專利名稱：植物降解材料的合成和應(yīng)用的制作方法
植物降解材料的合成和應(yīng)用
背景技術(shù)：
用于合成纖維素乙醇的生物質(zhì)，其組成和多樣性取決于高濃度下多酶體系所釋 放出的用于制備纖維素乙醇的糖。目前所有用于合成纖維素乙醇的酶均通過價(jià)格昂貴的 發(fā)酵系統(tǒng)制得，并采用與胰島素等生物制藥類似的工藝進(jìn)行純化。因此，用于生產(chǎn)乙醇 的試劑級酶價(jià)格極其昂貴。如目前Sigma產(chǎn)品目錄上Novozyme公司銷售的0 -葡萄糖 苷酶、果膠酶和纖維素酶，其價(jià)格分別為12.4萬美元/kg、41.2萬美元/kg和4.049萬美 元/kg。在未標(biāo)注酶成分的情況下，上述酶被添加到生物煉廠的配方中。因此，大批量 銷售的酶的真實(shí)價(jià)格難以估算。酶生產(chǎn)纖維素乙醇的成本預(yù)計(jì)為2 3美元/加侖，這 導(dǎo)致大規(guī)模應(yīng)用的成本顯著提高。除此之外，目前發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)能仍較為有限。隨著對 酶需求量的不斷增加及有限產(chǎn)能之間的矛盾日益突出，酶的價(jià)格有望進(jìn)一步提高。制約生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇發(fā)展的主要原因在于生產(chǎn)成本過高，而水解過程又需大 量酶的參與。目前Sigma目錄上Novozyme公司銷售的或其他公司生產(chǎn)的0 -葡萄糖苷 酶、果膠酶和纖維素酶，其價(jià)格分別為12.4萬美元/kg、41.2萬美元/kg和4.049萬美元 /kg。因此，美國能源部早就指出酶的價(jià)格及相對于絕大多數(shù)木質(zhì)纖維素原料而言較高的 負(fù)荷水平是纖維素乙醇生產(chǎn)的主要障礙。目前，所有市售酶均采用發(fā)酵工藝制備，但發(fā) 酵工藝的裝置建造和維護(hù)費(fèi)用高昂，通常需5 9億美元的預(yù)投資。而取代生產(chǎn)成本高 昂的發(fā)酵工藝的批量生產(chǎn)工藝尚未出現(xiàn)。本發(fā)明即闡述了這一領(lǐng)域的市場空白。


圖1 (a)為葉綠體16S trnl/trnA片段圖示。轉(zhuǎn)基因被植入煙葉葉綠體基因組的 tml/tmA間區(qū)。(b)葉綠體轉(zhuǎn)化載體圖示。感興趣的基因(GOI)為celD、celO、pelA、 pelB、pelD、角質(zhì)酶、lipY、egll、egl、swol、xyn2、axel 或 bgll。Prrn、rRNA 啟云力 子促進(jìn)劑；aadA、氨基糖苷_3’ _腺苷酰(基)轉(zhuǎn)移酶基因抵抗奇霉素；5' UTR、促 進(jìn)劑和psbA基因的5 ‘未翻譯區(qū)；3 ‘ UTR、psbA基因的3 ‘未翻譯區(qū)。(c)經(jīng)由pelB 印跡法所進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因整合和同型異源性評估。(d)pelD和(e)celD葉綠體轉(zhuǎn)基因線與側(cè) 序列探針雜交(1未轉(zhuǎn)化；2 4葉綠體轉(zhuǎn)基因線)。(f)未轉(zhuǎn)化的顯型(UT)和在溫室生 長的葉綠體轉(zhuǎn)基因線均顯示正常生長。圖2蛋白質(zhì)印跡分析和葉綠體轉(zhuǎn)基因線定量分析。葉綠體轉(zhuǎn)基因線的蛋白質(zhì)印 跡表達(dá)為(a) PelB或(b) PelD。UT 未轉(zhuǎn)化成熟葉片在10AM，2PM, 6PM和10PM進(jìn) 行采摘；5ng、10ng和25ng: PelA純化的蛋白質(zhì)，未成熟、成熟和舊葉片。(c)PelB和 PelD(c)或CelD的酶單元(d)不同年份或采摘時(shí)間下的葉片，其質(zhì)量為lg或100mg。圖 3 基材、pH、溫度和輔因子對 cpPelB、rPelB、cpPelD、rPelD、rCelD 和 cpCelD酶活性的影響。(a)PGA濃度增長對果膠酸裂解酶活性的影響。(b)無CaCl2存 在下，pH對果膠酸裂解酶活性的影響以及(c)CaCl2#在下，pH對果膠酸裂解酶活性的影 響。所用緩沖溶液如下50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 6-7)，Tris緩沖液(pH 8)，甘氨酸 /NaOH緩沖溶液(pH 9)以及CAPS緩沖溶液(pH 10.0)，含有從植物和腸埃希氏菌所獲得的含有4 ii g TSP的PelB和PelD。以2.5mg/ml PGA為基材，在40°C下對最佳pH進(jìn)行 測定。(d)無CaCl2存在下，pH = 8.0時(shí)溫度(30-70°C )對酶活性的影響和(e)CaCl2存 在下，pH = 8.0時(shí)溫度(30-70°C )對酶活性的影響。(f)為cpCelD和rCelD活性在60°C CMC (2 % )情況下進(jìn)行30分鐘的pH值最優(yōu)化。依據(jù)最大活性，cpCelD和rCelD的相 對活性(％ )分別為 25 u g/ml 和 10 u g/m。 (g)在 pH = 6.0，CMC (2% )下進(jìn)行 30min 研究溫度升高對cpCelD和rCelD相對活性的影響。依據(jù)最大活性，cpCelD和rCelD的 相對活性(％ )分別為25 u g/ml和10 u g/m。 (h)長期酶水解中通過，分別采用lOmM CaCl2和20 u g/ml BSA或上述兩種溶液或50mM醋酸鈉的混合溶液對cpCelD (25 u g TSP/ ml反應(yīng))活性提高進(jìn)行研究。上述水解在CMC (2% )存在下于60°C，pH = 6.0的條件 下反應(yīng)36小時(shí)。圖4含不同蛋白質(zhì)濃度的粗提取物中腸埃希氏菌VS葉綠體衍生酶。(a)采用 羧甲基纖維素(2% )為基材時(shí)的cpCelD和rCelD的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。反應(yīng)混合物中含 有10mM CaCl2和50mM醋酸鈉緩沖溶液，且cpCelD和rCelD TSP ( U g/ml)濃度不斷增 加，pH = 6.0。酶水解反應(yīng)在60°C下進(jìn)行30分鐘。插圖為cpCelD TSP含量(P g/ml) vs CMC(2% )時(shí)的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)飽和點(diǎn)。插圖中裝有反應(yīng)混合物的離心管為1未轉(zhuǎn)化 植物，2和3 rCelD和cpCelD 10 ug TSP。 (b)以5.0mg/ml多聚半乳糖醛酸鈉為基材， cpPelB、cpPelD、rPelB和rPelD對水解反應(yīng)的影響。反應(yīng)混合物溶于20mM Tris_HCl緩 沖溶液(pH = 8.0)，且 cpPelB、cpPelD、rPelB 和 rPelD (u g/ml)的濃度不斷增加。依 據(jù)D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜采用DNS方法測定多聚半乳糖醛酸鈉(Sigma)。酶水解反應(yīng) 在40°C下，以150rpm的震蕩速度反應(yīng)2小時(shí)。圖5濾紙、深加工木及桔皮所用的多酶混合物。(a)pH = 5.5，50°C下， 采用Whatman公司1號濾紙條(50mg/ml測定法)測定濾紙活性。多酶混合物中含 有 rEgl (100 y g/ml)、rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 u g/ml) > rCelO (100 u g/ml)和 cpCelD (100 u g/ml)的粗提取物。樣品在 10mM CaCl2 禾口 20 ii g BSA 中，以 150rpm 的震蕩速度培養(yǎng)24小時(shí)。(b)深加工木樣品(200mg/5ml反應(yīng))的水解反應(yīng)采用 含有 cpPelB(250iig/ml)、cpPelD (250 u g/ml) (pH = 8.0), cpCelD (200 u g/ml) > cpXyn2 (200 ii g/ml)、rEgl (100 y g/ml)、rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 u g/ml) > rCelO (100 u g/ml)、rAxel (100 u g/ml)、rPelA(200 u g/ml)、rCutinase (50 u g/ml)、 rLipY(100 u g/ml)粗提取物的多酶混合物。含有10mM CaCl2和20 u g/ml BSA的反應(yīng) 混合物以150rpm的震蕩速度反應(yīng)36小時(shí)；pH(5.5-8.0)和反應(yīng)溫度(40°C -50°C )依據(jù) 最佳條件進(jìn)行調(diào)整。反應(yīng)所釋放出的等當(dāng)量葡萄糖的終點(diǎn)采用DNS方法進(jìn)行測定。(c) 瓦倫西亞桔皮水解(200mg/5ml 反應(yīng))在含有 cpPelB (250 u g/ml)、pPelD (250 u g/ml)、 cpCelD (100 u g/ml)禾口 cpXyn2 (100 ii g/ml)、rEgl (100 u g/ml) > rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 ii g/ml)、rCelO (100 u g/ml)禾 P cpCelD (100 u g/ml) > rAxe2 (100 u g/ml) > rCutinase (50 u g/ml)、rLipY (100 u g/ml)和 rPelA (200 u g/ml)粗提取物的多酶混合物 中進(jìn)行。還原糖的終產(chǎn)物采用DNS法進(jìn)行分析31，D-葡萄糖和D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn) 物。加入100y g/ml氨芐青霉素和卡那霉素以避免水解過程中的微生物生長。