諸如包含序列SEQ ID NO :2或237的多肽)以及未修飾的包括信號(hào)肽的野生型前體促紅細(xì)胞生成素多肽(例如， SEQ ID N0:1的前體EPO多肽)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解成熟促紅細(xì)胞生成素多肽(SEQ ID NO 2)的位置與前體EPO多肽SEQ ID NO 1相差27個(gè)氨基酸殘基，SEQ ID NO :1是含有信號(hào)肽序列的促紅細(xì)胞生成素多肽。SEQ ID NO :2的第1個(gè)氨基酸殘基“對(duì)應(yīng)”SEQ ID NO=I 的第觀個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素”也包括從成熟EPO多肽(SEQ ID NO 2)通過(guò)蛋白酶解裂解C末端精氨酸制備的促紅細(xì)胞生成素多肽或C末端精氨酸已經(jīng)去除的重組 EPO多肽(例如，SEQ ID NOS :236 (前體)和237 (成熟))。本發(fā)明的EPO多肽可進(jìn)一步修飾，諸如通過(guò)化學(xué)修飾或翻譯后修飾。所述修飾包括但不限于，PEG化，白蛋白化，糖基化， 法尼基化(farnysylation)，羧化，羥基化，hasylation，氨甲酰化，硫酸化，磷酸化，和其它已知多肽修飾。本發(fā)明的EPO多肽可通過(guò)對(duì)一級(jí)氨基酸序列的缺失、添加或取代一或多個(gè)氨基酸進(jìn)一步修飾。
任何物種的促紅細(xì)胞生成素包括促紅細(xì)胞生成素(本發(fā)明中，種變體)，包括人和非-人物種。非-人來(lái)源EPO多肽包括但不限于，鼠、犬、貓、野兔、禽、牛，綿羊，豬，馬， 魚，蛙和其他靈長(zhǎng)類的促紅細(xì)胞生成素多肽。示例性非-人來(lái)源EPO多肽包括，例如，獼猴 (Macaca mulatta，例如，SEQ ID N0:202)，小鼠(Mus musculus，例如，SEQ ID N0:203)，大鼠(Rattusnorvegicus，例如，SEQ ID NO :204)，豬(Sus scrofa，例如，SEQ ID NO :205)， 犬(Canis familiaris，例如，SEQ ID NO :206)，貓(Felis catus，例如，SEQ ID NO :207)， 兔(Oryctolagus cuniculus，例如，SEQ ID NO :208)，公牛(Bos taurus，例如，SEQ ID N0:209)，馬(Equus caballus，例如，SEQ ID N0:210)，綿羊(Ovis aries，例如，SEQ ID NO: 211)，黑猩猩(Pan troglodytes，例如，SEQ ID NO :212)，斑馬魚(Danio rerio，例如， SEQ ID NO :213)，日本河飩魚(Takifugu rubripes，例如，SEQ ID NO :214)，猩猩(Pongo pygmaeus，例如，SEQ ID NO :225)，大猩猩(Gorilla gorilla，例如，SEQ ID NO :226)等 (例如，SEQ ID NOS :215-224)。通常，人EPO多肽種變體與人EPO多肽相比具有至少40%， 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高氨基酸相同性。
人和非-人EPO多肽包括EPO多肽，等位基因變體同種型，組織特異性同種型和等位基因變體，具有一或多個(gè)氨基酸突變、取代、缺失、插入或添加的合成變體，通過(guò)翻譯核酸制備的合成分子，分離自人和非人組織和細(xì)胞的蛋白，嵌合EPO多肽及其修飾形式。人和非-人EPO也包括足夠長(zhǎng)的EPO的片段或部分或包括適宜區(qū)域以保持全長(zhǎng)成熟多肽的至少一種活性。另外，本發(fā)明中的修飾EPO多肽的片段或部分包含一或多個(gè)本發(fā)明所述的氨基酸修飾(例如表3所示氨基酸修飾)。
本發(fā)明中，“成熟促紅細(xì)胞生成素”指缺乏信號(hào)序列的EPO多肽。通常信號(hào)序列靶向蛋白用于通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)高爾基途徑分泌并在插入ER中之后的翻譯過(guò)程中被裂解。因此，成熟EPO多肽通常是分泌型多肽。一個(gè)實(shí)例中，成熟人EPO多肽如SEQ ID N0:2所示。 SEQ ID NO 2所示氨基酸序列與SEQ ID NO 1所示前體多肽的區(qū)別在于SEQ ID N0:2缺少信號(hào)序列，所述信號(hào)序列包括SEQ ID NO 1的殘基1-觀。
本發(fā)明中，“天然促紅細(xì)胞生成素”指存在生物體包括人或其他動(dòng)物中的天然EPO 基因編碼的EPO多肽。天然EPO多肽包括編碼的前體多肽，其片段，以及加工的形式，諸如缺乏信號(hào)肽的成熟形式以及任何翻譯前或翻譯后加工的或修飾的形式。例如，人表達(dá)ΕΡ0。 示例性天然人EPO序列是SEQ ID NO 1(具有信號(hào)肽的前體ΕΡ0)和SEQ ID NO 2 (缺乏信號(hào)肽的成熟ΕΡ0)。天然EPO多肽還包括經(jīng)翻譯后修飾的那些，包括但不限于通過(guò)糖基化，羧化，羥基化，hasylation，氨甲?；?，硫酸化，和磷酸化修飾。天然EPO多肽也包括在SEQ ID NO 2的R166發(fā)生蛋白酶解裂解的那些。其他動(dòng)物產(chǎn)生天然ΕΡ0，包括但不限于，靈長(zhǎng)類，小鼠，大鼠，豬，狗，貓，兔，雞，牛，羊，蛙和魚。其他動(dòng)物的示例性天然EPO序列如SEQ ID NOS 202-226 所示。
本發(fā)明中，“蛋白酶-抗性多肽”是與天然或野生型多肽相比其一級(jí)氨基酸序列中包含一或多種修飾并與沒有所述一或多個(gè)氨基酸取代的天然或野生型多肽相比顯示增加的蛋白酶解抗性的蛋白。
本發(fā)明中，經(jīng)對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行修飾而具有蛋白酶抗性的多肽指在多肽的一級(jí)序列中的一或多個(gè)氨基酸修飾的多肽，其賦予蛋白酶抗性。其中包括不導(dǎo)致在該位點(diǎn)的翻譯后修飾的改變。
對(duì)蛋白酶抗性增加可通過(guò)檢測(cè)暴露于胃腸道和/或血清中的具體蛋白酶之后的活性來(lái)評(píng)估。通常與缺乏賦予所述抗性的氨基酸序列中的改變的相同多肽相比，蛋白酶抗性增加至少約 1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，20%，30%，40%，50%， 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300%,400%, 500%,或更多。其他實(shí)施方案中，與缺乏賦予抗性的氨基酸序列改變的相同多肽相比，口服配制劑中變體多肽的蛋白酶抗性增加至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍，200倍，300倍， 400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，1000倍，或更多。
本發(fā)明中，“蛋白酶解抗性”指多肽被蛋白酶解劑的裂解的任何量的降低，諸如蛋白酶。這可通過(guò)修飾易被具體蛋白酶裂解的多肽中的具體氨基酸殘基使得該多肽與沒有所述修飾的多肽在相同蛋白酶、相同條件下相比對(duì)裂解的易感性降低。顯示蛋白酶解抗性增加的修飾的多肽與缺乏所述氨基酸修飾的相同多肽相比顯示例如，1^,2% ,3^,4^,5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %,或更多的蛋白酶解抗性。
本發(fā)明中，“蛋白酶，” “蛋白質(zhì)酶”或“肽酶”可互換使用，指催化共價(jià)肽鍵的水解的酶。蛋白酶包括，例如，絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶或絲氨酸內(nèi)肽酶構(gòu)成一類肽酶，特征是存在位于酶活性中心的絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶參與機(jī)體的多種功能，包括血液凝結(jié)、炎癥以及原核生物和真核生物中的消化酶?！敖z氨酸蛋白酶”裂解的機(jī)制基于絲氨酸對(duì)靶肽鍵的親核攻擊。半胱氨酸，蘇氨酸或與天冬氨酸或金屬結(jié)合的水分子也起到這樣的作用。絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的排列的側(cè)鏈形成大多數(shù)絲氨酸蛋白酶常見的催化三體。絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)形狀是裂縫狀，其中結(jié)合有多肽底物。多肽底物N 末端到C末端的氨基酸殘基標(biāo)記為(Pi,…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)。代表性結(jié)合亞位點(diǎn)被標(biāo)記(Si，...，S3，S2，S1，S1'，S2'，S3'，...，Sj)。裂解在Pl和PI，之間催化。
本發(fā)明中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)指任何家族的金屬依賴性，諸如Si2+-依賴性，內(nèi)肽酶，其降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組分。MMP包括四個(gè)類型膠原蛋白酶，基質(zhì)降解酶，膜型金屬蛋白酶以及明膠酶。MMP和纖溶酶原激活物的蛋白裂解活性，以及其抑制物，對(duì)于保持 ECM完整性是重要的。細(xì)胞-ECM反應(yīng)影響并介導(dǎo)多種過(guò)程，包括各種細(xì)胞類型的增殖，分化，粘附以及遷移。MMP也加工多種細(xì)胞表面因子，受體和其他可溶蛋白并參與組織重構(gòu)，諸如創(chuàng)傷愈合，懷孕和血管生成。在體內(nèi)生理?xiàng)l件下，MMP作為非活性前體(酶原)合成并被裂解以產(chǎn)生活性形式。此外，所述酶被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的內(nèi)源性抑制物特異性調(diào)節(jié)。
本發(fā)明中，相應(yīng)的殘基指與等位基因變體或種變體或其他同種型多肽相比而言的殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易鑒定所述多肽中的相應(yīng)殘基。例如，通過(guò)排列EPO多肽的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可鑒定相應(yīng)的殘基，利用保守且相同的氨基酸殘基作為指引。例如，SEQ ID N0:2(成熟促紅細(xì)胞生成素)的Al對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :1 (前體促紅細(xì)胞生成素，其具有信號(hào)肽序列)的A28。另外的情況中可鑒定相應(yīng)的區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用保守氨基酸作為指引發(fā)現(xiàn)人和非人序列中的相應(yīng)氨基酸殘基。例如，前體人EPO SEQ ID N0:1的殘基 P148(成熟人EPO SEQ ID NO :2的殘基P121)對(duì)應(yīng)前體小鼠EPO SEQ ID NO :203中的殘基 P147。
本發(fā)明中，促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽或其他治療性多肽的“活性部分或片段”指多肽的部分，其包括至少一種本發(fā)明的修飾并顯示活性，諸如全長(zhǎng)多肽的一或多種活性或具有其他活性。例如，對(duì)于EPO多肽，所述活性包括但不限于，紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性。 活性可為全長(zhǎng)多肽活性的百分?jǐn)?shù)(更多或更少)，包括但不限于與全長(zhǎng)多肽相比1%，2%，3%,4%,5%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 的活性，或更高的活性。所述活性可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。確定EPO多肽或其他修飾的治療性多肽的功能或活性的實(shí)驗(yàn)包括本領(lǐng)域已知的那些，本發(fā)明中也進(jìn)行了舉例說(shuō)明。EPO多肽的測(cè)定包括，例如，但不限于紅細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)以測(cè)定治療性益處?；钚砸舶‥PO多肽的片段或修飾的形式或其他修飾的治療性多肽具有而全長(zhǎng)多肽或未修飾的EPO多肽不具有的活性。
本發(fā)明中，“未修飾的靶蛋白，” “未修飾的蛋白，” “未修飾的多肽，” “未修飾的ΕΡ0，” “未修飾的治療性多肽”以及其語(yǔ)法變體指這樣的起始多肽，其被選用于本發(fā)明所述的修飾。起始靶多肽可為天然存在的野生型多肽。此外，起始靶多肽可改變或突變，從而與天然野生型同種型不同，但相對(duì)于修飾的多肽在本文也稱為起始未修飾靶多肽。因此，本領(lǐng)域已知的存在蛋白被修飾從而與未修飾的參比多肽相比具有所需的具體活性或性質(zhì)的增加或降低可被選出并用作起始未修飾靶蛋白。例如，這樣的蛋白可為靶蛋白通過(guò)一或多個(gè)但氨基酸改變對(duì)其天然形式修飾并具有所需的性質(zhì)的增加或降低，諸如免疫原性降低(見例如，美國(guó)專利申請(qǐng)2004-0063917，2005-0220800，2006-035322，和 2006-0073563)或改變其氨基酸殘基以改變糖基化，在本文稱為未修飾的蛋白，以相同或不同性質(zhì)的進(jìn)一步修飾。本領(lǐng)域已知的示例性修飾的EPO多肽包括任何EPO多肽例如，美國(guó)專利 4，703，008，4，835，260，5，457，089，5，614，184，5，856，298，6，831，060，6，555，343， 6，831，060，和 7，041，794 ；美國(guó)專利申請(qǐng) 2004-0063917，2005-0107591，2005-0176627， 2006-029094,和 2006-0008872 ；國(guó)際專利公開 W08603520, EP0640619, W004003176, EP1228214, W005103076, W09424160W09012874 中所述的那些。
現(xiàn)有技術(shù)中已知的現(xiàn)存蛋白質(zhì)可以如本文所述選擇和使用以鑒別在其它結(jié)構(gòu)同源的靶蛋白質(zhì)上的結(jié)構(gòu)同源的基因座，所述現(xiàn)存蛋白質(zhì)先前已被修飾以在特定生物學(xué)活性或性質(zhì)中與未修飾的或參考蛋白質(zhì)相比具有希望的改變?nèi)缭黾踊蚪档?。例如，已通過(guò)一或多個(gè)單氨基酸變化修飾并具有希望的性質(zhì)或活性例如對(duì)蛋白酶解的抗性的增加或降低的蛋白質(zhì)可以用于本文提供的方法中，以在結(jié)構(gòu)同源的靶蛋白質(zhì)上鑒別相應(yīng)的結(jié)構(gòu)同源的基因座，所述基因座可以用合適的置換氨基酸置換并測(cè)試其希望的活性的增加或降低。
如本文所用，EPO多肽或其他治療多肽的“活性”或“功能活性”是指由所述多肽顯示的任何活性。這種活性可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。對(duì)于EPO多肽，這種活性包括但不限于促紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性。活性可以用已知的測(cè)定體外或體內(nèi)評(píng)估。例如，對(duì)于EPO多肽，活性可以通過(guò)體外或體內(nèi)測(cè)量紅細(xì)胞增殖而評(píng)估。這種測(cè)定的表明多肽顯示活性的結(jié)果可以與多肽的體內(nèi)活性相關(guān)，其中體內(nèi)活性可以被稱為治療活性或生物學(xué)活性。修飾的多肽的活性可以是未修飾多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于與未修飾多肽相比的活性、 2%,3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多活性。用于確定EPO修飾形式的功能性或活性的測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。舉例性的評(píng)估EPO多肽活性的測(cè)定包括促紅細(xì)胞生成測(cè)定，其測(cè)量紅細(xì)胞增殖并在實(shí)施例中描述。
如本文所用，“治療活性”是指治療多肽的體內(nèi)活性。通常，治療活性是用于治療疾病或病癥的活性。修飾多肽的治療活性可以是未修飾多肽的治療活性的任何百分比水平，包括但不限于與未修飾多肽相比的1%活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%, 200 300%,400%, 500 %或更多治療活性。
如本文所用，糖基化對(duì)于“治療活性是所需的”或“對(duì)于治療活性是重要的”是指多肽的糖基化形式具有比治療多肽的去糖基化或非糖基化形式(即未糖基化的多肽形式， 如在細(xì)菌宿主中表達(dá)的多肽)更高的治療活性(當(dāng)施用時(shí)的體內(nèi)活性)。例如，如果糖基化多肽的治療活性高于非糖基化形式，特別是非糖基化形式不能用于治療時(shí)，糖基化是治療活性所需的。這種活性差異依賴于蛋白質(zhì)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到特定蛋白質(zhì)是否適合治療用途。這種蛋白質(zhì)的舉例是促紅細(xì)胞生成素(EPO)，其是糖基化蛋白，并且作為糖基化蛋白治療性施用。糖基化治療蛋白形式與非糖基化形式的活性差異如所述依賴于蛋白質(zhì)，但是可以比治療多肽的去糖基化或非糖基化形式的治療活性高15 %、25 %、30 %、50 %、 100%，包括至少或大約1倍，至少或大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、 20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、 600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。
