專利名稱：酵母菌株及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酵母菌株，特別是用于發(fā)酵工藝的酵母菌株。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明 所述的酵母菌株單獨或結(jié)合其他菌株進行發(fā)酵的方法。本發(fā)明進一步涉及通過篩選多種代 謝產(chǎn)物以及使用特定營養(yǎng)源來挑選適于發(fā)酵培養(yǎng)物的酵母菌株的方法。本發(fā)明的開發(fā)主要用于葡萄汁的發(fā)酵以及果酒釀制方法，下文會參照本申請進行 說明。然而，本發(fā)明并不限于該特定的使用領域，也可用于其它發(fā)酵工藝。
背景技術：
說明書全文對于現(xiàn)有技術的任何討論，都不應被認為是承認所述現(xiàn)有技術廣為人 知或構成了本領域公知常識的一部分。發(fā)酵是一種工藝，所述工藝中，酵母將水果或蔬菜中的單糖主要代謝為乙醇和二 氧化碳。該工藝與很多食品(如面包、啤酒、果酒、烈酒、表面成熟奶酪和醋)以及生物燃料、 維生素和酶的生產(chǎn)相關。果酒是部分由酵母對葡萄汁進行酒精發(fā)酵制成的產(chǎn)物。發(fā)酵工藝中存在的酵母菌 株將葡萄汁碳水化合物代謝為乙醇和二氧化碳。然而，這些成分對果酒的整體風味影響甚 微。果酒的香氣和風味特征來自于大量化合物，包括揮發(fā)性酸和羰基化合物，作為在發(fā)酵工 藝中由酵母生成的化合物，其中有400種已經(jīng)被鑒定(Nykanen，1986)。發(fā)酵可自發(fā)進行，其中，天然存在的微生物組進行所述發(fā)酵；或者，釀酒商也可人 為地將已知的、可商購的果酒酵母的大量培養(yǎng)物接種到葡萄汁中。用于接種葡萄汁的酵母 1 酉良(Saccharomyces cerevisiae)白勺#禾中胃_。自發(fā)的果酒發(fā)酵的起始階段通常與非釀酒酵母(non-Saccharomyces)的生長相 關，所述酵母顯示出低的發(fā)酵能力，且在低乙醇環(huán)境下生長旺盛。這些酵母包括有孢漢生 酵母(Hanseniaspora)(克勒克酵母屬(Kloeckera))和假絲酵母(Candida)(如星形假 絲酵母(Candida stellata)和鐵紅假絲酵母(Candida pulcherrima)) (Heard 和 Fleet， 1986)以及其它種的酵母。在自發(fā)的情況下，發(fā)酵與多種酵母屬和酵母種的順序相互作用 (sequential interaction)相關(Heard 禾口 Fleet，1988)。非釀酒酵母的酵母對乙醇含量超過5%的環(huán)境的敏感性意味著它們只能在果酒發(fā) 酵最初的2-3天內(nèi)生長，隨后，乙醇耐受的釀酒酵母占據(jù)優(yōu)勢地位。重要地，由于非釀酒酵 母菌株的種群數(shù)量能達到IO6-IO7個細胞/ml，其能顯著影響發(fā)酵(Lema等，1996)。所述影 響包括由于多種揮發(fā)性及非揮發(fā)性產(chǎn)物(如有機酸、高級醇和酯)的生成對果酒的風味和 香氣特征的實質(zhì)性影響(Rapp和Versini，1991 ；Esteve-Zarzoso等，1998)。這些“風味化 合物”的性質(zhì)和濃度由發(fā)酵中存在的酵母屬和酵母種決定(Houtman等，1980 ；Lambrechts 和Pretorius，2000 ；Brandolini等，2002 ；Ramano等，200 ?？疾旆轻劸平湍阜N對果酒風味 和香氣影響的工作日益增多^steve-Zarzoso等，1998)。其中一些工作顯示混合種的發(fā)酵 物(ferment)能夠出乎意料地產(chǎn)生高水平的某些風味-活性化合物，如酯類(Garde-Cerdan ^P Ancin-Azpilicueta, 2006 ；Ro jas 等，2003)和 2，3-丁二醇(Clemente-Jiminez 等，2004)寸。揮發(fā)性硫醇是果酒中發(fā)現(xiàn)的一個風味化合物家族(Gachons等，2000)，其包括 4-巰基-4-甲基-2-戊酮GMMP)、4_巰基-4-甲基-2-戊醇(4MMP0H)、3_巰基-1-己醇 (3MH)和3-巰基己基乙酸酯(3MHA)。其中一些硫醇，如3MH和3MHA，具有獨特的類似葡萄 柚和西番蓮果的香氣和風味(Tominaga等，1998a)。常常發(fā)現(xiàn)3MH和3MHA以高于人類感覺閾限的濃度存在于白蘇維翁(Sauvignon Blanc, SB)酒中。在SB葡萄汁之中，發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)合半胱氨酸的、非揮發(fā)性的、無風味的3MH 前體，硫-(3-己烯-1-醇)_半胱氨酸，發(fā)酵中，該前體可能被切割而釋放出3MH，3MH隨后 轉(zhuǎn)化為3MHA (Gachons等，2000)。處理所述前體所需的酶被認為是來自于酵母，而轉(zhuǎn)化需要 活性酵母生長(Tominaga等，1998b)。相關的酶可能分別是β _裂解酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的某 種形式。某出版物暗示有多個酵母基因編碼的β-裂解酶(Howell等，200 。