專(zhuān)利名稱(chēng)：用于濃縮和處理液體樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于濃縮液體樣品，以獲得用于分析的生物核酸目標(biāo)材料的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)微生物的檢測(cè)和控制，在包括衛(wèi)生保健、環(huán)境控制、生物戰(zhàn)、病原體的鑒別、食物 和藥物測(cè)試在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域和各種各樣的工業(yè)系統(tǒng)中都很重要。在工業(yè)中，不需要的微生 物的存在降低了操作設(shè)備的效率并最終增加相關(guān)貨物或服務(wù)的成本。此外，因?yàn)槲⑸锓?殖快，微生物活性的存在也引起針對(duì)公眾健康的危險(xiǎn)。人們?cè)絹?lái)越關(guān)注病原生物污染水和 處理系統(tǒng)并對(duì)人、動(dòng)物和環(huán)境衛(wèi)生產(chǎn)生增加的危險(xiǎn)。在例如冷卻塔中，可能存在水源性病原微生物例如軍團(tuán)菌(Legionella sp.)。如 果不經(jīng)優(yōu)選的抗微生物劑適當(dāng)處理的話，含有微生物的氣溶膠化顆?？梢蛭霘馊苣z化微 生物而導(dǎo)致疾病(例如龐提阿克熱(Pontiac fever)或有時(shí)由嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)所致的致命軍團(tuán)菌病)產(chǎn)生的重大健康問(wèn)題。在開(kāi)放的再循環(huán)水系統(tǒng)例如冷 卻塔的情況下，對(duì)這種微生物進(jìn)行檢測(cè)是困難的，因?yàn)榈蜐舛染途哂袊?yán)重的健康危險(xiǎn)，而且 必需將大體積的水濃縮成較小體積的樣品，以便進(jìn)行所需的分析測(cè)試并獲得準(zhǔn)確而可重復(fù) 的結(jié)果。發(fā)明概述本發(fā)明涉及液體樣品的處理方法，所述液體樣品中含有非目標(biāo)微生物顆粒、無(wú)機(jī) 顆粒和微生物目標(biāo)種類(lèi)(例如細(xì)胞或病毒)。微生物目標(biāo)種類(lèi)包括包裹于其中的目標(biāo)材料。 將樣品通過(guò)預(yù)過(guò)濾介質(zhì)，讓目標(biāo)種類(lèi)作為濾液通過(guò)。一些非目標(biāo)生物顆粒和無(wú)機(jī)顆粒被保 留在預(yù)過(guò)濾介質(zhì)上。使來(lái)自預(yù)過(guò)濾步驟的濾液與主過(guò)濾介質(zhì)接觸，所述主過(guò)濾介質(zhì)適用于 將生物目標(biāo)種類(lèi)作為保留物與其它非目標(biāo)微生物一起保留在其上。使來(lái)自主過(guò)濾步驟的保 留物裂解，形成含有目標(biāo)材料的裂解物。另一方面，讓細(xì)胞裂解物通過(guò)主過(guò)濾介質(zhì)并進(jìn)一步接觸過(guò)濾后介質(zhì)，以將未裂解 的細(xì)胞保留在其上，同時(shí)讓目標(biāo)材料作為濾液通過(guò)。如有必要，可用一種或多種保留增強(qiáng)劑對(duì)主過(guò)濾介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以改進(jìn)微生物 目標(biāo)種類(lèi)在主過(guò)濾介質(zhì)上的保留。在這種情況下，主過(guò)濾介質(zhì)可用選自以下的一個(gè)或多個(gè) 成員來(lái)處理表面活性劑、螯合劑、鹽和有機(jī)溶劑。這些處理劑既能在主過(guò)濾器捕獲步驟期 間維持其中的微生物目標(biāo)種類(lèi)(例如細(xì)胞和病毒)的完整性，又能阻止微生物目標(biāo)種類(lèi)不 可逆的粘附在過(guò)濾器材料上。這確保了代表性樣品可被裂解并產(chǎn)生能準(zhǔn)確代表原材料的測(cè) 試樣品。示例性實(shí)施方案的詳述一方面，本發(fā)明涉及包括過(guò)濾和裂解步驟在內(nèi)的樣品收集和處理方法。