專利名稱：具有異丙醇生產(chǎn)能力的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異丙醇生產(chǎn)技術(shù)。更具體而言，涉及為賦予異丙醇生產(chǎn)功能而進(jìn)行 了特定的基因操作的棒狀細(xì)菌的轉(zhuǎn)化體和利用該轉(zhuǎn)化體的高效的異丙醇制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
異丙醇作為涂料或油墨等的工業(yè)用溶劑以及各種工業(yè)原料，目前世界上每年大 約生產(chǎn)180萬噸，即使在日本每年也大約生產(chǎn)18萬噸。另外，從異丙醇經(jīng)過簡單的脫水 反應(yīng)，可以轉(zhuǎn)變?yōu)樽鳛槟壳霸谌毡灸戤a(chǎn)310萬噸的聚丙烯的原料的丙烯。但是，所有這些制品都來自化石原油資源。從全球變暖問題、化石資源枯竭問題以及近年來原油價(jià)格高漲問題等地球環(huán)境 方面的問題考慮，另外，從降低重要化學(xué)制品原料資源的海外依賴度的觀點(diǎn)考慮，都迫 切需要開發(fā)利用與基本全部進(jìn)口的原油資源不同的可再生資源制造能源和化學(xué)制品的方 法。利用生物質(zhì)等可再生資源高效制造異丙醇的技術(shù)是可以解決這些各種問題的策略之
ο關(guān)于利用微生物從生物質(zhì)原料生成異丙醇的方法有如下報(bào)道進(jìn)行丙酮_ 丁醇 發(fā)酵的一種梭菌除丁醇之外還同時生產(chǎn)異丙醇(異丙醇-丁醇發(fā)酵)。這是因?yàn)?，通過表 現(xiàn)該發(fā)酵模式的梭菌所具有的異丙醇脫氫酶的催化反應(yīng)，丙酮被還原從而產(chǎn)生異丙醇。近年來，在世界各國生物燃料的生產(chǎn)利用提高的過程中，作為利用丙酮-丁醇 發(fā)酵得到的生物燃料，丁醇的生產(chǎn)研究再次受到關(guān)注，但這些都是以生產(chǎn)丁醇為主要目 的的研究，而基本沒有以生產(chǎn)異丙醇為目的研究。迄今為止，作為生產(chǎn)異丙醇的細(xì)菌，報(bào)道了作為異丙醇-丁醇發(fā)酵菌而已 知的梭菌屬細(xì)菌、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黃丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)等(非專禾丨J文獻(xiàn) 1)。但是，利用梭菌屬細(xì)菌的異丙醇生產(chǎn)存在以下的問題。(1)利用梭菌屬細(xì)菌進(jìn)行的異丙醇-丁醇發(fā)酵以丁醇為主要發(fā)酵代謝產(chǎn)物，異丙 醇的生產(chǎn)率低(異丙醇/ 丁醇生成比約為1/5-1/10)。(2)梭菌屬細(xì)菌在增殖和生產(chǎn)異丙醇的過程中需要絕對厭氧性條件。因此，需要 在厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，即，需要將培養(yǎng)裝置內(nèi)部用氮?dú)獾榷栊詺怏w等取代等繁雜的培 養(yǎng)操作，并且由于增殖速度極其緩慢，因此與之相應(yīng)的異丙醇生產(chǎn)速度低。為了解決這 些問題，考慮利用增殖速度高的好氧性微生物，但是，具有高效生產(chǎn)異丙醇的能力、并 且能在有氧條件下增殖的微生物(好氧性細(xì)菌或兼性厭氧細(xì)菌)還屬未知。(3)異丙醇-丁醇發(fā)酵中，在細(xì)胞增殖期生成乙酸和丁酸，在細(xì)胞增殖停止的穩(wěn) 定期中發(fā)酵培養(yǎng)液pH的酸性化成為向溶劑(異丙醇、丁醇)生成期轉(zhuǎn)移的誘因，代謝系 統(tǒng)發(fā)生大幅變化(代謝遷移(shift))從而生成異丙醇和丁醇。這樣，發(fā)酵過程需要嚴(yán)密的 控制，且從發(fā)酵開始后到生成異丙醇和丁醇之前需要花費(fèi)時間。另外，這些梭菌會由于 轉(zhuǎn)移到孢子形成期而停止生成異丙醇和丁醇，有不能長時間持續(xù)生成等問題。
因此，期望進(jìn)行解決這些問題的新型異丙醇生產(chǎn)微生物的創(chuàng)制和生產(chǎn)方法的開發(fā)。作為使用梭菌屬細(xì)菌的異丙醇生產(chǎn)技術(shù)，公開了如下所述的技術(shù)。非專利文獻(xiàn)1中公開了如下內(nèi)容拜式梭菌(Clostridiumbeijerinckii)除丁醇外 還生成異丙醇，金黃丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)除丁醇和丙酮外還生成異丙醇。另外，非專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3中公開了將梭菌屬細(xì)菌固定從而連續(xù)生產(chǎn) 異丙醇的技術(shù)；非專利文獻(xiàn)4中公開了使用具有凝聚性的梭菌屬細(xì)菌來生產(chǎn)異丙醇的技 術(shù)；非專利文獻(xiàn)5中公開了在梭菌屬細(xì)菌的異丙醇-丁醇發(fā)酵中，通過添加高分子樹脂， 吸附作為產(chǎn)物的異丙醇和丁醇從而減輕產(chǎn)物抑制的技術(shù)。但是，這些是以生產(chǎn)丁醇為主 要目的的技術(shù)，并且，均為使用梭菌屬細(xì)菌在厭氧條件下生產(chǎn)異丙醇的技術(shù)，對上述的 (1)、(2)、(3)等中指出的問題，絲毫沒有起到根本的解決作用。另一方面，雖然不是異丙醇的生產(chǎn)技術(shù)，但作為使用梭菌屬細(xì)菌生產(chǎn)丙酮-丁 醇的技術(shù)，公開了以下的技術(shù)。專利文獻(xiàn)1中公開了通過調(diào)控與孢子形成相關(guān)的基因使孢子形成期延遲，從而 提高丁醇生產(chǎn)的技術(shù)；專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)6中公開了在連續(xù)發(fā)酵法中，通過氣提 法來連續(xù)提取丁醇的技術(shù)；非專利文獻(xiàn)7和非專利文獻(xiàn)8中公開了將梭菌屬細(xì)菌固定來 生產(chǎn)丁醇的技術(shù)；非專利文獻(xiàn)9中公開了在連續(xù)發(fā)酵法中使用高濃度的梭菌屬細(xì)菌的菌 體，并將菌體重復(fù)利用的技術(shù)。這些技術(shù)被認(rèn)為也能夠應(yīng)用于使用梭菌屬細(xì)菌的異丙 醇_ 丁醇發(fā)酵中，但是均為使用梭菌屬細(xì)菌在厭氧條件下進(jìn)行的生產(chǎn)技術(shù)這一點(diǎn)沒有任 何改變，對于上述的問題絲毫沒有起到從根本上解決的作用。作為使用梭菌屬細(xì)菌以外的微生物的異丙醇生產(chǎn)技術(shù)，有如下技術(shù)。本發(fā)明人已經(jīng)提出了使用大腸桿菌(Escherichia coli)作為宿主的異丙醇生產(chǎn)技術(shù) (專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)10)。非專利文獻(xiàn)11公開了將選自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)禾口布氏 熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii)的微生物來源的編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙 酰乙酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶和異丙醇脫氫酶的基因在作為宿主 的大腸桿菌(Escherichia coli)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)從而生產(chǎn)異丙醇的技術(shù)。但是，上述技術(shù)中，為了能夠使用微生物更高效地生產(chǎn)異丙醇，還存在改善的 余地。專利文獻(xiàn)1 PCT公開公報(bào)W02006007530專利文獻(xiàn)2 美國公開專利公報(bào)US 2005089979專利文獻(xiàn)3:日本特愿2007-222633非專禾丨J 文獻(xiàn) 1 Applied and Environmental Microbiology, Vol.45, 1983， pll60-1163.非專利文獻(xiàn)2 : Enzyme and Microbial Technology，Vol.5, 1983, p46-54.非專利文獻(xiàn)3 : Biotechnology and Bioengineering，Vol.39, 1992, pl48-156.非專利文獻(xiàn)4 : Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.32, 1989，p22_26.非專利文獻(xiàn)5 : Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.25, 1986，p29_31.