如本文所用，“顯示至少一種活性”或“保持至少一種活性”是指由修飾的多肽如修飾的EPO多肽或其它治療多肽顯示的與不含修飾的多肽相比的活性。保持未修飾多肽的活性的修飾多肽可以顯示改良的活性或保持未修飾多肽的活性(例如，EPO多肽的促紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性)。在一些情況中，修飾多肽可以保持與未修飾多肽相比增加的活性。在一些情況中，修飾多肽可以保持與未修飾多肽相比降低的活性。修飾多肽的活性可以是未修飾多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于與未修飾多肽相比的活性、2%、 3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高活性。例如，修飾 EPO 多肽保持至少大約或 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少 99% 的未修飾多肽的活性。在其它實(shí)施方案中，活性變化高于未修飾多肽至少大約2倍、3倍、4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、 200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。保持活性的測(cè)定取決于待保持的活性。這種測(cè)定可以體外或體內(nèi)進(jìn)行?；钚钥梢岳缬矛F(xiàn)有技術(shù)已知并且在下述實(shí)施例中描述的測(cè)定測(cè)量，例如但不限于細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活活性。與未修飾多肽相比修飾多肽的活性也可以基于在施用多肽后體內(nèi)治療或生物學(xué)活性或結(jié)果評(píng)估。例如，對(duì)于EPO多肽，這種活性包括但不限于血細(xì)胞比容水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞質(zhì)量、 血漿鐵周轉(zhuǎn)率、骨髓通過(guò)時(shí)間(marrow transit time)或血紅蛋白濃度(即血紅蛋白C合成刺激)或網(wǎng)織紅細(xì)胞應(yīng)答刺激中的改變。
如本文所用，促紅細(xì)胞生成素或其它治療多肽的“性質(zhì)”是指促紅細(xì)胞生成素多肽或治療多肽顯示的任何性質(zhì)。這種性質(zhì)包括但不限于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白酶解抗性、構(gòu)象穩(wěn)定性、熱耐受性及PH條件耐受性。性質(zhì)變化可以改變多肽的“活性”。例如，治療多肽的蛋白酶抗性的變化可以改變體內(nèi)治療多肽。
如本文所用，“蛋白質(zhì)穩(wěn)定性”是指在一或多種條件下增加的蛋白質(zhì)半壽期，所述條件包括但不限于暴露于蛋白酶、增加溫度、特定PH條件和/或暴露于變性成分。由多肽顯示的增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性可以體現(xiàn)為增加的蛋白酶抗性或增加的構(gòu)象穩(wěn)定性如增加的溫度、PH耐受性或?qū)ζ渌冃猿煞值哪褪苄?。顯示體外或體內(nèi)增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的修飾多肽比修飾多肽更穩(wěn)定例如1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 100%,200%,300%,400%,500%或更高。多肽的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性例如可以在蛋白酶抗性或構(gòu)象穩(wěn)定性(例如對(duì)溫度變化的抗性)測(cè)定中評(píng)估以確定多肽的活性是否改變，如下述實(shí)施例所述。例如，修飾多肽與野生型多肽相比對(duì)蛋白酶(例如α-胰凝乳蛋白酶，羧肽酶， 內(nèi)蛋白酶Arg-C，內(nèi)蛋白酶Asp-N，內(nèi)蛋白酶Glu_C，內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶)酶解的抗性可以憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試，其是通過(guò)用蛋白酶處理多肽一定時(shí)間，然后測(cè)試多肽的殘余功能活性如促紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性。
如本文所用，“血清穩(wěn)定性”是指血清中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
如本文所用，“蛋白酶解抗性”是指蛋白酶解劑如蛋白酶對(duì)多肽裂解的任何量的降低。這可以通過(guò)修飾對(duì)特定蛋白酶裂解敏感的特定氨基酸殘基以使它們與在相同條件下由相同蛋白酶的裂解相比對(duì)裂解較不敏感。顯示增加的蛋白酶解抗性的修飾多肽顯示例如比未修飾多肽高 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%, 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300 %、400 %、500 %或更多的蛋白酶解抗性。
如本文所用，“蛋白酶敏感位點(diǎn)”是多肽中對(duì)特定蛋白酶裂解敏感的氨基酸位置。 蛋白酶敏感位點(diǎn)在本文中與蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)或蛋白酶裂解位點(diǎn)互換使用。
如本文所用，“構(gòu)象穩(wěn)定性”是指多肽對(duì)變性的耐受性的任何量的增加。這可以如下實(shí)現(xiàn)修飾對(duì)變性條件敏感的特定氨基酸殘基以使它們?cè)谙嗤瑮l件下對(duì)變性較不敏感。 構(gòu)象穩(wěn)定性可以通過(guò)評(píng)估多肽對(duì)變性條件的抗性或易感性而確定，例如對(duì)溫度或PH的抗性。顯示增加的構(gòu)象穩(wěn)定性的修飾多肽顯示例如高于未修飾多肽1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多的抗性。
如本文所用，“變性”是指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的任何非共價(jià)變化。這一變化可以改變多肽分子的二級(jí)、三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽的變性可以通過(guò)例如但不限于暴露于離液劑如脲和鹽酸胍、去污劑、溫度、PH和裂解二硫橋的試劑如二硫蘇糖醇而實(shí)現(xiàn)。
如本文所用，“熱耐受性”是指任何溫度影響的或依賴的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化。例如，一種變化如增加的熱耐受性，可以反映在暴露于改變的(特別是增加的)溫度之后或與相同條件下的未修飾蛋白質(zhì)相比降低的多肽變性的量。顯示增加的熱耐受性的修飾多肽顯示出在變化的溫度下與未修飾多肽相比高1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%,99%,100%,200%,300%,400%,500%或更高的穩(wěn)定性。例如，修飾多肽當(dāng)給對(duì)象施用時(shí)可以顯示與未修飾多肽相比增加的體內(nèi)熱耐受性，由此顯示增加的血清半壽期。
如本文所用，"EC5tl”是指產(chǎn)生一半的最大應(yīng)答所需的治療多肽的有效濃度。為本文目的，所測(cè)量的應(yīng)當(dāng)是EPO的任何活性，例如但不限于在促紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)測(cè)定中的活性。
如本文所用，“半壽期”是指測(cè)量的參數(shù)如多肽分子的效力、活性和有效濃度下落到其原始水平的一半如其在0時(shí)間點(diǎn)的原始效力、活性或有效濃度的一半所需的時(shí)間。因此，多肽分子的參數(shù)如效力、活性或有效濃度通常隨時(shí)間測(cè)量。為本文目的，半壽期可以體外或體內(nèi)測(cè)量。例如，治療多肽或修飾的治療多肽的半壽期可以體外測(cè)量，即在一定條件下，例如在暴露于蛋白酶或變性條件如溫度或PH下評(píng)估在保溫后隨時(shí)間增加的活性(例如促紅細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性)。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療多肽或修飾的治療多肽的半壽期可以在將多肽施用(例如靜脈內(nèi)、皮下、十二指腸內(nèi)、口服)給人類或其它動(dòng)物后體內(nèi)測(cè)量， 隨后隨時(shí)間取血樣以確定血樣中多肽的剩余有效濃度和/或活性。
如本文所用，“治療多肽介導(dǎo)的疾病或病癥”是指任何這樣的疾病或病癥，其中用治療多肽(或修飾的治療多肽)治療改善了該疾病或病癥的任何癥狀或表現(xiàn)。
如本文所用，“促紅細(xì)胞生成素或EPO介導(dǎo)的疾病或病癥”是指任何這樣的疾病或病癥，其中用促紅細(xì)胞生成素(或修飾的促紅細(xì)胞生成素)治療改善了該疾病或病癥的任何癥狀或表現(xiàn)。舉例的促紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的疾病或病癥包括但不限于貧血如慢性炎癥、 腎衰竭、AIDS、惡性腫瘤導(dǎo)致的貧血或使用EPO多肽的組織保護(hù)活性以在應(yīng)答性哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官損傷后保護(hù)抗損傷或功能恢復(fù)的疾病或病癥。
如本文所用，“治療”患有疾病或病癥的對(duì)象是指對(duì)象的癥狀部分或完全減輕，或者在治療后保持穩(wěn)定。因此治療包括預(yù)防、治療和/或治愈。預(yù)防是指防止?jié)撛诩膊』虿“Y和/或防止癥狀惡化或疾病或病癥的進(jìn)展。防止疾病或病癥包括減輕或消除導(dǎo)致疾病或病癥發(fā)生的一或多種風(fēng)險(xiǎn)因子。治療還包括本文提供的修飾的治療多肽和口服組合物的任何藥物學(xué)應(yīng)用。
如本文所用，治療包括預(yù)防、治療和/或治愈。例如，治療包括本文提供的修飾的促紅細(xì)胞生成素或其它治療多肽及本文提供的其組合物的任何藥物學(xué)應(yīng)用。
如本文所用，預(yù)防是指防止?jié)撛诩膊『?或防止癥狀惡化或疾病的進(jìn)展。
如本文所用，防止是指絕對(duì)防止特定疾病或病癥。因?yàn)橥ǔ２荒艽_定疾病或病癥是否從未發(fā)生，因此防止還包括降低發(fā)生或患有疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
如本文所用，不包括外源加入的蛋白酶的組合物是未添加蛋白酶而配制的組合物。組合物中存在的任何另外的蛋白酶產(chǎn)生自配制方法。
如本文所用，“施用的治療有效量”或“治療有效劑量”是指至少足以在對(duì)象中產(chǎn)生治療作用的劑量配制品(dosage formulation)中的藥劑、化合物、材料的量。典型地，所述的量足夠高，以在血液中達(dá)到治療有效量。要達(dá)到的血液中的治療有效量對(duì)于方法中采用的許多治療多肽是已知的，針對(duì)未修飾多肽已建立劑量配制品有效劑量。對(duì)于修飾蛋白質(zhì)， 用于治療的蛋白酶抗性多肽的治療有效量將根據(jù)被治療的特定條件、被治療的患者的年齡及物理?xiàng)l件、病癥的嚴(yán)重性、治療持續(xù)時(shí)間、并行治療的性質(zhì)、采用的特定蛋白酶抗性多肽、 特定的藥物學(xué)可接受賦形劑和/或主治醫(yī)師的知識(shí)和技能范疇內(nèi)的因素而變化。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥物學(xué)可接受賦形劑”包括任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生理學(xué)惰性、藥物學(xué)無(wú)活性材料，其與選擇使用的特定蛋白酶抗性多肽的物理化學(xué)特征相容。藥物學(xué)可接受賦形劑包括但不限于聚合物、樹脂、增塑劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、溶劑、共溶劑、緩沖系統(tǒng)、表面活性劑、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、藥物級(jí)染料或顏料及粘度劑。本文描述的藥物組合物中含有的藥物學(xué)可接受賦形劑的全部或部分可以是腸溶包衣的部分。
如本文所用，治療多肽的“ 口服施用”或“ 口服遞送”是指通過(guò)攝食而將治療多肽施用給胃腸道。典型地，本文提供的用于口服施用的組合物與粘膜遞送不同之處在于治療多肽被遞送至低位腸道以吸收進(jìn)血液。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低位腸道”是指小腸和大腸。
如本文所用，“粘膜施用”或“粘膜遞送”治療多肽是指將治療多肽施用粘膜表面， 包括鼻、肺、陰道、直腸、尿道和舌下或頰遞送。
如本文所用，“口腔粘膜(oromucosal)，，是指口腔和/或鼻咽腔的粘膜層。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腸溶包衣”涉及藥物學(xué)可接受賦形劑的混合物，其施加于蛋白酶抗性多肽、與蛋白酶抗性多肽組合、與蛋白酶抗性多肽混合或其它方式加入到蛋白酶抗性多肽。腸溶包衣實(shí)現(xiàn)在低位腸道釋放蛋白酶抗性多肽并防止片劑、膠囊劑或其它口服劑型的早期消化或降解。包衣可以施加于蛋白酶抗性多肽的壓縮片劑、明膠膠囊和/或珠、顆粒(granules)、顆粒(particles)或凍干粉末，所述凍干粉末被包在淀粉或明膠膠囊中或壓縮成片劑。
因此，腸溶包衣可以施加于壓縮片劑，該壓縮片劑含有蛋白酶抗性多肽的顆粒 (granules)、顆粒(particles)或凍干粉末；但是在顆粒(granules)或顆粒(particles) 本身在壓縮成片劑之前是腸溶包衣的情況下，則壓縮片劑自身的腸溶包衣是任選的。腸溶包衣還可施加于治療多肽珠或小顆粒上，其可以被包在淀粉或明膠膠囊中。如果希望，膠囊然后可以用腸溶包衣進(jìn)行包衣。因?yàn)槠淠c溶包衣，這些口服配制品會(huì)阻止蛋白酶抗性多肽不希望地遞送到上胃腸道特別是口腔、咽和食道的粘膜和上皮組織。通過(guò)選擇組成包衣的賦形劑、其類型和/或其厚度，包衣還實(shí)現(xiàn)了將活性成分遞送到低位胃腸道的可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員操作的點(diǎn)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“延遲釋放”是蛋白酶抗性多肽的遞送，其通過(guò)將蛋白酶抗性多肽配制在藥物組合物中以便釋放在低位腸道的一些通常可預(yù)測(cè)的位置實(shí)現(xiàn)，所述位置遠(yuǎn)離如果治療多肽的遞送無(wú)改變時(shí)會(huì)實(shí)現(xiàn)釋放的位置。用于實(shí)現(xiàn)活性成分的延遲釋放的舉例方法包括用一種物質(zhì)包衣(或其它方式包囊)活性成分，所述物質(zhì)不被吸收或不由胃腸液降解，從而直到到達(dá)小腸的特異希望地點(diǎn)才釋放活性成分。本文所用的延遲釋放配制品的舉例類型通過(guò)一種物質(zhì)包衣活性成分的片劑、膠囊、或顆粒(particles)、顆粒(granules)或珠而實(shí)現(xiàn)，所述物質(zhì)是PH依賴性的，即在小腸中通常存在的pH下降解，但是在口腔、咽、食道或胃通常存在的PH下不降解。但是，如果希望實(shí)現(xiàn)經(jīng)口服施用含有蛋白酶抗性多肽的藥物組合物局部遞送至僅大腸中，或遞送至起自小腸的整個(gè)腸道，則可以如本文所述或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法變化或改變包衣材料的選擇和/或包衣或組合蛋白酶抗性多肽和選擇的包衣材料或其它藥物學(xué)可接受賦形劑的方法。
如本文所用，“治療作用”或“治療效益”是指治療癥狀的正結(jié)果，可以包括例如臨床指標(biāo)的有益變化，例如，在用EPO多肽治療的情況中，血細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白水平(血紅蛋白C)以及主觀指標(biāo)如疼痛降低、疲勞降低、體力改善或感覺改善。
如本文所用，“應(yīng)答細(xì)胞”是指哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)暴露于修飾的治療多肽，其功能或生存力可以被保持、促進(jìn)、增強(qiáng)、再生或以任何其它方式受益。
如本文所用，待治療的“對(duì)象”包括人類及人類或非人動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類， 如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家養(yǎng)動(dòng)物，如狗、馬、貓、豬、山羊、牛，和嚙齒類，如小鼠、大鼠、 倉(cāng)鼠和沙鼠。
如本文所用，待治療的“患者”或“對(duì)象”包括人類或非人動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類，如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家養(yǎng)動(dòng)物，如狗、馬、貓、豬、山羊、牛；和嚙齒類，如小鼠、 大鼠、倉(cāng)鼠和沙鼠。
如本文所用，“定向進(jìn)化(directed evolution)方法”是指“適應(yīng)”蛋白質(zhì)，包括天然蛋白質(zhì)、合成蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的方法，以具有改變的比例，如在不同的或現(xiàn)存的天然或人工化學(xué)或生物學(xué)環(huán)境中起作用的能力和/或引起新功能和/或增加或降低給定活性和/或調(diào)節(jié)給定特征。舉例的定向進(jìn)化方法包括理性定向進(jìn)化方法，如美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)朥S 2003-0134351A1 和 US-2004-0132977A1 所述。
如本文所用，“二維理性誘變掃描Q-D掃描)，，是指本文提供的方法，其中掃描特定蛋白質(zhì)序列的二維(1) 一維是鑒別蛋白質(zhì)序列上的特異氨基酸殘基以用不同氨基酸置換，稱為is-HIT靶位置，及( 第二維是選擇用于置換特定is-HIT靶的氨基酸類型，稱為置換氨基酸。
如本文所用，“in silico”是指用計(jì)算機(jī)進(jìn)行的研究和實(shí)驗(yàn)。h Silico方法包括但不限于分子建模研究和生物分子?？繉?shí)驗(yàn)。
如本文所用，“is-HIT”是指在靶蛋白質(zhì)序列上in silico鑒別的氨基酸位置，其已經(jīng)基于i)待進(jìn)化的特定蛋白質(zhì)性質(zhì)，ii)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，和/或iii)各個(gè)氨基酸的已知性質(zhì)而鑒別。蛋白質(zhì)序列上的這些is-HIT位置無(wú)需使用實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法而鑒別。例如，一旦選擇了待優(yōu)化的蛋白質(zhì)特征，使用各種信息來(lái)源或先前知識(shí)(即蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)、文獻(xiàn)、專利)確定易于通過(guò)用不同氨基酸置換而改善蛋白質(zhì)適合性的那些氨基酸位置。這一步驟使用“in silico”蛋白質(zhì)分析。靶蛋白質(zhì)一級(jí)序列上可能參與被進(jìn)化特征的全部可能的候選氨基酸位置在本文中稱為“in silico HIT”( “is-HIT”)。在這一步驟中鑒別的所有is-HIT的集合(文庫(kù))代表了本文提供的二維掃描方法的第一維(靶殘基位置)。