樣品在 10mMCaCl2和20 u g/ml BSA中，以150rpm的震蕩速度培養(yǎng)24小時(shí)；pH (5.5-8.0)和反 應(yīng)溫度(40°C -50°C )依據(jù)最佳條件進(jìn)行調(diào)整。所有實(shí)驗(yàn)中對不含酶的基材或無基材的酶進(jìn)行控制。所有實(shí)驗(yàn)和分析均平行進(jìn)行三次。圖6市售葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草的生成(A)CelD LAMD芽根部(B)溫室中培養(yǎng)的 CelD LAMD葉綠體轉(zhuǎn)基因植物(C)正常開花的CelD LAMD葉綠體轉(zhuǎn)基因植物(D)CelD TN90 首次轉(zhuǎn)化株(E)CelD TN90 的第二次再生株(F) PelBTN90 (G-I)根部，PelB LAMD 的第一、第二和第三再生株(J)PelD LAMD芽根部(K)溫室培養(yǎng)的PelD LAMD葉綠體轉(zhuǎn) 基因植物(L)正常開花的PelD LAMD葉綠體轉(zhuǎn)基因植物(M)實(shí)施例1中LAMD芽根部 (N)實(shí)施例1中LAMD盆栽葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。圖7采用煙草側(cè)探針DNA雜交技術(shù)對同型異源性進(jìn)行驗(yàn)證(A) CelDLAMD (B) PelB LAMD (C) PelB TN90 (D) PelD LAMD 和(E)實(shí)施例 1 的 LAMD (UT 未轉(zhuǎn)化植物；
數(shù)字葉綠體轉(zhuǎn)基因線和B:空白)。圖8哈瓦那雪茄、TN90和LAMD煙草中果膠裂解酶B和D的酶活性(A) PelB(B)PelD注用于分析TN90和LAMD煙草酶活性的葉片采摘自體外植物，而哈瓦那 雪茄所用的葉片采摘自溫室。由于轉(zhuǎn)基因由psbA通過光線和發(fā)育調(diào)控元件進(jìn)行控制，當(dāng) 轉(zhuǎn)入溫室后，市售品種的表達(dá)水平較高。圖9為一些植物降解復(fù)合基因的序列信息。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)難題，本發(fā)明所述實(shí)施例從植物或細(xì)菌或植物和細(xì)菌中制備出所 需酶，大幅度降低了發(fā)酵和純化成本。在一個(gè)具體實(shí)施例中闡述了制備降解生物質(zhì)樣 品，進(jìn)而生成可發(fā)酵性糖的方法。上述方法包括制備含有至少兩種細(xì)胞提取物的植物降 解多酶混合物，每種細(xì)胞提取物均含有活性植物降解化合物，并在獲得上述細(xì)胞提取物 的細(xì)胞中重組表達(dá)。上述至少兩種細(xì)胞提取物為植物提取物或細(xì)菌提取物，或植物和細(xì) 菌提取物。植物降解多酶混合物與生物質(zhì)樣品進(jìn)行混合生成可發(fā)酵性糖。在一個(gè)更為具 體的實(shí)施例中，含有細(xì)胞提取物的植物降解多酶混合物為植物降解酶，如纖維素酶、木 質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸 裂解酶、脂肪酶、面包酶、果膠酶或有助于進(jìn)入上述酶的化合物，或稱輔助植物降解化 合物，包括但并不限于角質(zhì)酶或擴(kuò)展蛋白(如里氏木酶)。本發(fā)明作者發(fā)現(xiàn)輔助植物降解 化合物可輔助植物降解酶，進(jìn)而增加生物質(zhì)樣品中可發(fā)酵性糖的產(chǎn)量。絕大部分植物細(xì)胞提取物含有一定量的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (加氧酶)，而上述加氧酶來源于獲得植物細(xì)胞提取物的細(xì)胞。加氧酶是地球上最常 見的酶，約占葉綠體中可溶蛋白質(zhì)的30 50%，可固二氧化碳，但加氧酶的活性嚴(yán)重 抑制光和作用及作物產(chǎn)量(Ogren，W.L. (2003)Photosynth.Res.76, 53-63，2.Spreitzer， R.J.& Salvucci，M.E. (2002) Annu.Rev.Plant Biol.53, 449-475)。加氧酶含有 8 個(gè)較大的 亞單元(LSUs)和8個(gè)較小的亞單元(SSUs)。SSU從胞液中輸入，在合并為功能性全 酶前，兩種亞單元進(jìn)行幾次轉(zhuǎn)譯后修飾(Houtz，R.L.& Portis, A.R. (2003) Arch.Biochem. Biophys.414, 150-158)。由于表達(dá)蛋白質(zhì)嚴(yán)重影響植物壽命和生長，因此植物基因轉(zhuǎn)化通常不被視為對 生成植物降解酶的傳統(tǒng)發(fā)酵過程的可行性取代。本發(fā)明作者設(shè)計(jì)了一種合成不影響植 物細(xì)胞表達(dá)的植物降解酶的方法。本發(fā)明首次證實(shí)了植物中可行性植物降解酶的表達(dá)。本發(fā)明作者同時(shí)認(rèn)為在不影響植物的前提下，許多生物降解酶的表達(dá)均可在葉綠體中實(shí) 現(xiàn)。葉綠體的存在可使植物細(xì)胞免于酶的破壞。盡管此處只列舉了葉綠體中的表達(dá)，除 非特別說明，否則本發(fā)明實(shí)施例并不僅限于植物降解酶的葉綠體表達(dá)。某些實(shí)施例采用 了可重組表達(dá)植物降解化合物的植物和細(xì)菌提取物。此處所用的“重組表達(dá)”是指從與細(xì)胞異源的多核苷酸合成多肽，且上述多核 苷酸在上述細(xì)胞中轉(zhuǎn)染。重組表達(dá)可能來源于可在細(xì)胞基因組中或細(xì)胞器基因組或僅通 過轉(zhuǎn)染而存在于細(xì)胞之中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的異源多核苷酸。廣義的葉綠體包括所有質(zhì)體，包含元質(zhì)體、黃化質(zhì)體、成熟葉綠體和有色體。完整的纖維素酶體系包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡萄糖苷酶。 內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶協(xié)同作用將纖維素降解為纖維二糖，纖維二糖隨后加 氫，在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。纖維二糖酶或葡萄糖苷酶的活性決定纖 維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的反應(yīng)，且通過減輕對終產(chǎn)物的抑制(纖維二糖)在纖維素降解過程 中起重要作用。絕大部分這些來源于不同微生物體的酶的基因序列列于公共數(shù)據(jù)庫中。果膠或果膠質(zhì)是異源、接枝、高度水合的多糖的總稱，且果膠為植物細(xì)胞壁的 主要成分。這些多糖含有天然糖類，如阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。活性 蛋白質(zhì)酶可制備下列酶兩種a-L-鼠李水解酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、內(nèi)果 膠酸鹽裂解酶(果膠基質(zhì))、果膠裂解酶和較少含量的木聚糖酶。果膠降解酶、木聚糖酶 和纖維素酶的核苷酸序列列于公共數(shù)據(jù)庫。實(shí)施例9中討論了一個(gè)序列。本發(fā)明作者認(rèn)為用于制備纖維素乙醇的每種生物質(zhì)所需的酶各不相同。因此， 本發(fā)明所述實(shí)施例中涉及來源于植物表達(dá)和/或細(xì)菌表達(dá)中的多酶混合物，上述多酶混 合物對生物質(zhì)極其有效。乙醇生產(chǎn)中所需的降解生物質(zhì)及其權(quán)利要求，包括但并不限于谷類，如玉米、 小麥、黑麥、大麥和上述谷物殘留物(主要?dú)埩粑餅榻斩挕⑷~片和夾殼)、甜菜、甘蔗、 草類如柳枝稷和細(xì)葉芒，木類如楊樹、桉樹、柳樹、美洲楓香樹和刺槐以及森林廢物 (如鋸木廠的碎片和鋸末)。其他生物質(zhì)可能包括，但不限于，水果，如柑橘及其殘留 物，如桔皮等。本發(fā)明中煙草作為表達(dá)植物降解酶的示例植物。但是，除非特別說明，本發(fā)明 實(shí)施例不局限于煙草。本發(fā)明所述基因表達(dá)可應(yīng)用于多種植物，包括，但并不局限于 煙草、生菜、菠菜、向日葵，豆科作物如黃豆、大豆、豌豆和苜蓿、番茄、土豆、胡蘿
卜、甜菜、十字花科、纖維作物如棉花，園藝作物如非洲菊和菊花，油菜和亞麻籽。在一個(gè)具體實(shí)施例中，黑曲霉、棘孢曲霉、里氏黑霉和/或熱纖梭菌中可解碼 不同酶的基因通過基因特異性引物而相互隔離。為了在感興趣的葉綠體內(nèi)表達(dá)不同的 酶，采用以下方法含有葉綠體基因組側(cè)翼序列的葉綠體載體有助于同源重組。在一個(gè) 具體實(shí)施例中，外源基因單獨(dú)在葉綠體基因組區(qū)域進(jìn)行整合。不同酶的解碼序列經(jīng)由適 當(dāng)?shù)恼{(diào)控基因進(jìn)行調(diào)控。重組質(zhì)體進(jìn)攻煙草生成葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，粉末狀煙草葉片作為酶源，對生物質(zhì)生成乙醇進(jìn)行評 估。在一個(gè)更為具體的實(shí)施例中，生物質(zhì)源為谷物，如玉米、草類或柑橘殘留物。相對于轉(zhuǎn)基因葉綠體而言，同型異源性葉綠體對轉(zhuǎn)化更為有利。轉(zhuǎn)基因整合和 同型異源性分別經(jīng)PCR和DNA雜交技術(shù)證實(shí)。轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)蛋白質(zhì)分析證實(shí)，且經(jīng)ELISA定量分析。從轉(zhuǎn)基因葉綠體煙草植物提取的蛋白質(zhì)，對其降解柑橘廢物生物質(zhì)的 穩(wěn)定性進(jìn)行了測試。