然而，兩個 實驗室的科學家，包括本發(fā)明人等無法重復其實驗結(jié)果。迄今為止，我們認為，在酵母釋放 硫醇時起作用的前體、酶或通路方面還沒有強有力的數(shù)據(jù)發(fā)表。Chr Hansen(科-漢森)(丹麥)制造了四種可商購的酵母發(fā)酵劑(yeast starter culture)，所述發(fā)酵劑包括不同酵母種的混合物，稱為Harmony、Symphony、 Iihythm及Melody。所述混合物中的酵母種是釀酒酵母、德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)和耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)。已有報道表明這些 混合物可制造具有改變的風味概況(profile)的果酒，但其并未暗示所述風味概況與硫醇 的存在、混合或濃度相關。目前還沒有研究檢測非釀酒酵母種對果酒中揮發(fā)性硫醇水平的影響或酵母種的 混合物對硫醇產(chǎn)量或果酒風味的影響。我們了解僅有一項檢測釀酒酵母種對果酒中揮發(fā)性 硫醇水平影響的研究。所述研究涉及果酒中釀酒酵母生產(chǎn)的4MMP的測定(Howell等2004)。急需了解發(fā)酵工藝中控制化合物存在及含量的生物工藝。具體地說，對釀酒商而 言，能調(diào)節(jié)果酒中的硫醇含量及種類十分有用。調(diào)節(jié)果酒中的硫醇含量，特別是3MH和3MHA的含量，能夠帶動新工藝的發(fā)展，使得 釀酒商能夠更精確地改變其產(chǎn)品中這些獨特的風味化合物的含量。因此，所述工藝將具有 重大的商業(yè)價值。本發(fā)明的一個目的是克服或改善現(xiàn)有技術的至少一個缺陷，或提供一種有用的備 選方案。

發(fā)明內(nèi)容
已意外地發(fā)現(xiàn)特定酵母菌株具備在發(fā)酵工藝中有用的有利性質(zhì)。具體地說，所述 酵母菌株在發(fā)酵工藝中可與其它酵母聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應，即增加發(fā)酵產(chǎn)物中硫醇的產(chǎn)量。 更具體地說，所述酵母能用于提高果酒中3MH和3MHA的產(chǎn)量。此外，在發(fā)酵工藝中提高硫 醇產(chǎn)量的特定新菌株能利用發(fā)酵中該種的酵母通常無法利用的氮源和碳源，即脯氨酸。本發(fā)明人等意外地發(fā)現(xiàn)，如稱作I3K-KRl及H(-KR2(克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)的兩種新菌株)與可商購的酵母菌株協(xié)同作用，提高了果酒發(fā)酵培養(yǎng)物中揮發(fā) 性硫醇的水平。在發(fā)酵中，酵母可利用的氮含量相對有限，會嚴重影響發(fā)酵進程及酵母生成 的副產(chǎn)物。進一步意外地發(fā)現(xiàn)，特定酵母菌株能夠利用發(fā)酵培養(yǎng)物中商業(yè)化的釀酒酵母制品所無法利用的營養(yǎng)源。舉例來說，相比于釀酒酵母，所述Hi-KRl菌株更傾向于利用L-脯 氨酸作為氮源和碳源。脯氨酸是葡萄汁中最豐富的氨基酸之一，但釀酒酵母卻無法利用。因 此，PK-PRl的使用不僅可以出人意料地改變果酒最終的風味和香氣，還可以減輕發(fā)酵工藝 中H(-KR1與商業(yè)化的釀酒酵母制品對相對有限的營養(yǎng)素(氮)的競爭。如上所述，本發(fā)明涉及酵母菌株、酵母發(fā)酵的發(fā)酵劑及發(fā)酵方法，其使得硫醇產(chǎn)量 的提高及新型營養(yǎng)素的利用成為可能。相應地，就第一方面而言，本發(fā)明提供了一種分離的酵母菌株，該菌株保藏于 澳大利亞國家計量院(National Measurement hstitute)，保藏號為V06/022711或 V06/022712或本文定義的其功能等同物。所述分離株的保藏名稱對于Hi-KRl為JTl. 28， 對于 PK-KR2 為 JT3. 71。就第二方面而言，本發(fā)明提供了一種分離的酵母菌株，所述菌株包括核核糖體內(nèi) 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer (ITS)) 1-5. 8S-ITS2的核苷酸序列，所述核苷 酸序列如序列編號5或序列編號6的任一序列所示。就第三方面而言，本發(fā)明提供了一種分離的酵母菌株，所述菌株包括^S rDNA變 異區(qū)(divergent domain) 1和變異區(qū)2 (D1/D2)的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列編號 7或序列編號8所示。就第四方面而言，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵方法，所述方法包括使用所述第一、第二 或第三方面中的酵母菌株。本發(fā)明的酵母菌株可在發(fā)酵工藝中與一種或多種其它酵母菌株一起使用，以協(xié)同 增加硫醇的產(chǎn)量。