專利名稱：果膠分解酶在水果和蔬菜糊狀物的處理中的用途及其酶序列的制作方法
果膠分解酶在水果和蔬菜糊狀物的處理中的用途及其酶序列
本發(fā)明涉及具有果膠分解活性的果膠分解酶或多肽在水果或蔬菜糊狀物處理中 的用途。本發(fā)明還涉及果膠分解酶在水果或蔬菜汁的制備中的用途。至少一種酶可從里氏 木霉(Trichoderma reesei)獲得。此外，本發(fā)明涉及具有適合于水果或蔬菜糊狀物的處 理的果膠分解活性的多肽序列以及編碼所述多肽序列的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明涉及 來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶在水果或蔬菜糊狀物，尤其是蘋果糊狀物的處理中的用 途，以及所述酶在水果或蔬菜汁，尤其是蘋果汁的制備中的用途。
果膠聚合物是植物細(xì)胞壁的重要成分。果膠是水果或蔬菜胞間層(lamella)和細(xì) 胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖。水果或蔬菜的紋理取決于果膠的數(shù)量和特性。一般，未成熟水果包 含不溶性原果膠，而成熟水果包含較多可溶性果膠。果膠是具有由交替的同型半乳糖醛酸 聚糖(平滑區(qū))和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛狀區(qū))組成的主鏈的雜多糖。平滑區(qū)是1， 4-連接的α-D-半乳糖醛酸的線性聚合物。半乳糖醛酸殘基可以在羧基上被甲酯化。
水果包含在成熟過程中和成熟后參與天然離析過程的果膠分解酶。工業(yè)果膠酶用 于加工飼料和食物中的水果和蔬菜。為了水解果膠和在壓榨水果或蔬菜時增加汁液、降低 粘度以能夠濃縮渾濁汁液或為了澄清汁液而完全降解果膠和將汁液濃縮，在工業(yè)方法中將 酶用于例如水果或蔬菜加工。
可以通過壓榨操作或通過液化方法產(chǎn)生水果和蔬菜汁，尤其是用蘋果制成的汁。 兩種方法都得到使用果膠水解酶的支持。一般，在壓榨前碾碎整個水果并用果膠分解酶處 理，以松弛細(xì)胞壁和促進(jìn)汁液的自由流動。壓榨后，通常加熱汁液，滅活汁液中的所有酶。然 后將汁液轉(zhuǎn)移至澄清池，于其中向汁液加入其他酶，以在過濾前脫果膠(cbpectinize)和 水解淀粉。然后在隨后的汁液的巴氏滅菌過程中或在濃縮過程中在蒸發(fā)器中滅活酶。例如， 在蘋果汁的產(chǎn)生中，好的壓榨結(jié)果需要糊狀物的某種結(jié)構(gòu)。引起所謂的不溶性果膠的降解 或離析的果膠酶是不利的，因為它們增加汁液中的固體。若該結(jié)構(gòu)被完全破壞，則獲得所謂 的蘋果醬效應(yīng)且壓榨后汁液非常渾濁。果膠酶初步作用于可溶性果膠，從而導(dǎo)致汁液測定 的較低粘度和非常易于流走。在醬(puree)的制備中優(yōu)選離析特性。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)通過使用包含平滑區(qū)和毛狀區(qū)果膠酶的果膠分解酶來制備水 果糊狀物/水果汁?！捌交瑓^(qū)”果膠酶包含果膠酯酶(或果膠甲酯酶)、多聚半乳糖醛酸酶和 果膠裂合酶(或果膠反式消除酶)?！懊珷顓^(qū)”果膠酶主要包含內(nèi)切阿拉伯聚糖酶、阿拉伯 呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶等。兩類酶都存在于衍生自黑曲 霉(Aspergillus niger)的標(biāo)準(zhǔn)果膠酶制劑中。在現(xiàn)有技術(shù)方法中，因不建議攪拌，在壓碎 蘋果的過程中加入果膠酶以達(dá)到酶在糊狀物中的適合的分布。30-120分鐘的保留時間后， 通過臥式或壓帶式系統(tǒng)壓榨糊狀物。過濾所獲得的汁液以分離粗粒子。然后在真空蒸發(fā)器 中進(jìn)行汁液的巴氏殺菌或香精解吸(essence-stripped)。再冷卻至約48_52°C后，進(jìn)行汁 液處理以脫果膠和降解淀粉。該處理進(jìn)行約1-2小時，然后進(jìn)行過濾方法，即超濾。
由“平滑區(qū)”和“毛狀區(qū)”果膠酶組成的現(xiàn)有技術(shù)的果膠酶制劑(果膠酶組合物) 不適合用于所描述的這類壓榨方法，因為它們液化糊狀物和引起汁液中固體量高。特異性多聚半乳糖醛酸酶與高果膠酯酶組合的專一性應(yīng)用提供更好的壓榨結(jié)果，即更短的壓榨周 期、更高的壓榨產(chǎn)率和汁液中更低的固體量。此外，汁液包含更少的殘留果膠或無殘留果 膠，其改進(jìn)隨后的脫果膠和過濾。
在加工澄清汁液時，需要稱為“脫果膠”的第二次加工步驟，其中通常使用“平滑 區(qū)”和“毛狀區(qū)”果膠酶二者。原則上，為了達(dá)到最佳的超濾方法，有必要降解所有存在的高 分子量物質(zhì)(主要是果膠、淀粉等)。在它們在更高溫度的性能或所獲得的汁液的質(zhì)量方 面，現(xiàn)有技術(shù)方法中使用的果膠酶不能令人滿意。
目前不可得到在更高溫度(> 60°C )有活性的果膠酶。此外，目前不能令人滿意 地得到用于在壓榨后直接產(chǎn)生澄清汁液而無殘留果膠的糊狀物處理的果膠酶。從現(xiàn)有技術(shù) 已知果膠分解酶。曲霉屬(Aspergillus)果膠酶公開于例如WO 94/14952和WO 94/14966 中。Carbohydrate Research 338 000 ，515-5 描述了隸屬于糖基水解酶家族觀的兩種 里氏木霉(ATCC 26920)多聚半乳糖醛酸酶同種型的分離和表征。根據(jù)其pH和溫度特性表 征該酶。未描述所述多聚半乳糖醛酸酶的具體用途。
因此，在溫度特性和該方法的進(jìn)行方面更易于操作方面，現(xiàn)有技術(shù)中已存在對適 合用于水果或蔬菜糊狀物處理的果膠分解酶的需要。
因此，本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的用于水果或蔬菜汁的制備的方法。具體而言，本 發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的用于水果或蔬菜糊狀物的制備的方法。按照最終所獲得的汁液， 本發(fā)明的方法將導(dǎo)致更好的產(chǎn)率和質(zhì)量。此外，本發(fā)明的方法將可在寬的溫度范圍內(nèi)實施， 且當(dāng)在高溫實施該方法時還將導(dǎo)致好的結(jié)果。本發(fā)明的方法將改進(jìn)糊狀物的可提取性或可 降解性和從而改進(jìn)其壓榨容量。它將導(dǎo)致壓榨后具有低殘留果膠含量的汁液，即將改進(jìn)所 獲得的汁液的清澈性，從而避免費力的過濾。本發(fā)明的方法將適合用于不同水果。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼果膠分解酶的基因以及提供具有適合于上述方 法的果膠分解活性的多肽的序列。具體而言，本發(fā)明的序列將編碼果膠分解酶，其具有寬的 應(yīng)用范圍并導(dǎo)致糊狀物的處理和水果或蔬菜汁的制備的方法中的改進(jìn)。