在一個(gè)示 例性的實(shí)施方案中，所述方法的特征在于膜，所述膜通過(guò)包括預(yù)過(guò)濾步驟和主過(guò)濾步驟在 內(nèi)的兩步法而快速過(guò)濾高體積的液體，并收集液體中的目標(biāo)組分。所述方法采用濃縮后機(jī) 械或非機(jī)械工具，以將所需包裹的目標(biāo)材料釋放到溶液中。再將樣品溶液穩(wěn)定化，用于下游 分析。本文所用的微生物目標(biāo)種類(lèi)可包括細(xì)胞生物(例如細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌、原核生物等)或病毒。正如已經(jīng)熟知的，在細(xì)胞材料中，目標(biāo)材料核酸(例如DNA或RNA)位于細(xì)胞內(nèi)。在 病毒中，核酸與蛋白質(zhì)外殼在一起。本文所用的“裂解”則是使細(xì)胞或蛋白質(zhì)外殼破裂，以 釋放所需目標(biāo)核酸材料。所述方法例如可用于測(cè)定微生物內(nèi)容物?？砂凑账龇椒y(cè)定示例性的微生物， 例如細(xì)菌、病毒、藻類(lèi)、真菌和原核生物。按照所述方法處理的生物內(nèi)容物可來(lái)自任何水或 工藝系統(tǒng)，例如工藝用水、飲用水、市政用水、冷卻水、個(gè)人保健產(chǎn)品制造、制藥或食品和飲 料工藝過(guò)程中。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，膜用于預(yù)過(guò)濾系統(tǒng)，以除去任何無(wú)機(jī)顆粒和大的生 物顆粒。一個(gè)或多個(gè)預(yù)過(guò)濾膜不保留目標(biāo)種類(lèi)。這種膜可以是各種不同材料和孔徑的任何 膜，但優(yōu)選具有以固定尺寸分離的受控孔徑的膜。預(yù)過(guò)濾膜材料的非限制性實(shí)例是尼龍、不 銹鋼、纖維素酯、PTFE、玻璃纖維、聚丙烯、聚氯乙烯、親水性丙烯酸共聚物、聚醚砜、聚碳酸 酯和聚酯。根據(jù)所需的最終用途的應(yīng)用，可使用不同孔徑的膜。用于預(yù)過(guò)濾系統(tǒng)的膜孔徑 的非限制性實(shí)例為約1 μ m至約100 μ m,更優(yōu)選約1 μ m至約50 μ m,但是可用作本發(fā)明方法 所用預(yù)過(guò)濾器的任何膜應(yīng)當(dāng)執(zhí)行類(lèi)似功能，并應(yīng)具有明確限定的孔徑例如網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以確 保目標(biāo)材料在預(yù)過(guò)濾膜上的損失最小化。另一方面，可提供多種預(yù)過(guò)濾膜并安排在上游到下游的流動(dòng)取向。一個(gè)或多個(gè)上 游膜比下游膜具有更高的孔隙率。盡管我們不希望固守任何具體的操作或功能理論，但是看來(lái)預(yù)過(guò)濾器有兩個(gè)目 的。首先，它捕獲較大顆粒、真菌、藻類(lèi)和生物膜，如果讓其轉(zhuǎn)移到主膜，就會(huì)與有機(jī)物和小 顆粒凝集成塊并阻礙流動(dòng)。這導(dǎo)致長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間或不能過(guò)濾產(chǎn)生代表性樣品所需的總體積。 第二，預(yù)過(guò)濾器捕獲較大的生活型例如已知含有軍團(tuán)菌的阿米巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試 是用于浮游生物的軍團(tuán)菌，如果裂解的話，阿米巴將釋放很大量的軍團(tuán)菌。在嗜肺軍團(tuán)菌是所需微生物目標(biāo)種類(lèi)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，一對(duì)尼龍預(yù)過(guò)濾 膜可與上游膜一起使用，其中這一對(duì)的孔徑為約20 μ m，下游膜孔徑為約10-11 μ m。主過(guò)濾介質(zhì)包括經(jīng)設(shè)計(jì)為保留所需目標(biāo)種類(lèi)的膜。這樣的種類(lèi)可包括細(xì)胞材料或 病毒。這種膜可以是不同材料或孔徑的任何膜?？