就第五方面而言，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵方法，所述方法包括使用第二酵母菌株 以及所述第一、第二或第三方面中的第一酵母菌株，其中，所述方法包括下述步驟將所述 第一酵母菌株和所述第二酵母菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)物中，從而引起由所述方法產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn) 物中硫醇產(chǎn)量的協(xié)同增加。優(yōu)選地，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酒精飲料。更優(yōu)選地，所述酒精飲料是果酒。最優(yōu)選地， 所述果酒是白葡萄酒。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述白葡萄酒由品種為白蘇維翁的 葡萄制成。優(yōu)選地，其中一種酵母菌株為非釀酒酵母菌株。更優(yōu)選地，所述非釀酒酵母菌株 屬于畢赤酵母屬，更優(yōu)選所述非釀酒酵母菌株是克魯維畢赤酵母菌種中的成員。在一個特 別優(yōu)選的實施方式中，所述非釀酒酵母的酵母菌株保藏于澳大利亞國家計量院，保藏號為 V06/022711或V06/022712或其功能等同物。優(yōu)選地，其中一種酵母菌株為釀酒酵母菌株。更優(yōu)選地，所述釀酒酵母菌株選自本 文所述的、通?？傻玫腣L3、VIN 7、X5或“Merit”。本領域技術人員很清楚所述硫醇可以是任意硫醇或任意硫醇的組合。所述硫醇優(yōu) 選為揮發(fā)性的。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述硫醇是3-巰基己基乙酸酯(3MHA)，在另一 個優(yōu)選的實施方式中，所述硫醇是3-巰基-1-己醇(3MH)。本領域技術人員同樣很清楚所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株可以同時或 相繼加入發(fā)酵物中。就第六方面而言，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，所述發(fā)酵劑包括使發(fā)酵產(chǎn)物中的硫醇協(xié)同增加的至少兩種酵母菌株。優(yōu)選地，其中一種酵母菌株是非釀酒酵母菌株。在一個實施方式中，所述非釀酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母濃度的比例超 過10%。優(yōu)選地，存在于發(fā)酵劑中總酵母濃度為2.5X106細胞mr1。在另一個實施方式中， 所述非釀酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過20%。在另一個實施方式中，所 述非釀酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過30%。在另一個實施方式中，所述 非釀酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過40%。在另一個實施方式中，所述非 釀酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過50%。在另一個實施方式中，所述非釀 酒酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過60%。在另一個實施方式中，所述非釀酒 酵母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過70%。在另一個實施方式中，所述非釀酒酵 母菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過80%。在另一個實施方式中，所述非釀酒酵母 菌株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例約為90%。在另一個實施方式中，所述非釀酒酵母菌 株占存在于發(fā)酵劑中總酵母的比例超過90 %。在另一個實施方式中，發(fā)酵劑中存在的總酵母濃度超過2. 5X106細胞ml—1。 優(yōu)選地，所述非釀酒酵母菌株保藏于澳大利亞國家計量院，保藏號為V06/022711或 V06/022712。在一個實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物中協(xié)同增加的硫醇是3MHA，而在另一個可選擇的 實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物中協(xié)同增加的硫醇是3MH。本領域技術人員當然很清楚可以有多于一 種硫醇的協(xié)同增加。就第七方面而言，本發(fā)明提供了一種制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括使用本 發(fā)明的發(fā)酵劑，其中，所述方法包括將所述發(fā)酵劑加入發(fā)酵培養(yǎng)物的步驟。優(yōu)選地，所述發(fā) 酵產(chǎn)物為酒精飲料，最優(yōu)選地，所述酒精飲料是果酒。就第八方面而言，本發(fā)明提供了一種依照本發(fā)明的方法制備的飲料。優(yōu)選地，所述 飲料是酒精飲料，更優(yōu)選地，所述飲料是果酒。最優(yōu)選地，所述果酒是白葡萄酒。