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，來自里氏木霉的果膠酶在水果或蔬菜糊狀物的處理中，且 尤其是在來自包含可溶性或低酯化果膠的水果的糊狀物的處理中顯示優(yōu)良的性能。具體而 言，已發(fā)現(xiàn)里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶(PGAl)在蘋果糊狀物處理中顯示優(yōu)良的性能。已令 人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可將里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶(PGAl)作為唯一的酶用于來自包含可溶 性或低酯化果膠的水果的糊狀物的處理，且該方法可有利地在提高的溫度進(jìn)行。還已發(fā)現(xiàn)， 里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶PGAl可以有利地與其他果膠分解酶如果膠甲酯酶、多聚半乳 糖醛酸酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半 乳糖醛酸聚糖酶組合使用，以改進(jìn)甚至來自具有高酯化或不可溶性果膠的水果的水果糊狀 物的處理，由此必須在與所使用的酶相容的溫度進(jìn)行該方法。
本發(fā)明涉及一種或多種果膠分解酶在水果或蔬菜糊狀物的處理中的用途，其中至 少一種果膠分解酶可從里氏木霉獲得。具體而言，本發(fā)明涉及來自里氏木霉的多聚半乳糖 醛酸酶在蘋果糊狀物的處理中的用途。此外，本發(fā)明涉及包括加入一種或多種果膠分解酶 的步驟的用于水果或蔬菜糊狀物的酶處理的方法，以及包括所述用于水果或蔬菜糊狀物的 酶處理的方法用于水果或蔬菜汁的制備的方法，其中至少一種果膠分解酶可從里氏木霉獲 得。具體而言，本發(fā)明涉及用于蘋果糊狀物的酶處理的方法，其中使用具有SEQ ID N0:2的來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。
此外，本發(fā)明涉及在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有內(nèi)多切聚半乳糖醛酸 酶活性的多肽的重組DNA分子，所述重組DNA分子包含選自以下的DNA序列a)具有或包 含SEQ ID NO: l(pgal)的DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列雜交的DNA序列；c) 與a)的序列具有70%-98%的同一性程度的DNA序列；或d)由于遺傳密碼的簡并性而與 a)、b)或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
此外，本發(fā)明涉及在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有外切多聚半乳糖醛酸 酶活性的多肽的重組DNA分子。該重組DNA分子包含選自以下的DNA序列a)具有或包含 SEQ ID NO :3 (pgxl)的DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列雜交的DNA序列；c)與a)的序列具有60%-98%的同一性程度的DNA序列；或d)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b)或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
此外，本發(fā)明涉及在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有外切鼠李糖半乳糖醛 酸聚糖酶活性的多肽的重組DNA分子，該重組DNA分子包含選自以下的DNA序列a)具有 或包含SEQ ID NO 5 (rgxl)的DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列雜交的DNA序 列；c)與a)的序列具有60% -98%的同一性程度的DNA序列；或d)由于遺傳密碼的簡并 性而與a)、b)或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
本發(fā)明還涉及在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有木半乳糖醛酸聚糖酶活 性的多肽的重組DNA分子，該重組DNA分子包含選自以下的DNA序列a)具有或包含SEQ ID NO 7 (xgal)的DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列雜交的DNA序列；c)與a) 的序列具有60% -98%的同一性程度的DNA序列；或d)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b) 或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
本發(fā)明還涉及具有果膠分解活性且包含選自以下的氨基酸序列的多肽a)包含 與PGAI多肽的序列(SEQ ID NO 2)具有至少77%同一性、優(yōu)選至少80%同一性、更優(yōu)選至 少85%同一性、還更優(yōu)選至少90%同一性、還更優(yōu)選至少95%同一性和還更優(yōu)選至少98% 同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有果膠分解活性的片段的a)的變體；和c)具有果 膠分解活性的a)或b)的片段。
