專利名稱：IL-1α抗體及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及免疫學(xué)、炎癥、癌癥、血管病癥和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明 涉及特異性結(jié)合白細胞介素-Ia (IL-Ia)的抗體(Ab)以及使用這種抗體治療、預(yù)防或檢 測與異常的IL-I α表達相關(guān)的病理的方法。背景IL-Ia是促炎細胞因子，它在大量不同活性中發(fā)揮重要作用，所述大量不同活性 包括炎癥、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移和血細胞生成。針對IL-I α的IgG自身抗體天然地存在于 普通人群中并被認為有益于諸如動脈粥樣硬化等疾病。概述本發(fā)明基于完全人單克隆Ab(mAb)的開發(fā)，所述完全人單克隆抗體包含(i)抗原 結(jié)合可變區(qū)，所述抗原結(jié)合可變區(qū)表現(xiàn)出對人IL-I α的非常高的結(jié)合親和力，和(ii)恒定 區(qū)，所述恒定區(qū)對于通過Clq結(jié)合而活化補體系統(tǒng)以及對于與幾種不同的Fc受體結(jié)合都有 效。本文描述的IL-I α特異性的mAb通過用人IgGl mAb的恒定區(qū)取代人IgG4 mAb的恒 定區(qū)而制得，所述人IgG4 mAb具有對人IL-I α特異性的可變區(qū)。因此，本發(fā)明的特征是與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的人IgGl mAb，所述mAb包 含與輕鏈共價連接的重鏈。所述重鏈可包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列并且所述輕鏈可包 含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。一組分離的核酸也在本發(fā)明之中，這組分離的核酸包含編碼與IL-Ia特異性結(jié) 合的人IgGl mAb的重鏈的第一核酸，以及編碼與人IL-I α特異性結(jié)合的人IgGl mAb的輕 鏈的第二核酸。所述第一核酸可以編碼SEQ ID NO :9的氨基酸序列且所述第二核酸可以編 碼SEQ ID NO :11的氨基酸序列。所述第一核酸可包含SEQ ID NO 10核苷酸序列且所述第 二核酸可包含SEQ ID NO 12的核苷酸序列。在另一方面，本發(fā)明的特征是一種表達載體，該表達載體包含編碼SEQ ID N0:9或 SEQ ID NO=Il的氨基酸序列的核酸。本發(fā)明的另一個特征是包含一組分離的核酸的分離的宿主細胞(例如，哺乳動物 細胞，諸如CHO細胞)，這組分離的核酸包含編碼與IL-Ia特異性結(jié)合的人IgGl mAb的重 鏈的第一核酸，以及編碼與人IL-I α特異性結(jié)合的人IgGl mAb的輕鏈的第二核酸。所述 重鏈可包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列并且輕鏈可包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。本發(fā)明的特征還是殺傷表達人IL-I α的細胞的方法。該方法可包括使所述細胞接觸與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的人IgGl mAb的步驟。抑制人細胞穿過基膜基質(zhì)遷移的方法也在本發(fā)明之中。該方法可包括將與人 IL-I α特異性結(jié)合的純化的mAb添加到包括基膜基質(zhì)和人細胞的混合物中的步驟。還在本發(fā)明中的是抑制IL-I α誘導(dǎo)的在人內(nèi)皮細胞表面上的ICAM-I和/或E-選 擇素的表達增加的方法。該方法可以包括將與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的mAb添加到 包含內(nèi)皮細胞和IL-I α的混合物中的步驟。另外，本發(fā)明包括在人受治療者中示蹤炎癥的方法，所述人受治療者之前經(jīng)受了 下列步驟首次從受治療者獲得外周血單核細胞的第一樣品；用與人IL-I α特異性結(jié)合的 純化的mAb接觸所述第一樣品；以及確定所述第一樣品中與所述單克隆Ab結(jié)合的細胞的 百分比。該方法可包括下列步驟(a)再次從該受治療者獲得外周血單核細胞的第二樣品； (b)使所述第二樣品接觸與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的mAb; (c)確定所述第二樣品中 與所述單克隆Ab結(jié)合的細胞的百分比；以及(d)將所述第一樣品中結(jié)合所述mAb的細胞的 百分比與所述第二樣品中結(jié)合所述單克隆Ab的細胞的百分比相比較。在上述的方法中，純化的mAb可以是包含與輕鏈共價連接的重鏈的人IgGl mAb, 例如，其中所述重鏈包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列且所述輕鏈包含SEQ ID N0:11的氨基 酸序列。本發(fā)明中的另一種方法的特征是下列步驟(a)使用濾器富集從人受治療者獲得 的生物樣品，所述濾器根據(jù)分子量將分子分為包含與IL-I α復(fù)合的完整IgG的第一級分和 包含小于IOOKda的分子的第二級分；以及(b)對所述第一級分中的IL-I α的量進行定量。本發(fā)明中的又一種方法的特征是下列步驟(a)使用濾器富集從人受治療者獲得 的血漿樣品，所述濾器根據(jù)分子量將分子分為包含與IL-I α復(fù)合的完整IgG的第一級分和 包含小于IOOKda的分子的第二級分；(b)在允許所述第一級分中的IgG與固定在基質(zhì)上的 抗人IgG Ab特異性結(jié)合的條件下，將所述第一級分添加到含有固定的抗人IgG Ab的所述 基質(zhì)中；(c)洗滌所述基質(zhì)以去除所述第一級分中未與所述固定的抗人IgG Ab特異性結(jié)合 的材料；(d)在允許特異性結(jié)合人IL-I α的Ab與結(jié)合于所述基質(zhì)的任何人IL-I α特異性 結(jié)合的條件下，使在步驟(c)中洗滌的基質(zhì)接觸與人IL-I α特異性結(jié)合的Ab; (e)洗滌所 述基質(zhì)以去除與未結(jié)合于基質(zhì)的人IL-I α特異性結(jié)合的任何抗體；以及(f)對與步驟(e) 之后仍結(jié)合于所述基質(zhì)的人IL-I α特異性結(jié)合的抗體的量進行定量。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員所通常理解的相同含義。通常理解的生物術(shù)語的定義可見于=Rieger等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular (遺傳學(xué)詞匯經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué))，第5 版，Springer-Verlag :New York, 1991 ；禾口 Lewin, Genes V (基因 V)，Oxford University Press :New York,1994。如本文所使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”，當(dāng)涉及多肽(包括Ab)或受體時，指的是決定 在異質(zhì)蛋白群體和其它生物群體中的蛋白或多肽或受體的存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定 的條件下(例如，就Ab而言在免疫測定條件下)，指明的配體或Ab與其特定的“靶”結(jié)合且 不以顯著的量與樣品中存在的其它蛋白結(jié)合或與機體中該配體或Ab可能發(fā)生接觸的其它 蛋白結(jié)合。通常，與第二分子“特異性結(jié)合”的第一分子對所述第二分子具有大于約105(例 如，106U07U08U09U010U0n和IO12或更多)升/摩爾的平衡親和力常數(shù)。
