專利名稱：用于抑制TGF-β受體基因表達的組合物和方法
用于抑制TGF-β受體基因表達的組合物和方法本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNAs)及其介導(dǎo)DNA干擾以抑制TGF- β受體基因表 達的用途，特別是抑制I型TGF-β受體表達的用途。此外，所述dsRNA用于治療纖維化性 疾病/病癥、炎癥和增殖性疾病(例如癌癥)的用途也是本發(fā)明的一部分。轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β ；AfCS ID Α002271)是細胞因子的TGF-β超家族的一 部分，其具有超過40個成員。TGF-β本身具有至少三種同種型，包括TGF-β l、TGF-i3 2和 TGF-β 3 每種是同源二聚體，雖然在TGF-β同種型和TGF-β超家族的其它成員之間也可 形成異源二聚體。TGF-β由很多細胞類型分泌，包括與兩種其它多肽(潛在TGF-β結(jié)合蛋 白(LTBP)和潛在相關(guān)肽(LAP))復(fù)合的潛在形式的巨噬細胞。血清蛋白酶，例如纖溶酶，催 化活性TGF-β從復(fù)合體中釋放。這通常發(fā)生于巨噬細胞表面，其中潛在TGF-β復(fù)合體通 過其配體(血小板反應(yīng)蛋白-I(TSP-I))與CD36結(jié)合?；罨奘杉毎难仔源碳ねㄟ^促進 纖溶酶的活化，增強了活性TGF-β的釋放。巨噬細胞還可內(nèi)吞漿細胞分泌的結(jié)合IgG的潛 在TGF-β復(fù)合體，由此將活性TGF-β釋放進細胞外液體中。I 型和 II 型 TGF-β 受體(AfCS ID Α002272/Α002273)均涉及對 TGF-β 的信號 應(yīng)答。兩種均為具有胞質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的I型整合膜蛋白。II型受體在不 存在配體時形成同源二聚體，并且可互相自身磷酸化。II型受體可獨立于I型受體結(jié)合 TGF-β，它們是配體特異性的主要決定子。I型受體也可無需配體形成同源二聚體，但是在 不存在II型受體時它們不能與配體高效結(jié)合。存在配體時，I型和II型受體形成高親合 性(avidity)受體復(fù)合體。然后II型受體磷酸化I型受體，致使它們活化。除了對Smad轉(zhuǎn)錄因子的直接活化(下文詳述)之外，還有一些證據(jù)表明，TGF-β 受體可通過Ras、RhoA和TGF-β活化激酶(TAK)來活化ERK、JNK和ρ38ΜΑΡ激酶。其它報道 表明，TGF-β受體可通過PI 3-激酶和蛋白磷酸酶2Α產(chǎn)生信號。TGF-β受體活化非Smad 信號途徑的機制尚不清楚?；旧?，TGF- β受體通過被稱為Smads的潛在胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子傳遞信號。術(shù)語Smad 源于同源果也黽(Drosophila)Mad 蛋白("mothers againstdecapentaplegic，，的縮寫)禾口 秀麗隱桿線蟲(Celegans)Sma蛋白(“small”的縮寫)的名稱。結(jié)合配體后，磷酸化的I 型TGF- β受體結(jié)合被受體調(diào)節(jié)的Smads (R-Smads)——Smadl、2、3、5和8，并對它們磷酸化。 R-Smads和TGF-β受體復(fù)合體的結(jié)合由被稱為SARA的含F(xiàn)YVE結(jié)構(gòu)域的適體蛋白協(xié)助，并 且可在受體已經(jīng)內(nèi)化進內(nèi)體之后發(fā)生。一旦被磷酸化，R-Smads從受體復(fù)合體上解離，形成 同源三聚體并且與Smad4(共同介體Smad(Co-Smad))結(jié)合。R_Smad/Smad4復(fù)合體轉(zhuǎn)位進 細胞核，并且通過與組織特異性轉(zhuǎn)錄輔激活物或輔阻遏物相互作用來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Smad4 和R-Smads的Mad同源性1 (MHl)結(jié)構(gòu)域結(jié)合5 ‘ -AGACC-3 ‘ Smad結(jié)合元件(SBE)。TGF- β受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受Smad7抑制性Smad (I-Smad)的負調(diào)控。Smad7和Smurf2E3 連接酶的復(fù)合體與SARA競爭結(jié)合TGF-β受體，并促進TGF-β受體復(fù)合體的泛素化和降 解。1 狀/^孤途徑還削弱16 -0向細胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。ERK對R-Smads的磷酸化阻止了它 們的核積累。TGF-β有廣泛的生物活性，因其太多在此不予贅述。雖然其抑制了很多細胞類型的生長，但是其也可誘導(dǎo)細胞增殖和活化。近來已表明，對TGF-β受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制 可阻止大鼠頸動脈損傷模型中狹窄(stenosis)的形成(Fu et al.，Arteriosclerosis， Thrombosis, and Vascular Biology 2008,28:665)。此夕卜，II 型 TGF-β 受體的 增加的表達看起來在糖尿病性大血管病的發(fā)展中具有重要作用(Hosomi et al., Atherosclerosis. 