非專利文獻(xiàn)6 Bioprocess and Biosystems Engineering, Vol.27, 2005，p207_214.非專利文獻(xiàn)7: Pakistan Journal of Biological Sciences, Vol.9, 2006，pl923-1928.
非專利文獻(xiàn) 8 : Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.113-116，2004， p887-898.非專利文獻(xiàn)9 : JournalofBiotechnol，Vol.120, pl97_206.非專利文獻(xiàn)10 : Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.77, 2008， pl219-1224.非專利文獻(xiàn)11 : Applied and Environmental Microbiology, Vol.73, 2007， p7814-7818.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，能夠以可再生資源為原料來生產(chǎn)異丙醇的重組微生物 和能夠使用該微生物高效制造異丙醇的方法。本發(fā)明人為解決所述課題，進(jìn)行了反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過將編碼具有乙酰 輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因、編碼具有乙酰乙酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移 酶活性的酶的外源性基因、編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因、和編碼具 有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因?qū)氲桨魻罴?xì)菌中而創(chuàng)制的轉(zhuǎn)化體可高效生產(chǎn)異丙醇。根據(jù)本發(fā)明的使用棒狀細(xì)菌作為宿主的技術(shù)，與使用大腸桿菌作為宿主的技術(shù) 相比，可以發(fā)現(xiàn)若干優(yōu)良特征。大腸桿菌(Escherichiacoli)在3.5%的異丙醇存在下就不能增殖，與此相對，棒 狀細(xì)菌即使在5%的異丙醇存在下也能夠增殖，棒狀細(xì)菌與大腸桿菌(Escherichia coli)相 比，對異丙醇具有更高的耐受性(參見后述實(shí)施例)。這表明在進(jìn)行高濃度的異丙醇生產(chǎn) 時，作為宿主，棒狀細(xì)菌優(yōu)于大腸桿菌(Escherichia coli)。S卩，能夠以高濃度生產(chǎn)異丙醇 這一點(diǎn)意味著從發(fā)酵液中回收純化異丙醇所需的能量少，作為工業(yè)上的制造方法具有高 優(yōu)越性。另外，本發(fā)明人目前已經(jīng)公開了使基因重組型谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)在還原條件下的反應(yīng)液中反應(yīng)，從而在增殖抑制的狀態(tài)下高效生產(chǎn)乳酸、琥 珀酸或乙醇的技術(shù)(專利第3869788號)。此次，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基因重組型棒狀細(xì)菌在增殖抑制條件下可高效 地生產(chǎn)異丙醇(參見后述的實(shí)施例)。該發(fā)現(xiàn)意味著物質(zhì)生產(chǎn)中使用的碳質(zhì)的流向?qū)Ｒ坏爻蚰繕?biāo)產(chǎn)物，而不用于增 殖。并且還意味著伴隨增殖分裂而產(chǎn)生的分泌物實(shí)現(xiàn)了實(shí)質(zhì)性的抑制。該發(fā)現(xiàn)也使本發(fā) 明的利用重組型棒狀細(xì)菌的異丙醇生產(chǎn)技術(shù)成為高效、低能耗型的回收純化方法。因此，通過重組技術(shù)賦予棒狀細(xì)菌異丙醇生產(chǎn)能力，是比利用重組型大腸桿菌 等、與增殖相伴地生產(chǎn)異丙醇的技術(shù)更高效的技術(shù)。本發(fā)明是基于上述見解完成的，提供以下的微生物及使用該微生物的異丙醇制 造方法。(1) 一種具有異丙醇生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過將下述(a) (d)的基因?qū)氚魻罴?xì)菌而得到，(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)活性的酶的
外源性基因；(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A 乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)活性的酶的外源性基因；(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶(Acetoacetate decarboxylase)活性的酶的外源性基 因；(d)編碼具有異丙醇脫氫酶(Isopropanol dehydrogenase)活性的酶的外源性基因。(2)如上述(1)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號13的堿基序列的DNA、或具有與序列編號13 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶 活性的多肽的DNA，作為(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號14的堿基序列的DNA、或具有與序列編號14 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸 輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA，作為(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移 酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號15的堿基序列的DNA、或具有與序列編號15 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的 多肽的DNA，作為(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號16的堿基序列的DNA、或具有與序列編號16 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有異丙醇脫氫酶活性的多 肽的DNA，作為(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因。(3)上述⑴或⑵所述的轉(zhuǎn)化體，其中，(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因、(b)編碼具有乙 酰乙酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因、(C)編碼具有乙酰乙酸脫 羧酶活性的酶的外源性基因、和(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因， 相同或不同，為來源于選自由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、 金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁 醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁酉享梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、 巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum) > 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) > 尸毒梭 菌(Clostridium cadaveris) > 叚破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)禾口真氧產(chǎn)堿桿菌 (Ralstonia eutropha)組成的組中的微生物的基因。(4)上述⑴ (3)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，(b)編碼具有乙酰乙 酰輔酶A 乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因是大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的 基因，和/或(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因是赤紅球菌(Rhodococcus ruber)來源的基因。(5)上述⑴ (4)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，棒狀細(xì)菌選自由棒桿菌屬細(xì)菌、短桿菌屬細(xì)菌和節(jié)桿菌屬細(xì)菌組成的組。(6)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ISO 1 轉(zhuǎn)化體(保藏編號 NITE BP-561)、或谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) IS02 轉(zhuǎn)化體(保藏編號 NITE BP-562)。(7) 一種制造異丙醇的方法，包括將上述(1) (6)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在含 有糖類的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，和從培養(yǎng)物中回收異丙醇的步驟。發(fā)明效果本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以極其有效地從糖類生產(chǎn)異丙醇。根據(jù)本發(fā)明，能夠以可再生資源為原料高效地生產(chǎn)異丙醇，并能夠構(gòu)建新型的 不依賴于石油資源原料的異丙醇工業(yè)生產(chǎn)方法。