在一個特 別優(yōu)選的實施方式中，所述白葡萄酒由品種為白蘇維翁的葡萄制成。同樣出人意料地發(fā)現(xiàn)，新型酵母分離株，例如H(-KR1，能夠利用發(fā)酵培養(yǎng)物中的新 型氮源和碳源。就第九方面而言，本發(fā)明提供了一種包括使用酵母菌株的發(fā)酵方法，其中，所述方 法包括將所述酵母菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步驟，所述酵母菌株在發(fā)酵條件下能從氨基酸 中獲得氮和/或碳。優(yōu)選地，所述氨基酸是脯氨酸。就第十方面而言，本發(fā)明提供了一種包括將脯氨酸加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步驟的發(fā) 酵方法，其中，所述脯氨酸在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中是酵母菌株的氮源和/或碳源。就第十一方面而言，本發(fā)明提供了一種包括使用兩種酵母菌株的發(fā)酵方法，其中， 所述方法包括將所述菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步驟，所述菌株的每一種均能從不同的來源 獲得氮和/或碳。就第十二方面而言，本發(fā)明提供了一種為發(fā)酵培養(yǎng)物挑選酵母的方法，所述方法 包括將酵母菌株加入含有作為其幾乎唯一氮源的脯氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)物中以及從所述培養(yǎng) 物中分離出能從脯氨酸中獲得氮的酵母菌株的步驟。就第十三方面而言，本發(fā)明提供了一種包括使用酵母菌株的發(fā)酵方法，所述方法 包括將所述酵母菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)物的步驟，其中，所述酵母菌株不以葡萄糖或果糖作為其唯一或幾乎唯一的碳源。就第十四方面而言，本發(fā)明提供了一種增強發(fā)酵產(chǎn)物風味的方法，所述方法包括 在發(fā)酵培養(yǎng)物中使用如權利要求1-3中任一項所述的酵母菌株或如權利要求13-20中任一 項所述的酵母發(fā)酵劑，所述方法包括將所述酵母菌株或所述發(fā)酵劑加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步
馬聚ο在本發(fā)明的上下文中，只要是術語“其功能等同物”，均涉及本申請所說明或定義 的酵母菌株的功能等同物，在一個實施方式中，它指的是所述酵母菌株與至少一種其它酵 母菌株相互作用以協(xié)同增加發(fā)酵產(chǎn)物中硫醇含量的能力。在另一個可選實施方式中，術語 “其功能等同物”指的是能利用發(fā)酵培養(yǎng)物中該種的酵母通常無法利用的氮源和碳源的酵 母菌株。在本發(fā)明的上下文中，只要是“協(xié)同增加”，均涉及發(fā)酵產(chǎn)物中硫醇的含量，它指的 是由兩種酵母菌株產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物中硫醇含量的增加，所述硫醇含量大于任一種的酵母菌 株單獨在發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生的硫醇含量的總和。在本發(fā)明的上下文中，術語“發(fā)酵產(chǎn)物”包括發(fā)酵工藝中的任何產(chǎn)物，包括固體、液 體或氣體產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中，只要是術語“菌株”涉及酵母，它指的是種內(nèi)潛在的遺傳性 變體或亞型；例如，從特定地點及時采集的菌種分離株，或確證在核苷酸水平上與同種其他 成員不一致的分離株。在本發(fā)明的上下文中，術語“發(fā)酵”指的是酵母將水果或蔬菜中的單糖主要代謝為 乙醇和二氧化碳的工藝。在本發(fā)明的上下文中，術語“包含”、“包括”等應解釋為其包含的含義，即“包括但 不限于”，而不是其排他的含義。


圖1 JK-KRl的26S核糖體基因的D1/D2區(qū)與模式菌株(type strain)克魯維畢 赤酵母的核苷酸序列同源性比對。上部序列=克魯維畢赤酵母模式菌株(CBS188)，登錄號U75727下部序列=PK-KRl圖2 =PK-KRl的ITS區(qū)與模式菌株克魯維畢赤酵母同一區(qū)域的核苷酸序列同源性 比對。上部序列=克魯維畢赤酵母模式菌株(CBS188)，登錄號DQ104711下部序列=PK-KRl圖3 :PK-KR2的26S核糖體基因的D1/D2區(qū)與模式菌株克魯維畢赤酵母同一區(qū)域 的核苷酸序列同源性比對。上部序列=克魯維畢赤酵母模式菌株(CBS188)，登錄號U75727下部序列=PK_KR2圖4 :PK-KR2的ITS區(qū)與模式菌株克魯維畢赤酵母同一區(qū)域的核苷酸序列同源性 比對。上部序列=克魯維畢赤酵母模式菌株(CBS188)，登錄號DQ104711