本發(fā)明還涉及具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半 乳糖醛酸聚糖酶活性且包含選自以下的氨基酸序列的多肽a)包含與多肽SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8的序列具有至少60%同一性、優(yōu)選至少70%同一性、更優(yōu)選 至少80%同一性、還更優(yōu)選至少90%同一性和還更優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列的 多肽；和b) a)的變體。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“果膠分解酶”將包含果膠酶、果膠酯酶(或果膠甲酯 酶)、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶(或果膠反式消除酶)、果膠酸裂合酶(或果膠酸反式 消除酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。
制備本發(fā)明的水果或蔬菜糊狀物時，首先壓碎所討論的水果或蔬菜，然后用本發(fā) 明的果膠分解酶處理糊狀物，然后壓榨糊狀物和從而對所獲得的汁液任選地進(jìn)行巴氏殺菌 和任選地用果膠分解酶和/或用適合用于該方法的進(jìn)行的其他酶進(jìn)一步處理。關(guān)于這一 點，在該方法在較高溫度的總體進(jìn)行方面應(yīng)考慮到待使用的其他酶的溫度特征。
在壓碎過程中或壓碎之后以本領(lǐng)域中的常用量直接加入果膠分解酶。優(yōu)選的應(yīng)用是使用由在1-5%溶液中的50，000-100, 000P⑶/mg組成的果膠酶制劑。建議的酶劑量是 50-100g/t水果。建議的反應(yīng)溫度是10-30°C，反應(yīng)時間是30-120分鐘。糊狀物的平均pH ；^； 3. 2—3. 6 ο
可以以方便的和與該方法的進(jìn)行相容的任意形式加入果膠分解酶。
優(yōu)選將果膠分解酶作為濃縮或稀釋的液體溶液加入。
優(yōu)選地，該果膠分解酶是具有序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6和 SEQ ID NO :8之一的果膠分解酶。最優(yōu)選的是具有SEQID NO :2的來自里氏木霉的多聚半 乳糖醛酸酶。
上述方法適合用于任意水果或蔬菜糊狀物的處理。適合的水果選自蘋果、梨、葡 萄、白葡萄、紅葡萄、漿果和李子。該方法適合用于在低溫(例如10-30°C )加工的水果和在 高溫(例如50°C)加工的水果二者。適合的蔬菜選自胡蘿卜和西紅柿。其他可加工的材料 可以包含咖啡或可可豆和胡椒。
水果糊狀物是蘋果糊狀物且所使用的酶是來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶時 獲得最有利的結(jié)果。水果糊狀物是來自包含低酯化和可溶性果膠的水果如草莓或李子的糊 狀物時獲得尤其有利的結(jié)果。已發(fā)現(xiàn)在這種情況下，通過木霉屬(Trichoderma)PGAl作為 單一酶的使用可以獲得高產(chǎn)率和高質(zhì)量的汁液。在包含高度酯化和/或不可溶性果膠的水 果的情況下，在制備對應(yīng)汁液的方法中使用其他果膠分解酶可以是必要的。
本發(fā)明還涉及來自里氏木霉的新的果膠分解酶的DNA和蛋白質(zhì)序列。那些序列是 內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(Pgal)、外切多聚半乳糖醛酸酶(pgxl)、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚 糖酶(rgxl)和木半乳糖醛酸聚糖酶(xgal)。序列作為SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 8在所 附序列表中給出。
本發(fā)明還包含所述DNA序列的變體和衍生物，只要它們編碼具有所要求的活性的 多肽。本發(fā)明尤其包含在嚴(yán)格條件下雜交至各序列的DNA序列。嚴(yán)格條件的實例是于65°C 在硫酸葡聚糖溶液(GenescreenPlus，Dupont)中雜交18小時，漂洗濾膜30分鐘，先用6x SSC洗、用h SSC洗兩次、用3x SSC洗3次、用0. SDS洗和然后用0. h SSC于65°C洗 (膜轉(zhuǎn)移和檢測方法，Amersham)。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及與pgal的序列(SEQ ID NO 1)具有至少70%、優(yōu)選至少80%、 更優(yōu)選至少85%、還更優(yōu)選至少90%、還更優(yōu)選至少95%、還更優(yōu)選至少98%的同一性程 度的多核苷酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及與選自pgxl (SEQ ID NO 3)、rgxl (SEQ ID NO 5)和 xgal (SEQ ID NO 7)的序列之一具有至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、還更優(yōu)選至少80%、 還更優(yōu)選至少85%、還更優(yōu)選至少90%、還更優(yōu)選至少95%和還更優(yōu)選至少98%的同一性 程度的多核苷酸。
此外，本發(fā)明涉及由于遺傳密碼的簡并性而與本發(fā)明的序列相關(guān)的DNA序列以及 它們的所有等位變體。遺傳密碼的簡并性可以產(chǎn)生自天然簡并性或尤其是產(chǎn)生自密碼子的 選擇使用。可以通過使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或雜交技術(shù)鑒定 天然存在的等位變體。
可以用編碼本發(fā)明的多肽的DNA序列轉(zhuǎn)化任意宿主細(xì)胞，如真菌、酵母、細(xì)菌、植 物或哺乳動物的細(xì)胞。