圖1是表示實(shí)施例1的第⑵項(xiàng)中制作的質(zhì)粒pCRA725-SSIlI-ACE的制作方法
的示意圖。圖2是表示實(shí)施例1的第(2)項(xiàng)中制作的質(zhì)粒pCRC204的示意圖。圖3是表示異丙醇存在下的大腸桿菌(Escherichia coli) JM109/pCRC202和谷氨酸 棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) IS02 的增殖曲線的圖。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。(I)具有異丙醇牛產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的具有異丙醇生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體是將以下的(a) (d)的基因?qū)氲桨魻?細(xì)菌而得到的轉(zhuǎn)化體(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因；(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因。本發(fā)明中作為轉(zhuǎn)化對象的宿主，只要是經(jīng)含有異丙醇生產(chǎn)相關(guān)基因群的重組載 體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并表達(dá)這些基因所編碼的異丙醇生產(chǎn)相關(guān)酶從而可以生產(chǎn)異丙醇的棒狀細(xì) 菌，則沒有特別限定。棒狀細(xì)菌是指《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[BargeysManualofDeterminative Bacteriology、第8卷、599 (1974)]所定義的一群微生物，主要能在通常的有氧條件下增
殖，則沒有特別限定。具體示例可以列舉棒桿菌屬細(xì)菌、短桿菌屬細(xì)菌、節(jié)桿菌屬細(xì) 菌、分枝桿菌屬細(xì)菌或細(xì)球菌屬細(xì)菌等。另外，作為棒狀細(xì)菌，具體而言，作為棒桿菌屬細(xì)菌可以列舉谷氨酸棒 桿菌(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、ATCC13032、ATCC13058、 ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、 ATCC13745、ATCC13746, ATCC1376U ATCC14020 或 ATCC31831 等。
作為短桿菌屬細(xì)菌可以列舉乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) ATCC13869,黃色短桿菌 CBrevibacterium flavum) MJ-233 (FERM BP-1497)或者 MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)、或產(chǎn)氨短桿菌 CBrevibacterium ammoniagenes) ATCC6872 等。作為節(jié)桿菌屬細(xì)菌可以列舉球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) ATCC8010、ATCC4336、ATCC21056、ATCC31250、ATCC31738 或 ATCC35698 等。作為分枝桿菌屬細(xì)菌可以列舉牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)ATCC19210 或 ATCC27289 等。作為細(xì)球菌屬細(xì)菌可以列舉弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii) 239號 (FERM P-13221)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus) 240 號(FERM P-13222)、脲微球菌 (Micrococcus ureae)IAMlO 10 或玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)IF03764 等。另外，這些棒狀細(xì)菌除野生株以外，還可以是其突變株或人工基因重組體。例 如，作為這樣的棒狀細(xì)菌可以列舉乳酸脫氫酶(Iactatedehydrogenase)基因阻斷(破壊) 株、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)基因阻斷株、蘋果酸脫 氫酶(malate dehydrogenase)基因阻斷株等。作為本發(fā)明中的宿主的棒狀細(xì)菌，優(yōu)選棒桿菌屬細(xì)菌，特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)。異丙醇牛產(chǎn)相關(guān)基因作為上述(a) (d)的異丙醇生產(chǎn)相關(guān)基因，如果含有這些基因的DNA片段的 堿基序列已知，則可以使用按照該序列合成的DNA片段。即使在DNA序列未知的情況 下，也可以基于異丙醇生產(chǎn)相關(guān)酶蛋白間的保守氨基酸序列，通過雜交法、PCR法來獲 取片段。還可以使用基于其它已知異丙醇生產(chǎn)相關(guān)基因序列而設(shè)計(jì)的混合引物，通過簡 并PCR來獲取片段。上述(a) (d)的異丙醇生產(chǎn)相關(guān)基因只要可以保持異丙醇生產(chǎn)活性，則堿基 序列的一部分可以取代為其它堿基，也可以刪除，還可以插入新的堿基，另外堿基序列 的一部分也可以發(fā)生轉(zhuǎn)座。這些衍生物中的任何一種都可以用于本發(fā)明。上述“一部 分”，例如以氨基酸殘基換算，可以為1至數(shù)個(通常為1-5個，優(yōu)選為1-3個，更優(yōu)選 為1-2個)。上述(a) ⑷的基因通常在異丙醇生產(chǎn)菌中具有。作為生產(chǎn)異丙醇的細(xì) 菌，可以列舉作為丁醇-異丙醇發(fā)酵菌而已知的梭菌屬細(xì)菌、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)等[Geprge, H.A.等， Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum.Appl.Environ.Microbiol.45 1160-1163(1983)],已經(jīng)報(bào)道了從乙酰輔酶A通過四步反應(yīng)可以生成異丙醇[Mitchell， W.J.，Physiology of carbohydrate to solvent conversion by Clostridia.Adv.Microb.Physiol.39 31-130(1998)]0這些梭菌屬細(xì)菌中的異丙醇生成路徑，即從乙酰輔酶A到異丙醇的代謝路 徑，具體而言，由催化從乙酰輔酶A到乙酰乙酰輔酶A的反應(yīng)的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn) 移酶(AcetyHCoA acetyltransferase)(別名硫解酶(Thiolase))(以下，將其基因記為“thl”，將酶記為“THL”)、催化從乙酰乙酰輔酶A到乙酰乙酸的反應(yīng)的乙酰乙酰輔 酶A 乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)(以下，將其基因記 為“atoAD”，將酶記為“CTF”)、催化從乙酰乙酸到丙酮的反應(yīng)的乙酰乙酸脫羧酶 (Acetoacetate decarboxylase)(以下，將其基因記為“adc”，將酶記為“ADC”)、和催 化從丙酮到異丙醇的反應(yīng)的異丙醇脫氫酶(Isopropanol dehydrogenase)(別名伯-仲醇脫氫 酶(Primary-secondary alcohol dehydrogenase))(以下，將其基因記為 “adh”，將酶記為 “ADH” )所構(gòu)成。