下部序列=PK_KR2圖5 顯示含有酵母菌株VL3和I3K-KRl的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MHA 濃度的柱狀圖，所述酵母菌株VL3和I3K-KRl的混合比例為10 90,50 50及90 10。圖6 顯示含有酵母菌株VL3和H(-KR2的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MHA 濃度的柱狀圖，所述酵母菌株VL3和H(-KR2的混合比例為10 90,50 50及90 10。圖7 顯示含有酵母菌株VL3和I3K-KRl的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MH 濃度的柱狀圖，所述酵母菌株VL3和I3K-KRl的混合比例為10 90,50 50及90 10。圖8 顯示含有酵母菌株VL3和H(-KR2的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MH 濃度的柱狀圖，所述酵母菌株VL3和H(-KR2的混合比例為10 90,50 50及90 10。圖9:綜合圖3及圖4中的數(shù)據(jù)，顯示含有酵母菌株VL3、PK-KRl及I^-KR2 的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MHA濃度的柱狀圖，組合如下VL3 PK-KRU VL3 PK-KR2，組合比例為 10 90,50 50 及 90 10。圖10 綜合圖5及圖6中的數(shù)據(jù)，顯示含有酵母菌株VL3 JK-KRl及H(-KR2的單一 發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中產(chǎn)生的3MH濃度的柱狀圖，組合如下VL3 PK-KRUVL3 PK-KR2, 組合比例為10 90,50 50及90 10。圖11 顯示H(-KR1及VL3的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中3MHA濃度(采用氘代標 準)的柱狀圖。圖12 顯示I3K-KRl及VL3的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物中3MH濃度(采用氘代標 準)的柱狀圖。圖13a 顯示PK-KR1與多種商業(yè)化的果酒菌株VL3、EC1118、VIN7、X5、QA23及SVG 的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物(發(fā)酵溫度14°C )中產(chǎn)生的3MHA濃度的柱狀圖。在14°C下，一組商業(yè)化的果酒酵母的單一發(fā)酵物以及它們與I3K-KRl的共同發(fā)酵 物產(chǎn)生的3MHA(a)和3MH(b)的含量(平均值士平均值的標準誤差；η = 3)。所有共同發(fā) 酵物均在釀酒酵母Hi-KRl為10 90時起始。相比于VL3、VIN7及)(5的單一發(fā)酵物各 自的3ΜΗΑ水平，PK-KRl與VL3、VIN7及)(5的共同發(fā)酵物中3MHA的水平均有顯著性提高(P < 0. 01)。圖13b 顯示PK-KRl與多種商業(yè)化的果酒菌株VL3、EC1118、VIN7、X5、QA23及SVG 的單一發(fā)酵物和混合發(fā)酵物(發(fā)酵溫度14°C )中產(chǎn)生的3MH濃度的柱狀圖。圖14 顯示在5升的體積中，I3K-KRl、PK-KR2和VIN7的混合發(fā)酵物(發(fā)酵溫度 14°C )中產(chǎn)生的3MHA及3MH濃度的柱狀圖。3MHA及3MH的水平以ng Γ1表示；未用相同 字母表示的水平在t-檢驗下具有顯著性差異(P > 0. 05)。在5升的混合發(fā)酵物實驗中，3MHA及3MH的水平以ng Γ1表示；未用相同字母表 示的水平在t-檢驗下具有顯著性差異(P > 0. 05)。圖15 通過白蘇維翁葡萄汁中VL3及I3K-KRl的單一發(fā)酵物和共同發(fā)酵物的菌落 形成單位估定的細胞數(shù)。通過在14°C的條件下，VL3及I3K-KRl的單一發(fā)酵物(分別為實心三角和實心圓) 和共同發(fā)酵物(分別為空心三角和空心圓)的菌落形成單位估定的細胞數(shù)。所述共同發(fā)酵 物以VL3 PK-KRl = 10 90的比例接種。平均值士平均值的標準誤差；η = 6。圖16:單一發(fā)酵和混合發(fā)酵期間營養(yǎng)素的利用，單一發(fā)酵和混合發(fā)酵期間，
9I3K-KRl及VL3對(a)酵母可用氮(YAN)的利用；以及(b)葡萄糖和果糖的利用。a)在14°C的條件下，VL3單一發(fā)酵(實心三角)和共同發(fā)酵(空心三角)及Hi-KRl 單一發(fā)酵(實心圓)期間，酵母可用氮(YAN)含量的變化。所述共同發(fā)酵在VL3 PK-KRl 為10 90時起始。對照未接種的無菌葡萄汁(空心方塊)。平均值士平均值的標準誤 差；η = 3。b)在14°C的條件下，VL3單一發(fā)酵(實心三角)和共同發(fā)酵(空心三角)及Hi-KRl 單一發(fā)酵(實心圓)期間，葡萄糖和果糖總量的變化。所述共同發(fā)酵在VL3 H(-KR1為 10 90時起始。對照未接種的無菌葡萄汁(空心方塊)。平均值士平均值的標準誤差； η = 3。圖17 發(fā)酵條件下，PK-KRl及VL3在含有脯氨酸作為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長。14°C時，在發(fā)酵條件下，VL3(三角)及I3K-KRl (圓)在合成酵母氮源培養(yǎng)基中的 生長，所述培養(yǎng)基中，脯氨酸是唯一的氮源。平均值士平均值的標準誤差；η = 6。圖18 經(jīng)碳和氮饑餓后，在發(fā)酵條件下，PK-KRl在含有脯氨酸作為唯一氮源的培 養(yǎng)基中的生長。PK-KRl (經(jīng)碳和氮饑餓)在單獨的YNB (即無碳源及氮源補給)和加入有脯氨酸的 相同培養(yǎng)基中的生長。