優(yōu)選通過檢測參與比較并在另一序列中具有“適當(dāng)?shù)摹睂?yīng)物的較短序列的殘 基數(shù)來測定同一性程度。在這方面，同源性定義為同一性程度。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選 通過使用標(biāo)準(zhǔn)算法以通常方式測定同一性。根據(jù)本發(fā)明，僅使用各蛋白質(zhì)的cDNA進(jìn)行比 較，并利用已知的計算機(jī)程序?qū)⑾嗨频?、?yōu)選同一的序列對應(yīng)物測定為同源序列。這種程 序的實例是Clone Manager Suite，其是包含程序部分Align Part的程序，由kientific & Educational Software, Durham, NC, USA出售。在選項“局部比對”下，該程序通過使用 FastScan-MaxScore法或Needleman-Wunsch法和通過保留默認(rèn)值來進(jìn)行如上文所定義的 兩條DNA序列的比較。根據(jù)本發(fā)明，尤其使用包含功能“Compare Two Sequences/Global/ Compare DNA sequences，，的程序版本"Clone Manager 7 Align Plus 5”來確定同一性 程度。在這種情況下，使用可從以下來源獲得的算法Hirsctiberg，D. S. (1975)A linear space algorithm for computing longest common subsequences,Commun. Assoc. Comput. Mach. 18 :341-343 ；Myers, E. W.和 W. Miller. (1988)Optimal alignments in linear space, CABIOS 4:1，11—17 ；Chao, K-M, W.R.Pearson 和 W.Miller· (1992)Aligning two sequences within a specified diagonal band, CA-BIOS 8:5，481_487。
所克隆的基因序列的表達(dá)導(dǎo)致所希望的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或?qū)е略摰鞍踪|(zhì)的片段的 產(chǎn)生。該表達(dá)可以在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中以連續(xù)的方式或以受控的方式發(fā)生。
片段理解為長度足以具有所希望的酶特性或編碼所述的果膠分解多肽或其生物 學(xué)活性片段的多肽或核酸分子的部分。優(yōu)選地，片段序列是無信號序列的各成熟多肽序列。
本發(fā)明還涉及具有與以上多肽序列SEQ ID NO :2、4、6或8或其片段或它的部分具 有至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、還更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少95%的同 一性程度的序列的多肽，只要該多肽保留各自的果膠分解活性。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及與PGAl 多肽(SEQ ID NO :2)的序列具有至少77%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、還更優(yōu)選至 少90%、還更優(yōu)選至少95%和還更優(yōu)選至少98%的同一性程度的多肽。
本文中所用的術(shù)語多肽的“同一性”指相互比較的兩條氨基酸序列之間從由對 應(yīng)基因編碼的第一個氨基酸至最后一個氨基酸的總體同一性。通過用以下參數(shù)使用在 EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite ;Rice 等，2000)程序包 3. 0. 0 版上的Needleman-Wunsch總體比對程序測量全長序列的同一性EMBL0SUM62，空位罰分 10. 0，延伸罰分 0. 5。該算法描述于 Needleman 和 Wunsch(1970) Journal of Molecular Biology 48,443-453 中。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可以互換。具有內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶、外切多 聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽或酶指 根據(jù)本領(lǐng)域所建立的測定法具有所述活性的酶。本發(fā)明還包含所述酶的變體，只要它們保 留其原有活性。本發(fā)明的變體包括通過對天然蛋白質(zhì)N端和/或C端的一個或多個氨基 酸的缺失或添加、對天然蛋白質(zhì)中一個或多個位點的一個或多個氨基酸的缺失或添加或 對該酶中一個或多個位點的一個或多個氨基酸的置換所衍生的多肽變體。這類變體的產(chǎn) 生一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。多肽的氨基酸序列的變體可以例如通過DNA中的突變產(chǎn) 生。誘變的方法和核苷酸序列中的改變?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知(參見例如Kimkel，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 488 (1985) ；Kunkel 等，Methods in Enzymol. , 154 :367(1987)；美 國專禾Ij號 4，873，192 ;Walker 禾口 Gaastra，編輯，Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company，紐約(1983))。有關(guān)對蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)活性無負(fù)面影響 的適合的氨基酸置換的參考文獻(xiàn)可以見于來自Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C. (1978)的模型。優(yōu)選保守置 換，如通過具有相似特性的另一個氨基酸交換一個氨基酸。
可在組內(nèi)互換的這種氨基酸列于但不限于下表。
脂肪族非極性GAPMILVFW極性且不帶電荷CSTNQY極性且?guī)щ姾蒁EKRH芳香族HFWY