在本發(fā)明中使用該代謝系統(tǒng)。另外，只要具有異丙醇生成功能，則上述(a) (d)的基因的來源微生物的種類、組合及順序等沒有限制。另外，上述(a) (d)的基因也可以從不具有異丙醇生產(chǎn)能力的細(xì)菌中獲取。具 體而言，可以列舉以下的示例。梭菌屬細(xì)菌不生產(chǎn)異丙醇，但報(bào)道了進(jìn)行丁醇-丙酮發(fā)酵的丙 酮丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖乙酸多丁 醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁酉享梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、 巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒 梭菌(Clostridium cadaveris) > /[叚破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)等[Geprge， H.A.等，Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum.Appl.Environ.Microbiol.45 1160-1163(1983)]。據(jù)報(bào)道，這些進(jìn)行丁醇-丙酮發(fā)酵的梭菌屬細(xì)菌為了生成丙酮， 具有編碼從乙酰輔酶A到丙酮的三個步驟的酶(THL、CTF和ADC)的基因[Nolling， J.等，Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridiumacetobutylicum.J.Bacteriol. 183 4823-4838]。因此，可以分別使用上述進(jìn)行 丁醇_丙酮發(fā)酵的梭菌屬細(xì)菌來源的編碼THL的基因、編碼CTF的基因和編碼ADC的 基因來代替進(jìn)行丁醇-異丙醇發(fā)酵的拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黃丁酸梭菌 (Clostridium aurantibutyricum)等來源的編碼THL的基因、編碼CTF的基因和編碼ADC 的基因，或者與這些基因中的一種或兩種以上一起使用。另外，目前，通過對超過600種的生物物種進(jìn)行基因組解析，并通過與基因數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，能夠容易地提取多種生物物種來源的目的基因的信息和分離該基 因。因此，也能夠容易地分離出上述梭菌屬細(xì)菌以外的生物物種來源的編碼THL的基 因、編碼CTF的基因、編碼ADC的基因和編碼ADH的基因。以與上述梭菌屬細(xì)菌 來源的異丙醇生產(chǎn)相關(guān)基因具有較高同源性的基因?yàn)槔?，作為編碼THL的基因，可以 列舉產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、克氏 梭菌(Clostridium kluyveri) > 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) > 諾氏梭菌(Clostridium novyi)、 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、熱角軍糖梭菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、寸一毛〉于 7 i>^r ν r -I1 7 ^ ^· (Thermosinus carboxydivorans)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、生S氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans) > 騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis) > 還原脫硫腸 狀菌(Desulfotomaculumreducens)、海洋螺菌屬細(xì)菌(Oceanospirillum sp.)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)等來源的編碼THL的基因。
作為編碼CTF的基因，可以列舉騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoiinaerobacter tengcongensis)、大腸桿菌(Escherichia coli) Kl2等來源的編碼CTF的基因。作為編碼ADC的基因，可以列舉紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、黑胡桃鏈霉菌(Streptomyces nogalater)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)等來源的編碼ADC的基因。作為編碼ADH的基因，可以列舉赤紅球菌(Rhodococcus ruber)、產(chǎn)乙醇 熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、騰？中 B耆熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、布氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii) > 寸一毛〉于 7 力卟 # 今 ν r 彳 ffi y y % (Thermosinus carboxydivorans)、巴氏甲燒7V疊球菌(Methanosarcina barkeri)等來源的編碼ADH的基因。因此，只要各自顯示出相同的酶催化反應(yīng)，就可以使用例如在此列舉的其它生 物物種來源的編碼THL的基因、編碼CTF的基因、編碼ADC的基因和編碼ADH的基因 來代替上述進(jìn)行丁醇_異丙醇發(fā)酵或丁醇_丙酮發(fā)酵的梭菌屬細(xì)菌來源的編碼THL的基 因、編碼CTF的基因、編碼ADC的基因和編碼ADH的基因，或者與這些基因中的一種 或兩種以上一起使用。在本發(fā)明中，作為上述(a) (d)的基因，優(yōu)選分別使用來源于選自由丙 酮丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、赤紅球菌 (Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁酉享梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、 糖丙酮丁 醇梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、fx 破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetanomorphum)和真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstoniaeutropha)組成的組中 的相同或不同的微生物的編碼THL的基因、編碼CTF的基因、編碼ADC的基因和編碼 ADH的基因。在本發(fā)明中，上述(b)的基因優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的基因，和 /或(d)的基因優(yōu)選為赤紅球菌(Rhodococcusraber)來源的基因。在本發(fā)明中，作為上述ω (d)的基因，最優(yōu)選使用丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)來源的編碼 THL、ADC 的各基因、大腸桿菌(Escherichia coli)來源的編碼CTF的基因和赤紅球菌(Rhodococcusraber)來源的編碼ADH的基因。在本發(fā)明中，還優(yōu)選使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號13的堿基序列的DNA、或具有與序列編號13 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶 活性的多肽的DNA，作為(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號14的堿基序列的DNA、或具有與序列編號14 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸 輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA，作為(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移 酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號15的堿基序列的DNA、或具有與序列編號15 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的多肽的DNA，作為(C)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號16的堿基序列的DNA、或具有與序列編號16 的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有異丙醇脫氫酶活性的多 肽的DNA，作為(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因。序列編號13和15的堿基序列的DNA是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)來源的基因。另外，序列編號13是編碼THL的thl基因的堿基序列；序 列編號15是編碼ADC的adc基因的堿基序列。序列編號14的堿基序列的DNA是大腸 桿菌(Escherichia coli)來源的基因。另外，序列編號14是編碼CTF的atoAD基因的堿 基序列。序列編號16的堿基序列的DNA是赤紅球菌(Rhodococcus ruber)來源的基因。 另外，序列編號16是編碼ADH的adh基因的堿基序列。本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指通常的條件，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第二版，1989，第二卷，pi 1.45 等所記載的