當(dāng)涉及蛋白分子例如Ab時，“純化的”意思是與天然地伴隨這種分子的組分分離 的。通常，當(dāng)Ab或蛋白是按重量計至少約10% (例如，9%、10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%和100% )、不含非抗體蛋白或與其天然締 合的其它天然存在的有機分子時，Ab或蛋白是純化的。純度可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒y定， 例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析?；瘜W(xué)合成的蛋白或在其天然存在的細胞類 型之外的細胞類型中產(chǎn)生的其它重組蛋白是“純化的”。雖然類似于或等同于本文描述的那些方法和材料的方法和材料可用于本發(fā)明的 實踐或測試中，但是在下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物通過引用整 體并入。在矛盾的情況下，以包括定義的本說明書為標(biāo)準(zhǔn)。另外，下文討論的具體實施方案 僅是示例性的并且不旨在是限制性的。詳述本發(fā)明涵蓋與完全人mAb相關(guān)的組合物和方法，所述完全人mAb包含(i)抗原結(jié) 合可變區(qū)，所述抗原結(jié)合可變區(qū)表現(xiàn)出對IL-I α的非常高的結(jié)合親和力；和(ii)恒定區(qū)， 所述恒定區(qū)對于通過Clq結(jié)合而活化補體系統(tǒng)以及對于與幾種不同的Fc受體結(jié)合都有效。 下文描述的優(yōu)選的實施方案顯示這些組合物和方法的改編。盡管如此，由這些實施方案的 描述，基于下文提供的描述可做出和/或?qū)嵺`本發(fā)明的其它方面。本文描述了包含常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)和分子生物技術(shù)的方法。免疫學(xué)方法(例如，用 于檢測和定位抗原-抗體復(fù)合物的測定、免疫沉淀、免疫印跡及類似方法)通常是本領(lǐng)域已 知的并在下述方法學(xué)專著中描述，諸如Current Protocols in Immunology(現(xiàn)代免疫學(xué) 實驗技術(shù))，Coligan等人，編輯，John Wiley & Sons，New York。在下述專著中詳細描述 了分子生物學(xué)技術(shù)，諸如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手 冊)，第二版，第 1-3 卷，Sambrook 等人編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生 物學(xué)實驗技術(shù))，Ausubel 等人編輯，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York ο 在 Handbook of Therapeutic Abs (治療性抗體手冊)，Dubel，S.編輯，Wiley-VCH， 2007中描述了抗體方法。細胞培養(yǎng)技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的并在下述方法學(xué)專著中詳 述諸如 R Ian Freshney、Wiley-Liss、Hoboken, N. J.的 Culture of Animal Cells :A Manual of Basic ^Technique (動物細胞的培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊)，第四版，2000 ；和Maureen A Harrison 禾口 Ian F Rae 的 General Techniques of Cell Culture (細胞培養(yǎng)的一般技 術(shù))，Cambridge University Press，Cambridge，UK，1994。蛋白純化的方法在 Guide to Protein Purification =Methods in Enzymology (蛋白純化指南酶學(xué)中的方法)，第 182 卷，Deutscher M P 編輯，Academic Press, San Diego, Calif.，1990 中討論。在一個方面，本發(fā)明的特征為完全人mAb，其包含(i)抗原結(jié)合可變區(qū)，所述抗原 結(jié)合可變區(qū)表現(xiàn)出對人IL-I α的非常高的結(jié)合親和力，和(ii)恒定區(qū)，所述恒定區(qū)對于 通過Clq的結(jié)合而活化補體系統(tǒng)以及對于與幾種不同的Fc受體的結(jié)合都有效。人Ab優(yōu) 選地是IgGl。Ab的Ka優(yōu)選地是至少IX IO9M.1或更高(例如，高于9X IOkT1JX ΚΓΜ—1、 7Χ 101CIM"\6X 101CIM"\5X 101CIM"\4X 101CIM"\3X 101CIM"\2X IO10M-1 或 1 X IO10M-1)。因為人類中天然地存在表達對人IL-I α特異的Ig的B淋巴細胞，所以用于培育 mAb的一種目前優(yōu)選的方法是首先從受治療者中分離這種B淋巴細胞，并之后將該B淋巴細胞永生化以便它能在培養(yǎng)中連續(xù)復(fù)制?？捎靡环N或多種人IL-I α抗原免疫缺乏大量天 然存在的表達對人IL-I α特異的Ig的B淋巴細胞的受治療者以增加這種B淋巴細胞的數(shù) 量。通過使人Ab分泌細胞(例如，人漿細胞)永生化來制備人mAb。參見，例如，美國專利 % 4, 634, 664 號。在示例性的方法中，對一個或多個(例如5、10、25、50、100、1000或更多個)人受 治療者(即，之前未施用人IL-I α疫苗的受治療者)篩選他們的血液中這種人IL-I α特 異性的Ab的存在。表達期望的Ab的那些受治療者之后可被用作B淋巴細胞供體。在一個 可能的方法中，從擁有表達人IL-I α特異性的Ab的B淋巴細胞的人供體中獲得外周血。 之后從血液樣品中分離這種B淋巴細胞，例如，通過細胞分選(例如，熒光激活的細胞分選 “FACS”或磁珠細胞分選)以選擇表達人IL-I α特異性的Ig的B淋巴細胞。之后可以根據(jù) 已知的技術(shù)通過病毒轉(zhuǎn)化(例如，使用EBV)或通過與諸如人骨髓瘤的另一種永生化細胞融 合而將這些細胞永生化。之后可以通過有限稀釋法分離該群體內(nèi)表達對人IL-I α特異的 Ig的B淋巴細胞(例如，選擇微量滴定板孔中對人IL-I α特異的Ig呈陽性的細胞并傳代培 養(yǎng)，并重復(fù)上述步驟直至能夠分離期望的克隆株系)。參見，例如GodingJonoclonal Abs Principles and Practice (單克隆抗體原理和實踐)，第 59-103 頁，Academic Press, 1986。這些表達對人IL-I α具有至少納摩爾或皮摩爾結(jié)合親和力的Ig的克隆細胞系是優(yōu) 選的?？梢酝ㄟ^常規(guī)的Ig純化程序諸如鹽析(salt cut)、尺寸排阻、離子交換分離和親和 層析從培養(yǎng)基或體液中(諸如腹水)純化這些克隆細胞系分泌的mAb。雖然永生化的B淋巴細胞可用于體外培養(yǎng)以直接產(chǎn)生mAb，在某些情形下使用異 源表達系統(tǒng)來產(chǎn)生mAb可能是期望的。參見，例如，在美國專利申請第11/7M，899號中描 述的方法。例如，可以將編碼對人IL-I α特異的mAb的基因克隆并引入表達載體中(例 如，基于質(zhì)粒的表達載體)以在異源的宿主細胞(例如CH0細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞和 大腸桿菌細胞)中表達。因為Ig包括H2L2構(gòu)型的重鏈(H)和輕鏈(L)，所以可在不同的載 體中分別分離和表達編碼重鏈和輕鏈各自的基因。雖然通常不優(yōu)選，但是嵌合的mAb (例如，“人源化的”mAb)可用于本發(fā)明，嵌合的 mAb是具有來源于不同動物物種的不同部分的抗原結(jié)合分子(例如，小鼠Ig的可變區(qū)與人 Ig的恒定區(qū)融合)。這樣的嵌合的Ab可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。E.G.，Morrison等 人，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA, 81 :6851,1984 ；Neuberger 等人，Nature, 312 :604,1984 ； Takeda等人，Nature，314 :452，1984。類似地，可以用本領(lǐng)域已知的方法將Ab人源化。例如， 具有期望的結(jié)合特異性的單克隆Ab可以是商業(yè)上人源化的或如在美國專利第5，693，762 號、第5，530，101號或第5，585，089號中描述的。可通過下列已知方法使本文描述的mAb親和力成熟以增強或者另外改變它們的 結(jié)合特異性諸如VH和VL結(jié)構(gòu)域改組(Marks等人Bio/Technology 10 =779-783,1992)、 高變區(qū)(HVR)和/或框架殘基的隨機誘變(Barbas等人，Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 3809-3813，1994 ；Schier 等人，Gene 169 147-155，1995 ；Yelton 等人，J.Immunol. 155 1994-2004，1995 Jackson 等人，J. Immunol. 154(7) :3310-9,1995 ；和 Hawkins 等人， J. Mol. Biol. 226 =889-896,1992)。