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可加入更多酶以提高植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為用于發(fā) 酵生成乙醇所需的糖類。每種用于生成酶的煙草植物可生成1百萬個(gè)種子，播種于100 英畝。同源植物質(zhì)，如粉末狀煙草葉片或植物提取物，或經(jīng)由植物質(zhì)而來的經(jīng)純化的酶 可作為酶源對柑橘廢物轉(zhuǎn)化為乙醇進(jìn)行評估。本發(fā)明包含將異源基因安放于植物細(xì)胞核內(nèi)，CT轉(zhuǎn)化位于煙草植物細(xì)胞中的約 100個(gè)葉綠體基因組。每個(gè)煙草植物葉綠體含有約100個(gè)葉綠體基因質(zhì)的復(fù)制，這使得蛋 白質(zhì)數(shù)量(酶蛋白質(zhì)將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類，進(jìn)而用于生產(chǎn)乙醇)以指數(shù)形式增加。這也是 通過細(xì)胞壁降解酶生產(chǎn)纖維素乙醇價(jià)格昂貴的主要原因。煙草中含有大量生物質(zhì)(40噸 葉片/英畝)，在佛羅里達(dá)地區(qū)生長季內(nèi)可收獲幾次。同時(shí)，如前所述，采用單一煙草播 種100英畝較為容易。最后，由于葉綠體具有遺傳母源性，其在煙草花粉中無功能性。在一個(gè)具體實(shí)施例中描述了一種降解植物生物質(zhì)生成可發(fā)酵性糖類的方法。該 方法包括制備含有至少一種葉綠體基因組或可解碼纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷 酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、果膠 酶中的一種或幾種的基因片段的植物降解多酶混合物，其中上述植物質(zhì)含有纖維素酶、 木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠 酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面包酶、果膠酶或擴(kuò)展蛋白中的一種或幾種，且上述酶在 獲得上述植物質(zhì)的植物中表達(dá)；上述植物降解質(zhì)與上述生物質(zhì)樣品混合。在一個(gè)更為具 體的實(shí)施例中，酶或酶混合物的含量為植物質(zhì)中總蛋白質(zhì)含量的0.1%以上。在一個(gè)具體實(shí)施例中描述了一種降解植物生物質(zhì)生成大量可發(fā)酵性糖類的方 法，該方法包括制備含有至少一種可解碼纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖 維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面 包酶、果膠酶或擴(kuò)展蛋白中的一種或幾種的葉綠體的植物；采摘上述植物；加工上述植 物，生成適于混合和降解生物質(zhì)樣品的酶。在一個(gè)更為具體的實(shí)施例中，上述植物為煙 草、生菜、菠菜、向日葵；纖維類植物如棉；園藝作物如非洲菊和菊花；豆科作物如黃 豆、大豆、豌豆和苜蓿、番茄、土豆、甜菜、十字花科如油菜和亞麻籽。在一個(gè)更為具 體的實(shí)施例中，植物為煙草。本發(fā)明的目的在于提供一種來源豐富、價(jià)格低廉的酶用于生物質(zhì)降解。含有表 達(dá)植物降解化合物的植物或細(xì)菌經(jīng)干燥和粉末化處理。在一個(gè)具體實(shí)施例中，從植物和/ 或細(xì)菌中制備粗液體提取物。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，植物降解質(zhì)可為完全或部分純化 的酶，上述酶在植物和/或細(xì)菌中表達(dá)。由于植物降解質(zhì)為干態(tài)或植物和/或細(xì)菌質(zhì)粗 提取物，這使得操作時(shí)間大大縮短，并避免了價(jià)格昂貴的凈化步驟。因此，與傳統(tǒng)植物 降解和發(fā)酵工藝相比，植物質(zhì)的保存時(shí)間增加，且更易與植物生物質(zhì)樣品混合。在一個(gè)具體實(shí)施例中，制備植物的方法為制備葉綠體轉(zhuǎn)化為表達(dá)第一種酶的 第一種植物和制備葉綠體轉(zhuǎn)化為表達(dá)第二種酶的第二種植物。從第一種和第二種植物制 備的植物質(zhì)可進(jìn)行混合，進(jìn)而生成包含至少一種植物降解酶的植物降解樣品。在另一個(gè) 具體實(shí)施例中，制備植物的方法至少含有下列兩步制備含有表達(dá)纖維素酶的葉綠體的 第一種植物，制備含有可表達(dá)木質(zhì)素酶的葉綠體的第二種植物，制備含有可表達(dá)葡 萄糖苷酶的葉綠體的第三種植物，制備含有可表達(dá)半纖維素酶的葉綠體的第四種植物，制備含有可表達(dá)木聚糖酶的葉綠體的第五種植物，制備含有可表達(dá)a-淀粉酶的葉綠體 的第六種植物，制備含有可表達(dá)淀粉葡糖苷酶的葉綠體的第七種植物，制備含有可表達(dá) 果膠酸裂解酶的葉綠體的第八種植物，制備含有可表達(dá)角質(zhì)酶的葉綠體的第九種植物， 制備含有可表達(dá)脂肪酶的葉綠體的第十種植物，制備含有可表達(dá)面包酶的葉綠體的第 十一種植物，制備含有可表達(dá)果膠酶的葉綠體的第十二種植物和/或制備含有可表達(dá)擴(kuò) 展蛋白的葉綠體的第十三種植物(如里氏木酶)。如上所述，本發(fā)明作者認(rèn)為在某些具體實(shí)施例中，從植物中獲得的酶增加了在 細(xì)菌中重組表達(dá)的植物降解酶。因此，植物降解多酶混合物可以包括在植物中重組表達(dá) 的酶和在細(xì)菌中重組表達(dá)的酶，如但并不限于腸埃希氏菌。在一個(gè)具體實(shí)施例中，用于降解植物生物質(zhì)的植物質(zhì)，上述物質(zhì)包括至少一種 葉綠體基因組或可解碼纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、 a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面包酶、果膠酶或擴(kuò)展 蛋白中的一種或幾種的異源基因的基因片段；上述植物質(zhì)含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、
葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、 脂肪酶、淀粉酶、面包酶、果膠酶或擴(kuò)展蛋白中的一種或幾種。在一個(gè)更為具體的實(shí)施 例中，植物質(zhì)包括以下兩種第一種葉綠體基因組或可解碼纖維素酶的異源基因的基因 片段。第二種葉綠體基因組或可解碼木質(zhì)素酶維異源基因的基因片段，第三種葉綠體基 因組或可解碼葡萄糖苷酶的異源基因的基因片段，第四種葉綠體基因組或可解碼半 纖維素酶的異源基因的基因片段，第五種葉綠體基因組或可解碼木聚糖酶的異源基因的 基因片段，第六種葉綠體基因組或可解碼a-淀粉酶的異源基因的基因片段，第七種葉 綠體基因組或可解碼淀粉葡糖苷酶的異源基因的基因片段，第八種葉綠體基因組或可解 碼果膠酸裂解酶的異源基因的基因片段，第九種葉綠體基因組或可解碼脂肪酶的異源基 因的基因片段，第十種葉綠體基因組或可解碼淀粉酶的異源基因的基因片段，第十一種 葉綠體基因組或可解碼面包酶的異源基因的基因片段，第十二種葉綠體基因組或可解碼 果膠酶的異源基因的基因片段，以及第十三種葉綠體基因組或可解碼擴(kuò)展蛋白的異源基 因的基因片段(如里氏木酶)。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，含有植物細(xì)胞的植物，其中上述植物細(xì)胞其纖維素 酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、 果膠酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面包酶、果膠酶或擴(kuò)展蛋白中的一種或幾種的含量高 于一般含量；上述植物質(zhì)含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木 聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面包酶、果膠酶 或擴(kuò)展蛋白中的一種或幾種以及活性酶。在一個(gè)具體實(shí)施例中，酶或混合酶的含量為細(xì) 胞中總蛋白質(zhì)含量的0.1%以上。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，酶或混合酶的含量為細(xì)胞中總 蛋白含量的以上。在一個(gè)具體實(shí)施例中，植物中含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶、半纖 維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、淀粉酶、面包 酶、果膠酶和/或里氏木酶以及一定量的加氧酶。在一個(gè)具體實(shí)施例中，加氧酶和酶的 比例為99 1 1 99。在一個(gè)具體實(shí)施例中，重組表達(dá)一種或幾種植物降解化合物的市售品種。市售煙草品種，如但并不限于LAMD和TN90，較實(shí)驗(yàn)品種具有更多的葉片。然而，市售品 種對異源基因更為敏感。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明作者成功對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并對市售品 種中植物降解化合物進(jìn)行表達(dá)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 構(gòu)建葉綠體表達(dá)框架tail和trnA基因間轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域用于轉(zhuǎn)基因整合(圖la)。PCR顯示了各種感興 趣基因(GOI)，包括來自于熱纖梭菌基因組DNA的內(nèi)切葡聚糖酶(celD)、外切葡聚糖酶 (celO),來自于結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的脂肪酶(lipY)，來自于苜蓿根腐病菌的果膠 酸裂解酶(pelA，pelB, pelD)和角質(zhì)酶。使用一種基于新型PCR的方法，在未使用來源 于里氏木酶基因組DNA內(nèi)含子(范圍為1 5)的前提下，克隆包括內(nèi)切葡聚糖酶(egll 和egl)、里氏木酶(swol與擴(kuò)展蛋白相同)、木聚糖酶(xyn2)、乙酰木聚糖酯酶(axel)和