條件。具體而言，是指在比完全雜交的解鏈溫度(Tm)低5 10°C的溫度下發(fā)生雜交的 情況。此處，更優(yōu)選的“嚴(yán)格條件”是指，在序列間存在90%以上、更優(yōu)選95%以 上、特別優(yōu)選98%以上的同源性時發(fā)生雜交的情況。這樣的“嚴(yán)格條件”，記載于上 述《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉 港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)，特別是第11.45節(jié)“寡核苷酸引物的雜交條件”(Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes)，此處可以使用記載的條件。本發(fā)明中，堿基序列間的同源性是使用計(jì)算軟件GENETYX(注冊商標(biāo)) Ver.8(基因公司制造)計(jì)算出的值。另外，本發(fā)明中，與某一 DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，例如，在嚴(yán)格條件下 與具有與序列編號13的堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交的DNA，優(yōu)選與序 列編號13的堿基序列具有約90%以上的序列同源性，更優(yōu)選具有約95%以上的序列同源 性，特別優(yōu)選具有約98%以上的序列同源性。作為用于通過PCR (polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法將各種生物來
源的編碼THL的外源性基因、編碼CTF的外源性基因、編碼ADC的外源性基因和編碼 ADH的外源性基因的各序列進(jìn)行擴(kuò)增的寡核苷酸引物組，可以列舉以下引物組。作為這 樣的引物組，可以列舉例如用于擴(kuò)增編碼THL的基因的由序列編號1和2的堿基序列 表示的引物組；用于擴(kuò)增編碼CTF的基因的由序列編號5和6的堿基序列表示的引物組； 用于擴(kuò)增編碼ADC的基因的由序列編號3和4的堿基序列表示的引物組；用于擴(kuò)增編碼 ADH的基因的由序列編號7和8的堿基序列表示的引物組等。PCR法可以利用公知的PCR裝置，例如熱循環(huán)儀等。PCR的循環(huán)依照公知技 術(shù)進(jìn)行即可，例如，設(shè)變性、退火、延伸為一個循環(huán)，通常為10 100循環(huán)，優(yōu)選約 20 50循環(huán)。作為PCR的模板，使用從顯示上述異丙醇生成路徑的酶活性的微生物中 分離出的DNA，通過PCR法，可以擴(kuò)增分別編碼THL、CTF> ADC和ADH的基因的 cDNA。通過PCR法得到的基因可以導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中。作為克隆方法，可以使 用pGEM-T easy載體系統(tǒng)(Promega公司制造)、TOPO TA-克隆系統(tǒng)(Invitrogen公司制 造)、Mighty克隆試劑盒(Takara公司制造)等可通過商業(yè)銷售獲得的PCR克隆系統(tǒng)等。另外，方法的一個示例在實(shí)施例中有詳細(xì)記述，也可以基于已知的編碼THL的基因、編 碼CTF的基因、編碼ADC的基因和編碼ADH的基因各自的堿基序列，通過使用恰當(dāng)設(shè) 計(jì)的合成引物作為模板的雜交法，來獲得含有該區(qū)域的DNA片段。載體的構(gòu)建接下來，將含有由PCR法得到的基因的克隆載體導(dǎo)入到微生物，例如大腸桿菌 (ESCheriChiaCOli)JM109菌株等中，從而轉(zhuǎn)化該菌株。將該轉(zhuǎn)化后的菌株在含有適當(dāng)抗生 素(例如氨芐青霉素、氯霉素等)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中回收菌體。從回收 的菌體中提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的提取可以通過公知的技術(shù)進(jìn)行，或者也可以使用 市售的質(zhì)粒提取試劑盒來簡便地提取。作為市售的質(zhì)粒提取試劑盒，可以列舉QIAquick 質(zhì)粒純化試劑盒(商品名Qiaquick plasmid purification kit, QIAGEN公司制造)等。通 過確定該提取的質(zhì)粒DNA的堿基序列，可以確認(rèn)編碼THL的基因、編碼CTF的基因、編 碼ADC的基因和編碼ADH的基因的各序列。DNA堿基序列可以通過公知的方法，例如 雙脫氧末端終止法等進(jìn)行確定。另外，也可以利用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，使用多熒光技術(shù)進(jìn) 行檢測來確定堿基序列。另外，也可以使用DNA測序儀，例如ABI PRISM 3730x1 DNA 分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)等來確定。上述方法可以基于基因工程實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法來進(jìn)行。各種微生物的載體和外源 基因的導(dǎo)入及表達(dá)方法在很多實(shí)驗(yàn)書籍中都有記載，[例如，Sambrook，J. ^P Russel, D.W.,《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第三版)， 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(2001)；或Ausubel，F(xiàn).等，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current protocols in molecular biology)，Green Publishing and Wiley Interscience,紐約(1987)等], 因此可以按照這些記載進(jìn)行載體的選擇、基因的導(dǎo)入和表達(dá)。種類廣泛的啟動子適合在本發(fā)明中使用。這樣的啟動子可以從包含酵母、細(xì)菌 及其它細(xì)胞供給源在內(nèi)的多種公知的供給源得到，只要是在棒狀細(xì)菌中具有使目的基因 開始轉(zhuǎn)錄的功能的堿基序列，則任何一種都可以。作為這樣的啟動子的適當(dāng)例，例如在 棒狀細(xì)菌中可以使用lac、trc、tac啟動子等。本發(fā)明中使用的啟動子根據(jù)需要可以進(jìn)行 修飾從而改變其調(diào)控機(jī)制。另外，對于配置在目的基因下游的調(diào)控序列下的終止子，只 要是在棒狀細(xì)菌中具有使該基因轉(zhuǎn)錄終止的功能的堿基序列，也是任何一種都可以。然后，在所述的棒狀細(xì)菌中，使編碼THL、CTF、ADC、ADH的各基因在質(zhì) 粒上或染色體上進(jìn)行表達(dá)。例如，使用質(zhì)粒將這些基因?qū)氲侥軌蜻M(jìn)行表達(dá)的調(diào)控序列 下。此處，“調(diào)控序列下”是指，這些基因通過與例如啟動子、誘導(dǎo)物、操縱子、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等的共同工作，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。作為為實(shí)現(xiàn)這樣的目的而 使用的質(zhì)粒載體，只要是含有在棒狀細(xì)菌內(nèi)掌控自主復(fù)制功能的基因的質(zhì)粒載體即可。 作為其具體例，可以列舉例如乳酸發(fā)酵短桿菌CBrevibacterium lactofermentum) 2256來 源的 ρΑΜ330[日本特開昭 58_676"號公報(bào)]、[Miwa, K.等，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria, Agric.Biol.Chem, 48: 2901-2903(1984)]禾口 [Yamaguchi, R.