Ab的氨基酸序列變體可通過將合適的改變引入至編碼 該Ab的核苷酸序列中來制備。另外，可改變對編碼mAb的核酸序列的修飾(例如，不改變 mAb的氨基酸序列)以增強在某種表達系統(tǒng)中mAb的產(chǎn)生(例如，給定的表達系統(tǒng)的內(nèi)含子消除和/或密碼子優(yōu)化)。本文描述的mAb也可通過與另一種蛋白(例如，另一種mAb)或 非蛋白分子結(jié)合而被修飾。例如，mAb可與水溶性聚合物結(jié)合，諸如聚乙二醇或碳納米管 (參見，例如 Kam 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 :11600-11605,2005) 參見，美國專 利申請第11/754, 899號。優(yōu)選地，為保證可以將高效價的人IL-I α -特異性mAb以最小的副作用施用給受 治療者，本發(fā)明的mAb組合物按重量計至少為0. 5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%, 9 %U0 %U1 %>12 %,13 %,14%,15 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40%,45 %,50 %,60 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%或更高百分比的純度(不包含任何 賦形劑)。本發(fā)明的mAb組合物可僅包含單一類型的mAb (例如，從單一克隆的B淋巴細胞 系中產(chǎn)生的mAb)或可包含兩種或更多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)不同類型 的mAb的混合物。除人IL-I α mAb之外，本發(fā)明的Ab組合物也可包含與除人IL-I α之外 的抗原特異性結(jié)合的其它mAb。為修飾或增強它們的功能，人IL-I α mAb可與另一種分子諸如細胞毒素或可檢測 的標(biāo)記結(jié)合。人IL-I α特異性mAb可與一種或多種細胞毒素結(jié)合以更有效地殺傷表達 IL-Ia的細胞。本發(fā)明中使用的細胞毒素可以是能夠與人IL-I α特異性的mAb結(jié)合的任 何細胞毒性劑(例如，接觸細胞后能殺傷細胞的分子)。細胞毒素的實例包括但不限于放 射性核素(如 35S,14C,32P,125I,131I,90Y,89Zr,201TU186Re,188Re,57Cu^213Bi 和 211At)、結(jié)合的放射 性核素和化療劑。細胞毒素的其他實例包括但不限于抗代謝物(如5-氟尿嘧啶(5-FU)、 甲氨蝶呤(MTX)、氟達拉濱等)；抗微管劑(如長春新堿、長春堿、秋水仙堿、紫杉烷類(諸 如紫杉醇和多西他賽)等)；烷化劑(如環(huán)磷酰胺、美法侖、亞硝脲氮芥(BCNU)等)；鉬劑 (如順鉬(也稱為cDDP)、卡鉬、奧沙利鉬、JM-216、CI-973等)；蒽環(huán)類(如，多柔比星、柔 紅霉素等)；抗生素劑(如絲裂霉素-C)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如依托泊苷、替尼泊苷和喜樹 堿)；或其他細胞毒性劑諸如篦麻毒素、白喉毒素(DT)、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思 豆毒蛋白、皂草毒蛋白、商陸病毒蛋白、溴化乙錠、糖皮質(zhì)激素、炭疽毒素及其它。參見，例如 美國專利申請第5，932，188號。人IL-I α特異性的mAb也可以與可檢測的標(biāo)記結(jié)合。本發(fā)明中有用的可檢測標(biāo) 記包括生物素或抗生蛋白鏈菌素、磁珠、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅 丹明、綠色熒光蛋白及類似物)、放射性標(biāo)記(如3H、125I、35S、14C、32P、mh、97RU、67Ga、68Ga或 72As)、不透射線物質(zhì)諸如用于放射成像的金屬、用于磁共振成像的順磁劑、酶(如辣根過氧 物酶、堿性磷酸酶和通常在ELISA中使用的其它酶)以及顯色標(biāo)記諸如膠體金或有色玻璃 珠或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。檢測這種標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的。因此，例如，放射性標(biāo)記可使用攝影膠片或閃爍計數(shù)器檢測。也可使用熒光標(biāo)志物并可 以通過使用光探測器檢測發(fā)射照度來檢測。酶標(biāo)記通常通過將底物提供給酶并檢測由酶對 底物的作用而產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測，且顯色標(biāo)記通過簡單地將有色的標(biāo)記顯像而檢測。本發(fā)明也涵蓋編碼對人IL-I α特異的完全人mAb的核酸分子。雖然同一核酸分 子可編碼人IL-I α特異性的mAb的重鏈和輕鏈二者，但是也可使用兩種不同的核酸分子， 一種編碼重鏈且另一種編碼輕鏈。本文呈現(xiàn)了對人IL-I α特異的三種IgGl mAb的氨基酸 序列。參見SEQ ID NO :1、3、5、7、9和11。本文也描述了編碼這些氨基酸序列的示例性核酸 分子。參見SEQ ID NO :2、4、6、8、10和12。也可使用編碼本發(fā)明中的兩種描述的IgGl mAb或其它mAb的氨基酸序列的任何其它合適的核酸。為產(chǎn)生mAb，可以將本發(fā)明的核酸分子以如下方向并入表達載體中其中該核酸 分子與諸如轉(zhuǎn)錄控制序列和翻譯控制序列等表達控制序列可操作地連接。表達載體的實例 包括來源于質(zhì)粒的載體和來源于病毒諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的載體。編碼 輕鏈和重鏈的核酸分子可并入單一載體或不同載體中。本發(fā)明的載體還可包括調(diào)節(jié)序列諸 如啟動子和/或增強子(參見美國專利第5，168，062號、美國專利第4，510，245號和美國 專利第4，968，615號)、選擇性標(biāo)記或編碼親和標(biāo)簽的序列(以有利于純化)或可檢測標(biāo) 記。為產(chǎn)生mAb，可以將本發(fā)明的載體引入至合適的宿主細胞中，例如諸如細菌等原核 細胞或優(yōu)選真核細胞，諸如哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞或酵母宿主細胞。用于將異源 的多核苷酸引入至宿主細胞中的方法的實例包括使用病毒載體、電穿孔、多核苷酸在脂質(zhì) 體中的包封、右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化和將DNA直接微注射入細胞核中。哺乳動物細胞系目前優(yōu)選地用 于從載體中表達mAb。哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(如，DG44 CHO細胞系)、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如 Hep G2)、NSO 細胞、SP2 細胞、HEK-293T 細胞、293 Freestyle 細胞和 NIH-3T3 細胞。本發(fā) 明的mAb還可在轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物中表達。參見，例如美國專利第5，827，690號；第 5，756，687 號；第 5，750，172 號；第 5，741，957 號；第 6，046，037 號和第 5，959，177 號。本發(fā)明提供通過使細胞與人IL-I α特異性的mAb接觸并檢測與所述細胞結(jié)合的 mAb來檢測樣品中表達人IL-I α的細胞的方法。本發(fā)明還提供通過使細胞與人IL-I α特 異性的mAb接觸來殺傷表達人IL-I α的細胞的方法。這種殺傷可通過補體介導(dǎo)的殺傷、Ab 依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性或Ab介導(dǎo)的細胞毒素的遞送實現(xiàn)。本文描述的Ab還顯示可用 于其它方法。例如，MABpl已降低IL-I α誘導(dǎo)的ICAMl和E-選擇素在內(nèi)皮細胞上的表達。 MABpl還顯示用于檢測和定量生物樣品中的IL-I α的免疫測定。