如本文所用，“掩蔽的is-HIT”是指基于位于糖基化位點(diǎn)0-25人之內(nèi)的所述治療性多肽的三維結(jié)構(gòu)的特定性質(zhì)或活性(例如蛋白酶抗性)鑒定的is-HIT位置。通常，掩蔽的is-HIT殘基距離或距離大約至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)、有時(shí)是2個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)1，2，3， 4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 A。
如本文所用，“非掩蔽的is-HIT”是指不基于位于糖基化位點(diǎn)0-25人之內(nèi)的所述治療性多肽的三維結(jié)構(gòu)的特定性質(zhì)或活性(例如蛋白酶抗性)鑒定的is-HIT位置。因此， 非掩蔽的is-HIT殘基不被糖基化屏蔽并可以是在甚至所述多肽是糖基化的時(shí)暴露在所述多肽表面的那些殘基。
如本文所用，在鑒別is-HIT上下文中的“易于提供進(jìn)化的預(yù)定性質(zhì)或活性”是指蛋白質(zhì)上的氨基酸位置，其基于in silico分析被認(rèn)為具有當(dāng)被置換時(shí)導(dǎo)致進(jìn)化的希望活性的性質(zhì)或特征。在鑒別置換氨基酸上下文中的短語(yǔ)“易于提供進(jìn)化的預(yù)定性質(zhì)或活性”是指特定氨基酸類型，其基于in silico分析被認(rèn)為具有當(dāng)用于置換未修飾起始蛋白質(zhì)中的原始氨基酸時(shí)導(dǎo)致希望或預(yù)選的活性的進(jìn)化的性質(zhì)或特征。
如本文所用，“高通量篩選”(HTQ是指一種方法，其測(cè)試大量樣品，如測(cè)試蛋白質(zhì)或含有編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸的細(xì)胞的樣品，以鑒別感興趣的結(jié)構(gòu)或鑒別與變體蛋白質(zhì)或含有它們的細(xì)胞相互作用的測(cè)試化合物。HTS運(yùn)行易于自動(dòng)化并且被典型地計(jì)算機(jī)化以處理樣品制備、測(cè)定程序和大容量數(shù)據(jù)的后續(xù)處理。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受限制的”在鑒別選擇用于氨基酸置換的蛋白質(zhì)氨基酸殘基的 is-HIT氨基酸位置和/或鑒別置換氨基酸的上下文中，是指蛋白質(zhì)骨架上少于全部氨基酸被選擇進(jìn)行氨基酸置換和/或少于全部其余19個(gè)可用于置換未修飾起始蛋白質(zhì)中存在的原始氨基酸的氨基酸被選擇用于置換。在本文提供的方法的特定實(shí)施方案中，is-HIT氨基酸位置是受限制的，從而蛋白質(zhì)骨架上少于全部的氨基酸被選擇進(jìn)行氨基酸置換。在其它實(shí)施方案中，置換氨基酸是受限制的，從而少于全部其余19個(gè)可用于置換未修飾起始蛋白質(zhì)中存在的天然氨基酸的氨基酸被選擇用于置換。在舉例的實(shí)施方案中，鑒別is-HIT氨基酸位置和置換氨基酸的兩種掃描是受限制的，從而蛋白質(zhì)骨架上少于全部的氨基酸被選擇進(jìn)行氨基酸置換以及少于全部其余19個(gè)可用于置換天然氨基酸的氨基酸被選擇用于置換。
如本文所用，“候選LEAD”是突變蛋白質(zhì)，其設(shè)計(jì)具有性質(zhì)、活性或其它屬性中的改變，典型地是預(yù)定或預(yù)選的性質(zhì)、活性或其它屬性，如尋求這種改變的化學(xué)、物理或生物學(xué)性質(zhì)或活性。所述改變可以添加、改變、除去或其它方式改變多肽的性質(zhì)、活性或其它屬性。 在本文方法中，候選LEAD通常通過(guò)用受限制的亞集或全部其余19個(gè)氨基酸系統(tǒng)性置換蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域中的is-HITS位置而產(chǎn)生，如用PAM分析所獲得。候選LEAD可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生，由本文高通量方法測(cè)試。
如本文所用，“LEAD”是“候選LEAD”，其性質(zhì)、活性或其它屬性已被改變、優(yōu)化、改善、添加或消除。為本文目的，針對(duì)顯示這種活性或性質(zhì)的未修飾多肽中的感興趣的性質(zhì)或活性，“LEAD”典型地具有不同于修飾的和/或野生型(天然)蛋白質(zhì)至少大約是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多的活性。在一些實(shí)施方案中，活性改變是高于未修飾和/或野生型(天然)蛋白質(zhì)的活性的至少大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、 60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900 倍、1000倍或更多倍。希望的改變可以是活性增加或降低，取決于感興趣的功能或性質(zhì)(例如至少大約是或是10 %，至少大約是或是20 %等)。LEAD可進(jìn)一步通過(guò)置換相同蛋白質(zhì)分子上的多個(gè)O個(gè)或多個(gè))〃 is-HIT〃靶位置而優(yōu)化以產(chǎn)生〃 super-LEAD"。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“super-LEAD”是指將兩個(gè)或多個(gè)LEAD分子中存在的單突變加入到一個(gè)單個(gè)蛋白質(zhì)分子中而獲得的蛋白質(zhì)突變體(變體)。因此，在本文提供的修飾蛋白質(zhì)的上下文中，短語(yǔ)“包含一或多個(gè)單氨基酸置換的蛋白質(zhì)”包括對(duì)一個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)加入兩個(gè)或多個(gè)本文描述的突變。例如，本文提供的含有一或多個(gè)單氨基酸置換的修飾蛋白質(zhì)可以具有在披露的置換位置的任意 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19， 20或更多個(gè)氨基酸置換。super-LEAD突變體分子的集合被產(chǎn)生、測(cè)試和在可尋址陣列中逐一表型鑒定。Super-LEAD突變體分子是含有可變數(shù)目和類型LEAD突變的分子。展示對(duì)于被進(jìn)化的特定特征的進(jìn)一步改善的適合性的那些分子被稱為super-LEAD。Super-LEAD 可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生并由本文的高通量方法測(cè)試。為本文目的， super-LEAD典型地具有針對(duì)感興趣功能的活性，其與LEAD的改變的活性(或新活性或消除的活性)具有希望的量的不同，如與其所衍生的LEAD突變體不同至少大約是或是1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多。與LEAD—樣，super-LEAD的活性變化取決于被“進(jìn)化”的活性。希望的改變，其可以是活性的增加或降低，取決于感興趣的功能或性質(zhì)。希望的改變還可以是性質(zhì)或活性的添加或消除。
如本文所用，短語(yǔ)“改變的位置”是指LEAD或super-LEAD中用不同置換氨基酸置換以產(chǎn)生希望的改變表型或活性的is-HIT氨基酸位置。
如本文所用，“暴露的殘基”是指其15%以上的表面暴露于溶劑。
如本文所用，短語(yǔ)“結(jié)構(gòu)同源性”是指兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)骨架之間空間一致程度。 采取相同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，折疊，并且在三維結(jié)構(gòu)重疊時(shí)顯示空間相似性的蛋白質(zhì)骨架可被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)同源的。結(jié)構(gòu)同源性不是基于序列同源性，而是基于三維同源性?；诘鞍踪|(zhì)之間的結(jié)構(gòu)同源性而被稱為同源的兩個(gè)不同蛋白質(zhì)中的兩個(gè)氨基酸不是必須位于基于序列的同源區(qū)域中。例如，在給定空間位置或限定區(qū)域彼此具有小于3. 5,3. 0,2. 5,2. 0、1. 7或 1.5埃的均方根(RMS)差的蛋白質(zhì)骨架可以被認(rèn)為是在該區(qū)域結(jié)構(gòu)同源的，并在本文中稱為在它們的骨架間具有“高一致性”。本文中預(yù)期，位于共享一定程度結(jié)構(gòu)同源性的兩個(gè)或多個(gè)不同蛋白質(zhì)序列上的基本上等價(jià)的(例如“結(jié)構(gòu)相關(guān)的”)氨基酸位置具有相當(dāng)?shù)墓δ苋蝿?wù)；也在本文中稱為“結(jié)構(gòu)同源位置”。這兩個(gè)氨基酸然后可被稱為是彼此“結(jié)構(gòu)相似的” 或“結(jié)構(gòu)相關(guān)的”，即使它們?cè)诎被嵝蛄猩系木_一級(jí)線性位置當(dāng)對(duì)比它們的序列時(shí)不互相匹配?！敖Y(jié)構(gòu)相關(guān)的”氨基酸在一級(jí)蛋白質(zhì)序列中可以彼此遠(yuǎn)離，當(dāng)這些序列根據(jù)經(jīng)典序列同源性規(guī)則對(duì)比時(shí)。
如本文所用，“結(jié)構(gòu)同系物”是由結(jié)構(gòu)同源性識(shí)別的蛋白質(zhì)。舉例的EPO結(jié)構(gòu)同系物包括許多其它細(xì)胞因子，包括例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素_4 (IL-4)、白細(xì)胞介素_5 (IL-5)、白細(xì)胞介素-13 (IL-13)、Flt3配體和干細(xì)胞因子(SCF)。
如本文所用，兩個(gè)或多個(gè)多肽，如兩個(gè)EPO多肽或是EPO結(jié)構(gòu)同系物的其它多肽上的“相應(yīng)于結(jié)構(gòu)相關(guān)的”位置，是指基于基于結(jié)構(gòu)同源性確定的以最大化多肽之間的三維重疊的那些氨基酸位置。
如本文所用，“變體”、“治療多肽變體”、“修飾的治療多肽”和“修飾的治療蛋白質(zhì)” 是指與未修飾治療多肽相比具有一或多個(gè)突變的治療多肽。“促紅細(xì)胞生成素”、“修飾的促紅細(xì)胞生成素多肽”和“修飾的促紅細(xì)胞生成素蛋白”是指與未修飾促紅細(xì)胞生成素多肽相比具有一或多個(gè)突變的EPO多肽。所述一或多個(gè)突變可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入或缺失及其任何組合。典型地，修飾多肽與未修飾多肽相比在一級(jí)序列中具有一或多個(gè)修飾。例如，本文提供的修飾多肽與未修飾多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個(gè)突變。任何長(zhǎng)度的多肽均包括在內(nèi)，只要所得多肽顯示至少一種與天然多肽相關(guān)的活性即可。
如本文所用，“單氨基酸置換，，是指一個(gè)氨基酸由另一個(gè)氨基酸置換。置換可以通過(guò)天然氨基酸或非天然氨基酸進(jìn)行。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中一個(gè)氨基酸由另一個(gè)氨基酸置換時(shí)，該蛋白質(zhì)中的氨基酸總數(shù)不變。
如本文所用，短語(yǔ)“僅一個(gè)氨基酸置換發(fā)生在每個(gè)靶蛋白上”是指靶蛋白的修飾，從而其以單氨基酸改變與未修飾形式靶蛋白不同。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)置換蛋白質(zhì)骨架上的僅一個(gè)is-HIT靶位置的單氨基酸殘基而進(jìn)行誘變(例如在可尋址陣列中“逐一”)，從而所產(chǎn)生的每個(gè)突變體是每個(gè)單誘變反應(yīng)的單產(chǎn)物。針對(duì)在每個(gè)is-HIT靶位置選擇的每個(gè)置換氨基酸，重復(fù)進(jìn)行單氨基酸置換誘變反應(yīng)。因此，產(chǎn)生多個(gè)突變蛋白質(zhì)分子， 由此每個(gè)突變蛋白質(zhì)含有在僅一個(gè)is-HIT靶位置的單氨基酸置換。
如本文所用，短語(yǔ)“假野生型”在單或多個(gè)氨基酸置換的上下文中，是這樣的氨基酸，它們盡管在給定氨基酸位置與原始(例如天然)氨基酸不同，但是可以置換該位置的天然氨基酸而不導(dǎo)入特定蛋白質(zhì)活性的任何可測(cè)量的變化。
編碼突變分子集合的一群(文庫(kù))核酸分子集合被產(chǎn)生并表型鑒定，以便選擇這樣的蛋白質(zhì)，其具有不同于原始氨基酸的氨基酸序列，但是仍基本上相同水平(即至少大約是或是 10%,50%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%，根據(jù)蛋白質(zhì))和類型的與原始蛋白質(zhì)一樣的希望活性。一個(gè)集合(或文庫(kù))含有兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、10、50、100、500、1000、103、IO4或更多個(gè)修飾的治療多肽。
如本文所用，“相應(yīng)于蛋白質(zhì)的氨基酸位置的位置”，是指這樣的氨基酸位置，它們基于與具體的參考蛋白質(zhì)的序列和/或結(jié)構(gòu)對(duì)比被確定相應(yīng)于彼此。例如，相應(yīng)于SEQ ID NO 2所示人EPO的氨基酸位置的位置可以通過(guò)將SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列與感興趣的特定EPO多肽對(duì)比而憑經(jīng)驗(yàn)確定。相應(yīng)位置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用手工對(duì)比或使用各種可獲得的對(duì)比程序(例如BLASTP)進(jìn)行這種對(duì)比而確定。相應(yīng)位置也可以基于結(jié)構(gòu)對(duì)比，例如使用計(jì)算機(jī)模擬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)比。定義多肽的氨基酸相應(yīng)于一個(gè)公開序列中的氨基酸是指，使用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比算法如GAP算法對(duì)比所述多肽和所述公開序列以最大化相同性或同源性(當(dāng)保守氨基酸進(jìn)行對(duì)比時(shí))而鑒別的氨基酸。
如本文所用，“相應(yīng)于…的位置”是指一個(gè)核酸分子或蛋白質(zhì)中的相對(duì)于另一個(gè)參考核酸或蛋白質(zhì)中的位置的感興趣位置(即堿基編號(hào)或殘基編號(hào))。相應(yīng)于另一個(gè)參考蛋白質(zhì)中的位置的感興趣位置可以是例如在前體蛋白、等位基因變體、異源蛋白、來(lái)自另一物種的相同蛋白的氨基酸序列(即物種變體)中。相應(yīng)位置可以通過(guò)比較和對(duì)比序列以最大化匹配的核苷酸或殘基數(shù)而確定，例如，從而序列間的相同性大于95 %，優(yōu)選大于96 %，更優(yōu)選大于97 %，還更優(yōu)選大于98 %，最優(yōu)選大于99 %。感興趣的位置然后被給予參考核酸分子中的編號(hào)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源性”和“相同性”可互換使用，但是蛋白質(zhì)的同源性可包括保守氨基酸變化。與鑒別相應(yīng)位置中一樣，氨基酸序列被對(duì)比以便獲得最高級(jí)匹配 (參見例如!Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press, New York,1988 ；BiocomputinR :Informatics and Genome Projects, Smith，D. W.， ed.，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinie，G.，Academic Press，1987 ；and Sequence Analysis Primer，Gribskov, M. and Devereux, J.，eds.，M Stockton Press，New York， 1991 ；Carillo et al. (1988)SIAM J Applied Math 48 :1073)。
如本文所用，“序列相同性”是指在測(cè)試和參考多肽或多核苷酸之間比較中相同的氨基酸(或核苷酸堿基)數(shù)。同源多肽是指預(yù)定數(shù)目的相同或同源氨基酸殘基。同源性包括保守氨基酸取代及相同殘基。序列相同性可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比算法程序確定，使用每個(gè)供應(yīng)商確立的默認(rèn)缺口罰分。同源核酸分子是指預(yù)定數(shù)目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改變編碼的氨基酸的取代(即“沉默取代”)及相同殘基。基本上同源的核酸分子典型地在中等嚴(yán)格性或在高嚴(yán)格性在感興趣核酸分子全長(zhǎng)上或感興趣核酸分子全長(zhǎng)的至少大約 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%上雜交。還包括這樣的核酸分子，其含有簡(jiǎn)并密碼子代替雜交核酸分子中的密碼子。(為確定蛋白質(zhì)的同源性，保守氨基酸及相同氨基酸可以被對(duì)比；在這種情況中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任何兩個(gè)核酸分子是否具有至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% “相同的”核苷酸序列(或者任何兩個(gè)多肽是否具有這樣的氨基酸序列)可以用已知的計(jì)算機(jī)算法如“FASTA”程序確定，使用例如Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)所述的默認(rèn)參數(shù)(其它程序包括 GCG 禾呈(Devereux, J. ， et al. ， Nucleic Acids Research 12(1) :387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.，et al.，J. Molec. Biol. 215 :403(1990) :Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed.，Academic Press, San Diego (1994), and Carillo et al. SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。例如，National Center for Biotechnology ^formation數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST功能可用于確定相同性。其它商業(yè)或公共可利用程序包括DNA Star “ MegAlign" program (Madison, WI)禾口 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffG) " Gap"程序(Madison WI))。蛋白質(zhì)和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如用GAP計(jì)算機(jī)程序比較序列信息而確定(例如Needleman et al. J. Mol. Biol. 48 443(1970)，由 Smith and Waterman (Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)修正)。簡(jiǎn)而言之，GAP 程序確定相似性是將相似的對(duì)比符號(hào)(即核苷酸或氨基酸)數(shù)除以兩個(gè)序列中較短者的符號(hào)總數(shù)而得到。GAP程序的默認(rèn)參數(shù)可包括(1) 一元比較矩陣(1代表相同性，O代表非相同性)，Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14 :6745 (1986)的加權(quán)比較矩陣，如 khwartz and Dayhoff, eds. ， Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358(1979)所述；(2)每個(gè)缺口罰分 3. 0，每個(gè)缺口每個(gè)符號(hào)的另外0. 10罰分；及(3)末端缺口不罰分。