葡萄糖苷酶(bgll)在內(nèi)的GOI的解碼序列。采用每種GOI制備煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體 (圖lb)。所有的葉綠體載體都含有用于將同源重組為倒向重復(fù)區(qū)域的葉綠體基因組16S trnl/trnA側(cè)翼序列和抑制奇霉素的aadA基因。aadA基因由rRNA操縱促進(jìn)劑和GGAGG 核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)控制。GOI由psbA促進(jìn)劑和5' UTR控制，以此獲得較高水平的表 達(dá)。3' UTR位于控制轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定的GOI末端。實(shí)施例2 表達(dá)果膠酸裂解酶(PelB & PelD)和內(nèi)切葡聚糖酶(CelD)的葉綠體轉(zhuǎn) 基因煙草的制備和表征葉綠體轉(zhuǎn)基因植物采用如前所述方法制備28’ 29。采用DNA雜交分析技術(shù)對 pLD-pelB, pLD-pelD和pLD-celD盒整合入葉綠體基因組進(jìn)行驗(yàn)證，以確定其同型異源 性。采用從未轉(zhuǎn)化和葉綠體轉(zhuǎn)化線和植物總DNA進(jìn)行消化，當(dāng)與[32Ph標(biāo)記的tml-trnA 探針進(jìn)行雜化，生成4.014kb的未轉(zhuǎn)化片段(UT)或6.410kbpelB，6.377kb pelD或7.498kb celD片段，這證實(shí)了轉(zhuǎn)基因特定點(diǎn)整合入位于tail和trnA基因間的區(qū)域(圖lc-e)。此 外，葉綠體轉(zhuǎn)基因線中4.014kb片段的缺失也證實(shí)了同型異源性(在可檢測范圍內(nèi))。而 與未轉(zhuǎn)化植物相比，顯型葉綠體轉(zhuǎn)基因線也較正常。(培養(yǎng)的花朵和種子，圖If)。帶有PelA抗體的表明PelB和PelD為PelA免疫30。因此，盡管其葉綠體轉(zhuǎn)基 因線的相似性各不相同，PelA抗體仍用于檢測PelB和PelD表達(dá)。所有的葉綠體轉(zhuǎn)基因 線均顯示PelB或PelD蛋白質(zhì)表達(dá)。盡管PelB和PelD由光線調(diào)控，但依據(jù)收獲時(shí)間， 與酶活性相對應(yīng)的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著變化(圖2a，b)。這可能是因?yàn)镻elB、PelD和 PelA抗體的抗原表位相似性不同造成的。酶濃度隨葉片成熟度略有降低(圖2a，b)。實(shí)施例3 :不同采摘時(shí)間和葉片成熟度下的果膠酸裂解酶(PelB，PelD)和內(nèi)切 葡聚糖酶(CelD)酶活性隨葉片成熟度和采摘時(shí)間而顯著變化。PelB、PelD和CelD成熟葉片的酶 活性最高，老葉片中的酶活性下降(圖2c，d)。在6PM采摘的成熟葉片，其PelB和PelD 均顯現(xiàn)出最高酶活性，而10PM采摘的葉片，其CelD顯現(xiàn)出最高活性(圖2c，d)。這 可能是由于植物提取物中內(nèi)切葡聚糖酶對蛋白酶的穩(wěn)定性增加的原因。在室溫儲(chǔ)存時(shí)， cpCelD在植物提取物中的活性并未顯著降低，可保持超過30天(數(shù)據(jù)未列出)。根據(jù)IUPAC協(xié)議32，采用DNS試劑31對CelD酶活性進(jìn)行計(jì)算。對于從10PM采摘的成熟葉片所制備的粗提取物而言，采用2% CMC計(jì)算的cpCelD活性為493unitS/mg 總可溶蛋白質(zhì)(TSP)或lOOmg葉片組織。采用葡萄糖專用的葡萄糖激酶測定法，當(dāng)分別 采用5%微晶纖維素和sigmacell溶液為基材時(shí)(pH = 6.0，60°C )，測得活性為4.5units/mg TSP和6.28units/mg TSP。采用相同基材測得的市售纖維素酶(里氏木酶，EC 3.2.1.4， Sigma)活性為 4.2units/mg 和 3.43units/mg。圖 2c 和 2d 表明每 g 在 6PM 或 10PM 采摘 的成熟葉片約可獲得26單位、32單位和4930單位的PelB，PelD jmd CelD。因此，每 株煙草植物可獲得2048、2679和447938單位的PelB、PelD和CelD (實(shí)驗(yàn)品種，哈瓦那 煙草)。每英畝可種8000株煙草，因此可分別獲得16.21億和35.84億單位PelB、PelD 或CelD (表1)。以每年可收割三季計(jì)算，每年可收獲49.64億和107.51億單位的PelB、 PelD或CelD。市售品種可收獲40噸生物質(zhì)，而實(shí)驗(yàn)哈瓦那品種只可收獲2.2噸生物質(zhì)。 因此，市售品種產(chǎn)量為實(shí)驗(yàn)品種的18倍。實(shí)施例4 pH和溫度對果膠酸裂解酶(PelB & PelD)和內(nèi)切葡聚糖酶(CelD)活 性的影響植物和腸埃希氏菌提取物都表明在2.5mg/ml PGA時(shí)活性最高(圖3a)。 因 此，所有的酶均在此濃度下進(jìn)行研究。動(dòng)力學(xué)研究在4iigTSP，不斷增加濃度的 PGA(0-2.5mg)及標(biāo)準(zhǔn)分析條件下進(jìn)行，結(jié)果表明葉綠體(cp)和腸埃希氏菌(r)PelB的 Km值分別為0.39和1.19 u g/ml，而葉綠體和腸埃希氏菌PelD的Km值分別為0.50和 1.29ug/mL cpPelB、rPelB、cpPelD 和 rPelD 的 Vmax 值分別為 2.75、3.19、2.75 禾口 3.14units/mg(圖 3a)。植物或腸埃希氏菌提取物(4-5 u g TSP)用于研究pH和溫度對酶活性的影響。標(biāo) 準(zhǔn)測試條件下，腸埃希氏菌和由葉綠體生成的果膠酸裂解酶的最佳溫度為40°C，最佳pH 值為8.0。在lmMCaCl2#在下，葉綠體生成的果膠酸裂解酶其最佳pH為6.0。而對于 腸埃希氏菌粗提取物而言，無論CaC12存在與否，其最佳pH值為8.0 (圖3b，c)。溫度 升高對由植物生成的果膠酸裂解酶活性影響很小，而對于腸埃希氏菌酶，在較高溫度下 其活性較低(圖3d，e)。兩種不同寄主所表現(xiàn)的不同酶特性可能是由于其折疊性。用 HIS-標(biāo)記抗體，而不是葉綠體酶(數(shù)據(jù)未列出)可檢測腸埃希氏菌酶的事實(shí)也證實(shí)了上 述結(jié)論。眾所周知葉綠體二硫鍵形成的外源蛋白質(zhì)33_35，而不是腸埃希氏菌酶所形成的外 源蛋白可在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。PelB和PelD酶有偶數(shù)個(gè)(12或14)可形成二硫鍵的半胱氨酸
30
o在不同pH和溫度下測定含有2 % CMC的CpCelD活性。cpCelD的最佳pH值
在5.0 7.0之間(圖3f)，而腸埃希氏菌的最佳pH值為6.5。腸埃希氏菌的最佳溫度為 50-60植物酶的最佳溫度為50-70°C (圖3g)。熱纖梭菌CelD其結(jié)構(gòu)與CaC12具有相 似性，且具有熱穩(wěn)定性36。10mM CaC12可將含有2% CMC的腸埃希氏菌粗提取物中的 CelD活性提高兩倍，但在培養(yǎng)初期，這對葉綠體CelD粗提取物卻不適用。這可能是由 于植物細(xì)胞中的Ca2+達(dá)到最佳濃度。含有20 y g BSA的CaC12，在24小時(shí)培養(yǎng)末期， 可使cpCelD粗提取物活性提高5倍(圖3h)。實(shí)施例5 腸埃希氏菌vs葉綠體CelD、PelB & PelD含有CelD酶的腸埃希氏菌粗提取物，當(dāng)反應(yīng)混合物含有超過lOygTSP時(shí)，酶 活性下降，而含有CelD的植物粗提取物則可釋放出較多還原糖，且蛋白質(zhì)濃度增加(圖
144a)。葉綠體表達(dá)CelD活性在150 u g TSP時(shí)達(dá)到飽和(2% CMC)(圖4a插圖)，且通 過終點(diǎn)監(jiān)測，即使TSP含量高達(dá)500i!g，仍可觀測到葉綠體CelD酶活性增加。這些結(jié) 果表明含有cpCelD的粗植物提取物不需要提純即可直接用于生物質(zhì)降解，而腸埃希氏菌 可能含有內(nèi)切葡聚糖酶抑制劑。同樣，在較高蛋白質(zhì)濃度下，腸埃希氏菌表達(dá)rPelB和 rPelD表現(xiàn)出還原果膠酸降解酶活性，而即使在600iigTSP時(shí)，cpPelB或cpPelD仍表現(xiàn) 為活性增加(圖4b)。腸埃希氏菌中可能含有果膠酸裂解酶抑制劑，而植物粗提取物中卻 不含上述抑制劑。這些發(fā)現(xiàn)極其重要，因?yàn)榇痔崛∥锏氖褂靡馕吨辉傩枰獙γ高M(jìn)行提 純。如下所示大量粗植物酶可用于多酶混合物而不影響酶活性、水解或產(chǎn)率。實(shí)施例6:用于濾紙水解的多酶混合物在評估多酶混合物前，每種酶的活性分別用適宜的基材進(jìn)行測試。葉綠體或腸 埃希氏菌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶(cpCelD或rEgl)不會(huì)產(chǎn)生可檢測量的纖維素，但當(dāng)二者混合 后，最多可產(chǎn)生19%的水解反應(yīng)(圖5a，條1)。這可能是由于內(nèi)切葡聚糖酶和濾紙間 不同的碳水化合物鍵合所致。當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶(cpCelD和rEgl)與里氏木酶(rSwol)或