實施例實施例1-抗-hIL-1 α IgGl和κ鏈的克隆使用美國專利第5，959，085號提供的氨基酸序列信息對可變區(qū)重鏈(V-HC)序列 和可變區(qū)輕鏈(V-LC)序列進行基因合成。PCR擴增V-HC以引入ATG起始密碼子上游的 Hindlll/Clal位點和3'末端的Nhel位點。PCR擴增人種系IgGl恒定區(qū)(包括外顯子和內(nèi) 含子)以將編碼前兩個氨基酸Ala-Ser的兩個5'三聯(lián)體修飾為Nhel位點，并在3'末端引 入BamHI位點。人種系IgGl恒定區(qū)氨基酸序列除K171Q和M61L互換之外，與Swiss-Prot 條目P01857 —致。使用Nhel位點連接V-HC序列和恒定區(qū)IgGl-HC序列，并使用HindIII 位點和BamHI位點將其克隆至pcDNA3中。> hIL-la-IgGl-HCMEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFTFSMFGVHWVRQAPGKGLEWVA AVSYDGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNILFLQMDSLRLEDTAVYYCARGRPKVVIPAPLAHWGQGTLVTFSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAQTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIALEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 1)> hIL-la-IgGl-HCatggagttcgggctgagttgggtgttcctggtggctctgctgcggggcgtgcagtgccaggtgcagctg gtggagagtgggggtggcgtggtgcagcctggccggtctctgcgcctgtcttgcactgcctccggttttaccttttc tatgtttggtgtgcactgggtgcgccaggctcccggcaagggactggaatgggtggccgccgtgagttacgacgggt ccaacaaatattacgctgagagcgtgaaaggcagattcaccatcagcagagataattccaagaatattctgttcctg cagatggacagtctgagactggaggacactgctgtgtactactgcgctcgtggacgccctaaggtggtcatccccgc ccccctggcacattggggccagggaactctggtgaccttttctagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccc tggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtccacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggact ctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcaca agcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg tggaggtgcataatgcccagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagetga ccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccctggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact acacgcagaagagcctctccttaagtccgggaaaataa(SEQ ID NO :2)PCR擴增V-LC以引入ATG起始密碼子上游的Hindlll/Clal位點和3'末端的 BsiWI位點。PCR擴增人恒定區(qū)κ-LC序列，以引入編碼額外的Arg和第一個氨基酸Thr的 5' BsiWI位點和位于3'末端的BamHI位點。人恒定區(qū)κ-LC氨基酸序列與Swiss-Prot 條目Ρ01834 —致。使用BsiWI位點連接V-HC序列和恒定區(qū)κ-LC序列，并使用HindIII 位點和BamHI位點將其克隆至pcDNA3中。> hiL-Ia-K-LCMDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYEASNLETGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSSFLLSFGGGTKVEHRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO 3]> hiL-Ia-K-LCatggacatgcgcgtgcccgcccagctgctggggctgctgctgctgtggttccctggatctaggtgcgac attcagatgacccagtcccccagctcagtgtcagcctccgtgggcgacagagtgacaatcacctgccgcgcctctca gggaatctctagttggctggcctggtaccagcagaagcctggaaaggcccccaagctgctgatctatgaagcctcca acctggagaccggcgtgccctctcgcttcagcggctcaggctcaggcagtgattttactctgaccatcagctccctg cagccagaggatttcgctacttactactgccagcagacctcttccttcctgctgtccttcgggggaggcacaaaggtggagcaccgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcct ctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcg ggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgag caaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagttcaccggtgacaaaga gcttcaacaggggagagtgttag [SEQ ID NO 4]實施例2-NATHMAB-hIL-la IgGl 和 κ 鏈的產(chǎn)生對編碼ΝΑΤΗΜΑΒ-hIL-la/IgGl重鏈的完整序列進行基因合成。V-HC序列與在美國 專利第5，959，085號中描述的氨基酸序列一致。人恒定區(qū)IgGl-HC序列與Swiss+rot條目 P01857 —致。對核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化以在CHO細胞中表達。將Kozac序列(gccacc) 添加至起始ATG的上游。> NATHMAB-hIL-lA-IGGl-HCMEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFTFSMFGVHWVRQAPGKGLEWVA AVSYDGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNILFLQMDSLRLEDTAVYYCARGRPKVVIPAPLAHWGQGTLVTFSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO 5]> NATHMAB-hIL-lA-IGGl-HCgccaccatggagtttggtctgtcctgggtgttcttggtggctctgctgaggggggtgcagtgccaggtc cagctggtggagtctggtgggggagtggtgcagcctgggagatctctgcggctgtcttgcactgcctctggtttcac tttctctatgtttggtgtgcattgggtcaggcaagcaccaggcaaaggactcgagtgggtcgcagctgtgagctatg acgggtctaacaaatattacgctgagtctgtcaagggtaggtttaccatcagccgggataattccaaaaatatcctg ttcctgcaaatggactctctgaggctggaagatactgcagtctactattgtgcaagggggaggccaaaggtggtgat ccccgctcccctcgctcactggggacagggaaccctggtgactttcagctctgctagcaccaagggccctagcgtgt tcccattggctccttcctccaaatctacttctggaggcaccgccgccctgggatgtctcgtgaaagattattttcct gagcccgtcaccgtgagctggaacagcggcgccctgactagcggcgtgcacacctttcccgcagtgctgcaatctag cgggctgtactccctgagctctgtcgtgaccgtgccctccagcagcctcggaactcagacctacatctgcaatgtca atcataaaccctctaataccaaagtcgataagaaggtcgaacctaaatcttgcgataaaacccatacctgcccccct