具體實施例方式本發(fā)明涉及酵母菌株，特別是用于發(fā)酵工藝的酵母菌株。本發(fā)明還涉及酵母菌株I3K-KRl和H(-KR2，所述菌株保藏名稱分別為JTl.觀和JT 3. 71，保藏于澳大利亞國家計量院(克拉爾克大街51-65，南墨爾本，VIC 3205)，保藏號分 別為 V06/022711 和 V06/022712。例如，產(chǎn)于新西蘭南島馬爾堡區(qū)的白蘇維翁酒具有非常獨特的風味概況。這一獨 特的風格使得該果酒在國際果酒市場上占據(jù)重要的地位。相應地，與加強這些果酒的香氣 和/或風味相關的酵母也極具商業(yè)價值。本發(fā)明還涉及用酵母菌株單獨或結(jié)合其他菌株進行發(fā)酵的方法。本發(fā)明進一步涉及篩選和分離適于發(fā)酵培養(yǎng)物的酵母菌株、特別是加強果酒的一 種或多種特征(如風味和/或香氣)的酵母的方法。優(yōu)選地，所述篩選方法包括在一種或多種發(fā)酵培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中接種一種或多種 酵母菌株。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物或培養(yǎng)基含有幾乎單一的預先選定的碳源和/或氮源。優(yōu)選 地，所述碳源和/或氮源為脯氨酸。所述方法進一步包括在適合酵母生長的溫度下，孵育所 述經(jīng)接種的發(fā)酵物或培養(yǎng)物，并在一段時間內(nèi)監(jiān)測酵母的生長。所述方法進一步包括鑒定 和分離一種或多種能利用幾乎單一的預先選定的碳源和/或氮源作為營養(yǎng)源的酵母菌株。通常情況下，對酵母而言，葡萄汁中的氮是有限的必需資源，較低的氮水平會減緩 酵母生長及發(fā)酵，很可能導致發(fā)酵出現(xiàn)問題(如發(fā)酵停滯)(Ribereau-Gayon等2006)。對 于存在于葡萄汁中的氮源，酵母首先利用的是氨，然后是氨基酸。脯氨酸通常是葡萄汁中最 豐富的氨基酸之一(Ougt^PMashak 1974 ；Spayd和 Andersen-Bagge 1996)。然而，釀酒酵 母在厭氧條件下無法利用脯氨酸(處于釀酒酵母降解通路的PutI酶需要02，Ingledew等 1987)。在這點上，釀酒酵母在發(fā)酵中無法利用重要的氮源，如果酵母可以通過某些方式利用脯氨酸作為氮源和/或碳源，就能夠減少發(fā)酵中產(chǎn)生的問題，如釀酒商便無需人為添加 氮源。此外，從非釀酒酵母共同發(fā)酵的角度看，不會直接競爭有限的氮源(例如，通過利用 脯氨酸)共同發(fā)酵的酵母在商業(yè)應用中是十分理想的，因為這不僅減少了與釀酒酵母的競 爭，同時也釋放出隱藏于脯氨酸中的氮以供釀酒酵母隨后利用。相應地，本發(fā)明進一步涉及能利用發(fā)酵培養(yǎng)物中的新型氮源和/或碳源的酵母菌 株。本發(fā)明進一步由以下非限制性的實施例進行說明。實施例實施例1酵母分離稱為H(-KR1和H(-KR2的兩種酵母菌株是按照以下記載從奧克蘭西區(qū)的庫妙河果 酒公司(Kumeu River Wines)的Mate葡萄園得到的2005霞多麗(Chardonnay)葡萄汁的 天然發(fā)酵物中分離而得。圖1-圖16顯示了用所述菌株所做實驗的實驗數(shù)據(jù)，并在以下詳 細說明。在發(fā)酵工藝的不同時期采集葡萄汁樣品，并將其接種至經(jīng)酸化的麥芽培養(yǎng)基以挑 選酵母和抗細菌(Johnson等，2004)。采用本領域眾所周知的方案，用Chelex-100螯合 樹脂從分離的酵母樣菌落中提取DNA(Walsh等1991)。采用本領域眾所周知的方法，用聚 合酶鏈式反應，使用對真菌特異的引物擴增每種菌株的核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer (ITS)) 1,5. 8S、ITS2 及 ^S 變異區(qū) 1 和變異區(qū) 2(D1/D2) (White 等， 1990，Kurtzman和Robnett 1998))。本領域技術人員應當了解通常對所述酵母基因組的 這些區(qū)域進行分析以在種的水平上鑒定生物(Leaw等2006 ；White等，1990 ；Kurtzman和 Robnett 1998)。具體地，用序列編號1和序列編號2表示的引物擴增核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)(internal transcribed spacer (ITS)) 1、5. 8S 及 ITS2，用序列編號 3 和序列編號 4 表示 的引物擴增26S變異區(qū)1和變異區(qū)2(D1/D2)。用本領域中眾所周知的方法對所得DNA產(chǎn)物 的兩條鏈都進行測序。酵母I3K-KRl和H(-KR2的ITS1-5. 8S-ITS2的DNA序列分別表示為 序列編號5和序列編號6。