葡萄糖苷酶(rBgll，圖5a，條2&3)混合，協(xié)同活性可提高47%或48%。如向多酶 混合物中添加纖維二糖水解酶，可使濾紙水解提高兩倍，最大程度的釋放還原糖類(圖 5a,條4)。這種協(xié)同作用可能是由于纖維二塘水解酶37還原末端的外切模型，上述模型 中通過內(nèi)切葡聚糖酶(cpCelD和rEgl)任意切割纖維素鏈，同時(shí)伴隨擴(kuò)展蛋白和0 _葡萄 糖苷酶的運(yùn)動(dòng)。實(shí)施例7:用于深加工木水解反應(yīng)的多酶混合物采用可從濾紙上釋放最大等當(dāng)量纖維素的多酶混合物(除rEgl)對深加工木基材 進(jìn)行測試。水解24小時(shí)后，該多酶混合物發(fā)生31%的水解反應(yīng)(圖5b，條1)。內(nèi)切葡 聚糖酶的多酶混合物和乙酰木聚糖酯酶表現(xiàn)出41%的水解反應(yīng)(圖5b，條2)。當(dāng)這兩種 多酶混合物進(jìn)行混合，水解程度增加至88% (圖5b，條3)。當(dāng)深加工木基材用果膠酸 裂解酶處理后，再加入條3中的多酶混合物，水解程度進(jìn)一步提高，培養(yǎng)36小時(shí)后，可 釋放出275 u g葡萄糖(圖5b，條4)。加入角質(zhì)酶和脂肪酶提取物后(均帶有脂肪酶活 性)未對可發(fā)酵性糖類的生成產(chǎn)生顯著影響(數(shù)據(jù)未列出)。Novozyme 188多酶混合物 未從深加工木中產(chǎn)生可檢測量等當(dāng)量葡萄糖，而Celluclast 1.5L產(chǎn)量較粗提取多酶混合物 多10 %，與CMC水解酶單位相同。在一個(gè)具體實(shí)施例中，消化木質(zhì)生物質(zhì)樣品的方法，包括制備含有內(nèi)切葡聚糖 酶或乙酰木聚糖酯酶中的一種或兩種的植物質(zhì)，上述內(nèi)切葡聚糖酶或乙酰木聚糖酯酶在 植物中表達(dá)，且全部或部分植物質(zhì)從上述植物中獲得；上述植物質(zhì)與上述木質(zhì)生物質(zhì)樣 品混合。本實(shí)施例所述方法可進(jìn)一步包括與木質(zhì)生物質(zhì)樣品混合之前或同時(shí)與內(nèi)切葡聚 糖酶或乙酰木聚糖酯酶混合，植物質(zhì)含有在植物表達(dá)的果膠酸裂解酶，且部分或全部果 膠酸裂解酶來源于上述生物質(zhì)。生物質(zhì)還可含有加氧酶。另一個(gè)具體實(shí)施例包括用于消化木質(zhì)生物質(zhì)樣品的植物降解多酶混合物，其中 上述消化木質(zhì)生物質(zhì)樣品含有在植物中表達(dá)的纖維素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、 a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、里氏木酶或果膠酶中的一種或幾種，也可含 有一定量的加氧酶。實(shí)施例8 用于柑橘廢物水解反應(yīng)的多酶混合物
內(nèi)切葡聚糖酶的多酶混合物(cpCelD)、外切葡聚糖酶、里氏木酶和葡萄糖 苷酶與桔皮可最多進(jìn)行24%的水解反應(yīng)(圖5c，條1)。當(dāng)桔皮經(jīng)果膠酸裂解酶處理后 (cpPelB, cpPelD和rPelA)，水解程度可以成倍提高(圖5c，條2)。果膠酸裂解酶在此 多酶混合物中可貢獻(xiàn)47%的水解反應(yīng)，原因在于桔皮中較高的果膠含量(23% )41。向上 述兩種多酶混合物中添加內(nèi)切葡聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、角質(zhì)酶和脂肪酶，培養(yǎng)24小 時(shí)后，lOOmg桔皮可釋放360i!g/ml等當(dāng)量葡萄糖(圖5c，條3)。桔皮中的酶類如角質(zhì) 酶和脂肪酶可能含有水解親油體，更有助于內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酸裂解酶水 解桔皮。NovozymellS多酶混合物可使桔皮的葡糖糖產(chǎn)量提高11%，而較含有等當(dāng)量酶 單元的粗提取多酶混合物，可使CMC水解產(chǎn)量提高137%。在一個(gè)具體實(shí)施例中，消化柑橘生物質(zhì)樣品的方法，其中包含制備含有纖維素 酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶中 的一種或幾種的植物質(zhì)，上述酶在獲得上述植物質(zhì)的植物中表達(dá)；且上述植物質(zhì)和上述 柑橘生物質(zhì)樣品混合。在一個(gè)具體實(shí)施例中，用于消化柑橘生物質(zhì)的植物降解多酶混合物，上述植物 降解多酶混合物含有纖維素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、淀粉葡糖苷 酶、果膠酸裂解酶、里氏木酶或果膠酶中的一種或幾種，上述酶在植物中表達(dá)，還可含 有一定量的加氧酶。與實(shí)施例1-8相關(guān)的方法基因隔離和建造質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體熱纖梭菌和里氏黑霉的DNA基因組從ATCC中獲得，并作為擴(kuò)增不同基因的 模板。使用在pLD介質(zhì)克隆的含有Ndel點(diǎn)的正向引物和含有Xbal點(diǎn)的反向引物為基 因特異性引物，上述基因特異性引物專門用于celD、celO和lipY基因。從熱纖梭菌 DNA基因組對纖維素基因celD(X04584)和celO (AJ275975)的成熟區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。從結(jié) 核分枝桿菌DNA基因組對LipY(NC_000962)進(jìn)行擴(kuò)增。采用新型方法，運(yùn)用重疊引物 在里氏黑霉 DNA 基因組中對各種 egll(M15665)，egl (AB003694)，swol (AJ245918)， axel (Z69256)，xyn2 (X69574)和bgll (U09580)的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。采用基于PCR的新 型方法從不同外顯子中對這些基因的全長cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，上述方法分別采用含有Ndel 位點(diǎn)的首個(gè)外顯子的正向和含有Xbal位點(diǎn)的末端外顯子的反向。帶有相同限制性位點(diǎn)的 苜蓿根腐病菌的果膠酸裂解酶基因pelA，elB&pelD，分別采用pHILD2A，HILD2B3°和 HILD2D45的基因特意性引物進(jìn)行擴(kuò)增。采用相同的方法從苜蓿根腐病菌的重組克隆對角 質(zhì)酶基因46進(jìn)行擴(kuò)增。所有全長擴(kuò)增產(chǎn)物與pCR鈍化IITopo載體(Invitrogen)相連，并 作為DNA序列(Genewiz)。Topo載體中的每種克隆基因采用Ndel/Xbal消化，并嵌入 pLD載體17’ 47,以使煙草葉綠體表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因葉綠體植物的再生及通過PCR和DNA雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)行評估哈瓦那品種煙草在含有30g/l蔗糖的無激素MS瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)。 如前所述，采用pLD-PelB、pLD-PelD和pLD-CelD涂布的金粒子轟擊未成熟葉片，進(jìn) 而再生為轉(zhuǎn)基因葉綠體植物28’ 29。采用Qiagen公司DNeasy植物試劑盒，從葉片處對植 物DNA基因組進(jìn)行隔離。分別采用3P/3M和5P/2M引物進(jìn)行PCR分析，以確定轉(zhuǎn)基 因整合入葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)17。PCR反應(yīng)如前所述17’ 29。PCR正端莖處的葉片被切成小片，并轉(zhuǎn)入含有500mg/l奇霉素的RMOP(植物再生介質(zhì))介質(zhì)用于下一輪篩 選，隨后再轉(zhuǎn)入含有500mg/l奇霉素的MSO (不含維他命和生長激素的MS鹽)介質(zhì)用 于下一輪篩選，以生成同質(zhì)性線。進(jìn)行DNA雜交技術(shù)分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求確定同質(zhì) 性48?？偠灾?，與葉片隔離的總植物基因組DNA(l-2iig)采用Smal消化，并與含有 trnl-trnA基因的32P a [dCTP]標(biāo)記的葉綠體側(cè)翼序列探針(0.81kb)雜交。采用Stratagene 公司QUICK-HYB雜交溶液進(jìn)行雜化。免疫分析如前所述，約lOOmg葉片在液氮中粉碎用于免疫分析48。蛋白質(zhì)濃度Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行測試。采用SDS-PAGE將相同量的總?cè)艿鞍踪|(zhì)分離， 并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。采用兔子體內(nèi)對PelA免疫的多克隆血清檢測其轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)表 達(dá)。腸埃希氏菌酶(粗)的制備含有用于表達(dá)rCelD、rEgl (EC 3.2.1.4)、rCelO (EC 3.2.1.91)、 rXyn2(EC3.2.1.8)、rAxel (EC 3.1.1.72)、rBgll (EC 3.2.1.21)、rCutinase (EC 3.1.1.74)、 rLipY (lipase, EC 3.1.1.3)、rPelA、rPelB、rPelD (EC 4.2.2.2)或 rSwol 葉綠體表達(dá)載體 的腸埃希氏菌株(XL-10金)在37°C下隔夜培養(yǎng)。在4°C下收集細(xì)胞，并在含有蛋白酶 抑制多酶混合物(Roche)和疊氮化鈉(0.02% )的緩沖溶液中(對于CelD、Egl、CelO、 Swol、Xyn2、Axel和Bgll，采用pH = 5.5，50mM醋酸鈉緩沖溶液，對于角質(zhì)酶、脂肪 酶、PelA、PelB和PelD，采用pH = 7.0，100mM Tris-HCl)采用30s脈沖聲處理四次。 16000xg下離心10分鐘，收集上清液，并測定蛋白質(zhì)含量。從煙草葉綠體轉(zhuǎn)基因葉片中制備酶采摘新鮮綠葉，在液氮中粉碎。采用pH = 5.5，50mM醋酸鈉緩沖溶液提取 cpCelD和cpXyn2中的總可溶蛋白質(zhì)，采用pH = 7.0，100mM Tris_Cl緩沖溶液提取PelD 和PelB中的總可溶蛋白質(zhì)。所有緩沖溶液均含有蛋白酶抑制多酶混合物(Roche)和疊氮 化鈉(0.02% )。采用0.22 P m針管過濾器過濾總可溶蛋白質(zhì)。采用Bradford法測定TSP