tgcccagcacccgaactgctgggcggtccctctgtgtttctgttcccccccaaacccaaagataccctgatgatctc taggacccccgaggtcacttgtgtcgtggtggatgtgtcccacgaagatccagaagtcaaattcaactggtatgtgg acggggtcgaagtgcacaacgcaaagaccaagcctagggaggaacagtataatagcacatatagggtggtcagcgtc ctgaccgtcctgcatcaggactggctgaatggcaaagaatataagtgtaaagtgtccaacaaggccctgccagcccc aatcgaaaagacaatctctaaagccaaggggcaaccccgggaacctcaggtctatacactgccaccctctcgggatg aactgaccaagaatcaggtgagcctgacatgtcttgtgaagggtttttatccctccgacattgccgtggagtgggag agcaatggacaaccagaaaataactacaaaaccacaccccctgtgctggactccgatggttccttcttcctctactc taagctgacagtggataagtctaggtggcagcaggggaatgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggcactgcaca atcattatacacaaaagtctctgtctctgtctccaggaaagtaa[SEQ ID NO :6]對編碼NATHMAB-hIL-la/κ輕鏈的完整序列進行基因合成。V-LC序列與在美國專利第5，959，085號中描述的氨基酸序列一致。人恒定區(qū)κ -LC序列與Swiss-Prot條目 P01834—致。對核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化以在CHO細胞中表達。將Kozac序列(gccacc) 添加至ATG的上游。> NATHMAB-hIL-IA-K-LCMDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYEASNLETGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSSFLLSFGGGTKVEHTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC[SEQ ID NO 7]NATHMAB-hIL-IA-K-LCgccaccatggacatgcgcgttcctgcccagctcctcggactgctgctgctttggttcccaggctcccgg tgtgatattcagatgacacagtctccctcctccgtatctgcatccgtgggcgacagggtcacaatcacttgtagggc cagccaggggatctctagttggctcgcatggtaccaacaaaagccaggtaaggctccgaaactgctcatttacgaag ctagtaacctcgaaacaggcgtgccaagccggtttagcggctccggttccggttctgacttcaccctcactatttcc tccctgcaacctgaggattttgccacatattactgtcagcaaacttcttcttttctgctctcctttggtgggggaac taaggtggagcacacagtggccgcccccagcgtctttatcttccccccaagcgatgaacagctgaagtcagggaccg ccagcgtggtctgcctgctcaataatttttaccctcgcgaggctaaggtccaatggaaagtggataacgccctccag agcggtaactctcaggagtctgtcacagagcaagacagcaaggatagcacctattccctctccagcaccctgacact gtctaaggccgactacgagaaacacaaagtgtacgcttgtgaggtgactcaccagggactgagtagccctgtgacaa aatctttcaataggggagaatgctga [SEQ ID NO 8]實施例3-NATHMAB-IL-l-a(IgGl/K 亞型)的表達使用瞬時轉(zhuǎn)染法表達和純化NATHMAB-IL-1 α。細胞培養(yǎng)上清液或蛋白G親和純化 的Ab進一步經(jīng)受如下文所描述的分析。在含有10% FCS的DMEM中培養(yǎng)人胚胎腎(HEK)
細胞，并根據(jù)廠家的方案使用jetPEI試劑(Polyplus)瞬時轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之前24h將細胞 接種在IOcm皿中(每個IOcm皿3X IO6個細胞)以在轉(zhuǎn)染時間點達到約50%的密度。使 用每皿 5 μ g 的 pcDNA3-抗-hIL-1 α -IgGl-HC 和 2 倍摩爾過量的 pcDNA3_ 抗 _hIL_l α - κ 進行轉(zhuǎn)染。在回收之后，將培養(yǎng)基換為含有2% FCS的DMEM(每皿10ml)并收集Ab持續(xù)5 至6天。收集上清液，過濾，將pH調(diào)至7. 5-8，并儲存在4°C直到進一步的使用。將部分上清液Q50ml)與蛋白G瓊脂糖(GE Healthcare)在旋轉(zhuǎn)輪上在4°C下孵 育3小時。之后，將蛋白G瓊脂糖加樣于重力流柱中并用PBS洗滌。使用在100 μ 1 Tris (pH 8)中的IOOmM甘氨酸/150mM NaCl將Ab洗脫在Iml的級分中，隨后用含有10%甘油的PBS 透析。使用BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce)測量各級分的總蛋白濃度。通過SDS-PAGE確認 重鏈和輕鏈的正確大小和組裝的天然Ab的正確大小。使用125I-hIL_l α在放射免疫測定(RIA)中測試含有NATHMAB-hlL-l α純化的Ab 的上清液和生產(chǎn)者HEK 293Τ細胞的Triton X-100細胞裂解物的抗原結(jié)合。通過對蛋白G 的吸收來測定結(jié)合。洗脫物中所有樣品都以最高的活性與125I-hIL_l α結(jié)合。使用0. 012% 的濃度(在RIA中的半數(shù)最高活性)的純化的ΝΑΤΗΜΑΒ-hIL-l α與125I_hIL_l α的結(jié)合測 量親和系數(shù)。在這些條件下ΝΑΤΗΜΑΒ-hIL-l α的Ka是3. 03X IOkT1。反演計算揭示了在 純化的洗脫物中約30 μ g/ml的活性抗-hIL-1 α -IgG的估計濃度。使用鼠EL4-6. 1亞系在生物測定中測試NATHMAB_hIL Ια的中和活性，所述鼠EL4-6. 1亞系當(dāng)用鼠IL-Ia或人IL_1 α處理時產(chǎn)生高水平的IL_2 (Zubler等人， J. Immunol. 134 :3662-3668,1985)。將標(biāo)示濃度的 NATHMAB-hlL-l a (洗脫物)與多種濃 度的重組hIL-1 a (eBioscience)以100 μ 1/孔的終體積在96-孔培養(yǎng)板(平底的)中在 37°C下孵育30分鐘。每點以一式三份且在培養(yǎng)基中(DMEM，5%FCS)實施。將100 μ 1在含 有0.2yg/ml離子霉素(ionomycin)的培養(yǎng)基中的EL4-6. 1細胞(5X IO5細胞/ml)的懸 浮液添加至各孔中。在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱中孵育M小時之后，收獲無細胞的上清液并 使用商購獲得的ELISA (R&D Systems)測定其IL-2濃度。結(jié)果顯示NATHMAB-IL-1 α有效 地中和hIL-1 α誘導(dǎo)的EL-4細胞的IL-2分泌。為測試膜結(jié)合的hIL-la的中和，使用如上文所描述的相同的基于EL_4 細胞的測定，但具有下述修改。用不同數(shù)量的活化的人單核細胞孵育不同濃度的 NATHMAB-hIL-1 a (洗脫物)。對于單核細胞制備，使用Ficoll-Paque離心從暗黃覆蓋 層中分離PBMC。允許單核細胞在塑料皿上RPMI中于37°C附著1.5小時。洗掉未附著 的淋巴細胞以產(chǎn)生幾乎純的單核細胞培養(yǎng)物。將單核細胞在37°C下在5% CO2培養(yǎng)箱中 在含有Gin、Pyr和10% FCS的RPMI中與LPS(1 μ g/ml) 一起培養(yǎng)24小時。用PBS/2mM EDTA使細胞脫離，小心地從板上將細胞刮下，并轉(zhuǎn)移至i^alcon管中。用PBS洗滌細胞兩 次，將細胞重懸在PBS/1 % PFA中并在20°C固定10分鐘。用甘氨酸緩沖液(150mM甘氨 酸，75mM NaCl, pH 7. 4)然后用培養(yǎng)基洗滌細胞并計數(shù)。