捎米髦鬟^(guò)濾介質(zhì)的膜的非限制性實(shí)例是 尼龍、不銹鋼、纖維素酯、PTFE、玻璃纖維、聚丙烯、聚氯乙烯、親水性丙烯酸共聚物、聚醚砜、 聚碳酸酯和聚酯。主過(guò)濾膜的功能是將目標(biāo)組分作為保留物而保留在其上。同時(shí)，在本發(fā) 明的另一方面，當(dāng)其中含有微生物目標(biāo)種類(lèi)的目標(biāo)材料被裂解之后，裂解物可通過(guò)主過(guò)濾 介質(zhì)，用于后續(xù)下游測(cè)定或其它處理。本發(fā)明一方面，可通過(guò)在膜底部放置屏障，阻止裂解物通過(guò)主膜?？赏ㄟ^(guò)振搖而進(jìn) 行裂解作用，裂解產(chǎn)物可通過(guò)濃縮后的膜(例如PESO. 2 μ m)而提取。在裂解物能通過(guò)主膜的那些情況下，在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解物可在封閉系統(tǒng)中 再循環(huán)，在預(yù)定的再循環(huán)時(shí)間內(nèi)多次通過(guò)主過(guò)濾器。然后，從再循環(huán)系統(tǒng)中裂解物可連續(xù)取 出目標(biāo)材料核酸，用于后續(xù)分析。在嗜肺軍團(tuán)菌是所需生物目標(biāo)材料的一個(gè)實(shí)施方案中，可使用玻璃纖維主過(guò)濾成 員，孔徑為約IOnm至約3. 0 μ m的那些可作為實(shí)例提及。更優(yōu)選的是孔徑為約0. 7 μ m至約 2.7μπι之間的那些主過(guò)濾膜。主膜孔徑需要考慮兩個(gè)特征。首先，在濃縮步驟期間，它必須將所需目標(biāo)種類(lèi)保留其上，同時(shí)又不允許其粘附在膜上和裂解釋放出所包裹的目標(biāo)材料。在這種情況下，目標(biāo)材 料例如核酸在濃縮步驟期間將會(huì)釋放并與濾液一起通過(guò)。需要在濃縮步驟期間保持目標(biāo)種 類(lèi)(例如細(xì)胞和病毒的)完整性，使它們可以在裂解步驟期間裂解。第二，膜應(yīng)當(dāng)具有足夠 的孔隙率，以確?？稍趯?shí)際用于有效樣品測(cè)試的時(shí)間內(nèi)過(guò)濾大體積樣品。依據(jù)本發(fā)明的一方面，主過(guò)濾膜可用化學(xué)或流體保留增強(qiáng)劑(例如表面活性劑、 酸、堿、螯合劑、鹽、有機(jī)溶劑等)來(lái)處理，以增強(qiáng)目標(biāo)種類(lèi)在主過(guò)濾介質(zhì)上的保留，同時(shí)讓 實(shí)際樣品流過(guò)膜。合適的表面活性劑包括兩性離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽(yáng) 離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括預(yù)過(guò)濾介質(zhì)和主過(guò)濾介質(zhì)在內(nèi)的過(guò)濾系統(tǒng)可以高流速過(guò) 濾定量體積的液體樣品。例如，示例性的樣品體積可以是10升或以上。可通過(guò)完整的過(guò)濾 系統(tǒng)，借助于重力或壓力，過(guò)濾樣品。壓力過(guò)濾包括負(fù)壓和正壓。作為本領(lǐng)域的常規(guī)，可使 用泵產(chǎn)生負(fù)壓，例如真空泵、隔膜液體泵、蠕動(dòng)泵等。主過(guò)濾介質(zhì)所保留的目標(biāo)種類(lèi)例如微生物內(nèi)容物，可用于不同應(yīng)用，例如物理的、 化學(xué)的和生物學(xué)表征等。在處理生物內(nèi)容物時(shí)，將含有所需目標(biāo)細(xì)胞的主膜暴露給為產(chǎn)生 含有核酸和蛋白質(zhì)等的小體積的穩(wěn)定裂解物而設(shè)計(jì)的裂解緩沖液，用于下游檢測(cè)例如聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)PCR、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR等或其它分子測(cè)試方法。如果使用合適的裂解 材料，可獲得從目標(biāo)種類(lèi)釋放出的核酸的良好完整性，并且可在裂解物中，在約4°C -43°C 的溫度下，保持穩(wěn)定72小時(shí)或以上時(shí)間。