2002,162 :69-76)。TGF-β已被一般性地涉及纖維化性組織的形成中， 對TGF-β與TGF-β受體的結(jié)合的抑制已顯示能減輕纖維化(Yata et al, Hepatology 2003，35:1022-1030)。雙鏈RNA分子(dsRNA)已顯示能以被稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機制 來阻斷基因表達。WO 99/32619 (Fire et al.)公開了使用長度為至少25個核苷酸的dsRNA 來抑制TGF-β受體基因在秀麗隱桿線蟲中的表達。在肝中，正常情況下由非實質(zhì)星狀細胞產(chǎn)生的TGF-β的主要功能是通過抑制DNA 合成和誘導(dǎo)凋亡來限制肝細胞應(yīng)答于損傷的再生性生長。在可能是由于慢性肝炎導(dǎo)致的肝 細胞癌(HCC)患者的肝中存在高水平的TGF-β產(chǎn)生。TGF-β的水平與HCC進程良好相關(guān)。 但是，在HCC細胞中TGF-β-受體II被下調(diào)，使得它們對TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制不敏感。 因此，目前假設(shè)TGF-β在HCC中的功能是其通過抑制免疫系統(tǒng)幫助HCC細胞逃避免疫細 胞攻擊。HCC細胞能夠使用利于生長和侵入的替代性TGF-β信號途徑。TGF-β-受體I抑 制劑已被用于針對源于HCC的肝纖維化的臨床前研究。雖然在RNAi的領(lǐng)域取得了顯著進展以及在纖維化和增殖性病癥(例如癌癥)的 治療方面也取得了進展，但是人們?nèi)孕枰苓x擇性并且高效沉默TGF-β受體基因的試劑。在對用于治療纖維化疾病的治療活性物質(zhì)的開發(fā)中，使用RNAi是可行途徑，所述 疾病例如肝纖維化和肝硬化、腎纖維化、脾纖維化、胰和肺的囊性纖維化、注射性纖維化、心 內(nèi)膜心肌纖維化、肺的特發(fā)性肺纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進行性大 塊纖維化、腎源性系統(tǒng)纖維化、彌漫性實質(zhì)性肺病、輸精管切除術(shù)后疼痛綜合征和類風濕性 關(guān)節(jié)炎。或者，TGF-β受體表達的抑制劑，特別是用本發(fā)明的dsRNA分子對TGF-β受體I 的表達的抑制劑，可用于治療癌癥，例如肝癌，以及例如HCC。本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸分子(dsRNAs)以及使用此類dsRNA抑制TGF-β受體 基因在細胞、組織或哺乳動物中表達、特別是抑制TGF-β受體I基因的表達的組合物和方 法。本發(fā)明還提供了用于治療TGF-β受體基因(特別是TGF-β受體I基因)表達導(dǎo)致 的病理性狀況和疾病(例如在纖維化、炎癥中以及在增殖性病癥中)的組合物和方法。本 發(fā)明的雙鏈核糖核酸分子特征在于其在體外將TGF-β受體I基因(特別是哺乳動物和人 TGF-β受體I基因)的表達抑制至少80%的能力。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的雙 鏈核糖核酸分子包含有義鏈和反義鏈，反義鏈至少部分與有義鏈互補，其中有義鏈包含具 有與編碼TGF-β受體的mRNA的至少一部分至少90%同一性的序列，其中所述序列(i)位 于所述有義鏈與所述反義鏈的互補性區(qū)域；并且(ii)其中所述序列長度少于30個核苷酸。本發(fā)明的dsRNA包含具有下述區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，所述區(qū)域少于30個核苷酸 長，并且與I型TGF- β受體基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少部分實質(zhì)性互補。使用這些dsRNAs 使得I型TGF-β受體(其牽涉到哺乳動物中的纖維化應(yīng)答、炎性事件以及增殖性病癥等 等，例如癌癥，例如肝癌)的mRNAs得以靶向降解。使用基于細胞的測定法以及動物測定 法，本發(fā)明的發(fā)明人已證實非常低劑量的這些dsRNA可特異性并高效介導(dǎo)RNAi，導(dǎo)致對所
5述TGF-β受體基因的表達的顯著抑制。因此，本發(fā)明的包含這些dsRNAs的方法和組合物 可用于治療其中出現(xiàn)不期望的I型TGF-β受體表達的病癥。此類病癥包括纖維化性病癥、 炎癥以及增殖性病癥，例如癌癥/腫瘤。本發(fā)明上下文中提供了相應(yīng)的dsRNA分子，下文表1和表3中，以及優(yōu)選地所附的 SEQ ID NOs/ 對:1/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23Λ4、13/14、29/30 和 7/8 等等中，提供了最優(yōu)選的dsDNA分子。在本文提供的特定dsRNA分子的上下文中，SEQ ID NOs對涉及還在本文所附且包括的表中示出的相應(yīng)有義和反義鏈序列(5’至3’)。此外，本文提供了經(jīng)修飾的dsRNA分子，特別地，其還公開于表3中，其中提供了 對本發(fā)明的此類“經(jīng)修飾的dsRNA分子”的闡釋性例子。