酵母I3K-KRl和H(-KR2的^S D1/D2的DNA序列分別表示為序 列編號7和序列編號8。用標準BLAST搜索工具(可在http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/blast/上獲得)對 來自所述菌株的ITS1-5. 8S-ITS2DNA*^S D1/D2序列進行分析(依照Kurtzman & Fell， (2006) )0相關的序列同源性比對分析如圖1-4所示。如下所述，分析表明分離的酵母是克 魯維畢赤酵母的新型菌株。PK-KRlPK-KRl ITS 區(qū)的比對顯示出與 DQ674358(發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)) 和DQ104711 (克魯維畢赤酵母)具有99%的同一性PK-KRl 26S區(qū)的比對顯示出與EF564382. 1 (克魯維畢赤酵母)具有100%的同一 性上述指出的I3K-KRl序列也與克魯維畢赤酵母U75727和DQ104711的相應序列進 行了比對。比對結(jié)果分別如圖1和圖2所示。PK-KR2PK-KR2 ITS區(qū)的比對顯示出與AY027508. 1/DQ104711. 1 (發(fā)酵畢赤酵母/克魯維畢赤酵母)具有98%的同一性PK-KR2 26S區(qū)的比對顯示出與AJ746339. 1(克魯維畢赤酵母)具有99%的同一 性上述指出的H(-KR2序列也與克魯維畢赤酵母U75727和DQ104711的相應序列進 行了比對。比對結(jié)果如圖3和圖4所示。結(jié)論JK-KRl和H(-KR2是兩種不同的新型克魯維畢赤酵母菌株。鑒定物最優(yōu)匹配種PK-KRl克魯維畢赤酵母PK-KR2克魯維畢赤酵母實施例2分離的酵母在單一培養(yǎng)物和混合培養(yǎng)物中的微發(fā)酵用實施例1中制備的酵母分離株及Zymaflore VL3 (Laffort)酵母菌株進行發(fā)酵。 VL3是一種可商購的釀酒酵母菌株，在波爾多(Bordeaux)分離得到并出售專門用于果酒發(fā)酵。用200mL無菌2005白蘇維翁葡萄汁(產(chǎn)自馬爾堡的拉保拉(Rapaura))進行發(fā) 酵。首先用DMDC(焦碳酸二甲酯，C4H6O5, MW :134. OggmoF1, CAS :4525-33-1)對葡萄汁進行 滅菌。如下表1所示，用單一菌株及多種成對比例的菌株進行發(fā)酵。對葡萄汁進行接種 前，在標準酵母實驗室培養(yǎng)基中于對各酵母種進行4 的培養(yǎng)。與果酒產(chǎn)業(yè)協(xié)定一致， 以2. 5X IO6酵母細胞mL—1的起始濃度對葡萄汁進行接種。所記載的接種以百分比表示，即 100%對應于2. 5X IO6酵母細胞mL—1。研究了兩組獨立的發(fā)酵物，設計第一組發(fā)酵物用于研究混合種發(fā)酵物對硫醇濃度 的影響。上述發(fā)酵物中使用的酵母比例總結(jié)于表1中。表1 混合發(fā)酵物酵母接種比例(相對于2. 5X IO6細胞πιΓ1的百分比)
權利要求
1.一種分離的酵母菌株，所述菌株保藏于澳大利亞國家計量院，保藏號為V06/022711 或V06/022712或是本文定義的其功能等同物。
2.一種分離的酵母菌株，所述菌株包括核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS) 1-5. 8S-ITS2的 核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列編號5或序列編號6所示。
3.一種分離的酵母菌株，所述菌株包括26S核糖體DNA變異區(qū)1和變異區(qū)2 (D1/D2)的 核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列編號7或序列編號8所示。
4.一種使用權利要求1-3中任一項所述的酵母的發(fā)酵方法。
5.一種包括使用第二酵母菌株和權利要求1-3中任一項所述的第一酵母菌株的發(fā)酵 方法，所述方法包括下述步驟將所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)物 中，從而引起由所述方法產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物中硫醇產(chǎn)量的協(xié)同增加。
6.如權利要求5所述的發(fā)酵方法，其中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酒精飲料。
7.如權利要求6所述的發(fā)酵方法，其中，所述酒精飲料是果酒。
8.如權利要求7所述的發(fā)酵方法，其中，所述果酒是白葡萄酒。
9.如權利要求8所述的發(fā)酵方法，其中，所述白葡萄酒是白蘇維翁酒。
10.如權利要求5-9中任一項所述的發(fā)酵方法，其中，所述硫醇是3-巰基己基乙酸酯 (3MHA)。
11.如權利要求5-9中任一項所述的發(fā)酵方法，其中，所述硫醇是3-巰基-1-己醇 (3MH)。
12.如權利要求5所述的發(fā)酵方法，其中，所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株可以 同時加入發(fā)酵物中。