目標(biāo)種類(lèi)通過(guò)細(xì)胞或蛋白質(zhì)包膜破裂而發(fā)生裂解，并且可分為非機(jī)械或機(jī)械方 法。非機(jī)械方法包括化學(xué)方法、熱方法、酶方法等。機(jī)械方法包括使用均質(zhì)機(jī)的超聲破碎； 使用例如法式壓榨(French press)等的壓榨、減壓、粉碎等。對(duì)于非機(jī)械方法，非限制性實(shí)例是化學(xué)裂解方法，包括可破壞細(xì)胞或蛋白質(zhì)包膜 屏障的任何合適的化學(xué)方法。去垢劑是常用于破壞液體雙層膜而釋放細(xì)胞內(nèi)容物，并裂解 膜蛋白的化學(xué)試劑的非限制性實(shí)例，合適的裂解用化學(xué)試劑的非限制性實(shí)例是十二烷基硫 酸鋰、CHAPS、吐溫-20E、NP40、CTAB, PVPP, Triton X系列去垢劑、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉、鹽 酸胍或苛性堿。離液劑例如胍鹽也可作為裂解劑用于該系統(tǒng)。去垢劑和替代裂解劑的裂解 效率取決于細(xì)胞種類(lèi)和具體應(yīng)用。酶，例如溶菌酶、變?nèi)芫?、labiase、溶葡萄球菌素、溶細(xì) 胞酶、蛋白酶K、內(nèi)溶素和消色肽酶(achromop印tidase)可作為裂解劑或增強(qiáng)裂解的添加 劑包括在內(nèi)。有機(jī)溶劑，例如DMSO、DMF也可作為裂解試劑或增強(qiáng)裂解的添加劑包括在內(nèi)。 許多生物科學(xué)供應(yīng)商都提供適用于細(xì)胞裂解應(yīng)用的各種各樣的裂解緩沖劑。各種物理方法 例如振搖、加熱、切割和均質(zhì)等，都可用于增強(qiáng)裂解效率的工藝。的確，在一個(gè)實(shí)施方案中， 可利用切割作用，其中細(xì)胞可被破壞并且主膜本身也將被切割。根據(jù)應(yīng)用的復(fù)雜性和目標(biāo) 種類(lèi)的特性，單一的化學(xué)裂解方法或其組合可與機(jī)械方法組合使用。為了除去不需要的細(xì)胞裂解物和未裂解細(xì)胞的干擾，可加入一個(gè)或多個(gè)額外的膜 來(lái)處理細(xì)胞裂解物，用于下游應(yīng)用。膜可以是不同材料的、孔徑范圍為0. 22 μ m至0. 45 μ m 的任何膜，用于細(xì)菌、酵母、真菌或硫辛酸采樣。(病毒采樣需要較小的孔徑)。這些過(guò)濾 “后”膜材料的非限制性實(shí)例是PVDF、PES、聚碳酸酯、尼龍等。該膜的主要作用是從樣品中 除去大材料和/或未裂解細(xì)胞，以增強(qiáng)裂解物在上述條件下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。盡管目前的描述強(qiáng)調(diào)了樣品濃縮和處理方法，但是顯然，所述方法可用于實(shí)驗(yàn)室、野外應(yīng)用(field application)、在線、自動(dòng)化分批或離線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。這種性能的擴(kuò)展允許 系統(tǒng)用于水和過(guò)程監(jiān)測(cè)、以及最終工藝或產(chǎn)物監(jiān)測(cè)。另外，該方法應(yīng)當(dāng)容易的用于已知對(duì)微 生物生長(zhǎng)敏感的工藝流程，和不限于水系統(tǒng)。處理食物、飲料和個(gè)人保健產(chǎn)品以及在本發(fā)明 范圍之內(nèi)的其它系統(tǒng)。在以下實(shí)施例中將會(huì)進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例應(yīng)視為本發(fā)明的示例，而不 應(yīng)視為用于限制權(quán)利要求。稈序1.將(例如10~4CFU)嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)胞和10~6CFU熒光假單胞菌(I^seudomonas fluorescens)強(qiáng)力濃縮(spike specific concentration)至丨J 500ml合成水或里予夕卜水中。 