在該方面，優(yōu)選的分子包括SEQ ID NOs/ 對151/152、249/250、261/262、231/232、275/276、253/254、211/212、265/266、 181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280 和 219/220 所示的等等。本發(fā)明的 dsRNAs的這些組分的闡述性修飾在本文中作為修飾的例子提供。此外，本發(fā)明還包含這 些dsRNAs (及其組分)的其它修飾，這也作為本發(fā)明的一種實施方式。相應(yīng)的例子提供于 本發(fā)明的更詳細描述中。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于抑制TGF-β受體基因表達(特別是哺乳動 物或人I型TGF-β受體基因的表達)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子。人I型TGF-β受體 基因的編碼序列可從相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲得，見例如Genebank/EMBL. NM_004612. 2。還在本文中 用作為I型TGF-β受體基因的參考序列的一條編碼序列被提供于所附的SEQ ID NO. 326中。dsRNA包含互相互補的至少兩條序列。dsRNA包含含有第一序列的有義鏈和可含 有第二序列的反義鏈，還見所附的表1和3中提供的特定dsRNA對。反義鏈可包含與編碼 所述TGF-β受體的mRNA的至少部分實質(zhì)性互補的核苷酸序列，互補性區(qū)域最優(yōu)選長度小 于30個核苷酸。此外，優(yōu)選地，本文所述的本發(fā)明dsRNA分子的長度(雙鏈體長度)在大 約16至30個核苷酸的范圍內(nèi)，特別地，在大約18至觀個核苷酸的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的上 下文中，特別有用的是大約19、20、21、22、23或?qū)€核苷酸的雙鏈體長度。最優(yōu)選的是19、 21或23個核苷酸的雙鏈體片斷。DsRNA與表達TGF-β受體的細胞接觸時，將體外TGF-β 受體I基因的表達抑制至少80%。所附的實施例中提供了如何測試此類體外抑制的非限制性測定法，其中本發(fā)明及 本文所述的的siRNAs/dsRNAs的活性在HeLa，特別是HeLaS3細胞中被測試。這些培養(yǎng)中的 HeLa細胞被用于對I型TGF β -受體mRNA加以定量，這通過從用TGF β受體特異性siRNAs 測定法培養(yǎng)的細胞分離的總mRNA中支化DNA來實現(xiàn)。特別地，可體外測量這種抑制。相應(yīng) 測定法易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員建立，本文也有所提供。如例如本文所附實施例或提供的表 中所述，最優(yōu)選地，本發(fā)明的dsRNAs在30nM的濃度下對人I型TGF-β受體的體外表達抑 制至少大約80%。本發(fā)明的具體的dsRNA分子甚至在更低的濃度下(例如300pM)對I型 TGF-β受體的體外表達抑制至少大約80%。再次，表1和2中提供了相應(yīng)的例子，在所述 表中，通過被評估的細胞中剩余的RNA的量闡明了抑制。在一種實施方式中，有義鏈包含具有與編碼I型TGF-β受體的mRNA的至少部分 至少90 %同一性的序列。所述序列位于有義鏈與反義鏈的互補性區(qū)中，優(yōu)選地，位于反義鏈 5’末端的第2-7個核苷酸內(nèi)。在一種優(yōu)選的實施方式中，dsRNA特別地靶向人I型TGF- β受
6體基因，在另一實施方式中，dsRNA靶向小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus) I型TGF-β受體基因。在一種實施方式中，本發(fā)明的dsRNA分子包含有義和反義鏈，其中，兩條鏈均具有 至少5小時的半壽期。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的dsRNA包含有義和反義鏈，其中 兩條鏈在人血清中均具有至少5小時的半壽期。在另一實施方式中，本發(fā)明的dsRNa分子是非免疫刺激性的，例如，不體外刺激 INF- α 禾口 TNF- α。本發(fā)明的dsRNA分子可包含天然存在的核苷酸或可包含至少一個經(jīng)修飾的核苷 酸，例如，2’-0_甲基修飾的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸、與膽固醇基衍生物 或十二烷酸雙癸基酰胺基團相連的末端核苷酸。2’修飾的核苷酸可具有額外的優(yōu)點當本 發(fā)明的dsRNA分子體內(nèi)使用時，例如在醫(yī)藥背景中，某些免疫刺激性因子或細胞因子被抑 制?；蛘?，并且非限制性地，經(jīng)修飾的核苷酸可選自2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷酸、2’-脫 氧修飾的核苷酸、鎖定核苷酸、無堿基核苷酸、2’ -氨基修飾的核苷酸、2’ -烷基修飾的核苷 酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)和包含非天然堿基的核苷酸構(gòu)成的組。 在一種優(yōu)選的實施方式中，dsRNA分子包含下述經(jīng)修飾的核苷酸中的至少一種2’-0_甲基 修飾的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸和脫氧胸苷。