因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“相同性”代表測(cè)試和參考多肽或多核苷酸之間的比較。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，“至少90%相同”是指相對(duì)于參考多肽從90至100%的相同性百分比。在90%或以上水平的相同性表明如下事實(shí)，假定為舉例目的，長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸的測(cè)試和參考多肽被比較，測(cè)試多肽中不超過(guò)10% (即100個(gè)中的10個(gè))氨基酸不同于參考多肽的氨基酸。類似的比較可以在測(cè)試和參考多核苷酸之間進(jìn)行。這種差異可以是隨機(jī)分布于氨基酸序列全長(zhǎng)的點(diǎn)突變，或者它們可以簇集在一或多個(gè)不同長(zhǎng)度的位置，直至可允許的例如10/100個(gè)氨基酸差異(約90%相同性)。差異被定義為核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大約85-90%的同源性或相同性水平，結(jié)果應(yīng)該不依賴于程序和缺口參數(shù)集； 這種高水平相同性可以容易地評(píng)估，通常無(wú)需依賴軟件。
如本文所用，短語(yǔ)“序列相關(guān)蛋白質(zhì)”是指彼此具有至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列相同性或同源性的蛋白質(zhì)。
如本文所用，非相關(guān)蛋白質(zhì)或“序列不相關(guān)蛋白質(zhì)”是指彼此具有小于50%、小于40%、小于30%、小于20%氨基酸相同性或同源性的蛋白質(zhì)。
如本文所用，還應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“基本上相同，，或“相似”隨上下文變化，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員理解這一點(diǎn)。
如本文所用，“裸多肽鏈”是指未進(jìn)行翻譯后修飾或其它化學(xué)修飾僅含有共價(jià)連接的氨基酸的多肽。
如本文所用，多肽復(fù)合物包括由化學(xué)修飾或翻譯后修飾產(chǎn)生的多肽。這種修飾包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、hasylation，氨甲酰化、硫酸化、羧基化、羥基化、磷酸化及本領(lǐng)域已知的其它多肽修飾。
如本文所用，“輸出信號(hào)”是指可以隨時(shí)間被跟蹤及任選地定量的參數(shù)。例如，當(dāng)重組蛋白被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，含有重組蛋白的細(xì)胞經(jīng)歷許多變化?？梢员槐O(jiān)測(cè)及用于評(píng)估轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何這種變化就是輸出信號(hào)，細(xì)胞被稱為報(bào)道細(xì)胞；編碼核酸被稱為報(bào)道基因； 包括編碼核酸的構(gòu)建體是報(bào)道構(gòu)建體。輸出信號(hào)包括但不限于酶活性、熒光、發(fā)光、產(chǎn)生的產(chǎn)物量和其它信號(hào)。輸出信號(hào)包括基因的表達(dá)或基因產(chǎn)物，包括插入到質(zhì)粒構(gòu)建體中的異源基因(轉(zhuǎn)基因)。輸出信號(hào)是時(shí)間("t")的函數(shù)，并且與用于組合物中的蛋白質(zhì)量相關(guān)。對(duì)于較高濃度的蛋白質(zhì)，輸出信號(hào)可以更高或更低。對(duì)于任何特定濃度，輸出信號(hào)作為時(shí)間的函數(shù)而增加直至達(dá)到穩(wěn)態(tài)。輸出信號(hào)還可以測(cè)量細(xì)胞、表達(dá)異源基因和生物學(xué)物質(zhì)之間的相互作用。
如本文所用，編碼突變體集合(或文庫(kù))的核酸分子集合群是指攜帶(即編碼) 基因變體的質(zhì)?；蚱渌\(yùn)載體的集合。因此，個(gè)體質(zhì)?；蚱渌鼈€(gè)體運(yùn)載體攜帶個(gè)體基因變體。集合的每個(gè)元件(或成員)在合適的可尋址陣列中與其它元件(或成員)物理分隔， 并作為獨(dú)立誘變反應(yīng)的單產(chǎn)物產(chǎn)生。當(dāng)涉及這種蛋白質(zhì)集合(或文庫(kù))時(shí)，其是如此聲明的。集合(或文庫(kù))含有3、4、5、10、50、100、500、1000、IO3UO4或更多個(gè)修飾的EPO多肽或修飾的治療多肽。
如本文所用，“報(bào)道細(xì)胞”是應(yīng)答一種條件而經(jīng)歷變化的細(xì)胞。例如，應(yīng)答將蛋白質(zhì)或病毒暴露于其外部或內(nèi)部環(huán)境的變化，報(bào)道細(xì)胞“報(bào)道”(即展示或顯示變化)。
如本文所用，“報(bào)道子”或“報(bào)道部分”是指使得可以檢測(cè)感興趣的分子如由細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的任何部分。報(bào)道部分包括但不限于熒光蛋白(例如紅色、藍(lán)色和綠色熒光蛋白)、LacZ和其它可檢測(cè)蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物。為在細(xì)胞中表達(dá)，編碼報(bào)道部分的核酸可以作為與感興趣的蛋白質(zhì)的融合蛋白表達(dá)或者在感興趣的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
如本文所用，表型是指基因型(基因序列)的物理、生理或其它體現(xiàn)。在本文方法中，評(píng)估得自基因型改變的表型。
如本文所用，培養(yǎng)基是任何適于支持哺乳動(dòng)物細(xì)胞離體存活性、生長(zhǎng)、和/或分化的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。培養(yǎng)基的例子包括但不限于 X-Vivol5 (Bioffhittaker), RPMI 1640, DMEM, Ham = sF12, McCoys 5A 禾口 Medium 199。培養(yǎng)基可以補(bǔ)加另外成分，包括血清、血清蛋白、生長(zhǎng)抑制和生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)如促有絲分裂單克隆抗體及選擇劑用于選擇遺傳工程或修飾的細(xì)胞。
如本文所用，在本文提供的各種氨基酸序列中存在的氨基酸根據(jù)其已知的三字母或單字母縮寫識(shí)別(表1)。在各種核酸片段中存在的核苷酸用本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)單字母名稱命名。
如本文所用，“氨基酸”是一種有機(jī)化合物，其含有氨基和羧酸基團(tuán)。多肽包含2或多個(gè)氨基酸。為本文目的，氨基酸包括20個(gè)天然發(fā)生的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸類似物(例如其中α-碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。
如本文所用，任何保護(hù)基團(tuán)、氨基酸及其它化合物的縮寫除非另有說(shuō)明，均符合其常用法、認(rèn)可的縮寫或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem. 11 :1726。每個(gè)天然發(fā)生的L-氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)三字母代碼(或單字母代碼)或標(biāo)準(zhǔn)三字母代碼(或單字母代碼)WpreEPO" L-"表示；preEPO" D-"表示氨基酸的立體異構(gòu)形式是D。
如本文所用，“氨基酸殘基”是指在其肽鍵化學(xué)消化(水解)多肽形成的氨基酸。 本文描述的氨基酸殘基假定為“L”異構(gòu)形式?！癉”異構(gòu)形式的殘基可以取代任何L-氨基酸殘基，只要希望的功能性質(zhì)由多肽保持即可。"NH2”是指多肽的氨基末端存在的游離氨基。 “C00H”是指多肽的羧基末端存在的游離羧基。為與J. Biol. Chem.，243 :3552-3559 (1969) 描述的以及37C.F.R. § § 1.821-1. 822采用的標(biāo)準(zhǔn)多肽命名一致，氨基酸殘基縮寫如表1 所示 表1-對(duì)應(yīng)表
符號(hào)1-字母3-字母氨基酸YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu 和/或 GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn 和 /或 AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它 應(yīng)理解本文由化學(xué)式代表的所有氨基酸殘基序列從左至右方向是常規(guī)的氨基末端至羧基末端方向。另外，短語(yǔ)“氨基酸殘基”廣泛定義為包括對(duì)應(yīng)表(表1)列出的氨基酸以及修飾的和不尋常的氨基酸，入37C. F. R. § § 1.821-1. 822所指的那些，其引人本文做參考。另外，應(yīng)注意在氨基酸殘基序列開頭或結(jié)尾的短橫線“_”是指與其它一或多個(gè)氨基酸殘基的序列、氨基末端基團(tuán)如NH2或與羧基末端基團(tuán)如COOH的肽鍵。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指多肽中存在的20個(gè)L-氨基酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸”是指具有與天然氨基酸類似結(jié)構(gòu)但已被結(jié)構(gòu)修飾以模擬天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性的有機(jī)化合物。非天然發(fā)生的氨基酸因此包括例如除 20個(gè)天然發(fā)生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸類似物，并包括但不限于氨基酸的D-立體異構(gòu)體(isostereomer)。舉例的非天然氨基酸在本文描述并是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括蛋白質(zhì)核酸(PNA)及其混合物。 核酸可以是單鏈或雙鏈。當(dāng)指代探針或引物時(shí)(任選地用可檢測(cè)標(biāo)記物如熒光或放射標(biāo)記物標(biāo)記)，是指單鏈分子。這種分子典型具有這樣的長(zhǎng)度，從而它們統(tǒng)計(jì)學(xué)獨(dú)特低拷貝數(shù) (典型地小于5、通常小于3)，用于探查或引發(fā)文庫(kù)。通常探針或引物含有與感興趣基因互補(bǔ)或相同的至少10、15、20、25或30個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。探針和引物可以是5、6、7、8、9、 10或更多、20或更多、30或更多、50或更多、100或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
如本文所用，異源或外來(lái)核酸如DNA和RNA可互換使用，是指不是作為其所存在的基因組部分天然存在的，或者在不同于其天然存在的基因座中發(fā)現(xiàn)的。異源核酸包括不是其所導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)源性的而是從另一細(xì)胞獲得的或合成制備的核酸。通常，盡管不是必須的，這種核酸編碼不是正常由表達(dá)其的細(xì)胞產(chǎn)生的RNA和蛋白質(zhì)。本文的異源DNA包括本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到或認(rèn)為是對(duì)于表達(dá)其的細(xì)胞或基因座是異源或外來(lái)的任何DNA或RNA。 異源DNA和RNA也可編碼通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄、翻譯或其它可調(diào)節(jié)生物化學(xué)過(guò)程而介導(dǎo)或改變內(nèi)源DNA表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)。異源核酸的例子包括但不限于編碼可追蹤標(biāo)記蛋白(例如賦予藥物抗性的蛋白質(zhì))的核酸，編碼治療有效物質(zhì)(例如抗癌藥)、酶和激素的核酸，以及編碼其它類型蛋白質(zhì)(例如抗體)的DNA。因此，本文中異源DNA或外來(lái)DNA包括不以在基因組中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)DNA分子的精確方向和位置存在的DNA分子。其也可以指來(lái)自另一生物體或物種的DNA分子(即外源的)。
如本文所用，“關(guān)于核酸分子或多肽或其它生物分子是分離的”是指所述核酸或多肽已經(jīng)與獲得所述多肽或核酸的遺傳環(huán)境分離開。其也可以表示從天然狀態(tài)改變。例如， 天然存在于活體動(dòng)物中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存材料分離開的相同多核苷酸或多肽是“分離的”，如本文采用的術(shù)語(yǔ)。因此，在重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和/或包含的多肽或多核苷酸被認(rèn)為是分離的?！胺蛛x的多肽”或“分離的多核苷酸”還意在包括已從重組宿主細(xì)胞或從天然來(lái)源部分或基本上純化的多肽或多核苷酸。例如，重組產(chǎn)生的化合物可以通過(guò)Smith et al.，Gene,67 :31-40(1988)所述的一步法基本上純化。 術(shù)語(yǔ)分離的和純化的可互換使用。
因此，“分離的”是指核酸不含那些基因的編碼序列，所述基因是在生物體的天然發(fā)生的基因組(如果有)中緊鄰編碼感興趣核酸的基因側(cè)翼的基因。分離的DNA可以是單鏈或雙鏈的，并可以是基因組DNA、cDNA、重組雜合DNA或合成DNA。其可以與起始DNA序列相同或者可以通過(guò)缺失、添加或取代一或多個(gè)核苷酸而與這種序列不同。
從生物細(xì)胞或宿主制備的“純化的”制備物是指含有指定的DNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物，包括感興趣的DNA或蛋白質(zhì)的粗提取物。例如，在蛋白質(zhì)的情況中，純化的制備物可以通過(guò)單項(xiàng)技術(shù)或一系列制備或生物化學(xué)技術(shù)獲得，感興趣的DNA或蛋白質(zhì)可以以不同純度存在于這些制備物中。所述程序可以包括但不限于硫酸銨分級(jí)分離、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、親和層析、密度梯度離心和電泳。
“基本上純的”或“分離的”DNA或蛋白質(zhì)制備物是指基本上不含這種DNA或蛋白質(zhì)天然正常結(jié)合的天然發(fā)生材料的制備物，其含有5%或更少的其它污染物。
含有感興趣的DNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物是指得自表達(dá)所述蛋白質(zhì)或含有感興趣DNA的細(xì)胞的勻漿制備物或無(wú)細(xì)胞制備物。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞提取物”意在包括培養(yǎng)基，特別是已除去細(xì)胞的用過(guò)的培養(yǎng)基。
如本文所用，“靶向劑”是指可以結(jié)合另一個(gè)靶分子的任何分子，如抗體、受體或配體。
如本文所用，“受體”是指特異地結(jié)合其它分子的生物學(xué)活性分子。術(shù)語(yǔ)“受體蛋白，，可以用于更具體地指示特異受體的蛋白質(zhì)性質(zhì)。
如本文所用，“重組體”是指由基因工程形成的任何子代。
如本文所用，“啟動(dòng)子區(qū)”是指控制與其可操縱連接的DNA的轉(zhuǎn)錄的基因的部分。 啟動(dòng)子區(qū)包括足以供RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的特異序列。啟動(dòng)子區(qū)的這一部分稱為“啟動(dòng)子”。另外，啟動(dòng)子區(qū)包括調(diào)節(jié)RNA聚合酶的這種識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的序列。 啟動(dòng)子根據(jù)調(diào)節(jié)的性質(zhì)可以是組成型的或者由順式作用或反式作用因子調(diào)節(jié)。