對(duì)于野外冷卻水(field cooling water)，制備無(wú)添加的500ml原水。2. 500ml 水樣通過(guò)尼龍 20ym(Millipore NY2004700)和尼龍 11 μ m(Millipore NYl 104700)過(guò)濾，以除去任何顆粒和大的生物內(nèi)容物，同時(shí)不保留目標(biāo)內(nèi)容物。3.通過(guò)經(jīng)表面活性劑處理的玻璃纖維2. 7 μ m(MilliporeAPFD04700)，濃縮來(lái)自 步驟2的濾液，保留目標(biāo)種類(lèi)內(nèi)容物。4.向步驟3的主膜加入3ml裂解緩沖液并裂解5分鐘，振搖速率為100轉(zhuǎn)/分鐘。 裂解緩沖液包含十二烷基硫酸鋰、DMSO和乙氧基化壬基酚。5.裂解物通過(guò)PES 0. 22 μ m 0. 45 μ m膜過(guò)濾，用于下游分析。6.對(duì)于合成水的各過(guò)程分析，對(duì)照是通過(guò)裂解檢測(cè)而未濃縮的相同量的目標(biāo)內(nèi)容 物。7.所有下游分析都是基于RNA的方法，不同之處在于結(jié)果表中所提及的特定的基 于DNA的實(shí)時(shí)PCR分析。
實(shí)施例實(shí)施例1-膜的篩選作為預(yù)過(guò)濾介質(zhì)或過(guò)濾介質(zhì)測(cè)定各種不同膜種類(lèi)，以確保它們?cè)?0分鐘時(shí)間內(nèi) 能過(guò)濾500ml冷卻水樣。測(cè)試發(fā)現(xiàn)可接受的材料如下。
權(quán)利要求
1.液體樣品的處理方法，所述樣品中含有非目標(biāo)微生物顆粒、無(wú)機(jī)顆粒和微生物目標(biāo) 種類(lèi)，并且其中所述微生物目標(biāo)種類(lèi)包括包裹于其中的目標(biāo)材料，所述方法包括(a)將所述液體樣品通過(guò)預(yù)過(guò)濾介質(zhì)，讓所述微生物目標(biāo)種類(lèi)作為濾液通過(guò)，并將所述 非目標(biāo)生物顆粒和所述無(wú)機(jī)顆粒保留在其上；(b)使所述濾液與主過(guò)濾介質(zhì)接觸，所述主過(guò)濾介質(zhì)適用于將所述微生物種類(lèi)作為保 留物保留在其上；和(c)裂解來(lái)自步驟(b)的所述保留物，形成含有所述目標(biāo)材料的裂解物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物目標(biāo)種類(lèi)包括細(xì)胞微生物，并且其中所述目標(biāo) 材料是胞內(nèi)核酸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞微生物選自細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌和原核生物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物目標(biāo)種類(lèi)包括病毒，且其中所述目標(biāo)材料是所 述病毒的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)所包含的核酸。
5.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括(d)使所述裂解物接觸過(guò)濾后介質(zhì)，以將任何未裂解材料保留在其上，同時(shí)讓所述裂解 物作為濾液通過(guò)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述液體樣品是冷卻水。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述目標(biāo)種類(lèi)是嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述預(yù)過(guò)濾介質(zhì)包括孔徑為約1μ m至約100 μ m的濾膜。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述主過(guò)濾介質(zhì)包括孔徑為約IOnm至約3.0 μ m的濾膜。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述主過(guò)濾介質(zhì)包括孔徑為約0.7 μ m至約2. 7 μ m的濾膜。