中蛋白質(zhì)含量。果膠酸裂解酶B和果膠酸裂解酶D中酶定量分析采用分光光度法，通過測量A235增加來測定果膠酸裂解酶B和D3°’ 49’ 5°。對果 膠酸裂解酶B和D的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以便在相同蛋白質(zhì)和輔因子濃度下優(yōu)化基材濃度 (0-2.5mg)。反應(yīng)混合物含有 1ml 50mM 的 Tris-HCl 緩沖溶液(pH 8.0)，ImM CaCl2 (新 鮮配制)，1ml 0.0-2.5mg/ml多聚半乳糖醛酸鈉(Sigma)和0.5ml適宜的稀釋酶溶液。測 量在40°C下進(jìn)行。定義一單位酶為與摩爾消光系數(shù)為4600 u moTcm 1的1 y mol產(chǎn)品/ min中的酶含量。在40°C，pH = 8.0的50mM Tris_HCl緩沖溶液中進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。采 用Graphpad Prism 5.0軟件，利用非線性回歸法計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km & Vmax)。計(jì)算每 種基材濃度的起始斜率，且通過生成的不飽和半乳糖醛酸確定速度(單位/mg/min)。pH =8.0，50mM Tris-HCl緩沖溶液中，果膠酸裂解酶B和D活性最佳溫度為30°C 70°C。 基材均在適宜溫度下預(yù)培養(yǎng)5min。為了研究酶的熱穩(wěn)定性，在不同溫度固定時(shí)間內(nèi)對緩 沖酶樣品進(jìn)行培養(yǎng)。40°C下，采用具有相同離子強(qiáng)度的不同緩沖溶液確定果膠酸裂解酶B和D的最佳pH值為6 10。在不同pH值下對酶進(jìn)行培養(yǎng)以確定粗提取物中酶的最佳穩(wěn)定性。 在不同pH值和不同溫度下，通過添加和不添加CaCl2來確定輔因子CaCl2對果膠酸裂解 酶活性的影響。CelD和市售多酶混合物(Celluclast 1.5L和Novozyme 188)中酶的定量分析根據(jù)IUPAC建議32，采用Acicel和Sigmacell (Sigma)作為基材，通過在2 % CMC 中培養(yǎng)粗提取物來測定cpCelD中纖維素酶的活性。在60°C下，pH = 6.0，50mM醋酸緩 沖溶液中，對CMC培養(yǎng)30min，對Avicel和Sigmacell培養(yǎng)2h。在相同的分析條件下， 采用2% CMC對市售多酶混合物Celluclast 1.5L和Novozyme 188的酶單位進(jìn)行測定。采 用3，5- 二硝基水楊酸測定還原性糖含量31。D-葡萄糖和D-半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)物， 對生成的等當(dāng)量葡萄糖和不飽和半乳糖醛酸進(jìn)行測定。cpCelD的pH和溫度活性采用 CMC(2%)進(jìn)行測定。定義一單位酶為生成lymol等當(dāng)量葡萄糖/min的酶含量。根 據(jù)制造商提供的葡萄糖己糖激酶法計(jì)算Avicel和Sigmacell (Sigma)的纖維素酶單位。濾紙、深加工木和桔皮的酶水解反應(yīng)對濾紙、深加工木和桔皮中的單一酶組分或多酶混合物的酶進(jìn)行定量分析，采 用DNS法對生成的還原性糖進(jìn)行測定。瓦倫西亞桔皮(瓦倫西亞橙)在空氣中過夜干 燥，并在液氮中粉碎。粉碎的瓦倫西亞桔皮和預(yù)處理過的木質(zhì)生物質(zhì)在蒸餾水中清洗幾 遍，直至無還原性糖可被DNS試劑和葡萄糖己糖激酶法檢測出為止。采用50-200mg深加工木或粉碎桔皮進(jìn)行酶消化。含有腸埃希氏菌和植物的 酶的粗提取物加入多酶混合物用于水解反應(yīng)。采用DNS試劑31和D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn) 物，終產(chǎn)物還原性糖類進(jìn)行測定。加入100 yg/ml氨芐青霉素和卡那霉素以抑制酶水解 反應(yīng)過程中的微生物生長。在相同測試條件下，測試市售酶多酶混合物Celluclast 1.5L 和Novozyme 188對桔皮和深加工木的水解反應(yīng)。用于水解分析的Celluclast 1.5L和 Novozyme 188的酶單位與粗提取物中多酶混合物中的cpCelD酶單位相同(依據(jù)CMC水 解反應(yīng))。所有實(shí)驗(yàn)中，對無酶的基材和無基材的酶進(jìn)行控制。且所有實(shí)驗(yàn)和分析均平 行進(jìn)行三組。本發(fā)明發(fā)明者采用細(xì)菌或霉菌基因組的解碼序列構(gòu)建葉綠體載體?；赑CR的 新型方法，在不采用霉菌基因組DNA的內(nèi)含子的基礎(chǔ)上克隆ORF。采用腸埃希氏菌表 達(dá)系統(tǒng)評價(jià)在制備轉(zhuǎn)基因葉綠體線前每種酶的功能或其在多酶混合物中的功效；來源于 霉菌的酶在不使用后翻譯修飾的基礎(chǔ)上處于活性狀態(tài)(二硫鍵或糖基化)。同質(zhì)轉(zhuǎn)基因葉綠體線的顯性正常，且可生成花朵&種子。 根據(jù)一年所收獲的三季煙草，實(shí)驗(yàn)品種每年可獲得49.64億和107.51億果膠酸裂解酶單位 和內(nèi)切葡聚糖酶活性。當(dāng)采用市售品種培養(yǎng)的酶，產(chǎn)量可提高18倍。根據(jù)USDA經(jīng)濟(jì) 研究局的報(bào)告，2004年白肋煙的生產(chǎn)成本為3981美元/英畝。由于用于植物生物質(zhì)水解 的酶在高溫下活性較高，因此對于葉綠體制備的木聚糖酶，如前所述，建議將采摘的葉 片在陽光下干燥25。根據(jù)本發(fā)明所觀察到的植物粗提取物中的酶活性，無需對其進(jìn)行提 純。因此，不考慮加工成本的話，對PelB而言，其酶的生產(chǎn)成本為0.008分/酶單位， 對于PelD而言，其酶的生產(chǎn)成本為0.006分/酶單位(如Megazyme市售產(chǎn)品所定義)。 對于果膠酸裂解酶而言，與市售成本相比，其成本可降低925 1233倍(Megazyme由長 梗郁李制備)。盡管對于葉綠體制備的酶，其成本或產(chǎn)量不盡相同，但本發(fā)明提供了一種
18廉價(jià)多酶混合物，用以從木質(zhì)纖維生物質(zhì)制備可發(fā)酵性糖類。據(jù)我們所知，本發(fā)明是首個(gè)針對植物多酶混合物表達(dá)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生成可 發(fā)酵性糖類的水解反應(yīng)進(jìn)行研究的報(bào)道，并直接比較使用相同基因和調(diào)控序列，經(jīng)由發(fā) 酵或外來植物所制備的酶的特性。對天然基因，如預(yù)處理木材、玉米稈或麥稈的酶水解 研究已開始使用市售酶3’ 42或參雜純化的市售酶的純化重組酶4°’43。由于酶組分未知，因 此無法準(zhǔn)確比較粗提取多酶混合物與市售多酶混合物。因此，基于CMC水解的等當(dāng)量酶 單位用于基本對比參照。由于需要機(jī)構(gòu)協(xié)議，因此ACCELLERASE TM 1000 (Genencor) 未被用于本發(fā)明。經(jīng)Novozyme 188純化的多酶混合物未從深加工木中產(chǎn)生任何可檢 測范圍內(nèi)的等當(dāng)量葡萄糖，且上述多酶混合物與橘皮作用，將等當(dāng)量葡萄糖的產(chǎn)量提高 11%,較粗提取多酶混合物，Celluclast可使上述兩種生物質(zhì)基材在CMC水解過程中的等 當(dāng)量葡萄糖產(chǎn)量分別提高10%和137%。由于純化多酶混合物經(jīng)某些特定霉菌株發(fā)酵生 成，而在此過程中上述純化多酶混合物分泌某些酶，因此粗多酶混合物性能與純化多酶 混合物相似或更好。根據(jù)Novozymes的建議，仔細(xì)設(shè)計(jì)幾種單一組分的酶的混合物對合 理利用多酶混合物是必要的44。實(shí)施例9 植物降解酶的表達(dá)上述實(shí)施例1 8可用于制備異源基因表達(dá)盒，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化葉綠體及本 發(fā)明作者所列舉的有助于降解植物生物質(zhì)源的葉綠體表達(dá)。同時(shí)，葉綠體轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì) 表達(dá)請參見美國專利20070124830和20060117412。一些非限制性酶列于表I:表IGOI (感興趣基因)
權(quán)利要求