等，Determination of the complete nucleotide sequence ofthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis ο fits genetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16 265-267(1985)]、谷氨酸棒桿菌 ATCC13058 來源的 pHM1519[Miwa，K.等，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48 : 2901-2903 (1984)]禾口pCRY30[Kurasu, Y.等，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl.Environ.Microbiol.57 759-764(1991)]、谷氨酸棒桿菌 T250 來源的 pCG4[日本特 開日召 57—183799]、 [Katsumata, R.等，Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.159 306-311 (1984)], ρ AG 1> pAG3、pAG14、 pAG50[日本特開昭 62-166890 號公報(bào)]、pEKO、pEC5、pEKExl[Eikmanns, B.J.等，A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing.Gene，102 : 93-98 (1991)]及其衍生物等。還可以 列舉噬菌體DNA等，只要能夠在宿主中進(jìn)行復(fù)制，則也可以使用其它任何一種載體。另 外，載體優(yōu)選含有內(nèi)部具有各種限制性酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，或含有單一的限制性酶 切位點(diǎn)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌的創(chuàng)制中所使用的質(zhì)粒載體，可以如下構(gòu)建例如在使 用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)來源的編碼THL、ADC的各基因、大腸桿 菌(Escherichia coli)來源的編碼CTF的基因和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)來源的編碼
ADH的基因的情況下，可以將確認(rèn)過堿基序列的該基因與適當(dāng)?shù)膯幼印⒔K止子等調(diào)控 序列連接后，插入到上述例示的任何一個質(zhì)粒載體的適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)處。詳細(xì)內(nèi) 容記載于實(shí)施例中。轉(zhuǎn)化作為將含有目的基因的質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)和棒狀細(xì)菌中 的方法，可以通過例如電穿孔法、氯化鈣/氯化銣法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染等公知的方法進(jìn)行。具體而言，例如大腸桿菌的情況下，可以進(jìn)行氯化鈣法或 電穿孔法[例如，Sambrook，J.和Russel，D.W.《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(第三版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(2001)；或 Ausubel， F.等，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current protocols in molecular biology)，Green Publishing and Wiley Interscience,紐約(I987)等]等，或者通過使用大腸桿菌JM109的 感受態(tài)細(xì)胞(寶酒造株式會社制造)的方法、依照該公司的試驗(yàn)規(guī)程來進(jìn)行；棒狀細(xì)菌 的情況下，可以通過公知的方法[Kurasu, Y.等，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation.Agric.Biol.Chem.54 443-447 (1990)] 禾口 [Vertes A.A.等，Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res.Microbiol.144 181-185 (1993)]來進(jìn)行電脈沖法。上述方法可以基于基因工程實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法來進(jìn)行。大腸桿菌和放線菌等各 種微生物的載體的信息和外源基因的導(dǎo)入及表達(dá)方法在很多實(shí)驗(yàn)書籍中都有記載(例 如，Sambrook，J.和 Russel，D.W.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2001 ； Hopwood，D.A.、Bibb, M.J.、Chater, K.F.、Bruton, C.J.、Kieser, H.M.、Lydiate, D.J.、Smith, C.P.、 Ward, J.M.、Schrempf，H.《鏈霉菌遺傳操作實(shí)驗(yàn)室手冊》(Genetic manipulation of Streptomyces:A laboratory manual)，約翰因斯研究所，諾維奇，英國，1985等)，因此可 以按照這些記載進(jìn)行載體的選擇、基因的導(dǎo)入和表達(dá)。作為通過上述方法創(chuàng)制的棒狀細(xì)菌的轉(zhuǎn)化體，具體可以列舉谷
氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)IS01(保藏編號 NITE BP-561)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)IS02(保藏編號 NITE BP-562)(均在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏 中心(日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8(郵政編碼292-0818))保藏完 畢。保藏日2008年4月15日)。這些轉(zhuǎn)化體也是本發(fā)明之一。 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體為了提高異丙醇生產(chǎn)率，可以進(jìn)一步含有基因修飾，所述基因 修飾可產(chǎn)生選自由糖酵解系統(tǒng)的流量增加、對異丙醇、滲透壓或有機(jī)酸的耐受性增加和 副產(chǎn)物(可以理解為指目標(biāo)產(chǎn)物以外的含碳分子)生產(chǎn)減少組成的組中的一種以上特征。 這樣的基因修飾具體而言可以通過外源性基因的過量表達(dá)和/或內(nèi)源性基因的失活、經(jīng) 典誘變、篩選和/或目標(biāo)突變體的挑選來導(dǎo)入。另外，轉(zhuǎn)化體可以通過使用紫外線、X射線或化學(xué)試劑等的人工突變導(dǎo)入方法 來產(chǎn)生突變，這樣得到任何一種突變株只要具有作為本發(fā)明目的的異丙醇生產(chǎn)能力，就 可以作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物來使用。這樣創(chuàng)制出的本發(fā)明的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體(以下僅稱為轉(zhuǎn)化體)，使用微生物培養(yǎng) 中通常使用的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)即可。作為該培養(yǎng)基，通常可以使用含有碳源、氮源、無 機(jī)鹽類及其它營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基等。作為碳源，可以列舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露醇、 木糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨醇或甘油等糖類和糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬 酸、馬來酸或葡萄糖酸等有機(jī)酸；乙醇等醇等。另外，根據(jù)需要，也可以使用正構(gòu)烷烴 等烴等。碳源可以單獨(dú)使用一種，或者也可以兩種以上混合使用。這些碳源在培養(yǎng)基中 的濃度通常為約0.1 10% (重量)、優(yōu)選為約0.5 10% (重量)。作為氮源，可以列舉氮化合物，例如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無 機(jī)或有機(jī)銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉或硝酸鉀等，但并不限定于這些。