11.權(quán)利要求10的方法，所述方法還包括使所述裂解物接觸過(guò)濾后介質(zhì)，以將任何未 裂解的細(xì)胞保留在其上，同時(shí)讓所述裂解物作為濾液通過(guò)，并且其中所述過(guò)濾后介質(zhì)包括 孔徑為約0. 22 μ m至約0. 45 μ m的濾膜。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述裂解物含有DNA。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述裂解物含有RNA。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(c)包括使所述保留物與裂解緩沖液接觸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述步驟(c)還包括振動(dòng)所述保留物。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(c)包括使所述保留物進(jìn)行超聲振動(dòng)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述預(yù)過(guò)濾介質(zhì)包括一對(duì)尼龍膜，并且所述一對(duì)尼龍膜中 的第一個(gè)安排在上游流動(dòng)取向，所述一對(duì)尼龍膜中的第二個(gè)安排在下游流動(dòng)取向，所述第 一預(yù)過(guò)濾膜的孔徑大于所述第二預(yù)過(guò)濾膜的孔徑。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一預(yù)過(guò)濾膜的孔徑為約20μ m,且所述第二預(yù)過(guò)濾 膜的孔徑為約10-11 μ m。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述主過(guò)濾介質(zhì)包括玻璃纖維濾膜。
20.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括在所述步驟(c)之前，使所述主過(guò)濾介質(zhì)與保 留增強(qiáng)劑接觸，所述保留增強(qiáng)劑包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)成員表面活性劑、螯合劑、鹽 和有機(jī)溶劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了處理含有微生物目標(biāo)種類(lèi)的液體樣品，以濃縮所述目標(biāo)種類(lèi)并收集裂解物的方法。所述液體樣品包含非目標(biāo)微生物顆粒、無(wú)機(jī)顆粒和微生物目標(biāo)種類(lèi)。所述液體通過(guò)預(yù)過(guò)濾介質(zhì)，讓所述目標(biāo)種類(lèi)作為濾液通過(guò)并將非目標(biāo)微生物產(chǎn)物和無(wú)機(jī)顆粒保留在其上。所述濾液與主過(guò)濾介質(zhì)接觸，所述主過(guò)濾介質(zhì)適用于將所述目標(biāo)種類(lèi)作為保留物保留在其上。使所述保留物裂解，形成含有包裹在微生物目標(biāo)種類(lèi)中的目標(biāo)材料的裂解物。所述微生物目標(biāo)種類(lèi)可包括細(xì)胞生物(例如細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌、原核生物等)或病毒。目標(biāo)材料包括胞內(nèi)核酸或在病毒樣品的情況下包括所述病毒的蛋白質(zhì)外殼或涂層所包裹的核酸。
文檔編號(hào)C12Q1/24GK102076400SQ200980126140
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者J·羅, J·陳, R·徐, S·博耶特, T·陳, W·徐, W·肖 申請(qǐng)人:通用電氣公司