1.一種降解植物生物質(zhì)樣品以釋放其中可發(fā)酵性糖的方法，所述方法包括獲取含 有至少兩種細(xì)胞提取物的植物降解多酶混合物，每種細(xì)胞提取物均含有活性植物降解化 合物，并在獲得所述細(xì)胞提取物的細(xì)胞中重組表達(dá)，所述至少兩種細(xì)胞提取物為植物提 取物或細(xì)菌提取物或兩者的組合；且所述生物質(zhì)樣品與植物降解多酶混合物混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少兩種細(xì)胞提取物含有至少一種含有植 物降解化合物的植物細(xì)胞提取物和至少一種含有另一種植物降解化合物的細(xì)菌細(xì)胞提取 物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物降解多酶混合物含有至少三種細(xì)胞提 取物，所述至少三種細(xì)胞提取物均含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素 酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、面包酶、 果膠酶或擴(kuò)展蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)樣品含有谷物和/或谷物殘留 物、甜菜、甘蔗、草類、木質(zhì)生物質(zhì)、水果和/或水果殘留物或所述幾種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為玉米、小麥、大麥或柑橘或所 述殘留物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為柳枝稷。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為鋸末或深加工木。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為甘蔗。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為桔皮。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物生物質(zhì)為甜菜。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物降解多酶混合物還含有加氧酶。
12.—種制備植物生物質(zhì)降解物的方法，包括制備一種含有表達(dá)其植物降解酶葉綠體的植物和另一種含有表達(dá)其植物降解酶葉綠 體的植物；采摘所述兩種植物；并且加工所述兩種植物，生產(chǎn)含有適于混合和降解生物質(zhì)樣品的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一種和/或第二種植物為煙草。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述加工工藝包含對所述第一種和/或第二種 植物或部分第一種和/或第二種植物進(jìn)行均質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述步驟包括至少以下兩步合成含有表達(dá) 纖維素酶葉綠體的第一種植物；合成含有表達(dá)木質(zhì)素酶葉綠體的第二種植物；合成含有 表達(dá)葡萄糖苷酶葉綠體的第三種植物；合成含有表達(dá)半纖維素酶葉綠體的第四種植 物；合成含有表達(dá)木聚糖酶葉綠體的第五種植物；合成含有表達(dá)α-淀粉酶葉綠體的第 六種植物；合成含有表達(dá)淀粉葡糖苷酶葉綠體的第七種植物；合成含有表達(dá)果膠酸裂解 酶葉綠體的第八種植物；合成含有表達(dá)角質(zhì)酶葉綠體的第九種植物；合成含有表達(dá)脂肪 酶葉綠體的第十種植物；合成含有表達(dá)面包酶葉綠體的第十一種植物；合成含有表達(dá)果 膠酶葉綠體的第十二種植物或合成含有表達(dá)擴(kuò)展蛋白(如里氏木酶)葉綠體的第十三種植 物。
16.一種用于降解植物生物質(zhì)的植物降解多酶混合物，所述多酶混合物含有至少三種重組表達(dá)植物降解酶和加氧酶或擴(kuò)展蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述多酶混合物，其中所述多酶混合物含有至少四種植物降解酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述多酶混合物，其中所述至少兩種植物降解酶含有下列酶中的 幾種纖維素酶、木質(zhì)素酶、β “葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α “淀粉酶、淀 粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶或面包酶。
19.一種降解植物生物質(zhì)的植物，所述植物含有從第一種植物提純而來的第一種植物 降解酶和由第二種植物提純而來的第二種植物降解酶。
20.一種降解植物生物質(zhì)的植物，所述植物含有第一種葉綠體基因組或解碼第一種植 物降解酶的外源酶的基因片段和第二種葉綠體基因組或解碼第二種植物降解酶的外源酶 的基因片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物含有至少以下兩種第一葉綠體 基因組或可解碼纖維素酶的外源酶的基因片段，第二種葉綠體基因組或可解碼木質(zhì)素酶 的外源酶的基因片段，第三種葉綠體基因組或可解碼葡萄糖苷酶的外源酶的基因片 段，第四種葉綠體基因組或可解碼半纖維素酶的外源酶的基因片段，第五種葉綠體基因 組或可解碼木聚糖酶的外源酶的基因片段，第六種葉綠體基因組或可解碼α-淀粉酶的 外源酶的基因片段，第七種葉綠體基因組或可解碼淀粉葡糖苷酶的外源酶的基因片段， 第八種葉綠體基因組或可解碼果膠酸裂解酶的外源酶的基因片段，第九種葉綠體基因組 或可解碼角質(zhì)酶的外源酶的基因片段，第十種葉綠體基因組或可解碼脂肪酶的外源酶的 基因片段，第十一種葉綠體基因組或可解碼果膠酶的外源酶的基因片段，第十二種葉綠 體基因組或可解碼面包酶的外源酶的基因片段，或第十三種葉綠體基因組或可解碼擴(kuò)展 蛋白的外源酶的基因片段。
22.含有可重組表達(dá)纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖 酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶或面包酶或擴(kuò) 展蛋白的植物細(xì)胞的植物，其中所述植物為市售煙草。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的植物，其中所述酶位于所述葉綠體的細(xì)胞內(nèi)。
24.—種消化柑橘生物質(zhì)樣品的方法，包括獲取含有纖維素酶、葡萄糖苷酶、 木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶的一種或幾種的植物，所 述酶在全部或部分獲得所述植物的植物中表達(dá)；所述植物與所述柑橘生物質(zhì)樣品混合。
25.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一種和第二種植物為單子葉植物、雙子 葉植物或藻類中的一種或幾種。
26.—種均質(zhì)植物，含有至少兩種下列活性蛋白質(zhì)纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄 糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、 脂肪酶或果膠酶，或者他們的組合酶；所述植物含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖 苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂 肪酶，果膠酶或面包酶；所述植物也可含有加氧酶和/或里氏木酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述均質(zhì)植物，其中酶含量占所述木質(zhì)植物總蛋白質(zhì)含量的 0.1%以上。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述均質(zhì)植物，其中所述植物含有加氧酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述均質(zhì)植物，其中所述植物含有可在植物中表達(dá)的纖維素酶、 β-葡萄糖苷酶，木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、里氏木酶或果 膠酶，或它們的組合，也可含有一定量的加氧酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼纖維素酶的外源基因的基因片段。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼木質(zhì)素酶的外源基因的基因片段。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼葡萄糖苷酶的外源基因的基因片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼半纖維素酶的外源基因的基因片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼α-淀粉酶的外源基因的基因片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼淀粉葡糖苷酶的外源基因的基因片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼果膠酸裂解酶的外源基因的基因片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼角質(zhì)酶的外源基因的基因片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼脂肪酶的外源基因的基因片段。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼果膠酶的外源基因的基因片段。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼面包酶的外源基因的基因片段。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼里氏木酶的外源基因的基因片段。