另外，也可 以使用玉米漿、肉類提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或氨基酸等含氮有機(jī)化 合物等。氮源可以單獨(dú)使用一種，或者也可以兩種以上混合使用。氮源在培養(yǎng)基中的 濃度因所使用的氮化合物而異，通常為約0.1 10% (重量)，優(yōu)選為約0.5 10% (重 量)O作為無機(jī)鹽類，可以列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝 酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷或碳酸鈣等。這些無機(jī)鹽可以單獨(dú)使用一種，或者也 可以兩種以上混合使用。無機(jī)鹽類在培養(yǎng)基中的濃度因所使用的無機(jī)鹽而異，通常為約 0.01 (重量)、優(yōu)選為約0.05 (重量)。作為營養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉例如肉類提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提 取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物或者動植物或微生物菌體提取 物、它們的分解產(chǎn)物等。營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度因所使用的營養(yǎng)物質(zhì)而異，通常為 約0.1 10% (重量)，優(yōu)選為約0.5 10% (重量)。另外，根據(jù)需要，也可以添加維 生素類。作為維生素類，可以列舉例如生物素、硫胺素(維生素Bi)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、煙酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約5 8。作為優(yōu)選的棒狀細(xì)菌用培養(yǎng)基，可以列舉A培養(yǎng)基[Inui，Μ.等，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7 182-196(2004)]、BT 培 養(yǎng) 基[Omumasaba, C.A.等，Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol. Biotechnol.8 91-103 (2004)]等。培養(yǎng)溫度通常為約15 45°C，優(yōu)選約25 35°C，培養(yǎng)時間可以為約1 7天。然后，將轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)菌體進(jìn)行回收。作為從如上所述得到的培養(yǎng)物中回收分 離培養(yǎng)菌體的方法，沒有特別限定，可以使用例如離心分離或膜分離等公知的方法?？梢詫厥盏呐囵B(yǎng)菌體進(jìn)行處理，并將得到的菌體處理物用于下一步驟。作為 所述菌體處理物，可以是對培養(yǎng)菌體進(jìn)行任何處理后所得到的處理物，可以列舉例如用 丙烯酰胺或卡拉膠等將菌體固定后得到的固定化菌體等。(II)異丙醇的制造方法從如上所述得到的培養(yǎng)物中回收分離的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)菌體或其菌體處理物，通 常供給有氧條件下或厭氧條件下的反應(yīng)培養(yǎng)基中的異丙醇生成反應(yīng)。包含將上述轉(zhuǎn)化體 在含有糖類的培養(yǎng)基(反應(yīng)培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，和從培養(yǎng)物中回收異丙醇的步驟 的異丙醇制造方法也是本發(fā)明之一。異丙醇的生成方式可以使用分批式、分批補(bǔ)料式(流加式)、連續(xù)式中的任何一 種生成方式。反應(yīng)培養(yǎng)基(反應(yīng)液)中含有作為異丙醇的原料的有機(jī)碳源(例如，糖類等)即 可。作為有機(jī)碳源，只要是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在生化學(xué)反應(yīng)中可以利用的物質(zhì)即可。具體而言，作為糖類，可以列舉葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖或 甘露糖等單糖類；纖維二糖、蔗糖或乳糖、麥芽糖等二糖類；或者糊精或可溶性淀粉等 多糖類等。特別優(yōu)選C6糖和C5糖等單糖類，但棒狀細(xì)菌有時不能利用木糖、阿拉伯糖 等C5單糖類。在這樣的情況下，只要賦予細(xì)菌可利用這些單糖的功能即可。另外，本 發(fā)明中，也可以使用兩種以上糖的混合糖。更優(yōu)選有機(jī)化合物的生成反應(yīng)中使用的反應(yīng)培養(yǎng)基通常含有轉(zhuǎn)化體或其處理物 為維持其代謝功能所必需的成分，即各種糖類等碳源；蛋白質(zhì)合成所必需的氮源；及 磷、鉀或鈉等的鹽類；以及鐵、錳或鈣等微量金屬鹽。這些成分的添加量可以根據(jù)所 需的反應(yīng)時間、目標(biāo)有機(jī)化合物生產(chǎn)物的種類或所使用的轉(zhuǎn)化體的種類等來進(jìn)行適當(dāng)確 定。根據(jù)所使用的轉(zhuǎn)化體，有時也優(yōu)選添加特定的維生素類。碳源、氮源、無機(jī)鹽類、 維生素、微量金屬鹽可以使用公知的物質(zhì)，例如增殖培養(yǎng)步驟中例示的物質(zhì)。培養(yǎng)基的pH通常優(yōu)選為約6 8。轉(zhuǎn)化體或其菌體處理物與糖類的反應(yīng)，優(yōu)選在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或其菌體處理物 能夠進(jìn)行活動的溫度條件下進(jìn)行，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化體或其菌體處理物的種類等進(jìn)行適當(dāng)選 擇。通常為約25 35°C即可。最后，收集如上所述在反應(yīng)培養(yǎng)基中生成的異丙醇。其方法可以使用生物加工中使用的公知的方法。作為這樣的公知的方法，可以列舉異丙醇生成液的蒸餾法、膜 滲透法、有機(jī)溶劑提取法等，可以根據(jù)反應(yīng)液的組成和副產(chǎn)物等來適當(dāng)確定其分離純化 收集方法。另外，本發(fā)明還提供對于通過所述條件下的反應(yīng)從糖類等生產(chǎn)異丙醇的方法有 顯著改善的生產(chǎn)異丙醇的重組轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1谷氨酸棒桿菌(Corvnebacterium glutamicum) ISOl和谷氨酸棒桿菌 (Corvnebacterium glutamicum) IS02 的倉1J匍I(1)異丙醇牛產(chǎn)基因群的克降異丙醇生物合成路徑(從乙酰輔酶A到異丙醇)由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移 酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)、乙酉先乙酉先輔酶A: 乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)、乙酰乙酸脫羧酶(Acetoacetate decarboxylase)和異丙醇脫氫 酶(Isopropanol dehydrogenase)這四個步驟(四種酶)構(gòu)成。通過以下的PCR法來擴(kuò)增
編碼這四種酶的基因。以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株的染色體和質(zhì)粒 DNA (從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)獲得； ATCC 824D-5)為模板，分別使用引物1和2 (序列編號1和2)、引物3和4(序列編號3 和4)通過PCR擴(kuò)增乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(thl)和乙酰乙酸脫羧酶基因(adc)。乙 酰乙酰輔酶A :乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(atoAD)以大腸桿菌(Escherichia coli) JM109菌 株的染色體為模板，使用引物5和6(序列編號5和6)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR使用 GeneAmp PCR System 9700 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)，在PCR反應(yīng)1 (94°C 30秒、58°C 30 秒、72°C1.5 分鐘、30 個循環(huán)；模板 DNAlOng、反應(yīng)液、dNTP 0.2mM、Prime Star DNA 聚合酶(TAKARA公司制造)2U、5 X Prime Star緩沖液6 μ L、引物各0.2μΜ、最終液 量30yL)的條件下進(jìn)行。使用上述擴(kuò)增后的反應(yīng)液3 μ L，用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電 泳，在thl基因、atoAD基因和adc基因的情況下可以分別檢測到約1.2kb、約1.3kb和約 0.7kb的DNA片段。使用Minelute PCR純化試劑盒(QIAGEN公司制造)純化擴(kuò)增后的 DNA片段。將赤紅球菌(Rhodococcus ruber)DSM 44541菌株利用胰化酪蛋白胨(Trypticase peptone)培養(yǎng)基(Becton Dickinson公司制造)在30°C下液體振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)16小時