在另一優(yōu)選的實施方式中， 有義鏈的所有嘧啶是2’ -0-甲基修飾的核苷酸，反義鏈的所有嘧啶是2’ -脫氧-2-’ -氟修 飾的核苷酸。在一種優(yōu)選的實施方式中，在dsRNA分子的兩條鏈的3’端發(fā)現(xiàn)兩個脫氧胸苷 核苷酸之一。在另一實施方式中，dsRNA分子的兩條鏈的3’末端的這些脫氧胸苷核苷酸中 的至少一個包含5’ -硫代磷酸酯基團。在另一實施方式中，在有義鏈中，腺嘌呤之前的所 有胞嘧啶以及腺嘌呤、鳥嘌呤或尿嘧啶之前的所有尿嘧啶是2’ -0-甲基修飾的核苷酸，反 義鏈中腺嘌呤之前的所有胞嘧啶和尿嘧啶是2’ -0-甲基修飾的核苷酸。在所附的表3中， 提供了闡述性的、經(jīng)修飾的雙鏈RNA分子。本發(fā)明的dsRNA還可包含一個或多個單鏈核苷酸突出端。還如上文所描述的，這 些突出端可特別位于每條鏈的3’末端，并且可包含一個、兩個、三個、四個或五個額外的核 苷酸。還如所附實施例中闡述的，沒有額外的核苷酸、有一個或兩個額外的核苷酸的突出端 是特別感興趣的。在一些實施方式中，額外的核苷酸是“T”，優(yōu)選是兩個“T”，S卩，在每條鏈 的3’末端上具有“TT”的突出端。本發(fā)明的dsRNA分子可包含選自表1或3的有義序列構(gòu)成的組的dsRNA第一鏈， 以及選自表1或3的反義序列構(gòu)成的組的dsRNA第二鏈。這兩條序列的優(yōu)選的對提供于表 中一行/排內(nèi)。優(yōu)選地，dsRNA包含兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸(有義)由表1所示，第二 寡核苷酸(反義)由表1所示，或者其中，一個經(jīng)修飾的寡核苷酸(有義)由表3所示，第 二寡核苷酸(反義)也由表3所示。兩張表在每列中均提供了特別有用的有義和反義鏈序 列，均以5’至3’方向提供，每列中的這些序列是用于本發(fā)明的各dsRNAs的優(yōu)選序列。因此，本發(fā)明的dsRNA的第一序列可選自表1 (或3)的有義序列構(gòu)成的組，第二序 列可選自表1 (或3)的反義序列構(gòu)成的組，其中表3提供了示例性的2’ -0-甲基修飾的序 列。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的至少一種dsRNAs的細胞。所述細胞優(yōu)選是哺乳動物細胞，例如人細胞。此外，本發(fā)明還包含含有本文定義的dsRNA分子的組織和/或非人生 物，其中，所述非人生物對于研究目的或者作為研究工具來說特別有用，例如用于藥物測試 中。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的發(fā)明性dsRNAs的藥物組合物。這些藥物組合物特別 用于抑制I型TGF-β受體基因在細胞、組織或生物中的表達。包含本發(fā)明的一種或多種 dsRNA的藥物組合物還可包含(a)可藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑。因此，本發(fā)明的某些 方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA(任選與可藥用載體一起)的藥物組合物、使用所述組合物 抑制I型TGF-β受體基因表達的方法以及使用所述藥物組合物治療TGF-β受體基因，特 別是I型TGF-β受體基因的表達導(dǎo)致的疾病的方法。此外，本發(fā)明涉及抑制TGF-β受體基因(特別是哺乳動物或人I型TGF-β受體 基因)在細胞、組織或生物中表達的方法，所述方法包括下述步驟(a)向細胞、組織或生物中引入本文定義的雙鏈核糖核酸(dsRNA)；(b)將步驟(a)中產(chǎn)生的所述細胞、組織或生物保持足夠的時間，以獲得I型 TGF-β受體基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解，由此抑制I型TGF-β受體基因在給定細胞中的表 達。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或管理纖維化性病癥/疾病、炎癥或 增殖性病癥的方法，所述方法包括向需要此類治療、預(yù)防或管理的受試者施用治療或預(yù)防 有效量的一種或多種本發(fā)明的dsRNAs。優(yōu)選地，所述受試者是哺乳動物，最優(yōu)選是人類患
者ο本發(fā)明還提供了核酸序列，其編碼本文定義的雙鏈核糖核酸分子中包含的有義鏈 和/或反義鏈。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了抑制TGF-β受體基因，特別是包含與編 碼本發(fā)明dsRNA之一的至少一條鏈的核苷酸序列有效連接的調(diào)控序列的I型TGF-β受體 基因在細胞中表達的載體。此類本發(fā)明的核酸分子或載體可包含在細胞、組織或非人生物 中。此類非人生物可以是轉(zhuǎn)基因的非人動物。本發(fā)明的細胞、組織以及非人轉(zhuǎn)基因生物可 用作為研究工具。此外，細胞和組織還可用于醫(yī)學介入以及用作為藥物。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了包含用于抑制TGF-β受體基因(特別是I型 TGF-β受體基因)在細胞中表達的載體的細胞。所述載體包含與編碼本發(fā)明的dsRNA之一 的至少一條鏈的核苷酸序列有效連接的調(diào)控序列。