42.降解植物生物質(zhì)樣品的方法，包括制備包含至少一種葉綠素基因組或帶有外源 基因的可解碼纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉 酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶或面包酶中的一種或幾種 的基因組片段的第一種植物降解質(zhì)；所述第一種植物含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡 萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì) 酶、脂肪酶、果膠酶、面包酶或里氏木酶中的一種或幾種，所述酶在獲得所述植物質(zhì)的 植物中表達(dá)；制備包含至少一種葉綠素基因組或帶有外源基因的可解碼纖維素酶、木質(zhì) 素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂 解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶或面包酶中的一種或幾種的基因組片段的第二種植物降 解質(zhì)；所述第二種植物含有不同于所述第一種植物的纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖 苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂 肪酶、果膠酶、面包酶或里氏木酶中的一種或幾種，所述酶在獲得所述植物質(zhì)的植物中表達(dá)；所述第一種植物降解質(zhì)，所述第二種植物降解質(zhì)和所述生物質(zhì)樣品混合。
43.一種制備植物生物質(zhì)降解質(zhì)的方法，包括制備至少一種含有可表達(dá)纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚 糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶、面包酶或 里氏木酶的葉綠體的植物， 采摘所述植物；并加工所述植物，生成適于混合且可降解生物質(zhì)樣品的植物降解質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中加工過程包括純化表達(dá)酶。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述植物為煙草、生菜、甜菜、菠菜或胡蘿
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述加工過程包括對所述植物或部分植物進(jìn)行 均質(zhì)。
47.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中包括至少制備下列兩種植物制備含有可表 達(dá)纖維素酶的葉綠體的第一種植物，制備含有可表達(dá)木質(zhì)素酶的葉綠體的第二種植物， 制備含有可表達(dá)葡萄糖苷酶的葉綠體的第三種植物，制備含有可表達(dá)半纖維素酶的 葉綠體的第四種植物，制備含有可表達(dá)木聚糖酶的葉綠體的第五種植物，制備含有可表 達(dá)α-淀粉酶的葉綠體的第六種植物，制備含有可表達(dá)淀粉葡糖苷酶的葉綠體的第七種 植物，制備含有可表達(dá)果膠酸裂解酶的葉綠體的第八種植物，制備含有可表達(dá)角質(zhì)酶的 葉綠體的第九種植物，制備含有可表達(dá)脂肪酶的葉綠體的第十種植物，以及制備含有可 表達(dá)果膠酶的葉綠體的第十一種植物。
48.可有效降解植物生物質(zhì)生成可發(fā)酵性糖的植物質(zhì)，所述物質(zhì)含有加氧酶、里氏木 酶以及至少一種纖維素酶、木質(zhì)素酶、β-葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀 粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶或果膠酶。
49.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物為粉末狀。
50.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中相對于表達(dá)第一種或第二種酶的葉綠體而言， 所述第一種或第二種植物為同源或異源。
51.含有一種表達(dá)的介質(zhì)含有可用結(jié)合組分、在葉綠體內(nèi)作用的促進(jìn)劑、可解碼植物 降解酶的異源核苷酸序列，至少一種可解碼制定特性的多肽的結(jié)構(gòu)基因或功能性基因片 段，其中對所述異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄通過所述促進(jìn)劑和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)進(jìn)行控制，葉綠體 DNA序列側(cè)翼序列側(cè)翼表達(dá)盒有助于通過重組實(shí)現(xiàn)表達(dá)盒向葉綠體基因組的平穩(wěn)整合。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為纖維素酶。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為木質(zhì)素酶。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為葡萄糖苷酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為半纖維素酶。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為木聚糖酶。
57.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為α-淀粉酶。
58.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為淀粉葡糖苷酶。
59.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為果膠酸裂解酶。
60.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為角質(zhì)酶。
61.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為脂肪酶。
62.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為果膠酶。
63.根據(jù)權(quán)利要求51所述的介質(zhì)，其中所述植物降解酶為面包酶。
64.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物質(zhì)，其中酶與加氧酶的比例為99 1 1 99; 50 1 1 50 ； 25 1 1 25 ； 10 1 1 10 ； 5 1 1 5 ；或 2 1 1 2。
65.消化柑橘生物質(zhì)的植物降解酶多酶混合物含有植物表達(dá)的纖維素酶、β-葡萄糖 苷酶，木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶中的一種或幾種， 所述多酶混合物中也可含有一定量的加氧酶。
66.一種消化木質(zhì)生物質(zhì)樣品的植物降解酶多酶混合物，含有植物表達(dá)纖維素酶、 β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、里氏木酶和果 膠酶，以及一定量的加氧酶。
67.—種植物降解酶多酶混合物，含有三種或三種以上下列基因產(chǎn)物celD、egl、 egll、cellO、IipY> pelA、pelB、pelD、cut、swol、xyn2、axel、bgll、manl、abfl 或 lipJ，所述基因與細(xì)胞異源，可穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化表達(dá)所述基因。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述多酶混合物，其中所述細(xì)胞為植物細(xì)胞。
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述多酶混合物，其中所述細(xì)胞為植物細(xì)胞核細(xì)菌細(xì)胞。
70.根據(jù)權(quán)利要求22所述植物，其中所述市售品種為LAMD或TN90。
71.降解植物生物質(zhì)和從所述生物質(zhì)有效生成可發(fā)酵性糖的植物降解多酶混合物，所 述多酶混合物含有至少三種重組表達(dá)植物降解酶、加氧酶和里氏木酶。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述多酶混合物，其中所述多酶混合物至少含有四種植物降解酶。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述多酶混合物，其中至少兩種植物降解酶含有下列酶中的幾 種纖維素酶、木質(zhì)素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、淀粉 葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、果膠酶或面包酶。
全文摘要
本文披露用于降解植物生物質(zhì)的材料。在典型實(shí)施例中，植物材料含有一種或幾種在植物和/或細(xì)菌中表達(dá)的酶。更具體的說上述植物降解酶在葉綠體中表達(dá)。葉綠體表達(dá)酶可用作多酶混合物，通過與傳統(tǒng)方法結(jié)合將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料，如纖維素乙醇。
文檔編號C12N15/52GK102016041SQ200980115298
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者亨利·丹尼爾 申請人:中央佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)有限公司