結(jié)果顯示NATHMAB-hIL-1 α有 效地中和由膜結(jié)合的hIL-la誘導(dǎo)的EL-4細胞的IL-2分泌。在類似于上文所描述的 實驗中，測試了 NATHMAB-hIL-Ια對鼠IL-Ia的中和。用重組的人(h) IL_1 α或鼠(m) IL-Ia (eBioscience)孵育標(biāo)示量的NATHMAB-hlL-l α上清液。含有Ab的上清液中和人 IL-I α，而不中和鼠IL-I a。實施例4-Ab介導(dǎo)的癌細胞的殺傷在37°C下和5% CO2中將用標(biāo)準(zhǔn)Ficoll Paque制劑從暗黃覆蓋層中分離的人 外周血單核細胞(PBMC)在 RPMI-1640CM 或者含有 rhIL-2(30ng/ml，ebioscience)的 RPMI-1640-CM中孵育過夜，并將其用作效應(yīng)細胞(E)。將THPl細胞用作靶(T)。在96-孔 板中以每點一式三份進行測定。在用不同濃度的MABpl孵育IX IO4個靶15分鐘之后，按 25 1和50 1的ET比將效應(yīng)細胞加入至IX IO4個靶中并孵育另外4小時。將75μ 1的 測定體積轉(zhuǎn)移至新的96-孔板中，并根據(jù)廠家的方案使用LDH細胞毒性檢測試劑盒(Roche) 測定細胞毒性。％特異性裂解=(平均的實驗釋放-無抗體的平均自發(fā)釋放)X 100/(平 均的由靶最大釋放-平均的由靶自發(fā)釋放)。A.使用未處理的PBMC作為效應(yīng)細胞。B.使 用rhIL-2-處理的PBMC作為效應(yīng)細胞。在兩種情形下，增加MABpl的濃度(從1. 25 μ g/ml 至20 μ g/ml)在兩種ET比之下都導(dǎo)致靶細胞殺傷增加(達約90% )。 實施例5-人抗-ILl α特異性mAb序列如上文所述合成并表達編碼對人ILl α特異的另一種人抗_hIL_l α IgG1/ κ輕鏈 的完整序列(MABpl)。在編碼重鏈和輕鏈的核酸中，將Kozac序列(gccacc)添加至起始ATG 的上游。重鏈MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFTFSMFGVHWVRQAPGKGLEWVAA VSYDGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNILFLQMDSLRLEDTAVYYCARGRPKVVIPAPLAHWGQGTLVTFSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO 9]gccaccatggagtttggtctgtcctgggtgttcttggtggctctgctgaggggggtgcagtgccaggtc cagctggtggagtctggtgggggagtggtgcagcctgggagatctctgcggctgtcttgcactgcctctggtttcac tttctctatgtttggtgtgcattgggtcaggcaagcaccaggcaaaggactcgagtgggtcgcagctgtgagctatg acgggtctaacaaatattacgctgagtctgtcaagggtaggtttaccatcagccgggataattccaaaaatatcctg ttcctgcaaatggactctctgaggctggaagatactgcagtctactattgtgcaagggggaggccaaaggtggtgat ccccgctcccctcgctcactggggacagggaaccctggtgactttcagctctgctagcaccaagggccctagcgtgt tcccattggctccttcctccaaatctacttctggaggcaccgccgccctgggatgtctcgtgaaagattattttcct gagcccgtcaccgtgagctggaacagcggcgccctgactagcggcgtgcacacctttcccgcagtgctgcaatctag cgggctgtactccctgagctctgtcgtgaccgtgccctccagcagcctcggaactcagacctacatctgcaatgtca atcataaaccctctaataccaaagtcgataagagggtcgaacctaaatcttgcgataaaacccatacctgcccccct tgcccagcacccgaactgctgggcggtccctctgtgtttctgttcccccccaaacccaaagataccctgatgatctc taggacccccgaggtcacttgtgtcgtggtggatgtgtcccacgaagatccagaagtcaaattcaactggtatgtgg acggggtcgaagtgcacaacgcaaagaccaagcctagggaggaacagtataatagcacatatagggtggtcagcgtc ctgaccgtcctgcatcaggactggctgaatggcaaagaatataagtgtaaagtgtccaacaaggccctgccagcccc aatcgaaaagacaatctctaaagccaaggggcaaccccgggaacctcaggtctatacactgccaccctctcgggagg aaatgaccaagaatcaggtgagcctgacatgtcttgtgaagggtttttatccctccgacattgccgtggagtgggag agcaatggacaaccagaaaataactacaaaaccacaccccctgtgctggactccgatggttccttcttcctctactc taagctgacagtggataagtctaggtggcagcaggggaatgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggcactgcaca atcattatacacaaaagtctctgtctctgtctccaggaaagtaa [SEQ ID NO 10]輕鏈MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYEASNLETGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSSFLLSFGGGTKVEHKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO 11]gccaccatggacatgcgcgttcctgcccagctcctcggactgctgctgctttggttcccaggctcccgg tgtgatattcagatgacacagtctccctcctccgtatctgcatccgtgggcgacagggtcacaatcacttgtagggc cagccaggggatctctagttggctcgcatggtaccaacaaaagccaggtaaggctccgaaactgctcatttacgaag ctagtaacctcgaaacaggcgtgccaagccggtttagcggctccggttccggttctgacttcaccctcactatttcc tccctgcaacctgaggattttgccacatattactgtcagcaaacttcttcttttctgctctcctttggtggaggaac taaggtggagcacaagcggacagttgctgctcctagcgtctttatcttccctccaagcgatgaacagctgaagtcag ggaccgccagcgtggtctgcctgctcaataatttttaccctcgcgaggctaaggtccaatggaaagtggataacgcc ctccagagcggtaactctcaggagtctgtcacagagcaagacagcaaggatagcacctattccctctccagcaccct gacactgtctaaggccgactacgagaaacacaaagtgtacgcttgtgaggtgactcaccagggactgagtagccctg tgacaaaatctttcaataggggagaatgctga[SEQ ID NO 12]