此外，優(yōu)選地，所述載體除了包含所述調(diào) 控序列之外，還包含編碼本發(fā)明dsRNA的至少一條“有義鏈”和所述dsRNA的至少一條“反 義鏈”的序列。本發(fā)明還設(shè)想要求保護的細胞包含兩個或多個下述載體，所述載體除了包 含所述調(diào)控序列之外，還包含編碼本發(fā)明的dsRNA之一的至少一條鏈的本文定義的序列。本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及使用所述dsRNA抑制I型TGF-β受體 基因在細胞或哺乳動物中表達的組合物和方法。本發(fā)明還提供了使用所述dsRNA在哺乳動 物中治療I型TGF-β受體基因表達導(dǎo)致的病理性狀況和疾病的組合物和方法。dsRNA通 過被稱為RNA干擾(RNAi)的過程指導(dǎo)mRNA的序列特異性降解。該過程在多種不同的生物 (包括哺乳動物和其它脊椎動物)中發(fā)生。本發(fā)明中選擇的dsRNA分子提供于表1和3中，其中表1定義了 TGF-β受體(I 型)基因(也由Genebank/EMBL. NM_004612. 2示出)中的靶位點以及相關(guān)dsRNA的有義和 反義鏈。此外，還針對某些特別優(yōu)選的dsRNA(提供的有義和反義序列)，提供了生物和臨床
8相關(guān)的有利參數(shù)；見附表2和4。表1還涉及根據(jù)本發(fā)明用作為dsRNA的優(yōu)選分子。特別優(yōu)選的是第一層(1至10 排)和第二層(11至31 )提供的鑒定的dsRNA。但是，第三層(32至58排)和第四層(第 59至75排)也包含可用于本發(fā)明的dsRNA分子。如上文明顯所示地，部分優(yōu)選的dsRNA分 子被提供于 SEQ ID NOs :1/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23Λ4、13/14、29/30 和/或7/8定義的有義和反義對中。表2提供了表I所示的本發(fā)明的特定dsRNA分子的某 些生物和臨床特征。在本發(fā)明的上下文中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，可用于抑制(人)1型TGF-β受體基因表 達的一些特別優(yōu)選的dsRNAs在I型TGF-β受體基因的相應(yīng)mRNA的特定區(qū)域聚簇。關(guān)于 所附 SEQ ID NO. 326 中(以及還在 Genebank/EMBL NM_004612. 2 中)提供的人 I 型 TGF- β 受體基因，所述簇包含在所附SEQ ID NO. 326(代表人I型TGF-β受體基因)的第250至 350位以及1500至1600位核苷酸的區(qū)域中，更優(yōu)選地，第220-320位以及1520至1580位 核苷酸，或者更優(yōu)選地，第四8-332以及1522至1569位核苷酸的區(qū)域中。表3和4還提供了可用于本發(fā)明上下文中的其它SiRNA分子/dsRNA,其中表4提 供了表3所示的本發(fā)明的經(jīng)修飾的siRNA分子/dsRNA分子的某些生物和/或臨床相關(guān)的 令人驚奇的特征。特別有用的、經(jīng)修飾的分子包含第一層(1至15 )和第二層(16至42 排)中提供的序列(有義和反義鏈)。此外，第三層(43至75排)中定義的dsRNA/siRNAs 包含可用于本發(fā)明上下文中的有用的dsRNA分子，只要能實現(xiàn)對I型TGF-β受體基因表 達的抑制(所述抑制在體外測量，并且抑制了大約至少80%)即可。在經(jīng)修飾的dsRNA/ siRNAs 的上下文中，優(yōu)選的是 SEQ ID NOs :151/152,249/250,261/262,231/232,275/276, 253/2M、211/212、265/266、181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280 和 / 或 219/220中提供的序列。定義為方便起見，本說明書、實施例和所附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語和短語的含義 被提供于下文中。如果本說明書其它部分的術(shù)語使用與本章節(jié)所提供的其定義明顯不同， 以本章節(jié)的定義為準?！癎”、“C”、“A”、“U”和“T”或“dT”每個分別一般性地代表分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、
腺嘌呤、尿嘧啶和脫氧胸苷作為堿基的核苷酸。但是，術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可 表示經(jīng)修飾的核苷酸(如下文所詳細描述的)或者備選替換部分。包含此類替換部分的序 列也是本發(fā)明的實施方式。如下文所詳細描述的，本文所述的dsRNA分子還包含“突出端”， 即，不直接參與本文定義的“有義鏈”和“反義鏈”的對的正常形成的RNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的未 配對的突出核苷酸。通常，此類突出序列包含脫氧胸苷核苷酸，在大多數(shù)實施方式中，是3’ 末端的2-脫氧胸苷。此類突出端將在下文中描述和闡述。術(shù)語“TGF-β受體”或“轉(zhuǎn)化生長因子β因子”在本文中特別表示I型TGF-β受 體(TGF-β受體Ι，ΙΙ型激活蛋白A受體樣激酶)，所述術(shù)語涉及相應(yīng)的基因、編碼的mRNA、 編碼的蛋白/多肽以及它們的功能性片段。