如本文所用，短語(yǔ)與核酸分子“可操縱地連接”通常是指序列或節(jié)段與單鏈或雙鏈形式的一段DNA共價(jià)結(jié)合，由此一個(gè)節(jié)段上的控制或調(diào)節(jié)序列控制或允許其它節(jié)段的表達(dá)或復(fù)制或其它這種控制。這兩個(gè)節(jié)段不必須是相鄰的。對(duì)于基因表達(dá)，DNA序列和調(diào)節(jié)序列的連接方式是這樣的，當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄激活物蛋白與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)，控制或允許基因表達(dá)。
如本文所用，“用重組DNA方法經(jīng)重組方式產(chǎn)生”是指熟知的分子生物學(xué)方法表達(dá)由克隆的DNA編碼的蛋白質(zhì)、包括基因的克隆表達(dá)的用途及方法。
如本文所用，剪接變體是由基因組DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的差異加工產(chǎn)生的變體，所述差異加工產(chǎn)生超過(guò)一種類型的mRNA。
如本文所用，組合物是指兩個(gè)或多個(gè)產(chǎn)品或化合物(例如藥劑、調(diào)節(jié)物、調(diào)節(jié)物等)的任何混合物。其可以是溶液、懸液、液體、粉末、膏、水性或非水性配制品或其任何組合。
如本文所用，組合是指兩或多個(gè)項(xiàng)目的任何結(jié)合。用于施用給對(duì)象的組合的項(xiàng)目可以單獨(dú)或一起施用，同時(shí)或相繼使用，或者包裝在一起或分開包裝。
如本文所用，“制造品”是被制造和銷售的產(chǎn)品。在本申請(qǐng)中，該術(shù)語(yǔ)意在包括在包裝物品中含有的本文所述的修飾的EPO多肽或其它修飾的治療多肽和/或核酸的藥物組合物。
如本文所用，“試劑盒”是指提供在藥物組合物中的本文描述的修飾多肽或核酸分子與另一項(xiàng)目的組合，所述項(xiàng)目用于如下目的，所述目的包括但不限于施用、診斷和評(píng)價(jià)本文所述多肽的活性或性質(zhì)。試劑盒任選地包括使用說(shuō)明。
如本文所用，“與產(chǎn)物基本上相同”是指足夠相似，從而感興趣的性質(zhì)足夠不變以便可以使用基本上相同的產(chǎn)物代替所述產(chǎn)物。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指一種核酸分子，其能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一個(gè)核酸。一種類型的舉例的載體是附加體，即能染色體外復(fù)制的核酸。舉例的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)其所連接的核酸的載體，這種載體典型地包括復(fù)制起點(diǎn)。載體還可設(shè)計(jì)用于整合進(jìn)宿主染色體中。能指導(dǎo)與其可操縱連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。表達(dá)載體通常是“質(zhì)?！毙问剑渫ǔＪ侵腑h(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其在載體形式時(shí)不與染色體結(jié)合。 “質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。其它這種形式的表達(dá)載體起等價(jià)作用并且是本領(lǐng)域已知的。
如本文所用，載體還包括“病毒載體”。病毒載體是工程病毒，其可操作地與外源基因連接以將該外源基因轉(zhuǎn)移(作為運(yùn)載體或穿梭體)進(jìn)細(xì)胞。
如本文所用，“等位基因”在本文中與“等位基因變體”可互換使用，是指基因或其部分在群體中的可變形式。等位基因占據(jù)同源染色體上相同的基因座或位置。當(dāng)對(duì)象具有一個(gè)基因的兩個(gè)相同等位基因時(shí)，該對(duì)象被稱為對(duì)該基因或等位基因是純合的。當(dāng)對(duì)象具有一個(gè)基因的兩個(gè)不同等位基因時(shí)，該對(duì)象被稱為對(duì)該基因是雜合的。具體基因的等位基因可以互相有1個(gè)核苷酸或幾個(gè)核苷酸的不同，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入?；虻牡任换蛞部梢允呛型蛔兊幕蛐问?。典型地，等位基因變體與野生型和/ 或來(lái)自相同物種的優(yōu)勢(shì)形式具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高的氨基酸相同性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”或“重組基因”是指含有開放讀框并包括至少一個(gè)外顯子和任選地內(nèi)含子編碼序列的核酸分子?；蚩梢允荝NA或DNA?；蚩梢园ň幋a區(qū)之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū))。
如本文所用，“內(nèi)含子”是指基因中存在的但在mRNA成熟過(guò)程中被剪接除去的DNA 片段。
如本文所用，“與編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列”是指編碼一種多肽的核酸鏈的互補(bǔ)鏈的核苷酸序列，所述多肽包括具有該特定SEQ ID NO 1的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)鏈”在本文中與術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”可互換使用。核酸鏈的互補(bǔ)序列可以是編碼鏈的互補(bǔ)序列或非編碼鏈的互補(bǔ)序列。當(dāng)指代雙鏈核酸時(shí)，編碼含有具有特定SEQ ID NO :1的序列的氨基酸殘基的核酸的互補(bǔ)序列是指編碼該特定SEQ ID NO :1的氨基酸序列的鏈的互補(bǔ)鏈，或者指含有該特定核酸序列的互補(bǔ)鏈的核苷酸序列的任何核酸分子。當(dāng)指含有一核苷酸序列的單鏈核酸分子時(shí)，這一核酸的互補(bǔ)序列是具有與該特定核酸序列的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指基因的編碼蛋白質(zhì)中存在的氨基酸序列的部分。
如本文所用，“有義鏈”是指雙鏈核酸分子的一條鏈，其具有編碼由該雙鏈核酸分子編碼的氨基酸序列的mRNA序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指雙鏈核酸分子的一條鏈，其是編碼由該雙鏈核酸分子編碼的氨基酸序列的mRNA序列的互補(bǔ)序列。
如本文所用，“陣列”是指含有三個(gè)或多個(gè)成員的元件如核酸分子的集合。可尋址陣列是這樣的陣列，其中陣列的成員是可鑒別的，典型地通過(guò)在固相支持物上的位置或通過(guò)可鑒別或可檢測(cè)的標(biāo)記而鑒別，所述可鑒別或可檢測(cè)的標(biāo)記例如為顏色、熒光、電信號(hào) (例如RF、微波或不顯著改變感興趣分子的相互作用的其它頻率)、條碼或其它象征學(xué)、化學(xué)或其它這種標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，陣列成員固定化到固相表面上的分立的可鑒別位置上，或者直接或間接與可鑒別標(biāo)記連接或另外相關(guān)，如附于微球上或其它顆粒支持物上 (本文稱為珠)并懸浮于溶液或展開在表面上。
如本文所用，“支持物”(例如基質(zhì)支持物、基質(zhì)、不溶性支持物或固體支持物等) 是指任何固體或半固體或不溶支持物，感興趣的分子(例如生物分子、有機(jī)分子或生物特異性配體)與其連接或接觸。這種材料包括用作親和性基質(zhì)或支持物以進(jìn)行化學(xué)和生物學(xué)分子合成及分析的任何材料，例如但不限于聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、尼龍、玻璃、葡聚糖、幾丁質(zhì)、沙、浮石、瓊脂糖、多糖、dendrimers, buckybal 1、聚丙烯酰胺、硅、橡膠和用作支持物以進(jìn)行固相合成、親和分離和純化、雜交反應(yīng)、免疫測(cè)定及其它這種應(yīng)用的其它材料。本文的基質(zhì)可以是顆粒狀的或者可以呈連續(xù)表面形式，如微滴定板或孔、玻片、硅晶片、 硝基纖維素片材、尼龍篩或其它這種材料。當(dāng)是顆粒狀時(shí)，典型地所述顆粒的至少一維是 5-10mm范圍或更小。這種顆粒統(tǒng)稱為“珠”，通常但不是必須是球形。但是，這種指代不是限制基質(zhì)的幾何形狀，其可以是任何形狀，包括隨機(jī)形狀、針狀、纖維和加長(zhǎng)的。大概為球形的“珠”，特別是可用于液相的微球也包括在內(nèi)?！爸椤笨梢园硗獾某煞?，如用于用磁鐵進(jìn)行分離的磁性或順磁性顆粒(參見例如Dynabeads (Dynal，Oslo, Norway))，只要所述另外成分不干擾本文的方法和分析即可。
如本文所用，基質(zhì)或支持物顆粒是指呈離散顆粒形式的基質(zhì)材料。顆粒具有任何形狀和尺寸，但典型地具有至少一維尺寸為IOOmm或更小、50mm或更小、IOmm或更小、Imm或更小、IOOm或更小、50m或更小，典型地具有大小為IOOmm3或更小、50mm3或更小、IOmm3或更小、Imm3或更小、IOOm3或更小，并可以是立方微米級(jí)。這種顆粒統(tǒng)稱為“珠”。
如本文所用，對(duì)照是指與測(cè)試樣品基本上相同的樣品，除了其不用測(cè)試參數(shù)處理， 或如果是血漿樣品，其來(lái)自未患有感興趣病癥的正常志愿者。對(duì)照也可以是內(nèi)部對(duì)照。
如本文所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確另外指出。因此，例如指代化合物時(shí)，包含“胞外結(jié)構(gòu)域”包括具有一個(gè)或多個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的化合物。
如本文所用，范圍和量可以表示為“大約”特定數(shù)值或范圍。大約也包括精確量。 因此“大約5個(gè)堿基”意味著“大約5個(gè)堿基”以及“5個(gè)堿基”。
如本文所用，“任選的”或“任選地”意味著隨后描述的事件或情況發(fā)生或不發(fā)生， 以及所述描述包括所述事件或情況發(fā)生的情況和其不發(fā)生的情況。例如，任選地取代的基團(tuán)意味著所述基團(tuán)是未取代的或取代的。
如本文所用，對(duì)于任何保護(hù)基、氨基酸及其它化合物的縮寫除非另有說(shuō)明，否則符合其慣用法、認(rèn)可的縮寫或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem.，11 :942-944。
B.促紅細(xì)胞生成素(EPO) 促紅細(xì)胞生成素(EPO)是作為激素起作用的造血生長(zhǎng)因子家族的成員。其負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成并保持機(jī)體紅細(xì)胞量在優(yōu)化水平。EPO生成由腎動(dòng)脈循環(huán)中降低的氧含量刺激，由氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。EPO主要由腎臟的小管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。分泌的 EPO結(jié)合骨髓紅系前體表面上的EPO受體，導(dǎo)致它們快速?gòu)?fù)制和成熟為功能性紅細(xì)胞。這一刺激導(dǎo)致紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的快速上升和作為結(jié)果的血細(xì)胞比容(血液中的％紅細(xì)胞)的上升(D'Andrea et al. (1989)Cell 57 277-285 ；Lodish et al. (1995)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60 :93_104)。
最近，幾條線證據(jù)提示促紅細(xì)胞生成素作為細(xì)胞因子超家族的成員進(jìn)行其它重要的生理學(xué)功能，這些功能由與促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)的相互作用介導(dǎo)。這些作用包括促有絲分裂、調(diào)節(jié)進(jìn)入平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的鈣流入、紅細(xì)胞生成、血小板超活化、凝血細(xì)胞生成及對(duì)中間代謝的作用。據(jù)信促紅細(xì)胞生成素提供了補(bǔ)償應(yīng)答，用于改善低氧細(xì)胞微環(huán)境以及調(diào)節(jié)由代謝應(yīng)激導(dǎo)致的編程性細(xì)胞死亡。因此，除了其促紅細(xì)胞生成活性之外， EPO還顯示組織保護(hù)能力。另外，這種組織保護(hù)活性看起來(lái)不依賴于其造血功能。
人類EPO首先由Lin et al. (1985) Proc Nat Acad Sci USA 82 :7582_4and Jacobs et al. (1985) Nature 313 :806_810克隆并報(bào)道氨基酸序列。人類EPO是分子量大約30400 道爾頓的酸性糖蛋白。人EPO的前體序列是193個(gè)氨基酸多肽(SEQ ID N0:1所示)，包括相應(yīng)于SEQ ID NO :1所示氨基酸序列中第1-27位氨基酸殘基的27個(gè)氨基酸的信號(hào)序列。 成熟多肽由166個(gè)氨基酸的單多肽鏈(SEQ ID NO :2所示)組成，其通過(guò)包括通過(guò)羧肽酶裂解166位精氨酸的翻譯后修飾被加工為165個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO :237所示)。因此， EPO以165個(gè)氨基酸的形式存在，但可以166個(gè)氨基酸的形式存在，或者是以165或166個(gè)氨基酸的不均一分子存在。EPO含有4個(gè)半胱氨酸殘基(在SEQ ID NO :2所示成熟蛋白質(zhì)的位置 7、29、33 和 161)，其形成內(nèi)部二硫鍵(Lai et al. (1986) J BiolChem 261 :3116_3121 ； Recny et al. (1987) J Biol Chem 262:17156-17163)。半胱氨酸 7 和 161 之間的二硫鍵對(duì)于促紅細(xì)胞生成活性是重要的。人類EPO的結(jié)構(gòu)已在Cheetham et al. (1988)Nat Struct Biol 5:861-866 and Syed et al. (1998) Nature 395 :511_516 中報(bào)道及描述。人類 EPO 是4螺旋束，這在造血生長(zhǎng)因子家族成員中是典型的。
在體內(nèi)，EPO被糖基化翻譯后修飾。EPO的碳水化合物部分由在Asn24、38和83 的3個(gè)N聯(lián)糖及在Ser 126的1個(gè)0聯(lián)糖組成(參見例如Browne et al. (1986)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 693-702 ；Egrie et al. (1986) Immunbiology 172 213-224)。附著于EPO的碳水化合物結(jié)構(gòu)是可變的，這一特征稱為微不均一性。碳水化合物部分在分支模式、復(fù)雜性大小和電荷中的差異對(duì)EPO的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)有深遠(yuǎn)作用。 不同糖基化模式的作用已有很好研究(參見例如，Darling et al. (2002)Biochemistry 41 14524-14531 ；Storring et al. (1998)Br J Haematol 100 79-89 ；Halstenson et al. (1991 Clin Pharmacol Ther 50 702-712 ；Takeuchi et al. (1990)J Biol Chem265 12127-12130)。
通常，蛋白質(zhì)的糖基化在賦予溶解性、穩(wěn)定性、對(duì)免疫攻擊的保護(hù)和整體生物學(xué)活性是重要的。對(duì)于ΕΡ0，例如，糖蛋白中的糖基化位點(diǎn)涉及活性、生物合成和加工、半衰期、 維持活性構(gòu)象和其歸巢至骨髓以及其生物學(xué)活性(Dube et al. (1988) J Biol. Chem.，263 17516-17521 ；Cointe et al. (2000)Glycobiology，10 :511_519)。例如，含有增加的碳水化合物含量的EPO多肽同種型通常顯示增加的血清半衰期。CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO多肽的血清半衰期與具有的半衰期以分鐘量度的非糖基化EOP相比是大約2小時(shí)。EPO糖基化形式的半衰期還顯示相對(duì)短的半衰期。因此，努力產(chǎn)生具有改良的半衰期的EPO多肽。
EPO在胎兒期間通過(guò)肝細(xì)胞產(chǎn)生，并也通過(guò)腎成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生。人尿EPO和在細(xì)胞中重組產(chǎn)生的重組人EPO(rHuEPO)具有相同的一級(jí)序列，但是其糖基化模式不同。另外，不同的rHuEPO根據(jù)用于產(chǎn)生其的細(xì)胞系而含有不同的糖基化模式。rHuEPO 通過(guò)在CHO細(xì)胞(即下文討論的epoietin α和β)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(ΒΗΚ，即印oietin ω)； RPMI 1，788人類淋巴母細(xì)胞；COS非洲綠猴腎；MDCK犬腎；L929小鼠成纖維細(xì)胞和C127小鼠乳腺(Jelkmann et al. (2004) Internal Medicien，43 :649_659)中的重組工程產(chǎn)生。不同EPO制備物的糖基化的不同當(dāng)EPO作為治療藥物施用時(shí)影響其體內(nèi)存活。 EPO是主要的生物藥品，世界銷量達(dá)30億美元。其主要用于增強(qiáng)患者中紅細(xì)胞和紅細(xì)胞形成以治療與慢性腎衰竭、癌癥化療、HIV感染、兒科應(yīng)用、早產(chǎn)兒相關(guān)的貧血并用于降低經(jīng)歷擇期非心臟和非血管手術(shù)的貧血患者對(duì)于輸血的需求。其他用于EPO治療的指示征可以是與自體免疫疾病、AIDS、丙型肝炎感染、充血性心臟衰竭或手術(shù)干預(yù)相關(guān)的貧血。 在人中，用EPO劑量治療發(fā)現(xiàn)是安全且良好耐受的。