本發(fā)明還涉及分離的或基本上純化的核酸制劑(組合物)或蛋白質(zhì)制劑(組合 物)。在這方面，分離的和純化的多核苷酸/多肽或其片段指從其天然環(huán)境分離的多核苷酸 或多肽或其片段。分離的多核酸或多肽的片段可以存在于純化的形式中或可以存在于非天 然環(huán)境中，如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明還涉及可以用來將編碼本發(fā)明的果膠分解酶的可讀框引入宿主細(xì)胞的表 達(dá)盒。它們優(yōu)選包括連接至所希望的DNA序列的可讀框的具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的啟動子。這種 表達(dá)盒可以包含多種限制性切割位點用于可讀框和/或其他DNA例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和/或選 擇標(biāo)記基因的插入。在轉(zhuǎn)錄的5’一 3’方向上，該表達(dá)盒包含具有轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)的啟動 子、所希望的DNA序列和翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這種表達(dá)盒在微生物細(xì)胞中是功能性的。終 止區(qū)可以是該啟動子或所討論的DNA天然的或可以衍生自任意不同來源。
術(shù)語“可讀框”(ORF)指編碼序列的翻譯起始密碼子和終止密碼子之間編碼的氨基 酸序列。術(shù)語“起始密碼子”和“終止密碼子”指編碼序列中三個連續(xù)核苷酸(密碼子)的 單位，其指定蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)的鏈起始和鏈終止。
在核酸這一點上，“功能性連接”指化合物作為相同核酸分子的部分在適當(dāng)位置并 且具有與該分子的轉(zhuǎn)錄起始適當(dāng)?shù)娜∠?。功能性連接至啟動子的DNA處于該啟動子的轉(zhuǎn)錄 起始調(diào)節(jié)之下。編碼序列可以以有義取向或反義取向功能性連接至調(diào)節(jié)序列。對于多肽， “功能性連接”指作為相同多肽的部分的連接，即利用肽鍵。
根據(jù)本發(fā)明可以使用任意啟動子。通常，關(guān)于編碼序列，啟動子指核苷酸序列的上 游，其通過RNA聚合酶的識別和進(jìn)行正確轉(zhuǎn)錄必需的其他因子控制編碼序列的表達(dá)。本發(fā) 明所使用的啟動子可以包括最小啟動子，即來自TATA框和其他序列的短DNA序列，所述其 他序列指定轉(zhuǎn)錄起始位點，其中調(diào)節(jié)元件與所述轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明的啟動子還可以包括含有最小啟動子和調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列；該最小啟 動子可以檢驗編碼序列或功能性RNA的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的DNA的載體。這些載體包括雙鏈或單鏈、線性或環(huán)狀 形式的任意質(zhì)粒、粘粒、噬菌體和其他載體；這些載體自身可以傳遞或轉(zhuǎn)移，且可以通過整合入細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)化原核或真核宿主或它們存在于染色體外(例如具有復(fù)制起點的自主 復(fù)制質(zhì)粒)。
本發(fā)明可以使用的載體的構(gòu)建由于前述公開內(nèi)容(參見例如Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory manual (第二版，冷泉港實驗室出版社，Plainview，紐 約(1989))而為技術(shù)人員已知。本發(fā)明的表達(dá)盒可以包含一個或多個限制酶切割位點，以 插入在調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)下編碼果膠分解酶的核苷酸序列。該表達(dá)盒還可以包含功能性連接 至多核苷酸的終止信號，以及多核苷酸正確翻譯必需的調(diào)節(jié)序列。
選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體取決于宿主細(xì)胞。酵母或真菌的表達(dá)載體可以包含復(fù)制起 點、適當(dāng)?shù)膯幼雍驮鰪?qiáng)子以及任意必需的核糖體結(jié)合位點、多聚腺苷化位點、剪接供體和 受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和非轉(zhuǎn)錄的5’側(cè)翼序列。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的實例是曲霉屬、根霉屬(lihizopus)、木霉屬、肉座菌屬 (Hypocrea)、脈孢霉屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)、金孢 子菌屬(Chrysosporium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、鐮孢霉屬(Fusarium)等屬的 真菌細(xì)胞，如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、絲抱酵母屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、漢 遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)和該種類的其他屬的酵母。適當(dāng)?shù)乃拗飨?統(tǒng)是例如如曲霉屬(例如黑曲霉(ATCC 9142)、無花果曲霉(Aspergillus ficuum) (NRLL 3135))或木霉屬(例如里氏木霉QM6a及其衍生物)的真菌和如酵母屬(例如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae))或畢赤酵母屬(例如巴其j 德畢赤酵母(Pichia pastoris)) 或漢遜酵母屬(例如多形漢遜酵母(H. polymorpha) (DSMZ 70277))的酵母?？梢詮墓?認(rèn)的保藏機(jī)構(gòu)獲得這類微生物，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBQ [皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心]或Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)[德意志微生物保藏中 心]或任意其他保藏機(jī)構(gòu)。