13.一種發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，所述發(fā)酵劑包括使發(fā)酵產(chǎn)物中的硫醇協(xié)同增加的至少兩種 酵母菌株。
14.如權利要求13所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，一種酵母菌株是非釀酒酵母菌株。
15.如權利要求14所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述非釀酒酵母菌株占存在于所述 發(fā)酵劑中總酵母的比例超過10%。
16.如權利要求15所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述非釀酒酵母菌株占存在于所述 發(fā)酵劑中總酵母的比例超過50%。
17.如權利要求16所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述非釀酒酵母菌株占存在于所述 發(fā)酵劑中總酵母的比例約為90%。
18.如權利要求14-17中任一項所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述非釀酒酵母菌株保 藏于澳大利亞國家計量院，保藏號為V06/022711或V06/022712或其功能等同物。
19.如權利要求13-18中任一項所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述硫醇的協(xié)同增加是 3-巰基己基乙酸酯(3MHA)的協(xié)同增加。
20.如權利要求13-18中任一項所述的發(fā)酵酵母發(fā)酵劑，其中，所述硫醇的協(xié)同增加是 3-巰基-1-己醇(3MH)的協(xié)同增加。
21.一種制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括使用權利要求13-21中任一項所述的發(fā) 酵劑，其中，所述方法包括將所述發(fā)酵劑加入發(fā)酵培養(yǎng)物的步驟。
22.如權利要求4-12中任一項所述的發(fā)酵方法制備的飲料。
23.如權利要求22所述的飲料，其中，所述飲料是酒精飲料。
24.如權利要求23所述的飲料，其中，所述飲料是果酒。
25.如權利要求M所述的飲料，其中，所述果酒是白葡萄酒。
26.如權利要求25所述的飲料，其中，所述白葡萄酒由品種為白蘇維翁的葡萄制成。
27.如權利要求5所述的發(fā)酵方法，其中，所述第二酵母菌株是釀酒酵母菌株。
28.如權利要求27所述的發(fā)酵方法，其中，所述釀酒酵母菌株是VL3、VIN7、)(5或 MERIT。
29.—種包括使用酵母菌株的發(fā)酵方法，其中，所述方法包括將所述酵母菌株加入發(fā)酵 培養(yǎng)物中的步驟，所述酵母菌株在發(fā)酵條件下能從氨基酸獲得氮和/或碳。
30.如權利要求四所述的方法，其中，所述氨基酸是脯氨酸。
31.一種包括將脯氨酸加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步驟的發(fā)酵方法，其中，所述脯氨酸在所述 發(fā)酵培養(yǎng)物中是酵母菌株的氮源和/或碳源。
32.—種包括使用兩種酵母菌株的發(fā)酵方法，其中，所述方法包括將所述菌株加入發(fā)酵 培養(yǎng)物中的步驟，所述菌株的每一種均能從不同的來源獲得氮和/或碳。
33.一種為發(fā)酵培養(yǎng)物挑選酵母的方法，所述方法包括將酵母菌株加入含有作為其幾 乎唯一氮源的脯氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)物中以及從所述培養(yǎng)物中分離出能從脯氨酸中獲得氮的 酵母菌株的步驟。
34.一種包括使用酵母菌株的發(fā)酵方法，所述方法包括將所述酵母菌株加入發(fā)酵培養(yǎng) 物的步驟，其中，所述酵母菌株不以葡萄糖或果糖作為其唯一或幾乎唯一的碳源。
35.一種增強發(fā)酵產(chǎn)物風味的方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中使用權利要求1-3 中任一項所述的酵母菌株或權利要求13-20中任一項所述的酵母發(fā)酵劑，所述方法包括將 所述酵母菌株或所述發(fā)酵劑加入發(fā)酵培養(yǎng)物中的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及酵母菌株，特別是用于發(fā)酵工藝的酵母菌株。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明所述酵母菌株單獨或結(jié)合其他菌株進行發(fā)酵的方法。本發(fā)明進一步涉及通過篩選多種代謝產(chǎn)物以及使用特定營養(yǎng)源來挑選適于發(fā)酵培養(yǎng)物的酵母菌株的方法。
文檔編號C12R1/84GK102083958SQ200980116345
公開日2011年6月1日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權日2008年3月7日
發(fā)明者尼克爾·安凡吉, 理查德·克萊格·加德納, 馬修·羅伯特·戈達德 申請人:奧克蘭聯(lián)合服務有限公司