有多種可商購(gòu)獲得的EPO多肽。許多EPO多肽具有與人EPO(rhEPO)相同的氨基酸序列并且生產(chǎn)方法和糖基化的變化可以區(qū)分這些產(chǎn)品。Epoetin α (產(chǎn)生自基因組DNA)和 epoetin β (產(chǎn)生自cDNA)在美國(guó)專利4，703，008和5，955，422中描述。這些多肽具有與人類EPO相同的氨基酸序列并且在中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生。Epoetina可以商品名 Procrit(Ortho Biotech),Eprex (Johnson&Johnson),Epogin (Chugai)或Epogen (Amgen)獲得。Epoetin β 可以商品名 Neorecormon 或Recormon(Hoffmann-La Roche) 獲得。其由Genetics Institute開發(fā)用于治療與腎病相關(guān)的貧血。Epoetin ω，在美國(guó)專利 5，688，679中描述，具有與人類EPO相同的氨基酸序列并在幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(ΒΗΚ-21)中產(chǎn)生。 Epoetin ω可以商品名Epomax(Elanex)獲得。通常，rHuEPOa禾PrHuEPO^當(dāng)靜脈內(nèi)或皮下施用時(shí)顯示6-8小時(shí)的半衰期。Dynepo (Epoetin δ ；由Transkaryotic Therapies (與 Aventis Pharma聯(lián)合)開發(fā))是基因活化的人促紅細(xì)胞生成素，在人細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生，用于治療腎衰竭患者的貧血。
開發(fā)了其他EPO多肽試圖增加多肽的半衰期和生物利用度。Darb印oetina (也已知為 Novel Erythropoiesis Stimulating Protein, NESP)由 Amgen 開發(fā)并可以商品名 Aranesp 獲得(Macdougal 1(2002) Kidney Int Suppl. 80 :55_61)。其設(shè)計(jì)含有 5 個(gè) N 連接碳水化合物鏈(比rhEPO多2個(gè))。Aranesp⑧的氨基酸序列與rhEPO的不同在于5個(gè)氨基酸取代(A30N，H32T，P87V，W88N，P90T)，因此使得另外的寡糖附著于位置30和88的天冬酰胺殘基上。由于其增加的碳水化合物含量，Aranesp 不同于rhEPO，其有更高的分子量(37100，相比于30400道爾頓)、唾液酸含量(22，相比于14個(gè)唾液酸殘基)和增加的負(fù)電荷。Aranesp⑧增加的碳水化合物含量解釋了其獨(dú)特的生物化學(xué)和生物學(xué)活性，特別是當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下途徑施用時(shí)比其它促紅細(xì)胞生成素高3倍的循環(huán)半壽期，即24-26小時(shí)。 然而，相對(duì)EPO受體結(jié)合親和性與碳水化合物含量倒相關(guān)，Aranesp 展示比rhEPO低4. 3 倍的對(duì)EPO受體的相對(duì)親和性。在皮下施用后，Aranesp 吸收緩慢并是限速的，血清水平平均54小時(shí)達(dá)到最大。達(dá)到最大濃度的時(shí)間比報(bào)道的rhEPO的長(zhǎng)，可能是因?yàn)锳ranesp⑧ 分子大小增加。但是目前延長(zhǎng)的循環(huán)半壽期使得Aranesp⑧比Procrit⑧有顯著的臨床優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠浣o藥頻率低。
進(jìn)行了其他嘗試通過(guò)與聚乙二醇(PEG)的化學(xué)綴合來(lái)延長(zhǎng)EPO的半衰期。PEG化的EPO盡管具有更長(zhǎng)的半衰期，與非PEG化的EPO相比顯示改變的結(jié)構(gòu)和降低的功能。例如，連續(xù)的促紅細(xì)胞生成素受體激活物(CERA ；由Roche開發(fā))或R-744是第二代促紅細(xì)胞生成素，用于潛在治療與化療相關(guān)的貧血。CERA含有約30kDa的單個(gè)甲氧基聚乙二醇聚合物，其延長(zhǎng)了這一藥劑的半壽期。增加半衰期的其他機(jī)制包括但不限于EPO與載體蛋白如白蛋白連接，2個(gè)完整EPO分子通過(guò)使用連接肽(3至17個(gè)氨基酸)、通過(guò)使用不同試劑的化學(xué)交聯(lián)或者通過(guò)組合EPO分子和人免疫球蛋白(Ig)的Fc片段作為融合蛋白的同二聚體化的形成。這些策略的每一種均導(dǎo)致與天然EPO相比所述EPO多肽具有改變的活性。 EPO可以口服、全身性、頰內(nèi)、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下施用，典型地，治療方案中使用多次施用。通常，商業(yè)可獲得的EPO治療劑通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用注射施用。典型地，皮下施用更有效，盡管天然EPO通過(guò)皮下施用的生物利用度僅是26%。由于相對(duì)短的半衰期，天然EPO必須一周3次注射施用。而且，配制品典型地儲(chǔ)存在冷藏(2-8°C) 條件以保證活性。因此，改善的EPO穩(wěn)定性(半壽期)在施用條件(體內(nèi))如血清穩(wěn)定性及體外(例如在生產(chǎn)過(guò)程中、純化和儲(chǔ)存條件下)可以改善其作為藥物的用途和效率。
C.顯示增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的修飾的EPO多肽 本文提供了通過(guò)對(duì)蛋白酶抗性評(píng)估顯示改善的穩(wěn)定性的EPO多肽的變體(血液、 腸等)。增加的EPO多肽穩(wěn)定性可以例如通過(guò)破壞蛋白酶靶殘基或序列、從而使得所述多肽在施用、純化或儲(chǔ)存時(shí)對(duì)于蛋白酶降解具有抗性而實(shí)現(xiàn)。通過(guò)在傾向于被蛋白酶降解的位點(diǎn)處改變其一級(jí)序列而修飾蛋白酶以成為蛋白酶抗性的。例如，蛋白酶靶殘基或序列的氨基酸置換導(dǎo)致蛋白酶靶殘基或序列的直接破壞。因此，本文提供了修飾的EPO多肽，其中一級(jí)氨基酸序列被修飾以賦予對(duì)蛋白酶的增加的抗性，而無(wú)其他翻譯后或其他修飾的額外需要。
本文提供的蛋白酶抗性EPO多肽僅用在所述多肽的一級(jí)序列中一些氨基酸改變 (在很多情況中僅單個(gè)改變)修飾。自身一級(jí)序列中的突變使得給予多肽蛋白酶抗性。而且，因?yàn)樗龆嚯膬H含有一些改變，其能夠?qū)⑵浠钚员３衷谂c沒有所述突變的相同多肽的活性相同或在一些情況中大于沒有所述突變的相同多肽的活性的水平。這對(duì)于幾種原因而言是有利的。首先，這意味著實(shí)現(xiàn)治療作用所需的多肽的量(即劑量)不受所述多肽活性任何改變(即降低)的限制。這是使用許多治療性多肽例如peg化多肽具有的問題，其中對(duì)所述多肽的修飾使得蛋白質(zhì)活性更低。因此，為實(shí)現(xiàn)治療作用，這種治療性多肽必須以更高劑量施用。
第二，僅對(duì)多肽一級(jí)序列的改變意味著沒有其他加工要求或混合所述治療性蛋白和制劑中其他化合物以實(shí)現(xiàn)蛋白酶抗性或吸收多肽進(jìn)入血流的要求。因此，簡(jiǎn)化了劑量制劑的工藝。例如，僅含有凍干蛋白的片劑可以制備為用于口服施用，即所述蛋白酶抗性蛋白質(zhì)自身是口服利用的。在腸溶包衣中包括多肽以進(jìn)一步增加多肽對(duì)蛋白酶的抗性、特別是在口服施用時(shí)至胃腸道途徑時(shí)也可能是有利的。
所述修飾的EPO多肽通過(guò)對(duì)蛋白酶的抗性評(píng)估顯示改良的穩(wěn)定性；所述顯示這些性質(zhì)的修飾的EPO多肽因而具有增加的體外或體內(nèi)蛋白質(zhì)半衰期。所述修飾的EPO多肽 (本文也稱為變體)與未修飾的EPO多肽相比是更穩(wěn)定的。本文提供的顯示增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的修飾的EPO多肽可以導(dǎo)致增加的體外(例如在生產(chǎn)、純化和儲(chǔ)存期間)或體內(nèi) (例如在施用對(duì)象后)多肽半壽期。例如，增加的半壽期可以在多肽被施用給對(duì)象如人類對(duì)象后發(fā)生。修飾的EPO多肽的增加的半壽期與未修飾EPO多肽的半壽期相比可以增加的量至少大約是或是 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300%、400%、500%或更高。在一些實(shí)施例中，修飾的EPO多肽的增加的半壽期與未修飾 EPO多肽的半壽期相比可以增加的量是至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、 50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900倍、1000倍或更多倍。因此，本文提供的修飾的EPO多肽給EPO提供了優(yōu)點(diǎn)，包括維持血清中足夠藥物水平所需的注射頻率降低，由此導(dǎo)致例如對(duì)象更高的舒適度和接受性， 更低的達(dá)到相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)作用所需的劑量，及減輕了二級(jí)效應(yīng)。 顯示改良的穩(wěn)定性的EPO變體在施用條件中如在血流、胃腸道、口腔、喉和/或在儲(chǔ)存條件下具有增加的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性(即蛋白體內(nèi)半衰期)增加可以導(dǎo)致維持血清中足夠藥物水平所需的注射頻率降低，因而導(dǎo)致i)被治療對(duì)象、特別是人類對(duì)象更高的舒適性和接受性，ii)實(shí)現(xiàn)相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)作用所需的劑量更低，和iii)結(jié)果是(劑量依賴性)二級(jí)效應(yīng)減輕。而且，對(duì)蛋白酶的抗性使得多肽適于口服遞送，因?yàn)槠鋬A向于被胃腸道中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶消化。
因此，由于對(duì)胃腸道中蛋白酶的抗性，本文提供的EPO變體可以配制為口服施用。 對(duì)于沒有通過(guò)一級(jí)序列改變被修飾為是蛋白酶抗性的治療性蛋白質(zhì)，沒有蛋白質(zhì)可以通過(guò)口服施用施用以實(shí)現(xiàn)遞送治療有效量的天然或野生型多肽至血流。這是胃腸道蛋白酶對(duì)胃腸道中多肽的降解所導(dǎo)致的。盡管天然多肽如EPO可以用腸溶包衣配制，這也不足以實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道中蛋白酶的抗性以允許釋放至血流。一旦腸溶包衣溶解并且所述天然多肽釋放至胃腸道內(nèi)腔，所述多肽的高水平蛋白酶降解阻止了所述多肽自腸到血液的有效吸收。本文提供的EPO蛋白酶抗性多肽對(duì)于蛋白酶如胃腸道蛋白酶的降解是具有抗性的，因此可以被吸收和攝取進(jìn)入血液。當(dāng)釋放進(jìn)胃腸道內(nèi)腔時(shí)，所述蛋白酶抗性肽由于其對(duì)于腸蛋白酶的抗性而以高濃度存在。結(jié)果，治療有效量的蛋白酶可自腸吸收至血液。另外，對(duì)消化道和血流中的蛋白酶降解的抗性允許持續(xù)攝取所述蛋白酶抗性治療性多肽。因此，在血流中所述蛋白酶抗性多肽可以治療有效濃度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被吸收和維持。因此，所述蛋白酶抗性多肽可以被口服施用。如本文所述，這種蛋白酶抗性EPO多肽可以配制為以片劑或膠囊口服施用。有利地，其包括保護(hù)抵抗胃的PH條件并允許有效遞送所述多肽至下段消化道的腸溶包衣。
增加蛋白酶抗性的修飾補(bǔ)償了可能由于蛋白質(zhì)在不能糖基化的宿主中產(chǎn)生而發(fā)生的或者在施用及暴露于蛋白酶糖酵解作用后EPO多肽糖基化的缺失。因此，通常被糖基化掩蔽的蛋白酶敏感位點(diǎn)的修飾可以在這些位點(diǎn)沒有被掩蔽且暴露于蛋白酶(即血清、血清、腸)時(shí)對(duì)EPO多肽提供保護(hù)措施以提供與不含有這種修飾的多肽相比增加的多肽穩(wěn)定性。因此，盡管糖基化位點(diǎn)可以將蛋白質(zhì)與蛋白酶屏蔽并因而增加多肽的半衰期，沒有糖基化或部分糖基化的EPO多肽不被如此保護(hù)。因此，通過(guò)修飾EPO多肽以顯示增加的蛋白酶抗性，特別是在通常被糖基化掩蔽的位點(diǎn)，所述多肽與完全糖基化的EPO多肽相比被賦予保護(hù)或更好的保護(hù)。
1.蛋白酶抗性 將穩(wěn)定的肽和蛋白質(zhì)藥物遞送給患者是藥物工業(yè)的主要挑戰(zhàn)。這些類型的藥物在人體中經(jīng)常由不同的生理過(guò)程包括內(nèi)在化、腎小球?yàn)V過(guò)和蛋白酶解而消除或去掉。后者經(jīng)常是影響用作經(jīng)口施用或者靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射的治療劑的蛋白質(zhì)的半壽期的限制過(guò)程。因此，感興趣的是增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的治療蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加體現(xiàn)在增加的蛋白酶消化的抗性。治療蛋白質(zhì)的修飾是增加抗蛋白酶消化的保護(hù)，但不破壞或消除一種或該種治療活性。這種變化對(duì)于生產(chǎn)更持久的治療蛋白質(zhì)是有用的。因此，在一個(gè)方面中， 本文提供的EPO多肽已被修飾以增加對(duì)蛋白酶解的抗性，由此增加修飾的EPO多肽的體外 (例如生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、測(cè)定等)或體內(nèi)(例如血清穩(wěn)定性)半壽期。因此，本文提供的修飾的EPO多肽可用作更持久的治療蛋白質(zhì)。本文所述增加蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶(血液、裂解物、 腸、血清等)的穩(wěn)定性是意指對(duì)于特定蛋白質(zhì)分子提供更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期并因此降低對(duì)對(duì)象所需施用的頻率。也意指通過(guò)賦予蛋白酶抗性增加蛋白酶穩(wěn)定性產(chǎn)生可以口服施用的多肽。
蛋白酶(Proteases，proteinases)或肽酶催化共價(jià)肽鍵的水解。本文提供的修飾的EPO多肽顯示增加的對(duì)蛋白酶酶解的抗性，所述蛋白酶包括在體液和組織中存在的那些蛋白酶，所述體液和組織例如包括但不限于唾液、血液、血清、腸道、胃、血液、細(xì)胞裂解物、 細(xì)胞及其它。這些包括所有類型的蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶。
EP0多肽的修飾包括但不限于對(duì)一或多種蛋白酶的抗性，所述蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶、明膠酶B、明膠酶A、 α -胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、內(nèi)蛋白酶Arg-C、內(nèi)蛋白酶Asp-N、內(nèi)蛋白酶Glu_C、內(nèi)蛋白酶 Lys-C、內(nèi)腔胃蛋白酶、微絨毛內(nèi)肽酶(microvillar endop印tidase)、二肽基肽酶、腸肽酶 (enterop印tidase)、水解酶、NS3、因子Xa，粒酶(Granzyme) B、凝血酶、纖溶酶、尿激酶、tPA 禾P PSA0 本文提供的修飾的EPO多肽顯示對(duì)蛋白酶解，特別是存在于血清、血液、腸道、口腔和其它體液中的酶的蛋白酶解的抗性。這種抗性增加體現(xiàn)為EPO多肽半壽期與在體內(nèi) (人血液、人血清、唾液、消化液、腸道等)或含有一或多種蛋白酶的體外混合物中的未修飾或野生型EPO多肽相比增加的量至少大約是或是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%UOO%,200%,300%、400%,500%或更高。典型地，本文提供的修飾的EPO多肽的體外或體內(nèi)半壽期與在血液、血清、唾液或含有一或多種蛋白酶的體外制備物或混合物中的未修飾或野生型EPO多肽相比增加的量選自至少大約是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更高。
典型地，本文提供的修飾的EPO多肽顯示與未修飾的或野生型EPO相比至少一種基本上不變(小于1%、5%或10%變化)的活性。在一些實(shí)施例中，與未修飾EPO相比活性增加。在其它實(shí)施例中，與未修飾EPO多肽相比活性降低?；钚园ɡ绱偌t細(xì)胞生成或組織保護(hù)活性，并且可以與未修飾多肽相比，所述未修飾多肽例如是成熟的野生型天然EPO 多肽(SEQ ID NO :2或237)，野生型前體EPO多肽(SEQ ID NO 1 or 236)或者用作起始材料的任何前體EPO多肽。
a.絲氨酸蛋白酶 絲氨酸蛋白酶參與機(jī)體一系列功能，包括血液凝集、炎癥以及原核生物和真核生物中的消化酶。絲氨酸蛋白酶是序列特異性的。盡管蛋白酶級(jí)聯(lián)激活凝血和補(bǔ)體，其它蛋白酶參與信號(hào)途徑、酶激活和不同細(xì)胞或細(xì)胞外區(qū)室中的降解功能。
絲氨酸蛋白酶包括但不限于胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，彈性蛋白酶，NS3，因子Xa， 粒酶B，凝血酶，纖溶酶，尿激酶，tPA和PSA。胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和彈性蛋白酶由胰腺腺細(xì)胞合成，分泌在小腸中并且負(fù)責(zé)催化肽鍵水解。所有這三種酶由它們的X射線結(jié)構(gòu)顯示結(jié)構(gòu)類似。這些消化性絲氨酸蛋白酶的每一個(gè)靶向多肽鏈的不同區(qū)域，基于圍繞裂解位點(diǎn)的氨基酸殘基和側(cè)鏈而不同。絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)成形為裂縫，多肽底物結(jié)合在此。 氨基酸殘基是從多肽底物的N端到C端(Pi，…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)及其各自的結(jié)合亞位點(diǎn)(Si，…，S3，S2，Si，Sl'，S2'，S3'，…，Sj)標(biāo)記。裂解在Pl和 ΡΓ之間催化。胰凝乳蛋白酶水解兩側(cè)為大的疏水性氨基酸殘基肽鍵。特定的殘基包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，它們適合進(jìn)貼緊的疏水口袋(snug hydrophobic pocket) 0胰蛋白酶水解兩側(cè)為陽(yáng)性電荷的氨基酸殘基的肽鍵。代替具有胰凝乳蛋白酶疏水口袋，胰蛋白酶在口袋背部有一天冬氨酸殘基，其可以與陽(yáng)性電荷殘基如精氨酸和賴氨酸相互作用。彈性蛋白酶水解兩側(cè)為小中性氨基酸殘基如丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸的肽鍵。與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相反，彈性蛋白酶含有用纈氨酸和蘇氨酸排列的口袋，使其只是收縮，其可以容納較小的氨基酸殘基。絲氨酸蛋白酶遍在于原核生物和真核生物中并起重要的不同的生物學(xué)功能如止血、纖維蛋白溶解、補(bǔ)體形成和飲食蛋白消化。