本文提供的片段涉及本文定義的dsRNA分子所 針對的靶序列中簇的本文定義的“熱點”等等。此類片段包括所附SEQ ID NO. 3 的第250 至350位和第1500至1600位核苷酸等等。術(shù)語“I型TGF-β受體基因/序列”不僅涉及 野生型序列，還涉及所述基因/序列中可能包含的突變和改變。因此，本發(fā)明不限于本文提供的特定的dsRNA分子。本發(fā)明還涉及包含下述反義鏈的dsRNA分子，所述反義鏈與包含 此類突變/改變的I型TGF-β受體基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)核苷酸序列至少85%互補。在本文中使用時，“靶序列”指I型TGF-β受體轉(zhuǎn)錄期間形成的mRNA分子(包括 是對一級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行RNA加工的產(chǎn)物的mRNA)的核苷酸序列的連續(xù)部分。在本文中使用時，術(shù)語“包含序列的鏈”指這樣的寡核苷酸，其包含使用標準核苷 酸命名法的所述序列所示的核苷酸的鏈。但是，如本文中詳細描述地，此類“包含序列的鏈” 也可包含修飾，例如經(jīng)修飾的核苷酸。在本文中使用時，除非另有指明，在用于描述相對于第二核苷酸序列的第一核苷 酸序列時，術(shù)語“互補”指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序 列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下雜交并形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力。在本文中使用時， “互補”序列還可包括從非天然和經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對和/或非Watson-Crick堿 基對，或者完全由它們形成，只要它們雜交能力方面的上述要求能夠滿足即可。被稱為“完全互補”的序列包含包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包 含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長上的堿基配對。但是，在本文中當?shù)谝恍蛄斜环Q為相對第二序列“實質(zhì)性互補”時，兩條序列可以 是完全互補的，或者它們在雜交時可形成一處或多處但優(yōu)選不超過13處錯配堿基對。術(shù)語“互補”、“完全互補”和“實質(zhì)性互補”在本文中可根據(jù)dsRNA的有義鏈和反 義鏈之間或者dsRNA的反義鏈和靶序列之間的堿基匹配來使用，這將可從它們使用的上下 文來理解。術(shù)語“雙鏈RNA”、“dsRNA分子”或“dsRNA”在本文中使用時表示下述核糖核酸 分子或核糖核酸分子復(fù)合體，它們具有包含兩條反平行并且實質(zhì)性互補的核酸鏈的雙鏈體 結(jié)構(gòu)。形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是一個較大RNA分子的不同部分，或者它們可以是不 同的RNA分子。當兩條鏈是一個較大分子的部分并且由此通過形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的一條鏈的 3’末端和另一條鏈的5’末端之間的未間斷核苷酸鏈相連時，連接用的RNA鏈被稱為“發(fā)夾 環(huán)”。當兩條鏈并非通過形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的一條鏈的3’末端和另一條鏈的5’末端之間的 未間斷核苷酸鏈共價相連時，連接的結(jié)構(gòu)被稱為“接頭”。RNA鏈可具有相同或不同數(shù)量的核 苷酸。除了雙鏈體結(jié)構(gòu)之外，dsRNA可包含一條或多條核苷酸突出端。所述“突出端”中的 核苷酸可包含0至5個核苷酸，其中“0”表示沒有額外的形成“突出端”的核苷酸，而“5”表 示在dsRNA雙鏈體的各鏈上有5個另外的核苷酸。這些任選的“突出端”位于各鏈的3’末 端。如下文所詳細描述地，在本發(fā)明的范疇內(nèi)，僅在兩條鏈之一包含“突出端”的dsRNA分子 也可能是有用的，甚至是有利的?！巴怀龆恕眱?yōu)選包含0至2個核苷酸。最優(yōu)選地，在dsRNA 的兩條鏈的3’末端均有2個“dT”(脫氧胸苷)核苷酸。此外，2個“U”(尿嘧啶)核苷酸 可作為dsRNA的兩條鏈的3’末端的突出端。因此，“核苷酸突出端”指當dsRNA的一條鏈 的3’末端從另一條鏈的5’末端延伸出去或者反過來時，從dsRNA的雙鏈體結(jié)構(gòu)伸出的未 成對的一個或多個核苷酸。例如，反義鏈包含23個核苷酸，有義鏈包含21個核苷酸，就在 反義鏈的3’末端形成了 2個核苷酸的突出端。優(yōu)選地，該2個核苷酸的突出端與靶基因的 mRNA完全互補?！捌降摹被颉捌侥┒恕北硎驹赿sRNA的該末端沒有未成對的核苷酸，即，沒有 核苷酸突出端。“平末端” dsRNA是在其全長上均為雙鏈的dsRNA，S卩，在分子的任一末端都 沒有核苷酸突出端。
10