除特殊啟動子的使用外，其他類型的元件也可以影響所克隆的基因的表達(dá)。尤其 是已顯示內(nèi)含子具有增強(qiáng)基因表達(dá)的潛能。
表達(dá)盒還可以包含其他元件，如可以通過內(nèi)源或外源元件如鋅指蛋白質(zhì)(包含天 然存在的鋅指蛋白質(zhì)或嵌合鋅指蛋白質(zhì))調(diào)節(jié)的元件。
本發(fā)明所使用的表達(dá)盒還可以包含增強(qiáng)子元件或上游啟動子元件。
可以以這樣的方式構(gòu)建本發(fā)明使用的載體使其包含增強(qiáng)子元件。因此，本發(fā)明的 構(gòu)建體包括與作為終止轉(zhuǎn)錄和允許如此獲得的mRNA的多聚腺苷化的信號的3’ DNA序列一 起的目的基因。可以使用使得可能從所選擇的宿主生物分泌的任意信號序列。最優(yōu)選的用 于從絲狀真菌分泌的信號序列是來自黑曲霉的葡糖淀粉酶(glaA)或肌醇六磷酸酶信號序 列、來自米曲霉(A.0ryZae)的TAKA淀粉酶信號序列和來自里氏木霉的纖維二糖水解酶I 信號序列，或衍生自這些信號序列的信號序列。備選地，可以使用所希望的蛋白質(zhì)的信號序 列。
還可能使用特殊的前導(dǎo)序列，因為轉(zhuǎn)錄起始位點和編碼序列的起點之間的DNA序 列(即非翻譯的前導(dǎo)序列)可以影響基因表達(dá)。優(yōu)選的前導(dǎo)序列包含控制所連接的基因的 最佳表達(dá)的序列，即它們具有提高或保持mRNA穩(wěn)定性并避免不適當(dāng)?shù)姆g起始的優(yōu)選的共有前導(dǎo)序列。此類序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
—旦獲得本發(fā)明的表達(dá)盒或DNA序列，就可以利用已知的方法將其插入載體，以 在適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)中過量表達(dá)所編碼的多肽。但是，也可以用DNA序列本身轉(zhuǎn)化本發(fā)明的 適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)，以獲得所編碼的多肽的過量表達(dá)。
一旦本發(fā)明的DNA序列在適合的培養(yǎng)基中在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，就可以通過 已知方法或者從培養(yǎng)基(若該酶分泌至培養(yǎng)基中)或者從宿主生物(若該酶存在于細(xì)胞內(nèi) 或周質(zhì)空間中)濃縮和/或分離所編碼的酶。分離培養(yǎng)基的生物量和固體的已知方法后接 著濃縮酶的方法可以用來產(chǎn)生濃縮酶溶液或作為用于該酶的脫水制劑。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的制劑。一般，這些制劑是液體或干燥的。液體 制劑優(yōu)選包括純化或富集形式的酶。但是，可以加入佐劑如具有丙三醇、山梨醇或丙二醇、 硼酸鹽的穩(wěn)定劑、添加劑如鹽類、糖、防腐劑、用于調(diào)節(jié)PH值的工具等。通常的液體制劑是 含水或含油的懸液。如在本文中所使用，“酶制劑”指包含至少一種本發(fā)明的果膠分解酶的 任意酶產(chǎn)品。因此，這種酶制劑可以是用過的培養(yǎng)基或濾液。用過的培養(yǎng)基指包含所產(chǎn)生 的酶的宿主的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，在產(chǎn)生后從所述培養(yǎng)基分離宿主細(xì)胞。如果希望，這類制劑 可以噴霧干燥、粒化或凍干或可以濃縮和/或穩(wěn)定該制劑用于保存。如果需要，可以按照常 規(guī)方法進(jìn)一步純化所希望的酶，如提取、沉淀、層析、電泳等。
但是，本發(fā)明的優(yōu)勢是可以將具有宿主細(xì)胞或無宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基不經(jīng)進(jìn)一步純 化即如此用作酶制劑，因為本發(fā)明的果膠分解酶可以分泌入培養(yǎng)基并在用過的培養(yǎng)基的環(huán) 境條件中顯示活性。提供和使用這類酶制劑非常經(jīng)濟(jì)，因為不必從培養(yǎng)基分離具體的酶。
除果膠分解酶外，酶制劑可以包含一種或多種其他酶，其可以是例如其他纖維素 酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、半纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和/或氧化酶如漆酶和過氧化 物酶。
除果膠分解酶外，酶制劑可以包含添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑 和/或培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的添加劑是這樣的添加劑，其常用于預(yù)期用于使用酶制劑的應(yīng)用 的酶制劑中。
干燥制劑可以包括冷凍干燥制劑、噴霧干燥制劑、速溶制劑、顆粒制劑或擠出制 劑，其可以僅包含酶或具有添加劑如淀粉、糊精、糖、面粉、蛋白質(zhì)或油。
附圖將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。


圖1.為了過量產(chǎn)生果膠酶蛋白質(zhì)而在里氏木霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化中使用的表達(dá)盒 的示意圖。果膠酶基因處于里氏木霉cbhl (cel7A)啟動子(pcbhl)的控制下并通過使用里 氏木霉cbhl終止子序列(t (Ahl)來確保轉(zhuǎn)錄的終止。包含amdS基因或pyr4基因作為轉(zhuǎn) 化選擇標(biāo)記。
圖2A-C)在各種pH值(40°C，60分鐘)測定的現(xiàn)有技術(shù)曲霉屬PGl (2A)、曲霉屬 PG2(2B)和本發(fā)明的過量產(chǎn)生的粗制木霉屬PGAl制劑QC)的pH依賴性。
圖2D-F)在各種溫度(2D和2E pH 4. 5，2F pH 5. 0,60分鐘)測定的現(xiàn)有技術(shù)曲 霉屬？61(20)、曲霉屬？62(2幻和本發(fā)明的過量產(chǎn)生的粗制木霉屬PGAl制劑QF)的溫度依賴性。