屬于絲氨酸蛋白酶家族的彈性蛋白酶展示與其它絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的廣泛的序列同源性。絲氨酸彈性蛋白酶優(yōu)先裂解與脂族氨基酸殘基相鄰的多肽，典型地為丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸，以及程度差一些的亮氨酸和異亮氨酸。人類具有6種彈性蛋白酶基因，它們編碼結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，彈性蛋白酶1(ELA-1，也已知為胰腺?gòu)椥缘鞍酌?，PE，)，彈性蛋白酶2 (嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，NE，也已知為PMN彈性蛋白酶，骨髓絲氨酸蛋白酶，medullasin，人白細(xì)胞彈性蛋白酶，HLE)，彈性蛋白酶2A(ELA_2A)， 彈性蛋白酶2B(ELA-2B)，彈性蛋白酶3A(ELA-3A，彈性蛋白酶IIIA，蛋白酶E)，和彈性蛋白酶-3B(ELA-3B，彈性蛋白酶IIIB，蛋白酶E)。具有彈性蛋白酶活性的其它絲氨酸蛋白酶包括但不限于蛋白酶-3 (PR-3)、內(nèi)源血管彈性蛋白酶(EVE)和內(nèi)皮細(xì)胞彈性蛋白酶(ECE)。
嗜中性初級(jí)嗜苯胺藍(lán)粒攜帶NE (ELA-2)和PR-3，它們?cè)谑戎行粤＜?xì)胞活化時(shí)被釋放。NE參與胞外基質(zhì)(ECM)降解，包括彈性蛋白、軟骨蛋白聚糖、膠原蛋白和纖連蛋白的降解，以及通過(guò)吞噬作用吸收進(jìn)細(xì)胞的材料的消化。NE還幫助降解蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白和表面活性劑脫輔蛋白。NE優(yōu)先裂解Val-X鍵，以及程度差一些的Ala-X鍵。NE的異?；蜻^(guò)量釋放已與結(jié)締組織更新、關(guān)節(jié)炎和炎癥相聯(lián)系。類似于NE，PR-3也激活酶原，如金屬蛋白酶和細(xì)胞因子如TNF-α，IL-I β和白細(xì)胞介素_8 (IL-8)。
胰腺?gòu)椥缘鞍酌?ELA-I)優(yōu)先裂解Ala-X鍵并主要在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)。 ELA的表達(dá)正常不在成人胰腺中發(fā)現(xiàn)，盡管其經(jīng)常在胰腺癌中表達(dá)并用作胰腺癌的標(biāo)記。 正常胰腺的彈性蛋白酶活性歸因于ELA-2A和ELA-2B。ELA-2A和ELA-2B優(yōu)先裂解Leu_X， Met-X 禾口 Phe-X 鍵。
據(jù)信一些病理學(xué)癥狀至少部分是由于彈性蛋白酶和它們的內(nèi)源抑制劑之間失衡導(dǎo)致。嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶特別是ELA-2導(dǎo)致的不受控蛋白酶降解參與多種病理學(xué)癥狀，如肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合征、敗血性休克、多器官衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和囊性纖維化。
高濃度的彈性蛋白酶可在胃腸道和血液中發(fā)現(xiàn)。因此，經(jīng)這些途徑施用的有效治療劑可以通過(guò)彈性蛋白酶裂解位點(diǎn)的修飾而實(shí)現(xiàn)。
b.基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是Zn2+和鈣依賴性內(nèi)肽酶家族，其降解胞外基質(zhì)(ECM)成分。另外，MMP還可以加工許多細(xì)胞表面細(xì)胞因子、受體和其它可溶蛋白。它們參與正常組織重塑過(guò)程如傷口愈合、懷孕和血管發(fā)生。在生理?xiàng)l件下，MMP作為無(wú)活性前體(酶原)產(chǎn)生并被加工成其活性形式。另外，所述酶由稱為基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的內(nèi)源抑制劑特異調(diào)節(jié)。MMP的蛋白酶解活性作為生理和病理?xiàng)l件中的組織重塑的效應(yīng)物機(jī)制起作用，以及作為炎癥介質(zhì)起作用。這些蛋白質(zhì)的過(guò)量合成和產(chǎn)生導(dǎo)致ECM的加速降解，其與各自疾病和病癥相關(guān)，例如骨髓穩(wěn)態(tài)、關(guān)節(jié)炎、癌癥、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在神經(jīng)炎性疾病中，MMP參與如下過(guò)程，例如(a)血腦屏障(BBB)和血液-神經(jīng)屏障開放，(b)血液衍生的免疫細(xì)胞侵襲神經(jīng)組織，(c)細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體脫落(shedding)，以及(d) 在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的直接細(xì)胞損害(L印pert et al. Brain Res. Rev. 36(2-3) 249-57(2001) ；Borkakoti et al. Prog. Biophys. Mol. Biol. 70 (1) :73_94 (1998)). MMP家族成員包括膠原蛋白酶、明膠酶、基質(zhì)降解酶、基質(zhì)溶解因子和膜結(jié)合MMP。 大多數(shù)MMP以無(wú)活性酶原形式分泌。分泌的酶原MMP可以通過(guò)幾種促炎性因子激活，促炎性因子例如氧化劑、蛋白酶包括彈性蛋白酶、纖溶酶和胰蛋白酶及其它MMP(Cuzner and Opdenakker. J. Neuroimmunol. 94(1-2) 1-14 (1999)) 在組織中，生理血 MMP 激活物包括組織或血漿蛋白酶或機(jī)會(huì)細(xì)菌蛋白酶。例如，纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)、包括遍在纖溶酶原和尿激酶(u-Pa)和組織型纖溶酶原激活物(t-Pa)是病理?xiàng)l件下pro-MMP的重要激活物。MMP活性可以由金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)抑制，由絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins) 抑制，及由非特異性蛋白酶抑制劑如α 2-巨球蛋白抑制。TIMP通過(guò)非共價(jià)結(jié)合MMP的活性鋅結(jié)合位點(diǎn)而抑制MMP活性。MMP和纖溶酶原激活物的蛋白酶解活性及其抑制劑在維持ECM完整性方面很重要，因?yàn)榧?xì)胞-ECM相互作用影響和介導(dǎo)廣泛過(guò)程，包括各種細(xì)胞類型的增殖、分化、粘附和遷移?；|(zhì)金屬蛋白酶的過(guò)量產(chǎn)生牽涉到組織損害和傷口愈合、炎性疾病、±曾生性疾病禾口自身免疫疾病中(St-Pierre et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2(3) :206_215 (2003) ；Opdenakker, G. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 59 (6) 489-514(1997))。
c.通過(guò)除去蛋白酶解位點(diǎn)導(dǎo)致的增加的蛋白酶解抗性 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知任何方法如下文D部分所述方法可以用于修飾EPO多肽以增加蛋白酶抗性。例如，如本文實(shí)施例所述，2D掃描方法學(xué)已用于鑒別hEPO上的導(dǎo)致當(dāng)用蛋白酶(血液、腸道等)、溶血產(chǎn)物或血清攻擊時(shí)穩(wěn)定性增加的氨基酸改變。增加對(duì)蛋白酶 (血液、裂解物、腸道、血清等)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性包括在本文中，以提供特定蛋白質(zhì)分子的更長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期，由此降低對(duì)象所需給藥頻率。
設(shè)計(jì)蛋白酶解抗性hEPO突變體的第一步包括鑒別蛋白質(zhì)序列上易受蛋白酶解攻擊的位點(diǎn)?；谶x擇的血液、腸道或任何其它類型蛋白酶列表(表2)，首先in Silico確定 hEPO中可以被那些蛋白酶靶向的所有氨基酸和氨基酸序列的完全列表。這些蛋白酶靶位 (hEPO多肽上的氨基酸或氨基酸序列)被稱為in silico HIT(IS-HIT)0由于機(jī)體內(nèi)蛋白酶混合物組成相當(dāng)復(fù)雜，可以預(yù)期給定蛋白質(zhì)序列中的大多數(shù)殘基可以被蛋白酶解靶向。
設(shè)計(jì)蛋白酶解抗性的hEPO的第二步包括鑒別合適的置換氨基酸以便如果它們置換了 is-HIT處的hEPO的天然氨基酸，所述蛋白(i)變得蛋白酶解抗性；以及(ii)引起至少與野生型hEPO多肽相當(dāng)?shù)幕钚运?。置換氨基酸的選擇必須考慮某些蛋白酶的廣譜靶特異性以及保持理化性質(zhì)如hEPO中關(guān)鍵(例如催化行、結(jié)合等)殘基的疏水性、電荷和極性的需求。
“點(diǎn)接受的突變(Point Accepted Mutation)，，(PAM ；Dayhoff et al.，1978)可以用作2D掃描方法的部分。PAM值，最初用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列間的對(duì)比，可以以概率矩陣形式獲得，其反映了氨基酸之間的進(jìn)化距離。參考序列中的殘基的保守取代是這樣的取代，其與相應(yīng)的參考?xì)埢锢韺W(xué)和功能上相似，即具有相似的大小、形狀、電荷和/或化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵和其它相互作用的能力。保守取代顯示以最高評(píng)分適合可接收點(diǎn)突變形式的PAM矩陣標(biāo)準(zhǔn)。PAM250矩陣用于2D掃描框架中以鑒別用于is_HIT的候選置換氨基酸，以產(chǎn)生不影響蛋白質(zhì)功能的保守突變。選擇了至少兩個(gè)氨基酸用于在每個(gè)is-HIT進(jìn)行置換，所述氨基酸在PAM250矩陣中具有相應(yīng)于保守取代或可接受點(diǎn)突變的最高值。明確避免氨基酸由半胱氨酸置換，因?yàn)檫@一變化可以導(dǎo)致分子間二硫鍵形成。
簡(jiǎn)而言之，使用PR0TE0L 算法(在線得自 infobiogen. fr 和 bioinfo. hku. hk/ services/analyseq/cgi-bin/proteol_in. pi)，建立了在 166 個(gè)氨基酸的成熟 hEPO 多肽 (SEQ ID NO 2)上的可以被識(shí)別為蛋白酶(血液、腸道等)的底物的殘基的列表，見表2。 該算法基于蛋白酶、蛋白酶的蛋白酶解特異性以及被輸入的多肽氨基酸序列生成了蛋白酶消化圖。表2示出是用選擇的蛋白酶和化學(xué)處理進(jìn)行的蛋白酶解的靶位氨基酸位置的in silico 鑒別。
表2
氨基酸位置蛋白酶或化學(xué)處理
AspND內(nèi)蛋白酶Asp-N
Chymo(F，W，Y，M，L) P胰凝乳蛋白酶
ClosR梭菌蛋白酶
CnBrM溴化氰
IBzOW鄰碘苯甲酸
MyxoKMyxobacter
ΝΗ20ΗFgWM
ρΗ2. 5FpρΗ 2. 5
ProEnP脯氨酸內(nèi)肽酶
權(quán)利要求
1.一種修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽，其包含在被不同糖基化位點(diǎn)掩蔽的掩蔽is-Hit殘基處的2個(gè)氨基酸修飾；和在非掩蔽is-Hit殘基處的一或多個(gè)額外的氨基酸修飾，條件是所述修飾不是選自 R4H/K20Q/R139H/L80I ；E159N/K20Q/R139H/L93I ；L153V/K20Q/R139H/L80I ；和 E159N/ K20Q/R139H/L80I。
2.權(quán)利要求1的修飾的EPO多肽，其中所述修飾選自K20Q/R139H/R4H；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/ R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/ L153V；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/ K52N/L80I/R139H ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N；K20Q/L93V/R139H/ K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/ L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ； K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/ R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ； R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
3.權(quán)利要求1或2的修飾的EPO多肽，其中所述修飾選自K20Q/L80I/R139H/E159N； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；和 K20Q/L93V/R139H/ E159N/K52N。
4.一種修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽，其在未修飾的EPO多肽中包含選自L80I/ R139H/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ； K20Q/K52N ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的 2 或多個(gè)氨基酸修飾。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
6.權(quán)利要求5的修飾的EPO多肽，其中所述多肽由于在糖基化位點(diǎn)NM、N38或N83的一或多個(gè)處的一或多個(gè)進(jìn)一步的氨基修飾而是部分糖基化的或去糖基化的，其中所述修飾消除了該位點(diǎn)的糖基化。
7.權(quán)利要求6的修飾的EPO多肽，其中所述修飾是選自N24H，N38H,N83H, N24K, N38K 和N8I的氨基酸置換。
8.—種修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽，其在未修飾的EPO多肽中包含選自R4H/ R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V ； R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q ；R4H/K45N ；R4H/K52N ； R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ； R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ；R4H/ R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H ；和R4H/L93I/E159N的2或多個(gè)氨基酸修飾。
9.一種修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽，其在EPO多肽中包含2或多個(gè)修飾，其中至少一個(gè)修飾是相應(yīng)于SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示氨基酸殘基的R4H。
10.權(quán)利要求9的修飾的EPO多肽，其中所述一或多個(gè)額外的氨基酸修飾選自P2S， P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I，L5V，C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, D165H, R166H，和 R166Q。
11.權(quán)利要求10的修飾的EPO多肽，其中所述額外的氨基酸修飾選自K20Q；F48I ； K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ；D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q；R143H ；R143Q ；R150H ； D123N ；D136N ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ； R139Q ；和 L153V。
12.權(quán)利要求11的修飾的EPO多肽，其中所述額外的氨基酸修飾選自K20Q;F48I； K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。
13.權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述修飾的EPO選自R4H/R150H； R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139H ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/ L153V ；R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/ K116T；R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ； R4H/R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/ R143Q/R150H和 R4H/L93I/E159N。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述未修飾的EPO多肽長(zhǎng)度是160， 161，162，163，164，165 或 166 個(gè)氨基酸。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述EPO多肽包含SEQID NO :2或 237所示氨基酸序列或與具有SEQ ID NO 2或237所示序列的多肽具有至少或具有至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 % , 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的變體。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述未修飾的EPO多肽包含SEQID NO :2或237所示氨基酸序列。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述多肽被進(jìn)一步修飾，且所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；⒘蛩峄?、磷酸化、白蛋白化、氧化或綴合聚乙二醇(PEG)部分的一或多種。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽，其中所述多肽含有導(dǎo)致該多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；?、硫酸化、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性發(fā)生改變的一或多個(gè)額外的氨基酸修飾。