術(shù)語“反義鏈”指dsRNA的鏈，其包括與靶序列實質(zhì)性互補的區(qū)域。在本文中使用 時，術(shù)語“互補性區(qū)域”指反義鏈上與序列(例如靶序列)實質(zhì)性互補的區(qū)域。當互補性區(qū) 域與靶序列并不完全互補時，在反義鏈5’末端的第2-7個核苷酸之外的錯配是最可容忍 的。術(shù)語“有義鏈”在本文中使用時指這樣的dsRNA鏈，所述鏈包括與反義鏈的區(qū)域 實質(zhì)性互補的區(qū)域。“實質(zhì)性互補”指有義和反義鏈中重疊的核苷酸中至少85%是互補的。在提到dsRNA時，“引入細胞”表示促進攝入或吸收進細胞，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理 解的。吸收或攝入dsRNA可通過獨立進行的擴散或主動的細胞過程來進行，或可通過輔助 試劑或裝置來進行。該術(shù)語的含義不限于體外細胞；dsRNA也可被“引入細胞”，其中細胞是 活生物的一部分。在這種情況下，引入細胞將包括遞送進生物。例如，對于體內(nèi)遞送而言， 可將dsRNA注射進組織位點或者全身性施用。例如，本發(fā)明的dsRNA分子可被施用至需要 醫(yī)學介入的受試者。此類施用可包括將本發(fā)明的dsRNA、載體或細胞注射進所述受試者的患 病側(cè)，例如，注射進肝組織/細胞或注射進癌組織/細胞，例如肝癌組織。但是，也設(shè)想在患 病組織的鄰近區(qū)域注射。體外引入細胞包括本領(lǐng)域已知的方法，例如電穿孔或脂轉(zhuǎn)染。在指I型TGF- β受體基因時，術(shù)語“沉默”、“抑制......的表達”和“擊倒”在本
文中表示1型TGF-β受體基因的表達至少部分被抑制，這是通過從I型TGF-β受體基因 轉(zhuǎn)錄的mRNA的量降低表現(xiàn)的，所述mRNA可分離自第一細胞或細胞組(I型TGF-β受體基因 在其中轉(zhuǎn)錄，并且經(jīng)過處理，使得I型TGF-β受體基因的表達被抑制)，所述抑制是較之第 二細胞或細胞組(與第一細胞或細胞組基本相同，但是沒有經(jīng)過那樣的處理(對照細胞)) 而言的。抑制程度通常表示為
權(quán)利要求
1.雙鏈核糖核酸分子，所述分子能夠在體外將人I型TGF-β受體基因的表達抑制至少 80%。
2.權(quán)利要求1的雙鏈核糖核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子包含有義鏈和反義 鏈，所述反義鏈至少部分與所述有義鏈互補，其中所述有義鏈包含具有與編碼TGF-β受體 的mRNA的至少一部分至少90%同一性的序列，其中所述序列(i)位于所述有義鏈與所述反 義鏈的互補性區(qū)域；并且(ii)其中所述序列長度少于30個核苷酸。
3.權(quán)利要求1或2的雙鏈核糖核酸分子，其中所述有義鏈選自由SEQIDNos :1,117, 103、31、81、99、23、13、四和7中所示的核酸序列組成的組，并且所述反義鏈選自由SEQ ID Nos :2、118、104、32、82、100、M、14、30和8所示的核酸序列組成的組，或者其中所述雙鏈核 糖核酸分子包含選自由 SEQ ID NOs :l/2、117/118、103/104、31/32、81/82、99/100、23/M、 13/14,29/30和7/8組成的組的序列對。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項的雙鏈核糖核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子包含至 少一個經(jīng)修飾的核苷酸。
5.權(quán)利要求4的雙鏈核糖核酸分子，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸選自由2’-0_甲基修飾 的核苷酸、包含5’ -硫代磷酸酯基團的核苷酸、和與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸基酰 胺基團相連的末端核苷酸、2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷酸、2’-脫氧修飾的核苷酸、鎖定核 苷酸、無堿基核苷酸、2’ -氨基修飾的核苷酸、2’ -烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基 磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸組成的組。
6.權(quán)利要求4或5的雙鏈核糖核酸分子，其中所述有義鏈選自由SEQIDNos :151,249, 261、231、275、253、211、265、181、185、209、299、295、279 和 219 所示的核酸序列組成的組， 并且所述反義鏈選自由 SEQ IDNos :152、250、洸2、232、276、254、212、洸6、182、186、210、 300,296,280和220所示的核酸序列組成的組，或者其中所述雙鏈核糖核酸分子包含選自 由SEQ ID NOs :151/152、249/250、261/262、231/232、275/276、253/2M、211/212、265/266、 181/182、185/186、209/210、299/300、295/296、279/280 和 219/220 組成的組的序列對。
7.編碼權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子中包含的有義鏈和/或反義 鏈的核酸序列。
8.載體，其包含與編碼權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子中包含的有 義鏈或反義鏈中至少一條的核苷酸序列有效連接的調(diào)控序列，或包含權(quán)利要求7的核酸序 列。