實施例6-MABpl結(jié)合親和力在BIAcore 2000儀器(GE Health Sciences)上使用表面等離子共振(SPR)檢測 純化的MABpl的結(jié)合親和力。使用人Ab捕獲試劑盒和胺偶聯(lián)試劑盒(GE Health Sciences) 將小鼠抗人IgG(Fc)單克隆Ab共價地固定在CM5傳感器芯片的流動池上。通常達到 8000-14000RU的固定水平。在小鼠抗-人IgG(Fc)捕獲Ab固定之后，用HBS-EP運行緩沖 液(GE Health Sciences)運行三次起始循環(huán)并用MABpl運行二次起始循環(huán)以穩(wěn)定CM5表面 并去除任何未共價結(jié)合的Ab。為了分析，將MABpl Ab稀釋到HBS-EP運行緩沖液中至1 μ g/ mL的終濃度并將其以700RU固定到CM5傳感器芯片的一個流動池上。在IOOnM至0. 05nM 的檢測范圍內(nèi)將無載體的人IL-IA細胞因子(eBioscience，#34-8019)系列稀釋在HBS-EP 運行緩沖液中。流速為30μ1/π η。持續(xù)15分鐘記錄每個細胞因子稀釋物的解離數(shù)據(jù)。在 每次循環(huán)之后，用30 μ 1/min的流速單次注射3M MgCl2持續(xù)25秒以再生CM5表面。使用 BiaEvaluation軟件和Langmuir結(jié)合模型擬合數(shù)據(jù)。測得MABpl的Kd為小于2. OX 1(T1CIM。實施例7-MABpl抑制腫瘤細胞對基膜基質(zhì)的侵襲將基質(zhì)膠(BD)( 一種基膜基質(zhì))在4°C下融化過夜并在無血清的冷細胞培養(yǎng)基中 稀釋(從5mg/ml至lmg/ml)。將100 μ 1稀釋的基質(zhì)膠置于24-孔transwell (Costar)的 上室中并將transwell在37°C下孵育至少4至5小時以凝膠化。用胰蛋白酶/EDTA從組 織培養(yǎng)瓶中收獲腫瘤細胞(MDA-MB-231和THP-1)、用培養(yǎng)基洗滌并以1 X IO6細胞/ml的密 度重懸在含有FBS的培養(yǎng)基中。用溫的無血清培養(yǎng)基輕輕地洗滌凝膠化的基質(zhì)膠，并 將100 μ 1細胞懸浮液添加至每孔中。用600 μ 1培養(yǎng)基填充transwell的下室，并將板在 37°C下孵育12至M小時。用棉拭子輕輕地將未侵襲基質(zhì)膠的細胞從每個transwell的頂 部擦去。之后將transwell從24-孔板中移出并在用70%乙醇或甲醇固定侵襲的細胞之后 用結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下對侵襲的細胞計數(shù)。在MABpl存在下，侵襲基質(zhì)膠的細胞 的百分比被顯著地抑制。實施例8-MABpl阻斷內(nèi)皮細胞中ICAMl表達的增加將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC) (BD Biosciences)以在ImL補充了低血清生長補充 物的M-200培養(yǎng)基(Invitrogen)中以5 X IO5個/孔接種至24-孔板中。允許細胞沉降3_4 小時。吸出培養(yǎng)基并將新鮮的ImL M-200添加到每孔中。以4.沈μ g/mL直接添加MABpl 至細胞中，在室溫下共孵育15分鐘，并之后添加重組人IL-Ia (rhILlA，eBioscience) 至40pg/mL的終濃度。陽性對照孔僅接受IL-I α的添加。使用不存在IL-I α或不存在 MABpl的HUVEC細胞作為陰性對照。在37°C、5 % CO2下孵育17-20小時之后，通過使用 CellMripper試劑(Cellgro Mediatech)無酶處理20分鐘使細胞從板上浮起，并之后使用 標(biāo)準(zhǔn)的流式細胞術(shù)方案立即測定⑶M(ICAM-I)的表達。染色緩沖液包含補充了 2%熱滅 活的胎牛血清的Dulbecco PBS0參照廠家的說明書，在室溫下于黑暗中使用PE-結(jié)合的小 鼠抗人CM4(ICAM-l)mAb (eBioscience，HA58克隆)或PE-結(jié)合的小鼠IgGlk同種型對照 (eBiocience，#12-4714)以100微升染色體積將HUVEC細胞染色20分鐘。隨后用染色緩 沖液進行兩次洗滌并之后在FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)上獲得樣品。在 幾次獨立的實驗(n = 5)中，HUVEC細胞表面上的由rhILlA誘導(dǎo)的ICAM-I粘附分子的上 調(diào)被MABpl中和至未被刺激的HUVEC細胞所顯示的基線水平。實施例9-MABpl阻斷內(nèi)皮細胞中E-選擇素的表達的增加
類似于MABpl對ICAM-I誘導(dǎo)的作用，還觀察到了 MABpl-介導(dǎo)的HUVEC細胞上 ⑶62E (E-選擇素)誘導(dǎo)的中和。這個作用在當(dāng)HUVEC細胞不是被可溶性的rhIL_la刺激而 是被通過糖基磷脂酰肌醇錨定在DG44CH0細胞(GPI-IL1A細胞)表面的膜IL-Ia刺激時是 最明顯的。在本實驗中，將在6-孔板中的HUVEC細胞的匯合培養(yǎng)物與5 X IO6GPI-ILIA DG44 細胞在單獨的M-200培養(yǎng)基中共培養(yǎng)過夜、或在10μ g/mLMABpl的存在下共培養(yǎng)過夜、或在 10 μ g/mL D5同種型對照Ab的存在下共培養(yǎng)過夜。在17-20小時之后，用Dulbecco PBS 徹底洗滌HUVEC單層并之后用CellMripper試劑(Cellgro Mediatech)無酶處理20分鐘 使HUVEC單層浮起，并且之后使用標(biāo)準(zhǔn)的流式細胞術(shù)方案立即測定CD62E (E-選擇素)的表 達。染色緩沖液包含補充了 2%熱滅活的胎牛血清的Dulbecco PBS0參照廠家的說明書，在 室溫下于黑暗中使用PE-結(jié)合的小鼠抗人CD62E mAb(eBioscience, P2H3克隆)或PE-結(jié) 合的小鼠IgGlk同種型對照(eBiocience，P3克隆)在100微升的染色體積中將HUVEC細 胞染色20分鐘。隨后用染色緩沖液進行兩次洗滌并之后在FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)上獲得樣品。由膜GPI-IL-Ia誘導(dǎo)的HUVEC細胞表面上的E選擇素的表達上 調(diào)被MABpl中和至由未被刺激的HUVEC細胞所顯示的基線水平。實施例IO-MABpl效價(rhILlA的中和)的MRC-5生物測定來源于人胎兒肺成纖維細胞的MRC-5細胞系獲自ATCC保藏中心(CCL-171)。通 過測量IL-IA誘導(dǎo)的IL-6從MRC-5細胞中的釋放測定MABpl的IL-I中和效價。將在100 微升DMEM完全培養(yǎng)基中的MRC-5細胞按5 X IO3每孔接種在96-孔板中。37 °C下在加濕 的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞過夜。隨后將匯合的MRC-5細胞與單獨的20pg/mL的重組人 IL-IA (rhILlA，eBioscience)培養(yǎng)另外M小時或者在遞增濃度的MABpl存在下與20pg/mL 的重組人IL-IA (rhILlA，eBioscience)培養(yǎng)另外M小時。陰性對照細胞不用rhILlA刺激。 24小時之后，收集上清液并用來自eBioscience的IL-6ELISA試劑盒測定IL-6釋放。IC5tl 或抑制最大IL-6釋放的50%所需的MABpl濃度在0. 001 μ g/mL-0. 01 μ g/mL的范圍中。實施例Il-MABpl鑒定IL-la+細胞將一百微升肝素鈉抗凝的全血等分到聚苯乙烯FACS管中。將樣品與Img人 IgG(蛋白A純化的)加上2ml阻斷Fc受體的熱滅活的胎牛血清一起在室溫下孵育15分 鐘。之后添加一抗至下列樣品中l(wèi)mg Alexa-488標(biāo)記的MABplUmg FITC-標(biāo)記的單克隆抗 膜人 ILlAAb (FAB200F，R&DSystems)、或者 Img 鼠同種型對照(IC002F，R&D Systems)。將一 抗與樣品在室溫下黑暗中孵育30分鐘。之后在室溫下將樣品紅細胞裂解(BDBiosciences WiarmLyse溶液)15分鐘，以300 Xg離心5分鐘，并吸出。用ImL含有2%熱滅活的胎牛血 清的Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)將樣品團粒洗滌三次。將樣品重懸在0. 3mL HBSS+2%FBS 中并在FACSCalibur流式細胞儀上獲得數(shù)據(jù)并使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。使用MABp 1 的人PBMC的流式細胞術(shù)分析顯示僅0. 2%的PBMC是IL-I α陽性的。實施例12-用于檢測和示蹤感染及炎癥的MABpl使用MABpl的人PBMC的流式細胞術(shù)分析(如在實施例11中的)顯示與正常對照 相比在具有亞臨床感染的受治療者中IL-I α +陽性的PBMC的百分比增加了 3. 6倍。類似 地，在具有發(fā)炎的智齒的受治療者中，IL-I α +陽性的PBMC的百分比也增加。在智齒去除之 后14至45天，觀察到IL-I α +PBMC的數(shù)量大量降低。實施例13-用于檢測和/或定量IL-I α的免疫測定