19.編碼權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽的核酸分子。
20.一種載體，其包含權(quán)利要求19的核酸分子。
21.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求19的核酸分子。
22.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20的載體。
23.權(quán)利要求21或22的細(xì)胞，其是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
24.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的修飾的EPO多肽。
25.權(quán)利要求對(duì)的藥物組合物，其中所述組合物是液體、溶液、懸浮液、氣霧劑、片劑、 錠劑或膠囊的形式。
26.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述組合物是片劑或膠囊的形式。
27.權(quán)利要求沈的藥物組合物，其中所述片劑或膠囊是腸溶包衣的。
28.權(quán)利要求對(duì)-27任一項(xiàng)的藥物組合物，其配制為口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、皮下、口腔、 吸入、肌內(nèi)、直腸或局部施用。
29.權(quán)利要求觀的藥物組合物，其配制為口服施用。
30.權(quán)利要求四的藥物組合物，其中所述藥物組合物配制口服施用至胃腸道。
31.一種治療方法，包括施用權(quán)利要求M-30任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述疾病或病癥可被促紅細(xì)胞生成素(EPO)治療。
32.權(quán)利要求31的治療方法，其中口服施用所述藥物組合物。
33.權(quán)利要求31或32的治療方法，其中所述疾病或病癥選自伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎癥的貧血；圍手術(shù)期手術(shù)；鐵超載病癥；異常止血；組織保護(hù)治療；神經(jīng)性障礙； 和自體捐血。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述貧血選自地中海貧血，鐮刀細(xì)胞貧血，早產(chǎn)兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植后貧血。
35.一種配制為口服施用的藥物組合物，其包含修飾的治療性多肽或所述多肽的活性片段，所述活性片段中含有一或多個(gè)修飾，其中所述治療性多肽或其活性片段是含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的多肽；所述治療性多肽或其活性片段在一或多個(gè)掩蔽的is-HIT殘基處包含一或多個(gè)氨基酸修飾；及所述治療性多肽或其活性片段與不包含所述一或多個(gè)氨基酸修飾的未修飾的治療性多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。
36.權(quán)利要求35的藥物組合物，其中所述掩蔽的is-HIT殘基選自在所述多肽的糖基化位點(diǎn)0_25人之內(nèi)的is-HIT殘基。
37.權(quán)利要求35或36的藥物組合物，其中所述掩蔽的is-HIT殘基選自在所述多肽的糖基化位點(diǎn) 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25人之內(nèi)的is-HIT殘基。
38.權(quán)利要求35-37任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
39.權(quán)利要求35-38任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述治療性多肽是細(xì)胞因子。
40.權(quán)利要求39的藥物組合物，其中所述治療性多肽選自促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)，白細(xì)胞介素-1 β (IL-I)，白細(xì)胞介素-2 (IL-2)，白細(xì)胞介素-3 (IL-3)，白細(xì)胞介素_4 (IL-4)，白細(xì)胞介素-5(IL-5)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)白細(xì)胞介素_9 (IL-9)，干擾素-β (IFN-β)，干擾素-Y (IFN-γ)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)， 巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)，血小板生成素(TPO)，白血病抑制因子(LIF)，干細(xì)胞因子(SCF)，制瘤素M(OSM)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述治療性多肽選自SEQID Ν0:2，237 274,276, 278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 的任一個(gè)，其活性片段，或與 SEQ ID NO 2,237 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300，302，304和306任一所示多肽具有至少或至少大約60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%，96%，97%，98%，99%或更高序列相同性的變體。
42.權(quán)利要求35-41任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述治療性多肽包含至少2個(gè)氨基酸修飾，及所述2個(gè)氨基酸修飾在被不同糖基化位點(diǎn)掩蔽的掩蔽is-HIT殘基處。
43.權(quán)利要求35-42任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述治療性多肽是SEQID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽，或者是與具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大約 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %， 99%或更高序列相同性的變體。
44.權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT殘基選自被在選自 N24，N38, N83和SU6的一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的糖基化掩蔽的殘基。
45.權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述掩蔽is-Hit殘基選自相應(yīng)于SEQID NO 2 或SEQ ID而237中氨基酸殘基的氨基酸殘基1 14丄16丄17』18，1(20工21工23工31丄；35， E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93，D96，K97，P121，P122，D123，P129，L130，R131，D136，F(xiàn)138，R139，K140，L141，F(xiàn)142，R143 和 Y145。
46.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自R14H，R14Q，L16I， L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H和Y145I的一或多個(gè)氨基酸修飾修飾。
47.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自K20Q，L80I,P90S， L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q 的一或多個(gè)氨基酸修飾修飾。
48.權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自K20Q，L80I,L93I，L93V和R139H的一或多個(gè)氨基酸修飾修飾。
49.權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述治療性多肽是選自R139H;L93I；K20Q/ R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/ L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ； K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的修飾的 ΕΡ0。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述治療性多肽是選自R139H，R139H/K20Q，K20Q/ R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/ L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V 禾口 R139H/L93I 的修飾的 ΕΡ0。
51.權(quán)利要求35-50任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述治療性多肽在非掩蔽is-HIT殘基處進(jìn)一步包含一或多個(gè)氨基酸修飾。
52.權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所述治療性多肽是促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽且所述非掩蔽is-HIT殘基選自相應(yīng)于 SEQ ID NO :2 或 237 的氨基酸殘基 P2，P3，R4, L5，C7，D8，RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165，和 R166。
53.權(quán)利要求52的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進(jìn)一步修飾選自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I，R103H，R103Q,L105I，L105V，L108I，L108V，L109I，L109V，R110H,R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q0
54.權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進(jìn)一步修飾選自 R4H ；F48I ；K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V。
55.權(quán)利要求M的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進(jìn)一步修飾選自 R4H, K52N, L153V 和 E159N。
56.權(quán)利要求51-55任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/ R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/ R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
57.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/ R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/ E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/ R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N；K20Q/ L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/ L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/ R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/ R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/ L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/ K52N。
58.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ； L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H；K20Q/L80I/ R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L801/Rl39H/L931 ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
59.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/ L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N。
60.權(quán)利要求43-59任一項(xiàng)的藥物組合物，其在糖基化位點(diǎn)N24、N38和N83的一或多個(gè)處進(jìn)一步包含一或多個(gè)氨基修飾，其中所述修飾消除了在該位點(diǎn)的糖基化。
61.權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述修飾是選自NMH，N38H,N83H, N24K, N38K和 N83K的氨基酸置換。
62.權(quán)利要求43-61任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述未修飾的EPO多肽長(zhǎng)度是160， 161，162，163，164，165 或 166 個(gè)氨基酸。
63.權(quán)利要求43-62任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述未修飾的EPO多肽包含SEQID NO: 2或237所示氨基酸序列。
64.權(quán)利要求35-63任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽被進(jìn)一步修飾且所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化白蛋白化、氧化或綴合聚乙二醇(PEG)部分的一或多種。
65.權(quán)利要求35-64任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽含有導(dǎo)致修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲?；⒘蛩峄?、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性發(fā)生改變的一或多個(gè)額外的氨基酸修飾。
66.權(quán)利要求35-65任一項(xiàng)的藥物組合物，其配制為片劑或膠囊。
67.權(quán)利要求66的藥物組合物，其中所述片劑或膠囊是腸溶包衣的。
68.權(quán)利要求35-67任一項(xiàng)的藥物組合物，其配制為液體。
69.一種治療方法，其包含口服施用權(quán)利要求35-68任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述疾病或病癥可被所述治療性多肽治療。
70.權(quán)利要求69的治療方法，其中所述藥物組合物中的修飾的治療性多肽是修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)且所述疾病或病癥選自伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎癥的貧血；圍手術(shù)期手術(shù)；鐵超載病癥；異常止血；組織保護(hù)治療；神經(jīng)性障礙；和自體捐血。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述貧血選自地中海貧血，鐮刀細(xì)胞貧血，早產(chǎn)兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植后貧血。
72.權(quán)利要求M-30或35-68任一項(xiàng)的藥物組合物，其配制為用于治療可用所述促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽或所述治療性多肽治療的疾病或病癥的藥物。
73.權(quán)利要求M-30或35-68任一項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療可用所述促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽或所述治療性多肽治療的疾病或病癥。
全文摘要
提供了修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和其它修飾的治療性多肽。所述EPO多肽和其它治療性多肽經(jīng)修飾分別顯示與未修飾的EPO多肽和其它未修飾的治療性多肽不同的物理性質(zhì)和活性。還提供了編碼這些多肽的核酸分子。還提供了利用所述多肽的治療和診斷方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102186879SQ200980129823
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者T·居永, G·伯雷利, X·加萊, L·德里坦提, M·維嘉 申請(qǐng)人:韓諾生物制約株式會(huì)社