圖3.里氏木霉PGAl蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。漏分子量標(biāo)記，泳道1 實施例3 中所述的過量產(chǎn)生木霉屬PGAl的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物上清液。通過用考馬斯亮藍(lán)染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)帶。木霉屬PGAl的大小是大約38kDa。
圖4. A)壓榨酶處理的蘋果糊狀物制劑后的汁液產(chǎn)率。在實驗中使用IOOppm劑量 的混合物，該混合物包含均添加2000PE單位/克的黑曲霉果膠甲酯酶的50 000PG單位/ 毫克的木霉屬PGAl (F050183和F050200)或現(xiàn)有技術(shù)的曲霉屬PGl (參考)。在糊狀物試驗 之一中未加入酶(空白)。酶孵育時間是在25°C孵育60分鐘。
B)顯示每一壓榨步驟后的汁液產(chǎn)率的壓榨圖。
圖5.酶處理和壓榨后汁液的濁度(測量為NTU)。在實驗中使用IOOppm劑量的混 合物，該混合物包含均添加2000PE單位/克的黑曲霉果膠甲酯酶的50 000PG單位/毫克 的木霉屬PGAl (F050183和F050200)或現(xiàn)有技術(shù)的曲霉屬PGl (參考)。在糊狀物試驗之一 中未加入酶(空白)。酶孵育時間是在25°C孵育60分鐘。
圖6.酶處理和壓榨后的樣品汁液的照片。樣品從左至右空白(無酶)、F050183、 F050200和作為參考的現(xiàn)有技術(shù)曲霉屬PGl。
圖7.用里氏木霉PGAl處理后從不同水果/蔬菜糊狀物的壓榨獲得的汁液的產(chǎn)率 )。
包含質(zhì)粒pALK1958(RF 6249)的大腸桿菌(E. coli)菌株于2006年7月19日保藏 于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ)，Mascheroder Weg lb, D-38124Braunschweig, Germany 并分配保藏號 DSM18450。pALK1958在克隆入經(jīng)類似切割的pBluescript II SK+載體的1690bp的 SacII-XhoI片段(包含基因3'區(qū)的3(^bp)上攜帶木霉屬pgal基因(表2)。
以下非限制性實施例旨在詳細(xì)說明本發(fā)明的主題。
實施例1 里氏木霉果膠分解酶的全基因組篩選
在DNA(質(zhì)粒、DNA片段)的分離和酶處理、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等中使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物 學(xué)方法。所使用的基本方法描述于標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)手冊中，例如Sambrook等(1989). Molecular cloning, a laboratory manual.冷泉港實驗室，紐約，美國禾口 Sambrook 禾口 Russell (2001). Molecular cloning, a laboratory manual.冷泉港實驗室，紐約，美國。
ffl il ^ ffi tBlastn fM Ιψ (Altschul 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 :403-410)，用各種曲霉屬果膠酶的序列(表1)檢索里氏木霉 (Hypocrea jecorina 的無個生型)基因組數(shù)據(jù)庫(http //gsphere. lanl. gov/trirel/ trirel. home, html)。
僅用黑曲霉內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶、塔賓曲霉(A. tubingensis)外切多聚半乳糖 醛酸酶、黑曲霉推定的外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶和塔賓曲霉內(nèi)切木半乳糖醛酸聚糖酶 檢索產(chǎn)生具有顯著相似性(在其全長的至少80%內(nèi)低于e-20)的命中，這導(dǎo)致四個不同 可讀框(表2)的鑒定。這些序列的完整編碼區(qū)獲自http://gsphere. lanl.gov/trirel/ trirel. home, html。
表1.用于里氏木霉基因組數(shù)據(jù)庫挖掘的曲霉屬果膠酶基因序列。
權(quán)利要求
1.一種或多種果膠分解酶在水果或蔬菜糊狀物的處理中的用途，其中至少一種果膠分 解酶可從里氏木霉獲得。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述果膠分解酶選自果膠酶、果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸 酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛 酸聚糖酶。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述果膠分解酶是來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述多聚半乳糖醛酸酶具有SEQID NO 2的22-379的氨 基酸序列。
5.權(quán)利要求1-4之一的用途，其中所述水果或蔬菜選自蘋果、梨、葡萄、漿果、胡蘿卜或 西紅柿。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述水果是蘋果。
7.權(quán)利要求1-5之一的用途，其中所述果膠分解酶是具有SEQID NO 2的22-379的 氨基酸序列的來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶且所述水果是蘋果。
8.用于水果或蔬菜糊狀物的酶處理的方法，其包括加入一種或多種果膠分解酶的步 驟，其中至少一種果膠分解酶可從里氏木霉獲得。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述果膠分解酶選自果膠酶、果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸 酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛 酸聚糖酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述果膠分解酶是來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述多聚半乳糖醛酸酶具有SEQID NO :2的22-379的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求8-11之一的方法，其中所述水果或蔬菜選自蘋果、梨、葡萄、漿果、胡蘿卜 或西紅柿。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述水果是蘋果。