通常，人受治療者的血漿中存在非常低水平的IL-I α。由于這些水平常常超出常 規(guī)免疫測定的檢測閾，所以開發(fā)了具有提高的靈敏度的ELISA。在該ELISA中，可以在允 許Ab與樣品中的IL-Ia結(jié)合的條件下，將外源的抗-IL-I a Ab (如，MABpl)添加至被測 試的生物樣品(如人血漿)中。因為觀察到在人血漿樣品中幾乎所有的IL-I α都已經(jīng)與 內(nèi)源抗-IL-I a Ab結(jié)合存在，所以后一步驟通?？梢允÷?。之后將具有IL-I a -Ab復(fù)合物 的樣品施加到具有約IOOkDa的分子量截留的濾器(Amicon離心裝置)中，來將IL-I a -Ab 復(fù)合物與樣品中小于分子量截留的分子分離。在一個實驗中，這引起50倍的濃縮。之后 將處理的樣品(及其稀釋物)加至用抗-人IgG捕獲Ab (2 μ g/ml小鼠抗人IgG，F(xiàn)c-特異 性的，Southern Biotech產(chǎn)品編號9042-01)包被的微量滴定板的孔中。在允許結(jié)合樣品 中的IL-I a -Ab復(fù)合物的時間之后，洗滌各孔以去除未結(jié)合的材料。之后將標(biāo)記的抗-人 IL-Ia 二抗加至孔中(OJyg/ml生物素結(jié)合的單克隆小鼠抗-人IL_lAAb，CRM6克隆， eBioscience目錄號13-7017)。在允許結(jié)合孔中的IL_1 α的時間之后，洗滌板，并將各孔 中的標(biāo)記的抗-人IL-I α的量定量作為被測試的樣品中的IL-I α的濃度的指示。其它實施方案應(yīng)理解雖然已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的詳述描述了本發(fā)明，但是上述描述旨在闡述且不限 制由所附的權(quán)利要求書的范圍所限定的本發(fā)明的范圍。其它方面、優(yōu)點及修改都在下述的 權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的人IgGl單克隆抗體，所述單克隆抗體包含與 輕鏈共價連接的重鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的純化的人IgGl單克隆抗體，其中所述重鏈包含SEQID NO :9的 氨基酸序列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。
3.一組分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼與IL-Ia特異性結(jié)合的人IgGl單克隆 抗體的重鏈的第一核酸以及編碼與人IL-I α特異性結(jié)合的人IgGl單克隆抗體的輕鏈的第 二核酸。
4.如權(quán)利要求3所述的一組分離的核酸，其中所述第一核酸編碼SEQID Ν0:9的氨基 酸序列并且所述第二核酸編碼SEQ ID NO=Il的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的一組核酸，其中所述第一核酸包含SEQID Ν0:10的核苷酸序 列并且所述第二核酸包含SEQ ID NO 12的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求3所述的一組分離的核酸，其中所述一組分離的核酸被包含在至少一種 表達載體內(nèi)。
7.如權(quán)利要求4所述的一組分離的核酸，其中所述一組分離的核酸被包含在至少一種 表達載體內(nèi)。
8.如權(quán)利要求5所述的一組分離的核酸，其中所述一組分離的核酸被包含在至少一種 表達載體內(nèi)。
9.如權(quán)利要求3所述的一組分離的核酸，其中所述一組分離的核酸被包含在分離的宿 主細胞中。
10.如權(quán)利要求4所述的一組分離的核酸，其中所述一組分離的核酸被包含在分離的 宿主細胞中。
11.如權(quán)利要求8所述的一組分離的核酸，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
12.—種殺傷表達人IL-I α的細胞的方法，所述方法包括使所述細胞接觸與人IL-I α 特異性結(jié)合的純化的人IgGl單克隆抗體的步驟。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述人IgGl單克隆抗體包含重鏈和輕鏈，所述重 鏈包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。
14.一種抑制細胞穿過基膜基質(zhì)遷移的方法，所述方法包括將與人IL-I α特異性結(jié)合 的純化的單克隆抗體添加至包含所述基膜基質(zhì)和所述細胞的混合物中的步驟。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述純化的單克隆抗體是包含與輕鏈共價連接的 重鏈的人IgGl單克隆抗體。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述重鏈包含SEQID NO 9的氨基酸序列并且輕 鏈包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。
17.—種抑制IL-I α誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細胞表面上ICAM-I或E-選擇素的表達增加的方 法，所述方法包括將與人IL-I α特異性結(jié)合的純化的單克隆抗體加入至包含所述內(nèi)皮細 胞和IL-I α的混合物中的步驟。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述純化的單克隆抗體是包含與輕鏈共價連接的 重鏈的人IgGl單克隆抗體。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述重鏈包含SEQID NO 9的氨基酸序列并且輕 鏈包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。
20.一種在人受治療者中示蹤炎癥的方法，所述人受治療者之前經(jīng)受過以下步驟首 次從所述受治療者獲得外周血單核細胞的第一樣品；使所述第一樣品接觸與人IL-I α特 異性結(jié)合的純化的單克隆抗體；以及確定在所述第一樣品中與所述單克隆抗體結(jié)合的細胞 的百分比，所述方法包括以下步驟(a)再次從所述受治療者中獲得外周血單核細胞的第二樣品；(b)使所述第二樣品接觸與人IL-Iα特異性結(jié)合的純化的單克隆抗體；(c)確定所述第二樣品中與所述單克隆抗體結(jié)合的細胞的百分比；以及(d)將所述第一樣品中結(jié)合所述單克隆抗體的細胞的百分比與所述第二樣品中結(jié)合所 述單克隆抗體的細胞的百分比相比較。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述純化的單克隆抗體是包含與輕鏈共價連接的 重鏈的人IgGl單克隆抗體。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重鏈包含SEQID NO :9的氨基酸序列并且輕 鏈包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。
23.一種方法，所述方法包含以下步驟(a)使用濾器富集從人受治療者獲得的生物樣品，所述濾器根據(jù)分子量將分子分為包 含與IL-I α復(fù)合的完整IgG的第一級分和包含小于IOOKda的分子的第二級分；以及(b)對所述第一級分中的IL-Iα的量進行定量。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，所述方法包括以下步驟(a)使用濾器富集從人受治療者獲得的血漿樣品，所述濾器根據(jù)分子量將分子分為包 含與IL-I α復(fù)合的完整IgG的第一級分和包含小于IOOKda的分子的第二級分；(b)在允許所述第一級分中的IgG與固定在基質(zhì)上的抗人IgG抗體特異性結(jié)合的條件 下，將所述第一級分添加到包含固定的抗人IgG抗體的所述基質(zhì)中；(c)洗滌所述基質(zhì)以去除所述第一級分中未與所述固定的抗人IgG抗體特異性結(jié)合的 材料；(d)在允許特異性結(jié)合人IL-Iα的抗體與結(jié)合于所述基質(zhì)的任何人IL-I α特異性結(jié) 合的條件下，使在步驟(c)中洗滌的所述基質(zhì)接觸與人IL-I α特異性結(jié)合的抗體；(e)洗滌所述基質(zhì)以去除與未結(jié)合于所述基質(zhì)的人IL-Iα特異性結(jié)合的任何抗體；以及(f)對與步驟(e)之后仍結(jié)合于所述基質(zhì)的人IL-Iα特異性結(jié)合的抗體的量進行定量。
全文摘要
完全人單克隆抗體，其包含(i)抗原結(jié)合可變區(qū)，所述抗原結(jié)合可變區(qū)表現(xiàn)出對IL-1α的非常高的結(jié)合親和力；和(ii)恒定區(qū)，所述恒定區(qū)對于通過C1q結(jié)合而活化補體系統(tǒng)和與幾種不同的Fc受體結(jié)合都有效。
文檔編號C12N5/071GK102112154SQ200980125033
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者J·西馬德 申請人:埃克斯生物科技公司