9.細胞、組織或非人生物，其包含權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子、 權(quán)利要求7的核酸分子或權(quán)利要求8的載體。
10.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要求 7的核酸分子、權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9的細胞或組織。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，還包含可藥用載體、穩(wěn)定劑和/或稀釋劑。
12.抑制TGF-β受體基因在細胞、組織或生物中表達的方法，所述方法包括下述步驟(a)向所述細胞、組織或生物中引入權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分 子、權(quán)利要求7的核酸分子、權(quán)利要求8的載體；以及(b)將在步驟(a)中產(chǎn)生的所述細胞、組織或生物保持足以獲得TGF-β受體基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時間，由此抑制TGF-β受體基因在所述細胞中的表達。
13.治療、預(yù)防或管理纖維化疾病、炎癥事件或增殖性疾病的方法，所述方法包括向需 要此類治療、預(yù)防或管理的受試者施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-6中任意一項定義 的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要求7的核酸分子、權(quán)利要求8的載體和/或權(quán)利要求10或11 定義的藥物組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述受試者是人。
15.權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要求7的核酸分子、權(quán)利 要求8的載體和/或權(quán)利要求10或11定義的藥物組合物，用于治療纖維化疾病、炎癥事件 或增殖性疾病。
16.權(quán)利要求1-6中任意一項定義的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要求7的核酸分子、權(quán)利 要求8的載體和/或權(quán)利要求9的細胞或組織用于制備用于治療纖維化疾病、炎癥事件或 增殖性疾病的藥物組合物的用途。
17.權(quán)利要求12至14中任意一項的方法、權(quán)利要求15的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要 求15的細胞、權(quán)利要求10的藥物組合物或權(quán)利要求16的用途，其中所述纖維化疾病選自 由肝纖維化、肝硬化、腎纖維化、脾纖維化、胰和肺的囊性纖維化、注射性纖維化、心內(nèi)膜心 肌纖維化、肺的特發(fā)性肺纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進行性大塊纖維 化、腎源性系統(tǒng)纖維化、彌漫性實質(zhì)性肺病、輸精管切除術(shù)后疼痛綜合征和類風濕性關(guān)節(jié)炎 組成的組。
18.權(quán)利要求12至14中任意一項的方法、權(quán)利要求15的雙鏈核糖核酸分子、權(quán)利要求 9的細胞、權(quán)利要求10的藥物組合物或權(quán)利要求16的用途，其中所述增殖性疾病是癌性疾病。
19.權(quán)利要求18的方法、雙鏈核糖核酸分子、細胞、藥物組合物或用途，其中所述癌性 疾病選自由肝癌、腦癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌組成的組。
20.權(quán)利要求19的方法、雙鏈核糖核酸分子、細胞、藥物組合物或用途，其中所述肝癌 選自由肝細胞癌(HCC)、肝母細胞瘤、混合型肝癌、源于間質(zhì)組織的癌、肝肉瘤或膽管癌組成 的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制I型TGF-β受體基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含反義鏈，所述反義鏈具有長度小于30個核苷酸并且與I型TGF-β受體基因的至少一部分實質(zhì)性互補的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含所述dsRNA或編碼它們的核酸分子或載體以及可藥用載體；使用所述藥物組合物治療I型TGF-β受體基因的表達導(dǎo)致的疾病的方法；以及抑制I型TGF-β受體基因在細胞中表達的方法。
文檔編號C12N15/113GK102089429SQ200980127313
公開日2011年6月8日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月15日
發(fā)明者B·布拉姆利奇, H-P·沃恩洛赫爾, M·浩斯巴赫, P·丹 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司