14.權(quán)利要求8-12之一的方法，其中所述果膠分解酶是具有SEQID NO :2的22-379的 氨基酸序列的來自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶且所述水果是蘋果。
15.用于水果或蔬菜汁的制備的方法，其包括權(quán)利要求8-14之一的用于水果或蔬菜糊 狀物的酶處理的方法。
16.重組DNA分子，其在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有內(nèi)切多聚半乳糖醛酸 酶活性的多肽，所述重組DNA分子包含選自以下的DNA序列a)具有或包含SEQID NO :l(pga 1)的DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列雜交的DNA序列；c)與a)的序列具有70%到98%的同一性程度的DNA序列；或d)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b)或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
17.具有內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶活性且由權(quán)利要求16的重組DNA分子編碼的多肽。
18.具有果膠分解活性且包含選自以下的氨基酸序列的多肽a)包含與PGAI多肽的序列(SEQ ID NO 2)具有至少77%同一性、優(yōu)選至少80%同一 性、更優(yōu)選至少85%同一性、還更優(yōu)選至少90%同一性、還更優(yōu)選至少95%同一性和還更 優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有果膠分解活性的片段的a)的變體；和c)具有果膠分解活性的a)或b)的片段。
19.重組DNA分子，其在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有外切多聚半乳糖醛酸 酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽，所述重組DNA分子 包含選自以下的DNA序列a)具有或包含SEQ ID NO :3(pgx 1)、SEQ ID NO :5(rgx 1)或 SEQ ID NO :7(xga 1)的 DNA序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)的DNA序列之一雜交的DNA序列；c)與a)的序列具有60%到98%的同一性程度的DNA序列；d)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b)或c)的序列相關(guān)的DNA序列。
20.具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖 酶活性且由權(quán)利要求19的重組DNA分子編碼的多肽。
21.具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖 酶活性且包含選自以下的氨基酸序列的多肽a)包含與多肽SEQID N0:4、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :8的序列具有至少60%同一 性、優(yōu)選至少70%同一性、更優(yōu)選至少80%同一性、還更優(yōu)選至少90%同一性和還更優(yōu)選 至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；b)a)的變體。
22.具有轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的能力的載體，該載體包含至少一個權(quán)利要求16或19之一的重 組DNA分子。
23.權(quán)利要求22的載體，其是以保藏號18450保藏于DSMZ的pALK1958。
24.選自真菌、酵母、細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含至少一個權(quán)利要 求16或19之一的重組DNA分子，且具有表達(dá)具有各自活性的多肽的能力。
25.權(quán)利要求對的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其屬于克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、 裂殖酵母屬、曲霉屬、根霉屬、木霉屬、肉座菌屬、毀絲霉屬、金孢子菌屬、脈孢霉屬、毛霉屬、 青霉屬、酵母屬或鐮孢霉屬的種類。
26.包含權(quán)利要求17、18、20和21之一的一種或多種多肽，任選地以及其他酶和/或賦 形劑的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種或多種果膠分解酶在水果或蔬菜糊狀物的處理中的用途，以及包括加入一種或多種果膠分解酶的步驟的用于水果或蔬菜糊狀物的酶處理的方法，其中至少一種果膠分解酶可從里氏木霉獲得，以及涉及包括用于水果或蔬菜糊狀物的酶處理的方法的用于水果或蔬菜汁的制備的方法。此外，本發(fā)明公開了編碼具有內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽和具有木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽的重組DNA分子。
文檔編號C12N9/24GK102037122SQ200980118745
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者B·塞波斯, C·P·庫比賽克, J·卡里奧, J·維馬恩派拉, K·米羅斯, T·普拉寧, W·泰斯 申請人:Ab酶有限公司