后，將5mL培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離[微量高速冷卻離心機(jī)MX-301(卜$—精工公司制 造)5000rpm，10分鐘]，并將沉淀后的菌體用于提取染色體DNA。使用Isoplant II(日 本基因公司制造)，按照附帶的操作規(guī)程來提取染色體DNA。以赤紅球菌(Rhodococcus ruber)DSM 44541菌株的染色體DNA為模板，使用引物7和8 (序列編號7和8)，通過上 述PCR反應(yīng)1的條件擴(kuò)增異丙醇脫氫酶基因(adh)。使用擴(kuò)增后的反應(yīng)液3yL，用0.8% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測到包含adh基因的約l.Okb的DNA片段。使用Minelute PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增后的DNA片段。為了獲得基因表達(dá)啟動子(tac啟動子)，以pKK223-3 (Pharmacia公司制造)為 模板，使用引物9和10 (序列編號9和10)，通過上述PCR反應(yīng)1的條件擴(kuò)增包含tac啟動子的約0.2kb的DNA片段。反應(yīng)終止后，使用Minelute PCR純化試劑盒(QIAGEN公
司制造)純化擴(kuò)增后的DNA片段。將通過上述PCR反應(yīng)1得到的約1.3kb的包含atoAD基因的DNA片段、約0.7kb 的包含adc基因的DNA片段和約l.Okb的包含adh基因的DNA片段分別與tac啟動子連 接，該連接按照以下程序進(jìn)行。即，將上述三種各DNA片段和包含tac啟動子的DNA片 段以各約IOOng的量分別進(jìn)行混合，之后向其中混合dNTP 0.2mM、Prime Star DNA聚合 酶(TAKARA公司制造)2U、5 XPrime Star緩沖液6 μ L各試劑，使最終液量為30 μ L。 將該反應(yīng)液在PCR反應(yīng)2 (94°C 30秒、52°C30秒、72°C1.5分鐘、30個循環(huán))的條件下， 使用GeneAmp PCR System 9700進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)終止后，為了得到tac啟動子與各基因 (atoAD、adc和adh)相連接的DNA片段，以該反應(yīng)液0.5 μ L為模板，分別使用引物6和 9、引物4和11 (序列編號11)、引物8和12 (序列編號12)，按照上述PCR反應(yīng)1的條 件，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。使用擴(kuò)增后的反應(yīng)液3yL，用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 可以檢測到在tac啟動子上連接有atoAD基因的約1.5kb的DNA片段(Ptac-atoAD)、在 tac啟動子上連接有adc基因的約0.9kb的DNA片段(Ptac_adc)、和在tac啟動子上連接有 adh基因的約1.2kb的DNA片段(Ptac-adh)。這些DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分 離，并使用Minelute凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制造)從凝膠中進(jìn)行回收。按照操作說明書，將上述未連接tac啟動子的約1.2kb的thlDNA片段、連接有 tac啟動子的約1.5kb的包含Ptac-atoAD的DNA片段、約0.9kb的包含Ptac-adc的DNA片 段和約1.2kb的包含Ptac-adh的DNA片段分別與pGEM_T載體(Promega公司制造)相連 接，通過氯化鈣法[Journal of Molecular Biology，53，159 (1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109， 并涂布到含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基(將多聚蛋白胨10g、酵母提取 物5g、NaCl 5g和瓊脂15g溶解于蒸餾水IL中)上。將各培養(yǎng)基上的生長菌株通過常 規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶將該質(zhì)粒分別進(jìn)行 切割，由此確認(rèn)插入片段。進(jìn)而通過對該插入片段進(jìn)行測序來確認(rèn)目標(biāo)DNA序列的構(gòu) 建。將包含thl基因(序列編號13)的質(zhì)粒、包含atoAD基因(序列編號14)的質(zhì)粒、 包含adc基因(序列編號15)的質(zhì)粒和包含adh基因(序列編號16)的質(zhì)粒分別命名為 pGEM-thl、pGEM-Ptac-atoAD、pGEM-Ptac-adc 和 pGEM-Ptac-adh。另外，DNA 測序 儀使用ABI PRISM 3100 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)，測序反應(yīng)使用ABI PRISM循環(huán)測序 試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)。將由此制備的質(zhì)粒pGEM-thl、pGEM-Ptac-atoAD、 pGEM-Ptac-adc 和 pGEM-Ptac-adh 分別用限制性內(nèi)切酶 EcoRI 和 BamHI、BamHI 和 SphK SphI和SmaI以及EcoRI進(jìn)行切割后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并使用 Minelute凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制造)從凝膠中回收，由此，分別得到未連接tac 啟動子的包含thl基因的約1.2kb的EcoRI-BamHI DNA片段、連接有tac啟動子的包含 Ptac-atoAD基因的約1.5kb的BamHI-Sphl DNA片段、包含Ptac-adc基因的約0.9kb的 SphI-SmaI DNA片段和包含Ptac-adh基因的約1.2kb的EcoRI DNA片段。(2)表達(dá)質(zhì)粒pCRA725-SSIl 1~ACE和pCRC203的構(gòu)建與谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) ISOl 禾口谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ISQ2 的
MM將上述(1)項(xiàng)中獲得的未連接tac啟動子的包含thl基因的約1.2kb的EcoRI-BamHI DNA片段、連接有tac啟動子的包含Ptac-atoAD基因的約1.5kb的 BamHI-SphI DNA 片段和包含 Ptac_adc 基因的約 0.9kb 的 SphI-SmaI DNA 片段各 IOOng, 與預(yù)先用 EcoRI 和 SmaI 消化過的 pCRC200[Applied Microbiology and Biotechnology.77
853-860 (2007) ]10ng全部混合，通過DNA連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)。另外，由于 PCRC200在克隆位點(diǎn)上游含有tac啟動子，因此結(jié)果在thl基因上也連接有tac啟動子。 使用該連接液通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) JM109，并利用氯霉素抗性篩 選保持有含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌株，由此得到質(zhì)粒pCRC203(圖1、 序列編號17)。然后，為了將連接有tac啟動子的tM-atoAD-adc基因簇(遺伝子七^卜)以 無抗性標(biāo)記的方式導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌R的染色體中，根據(jù)文獻(xiàn)信息[AppLEnviron. Microbiol.,第71卷，3369-3372 (2005)]確定了對于該微生物的生長非必須的染色體區(qū) 域，并將tM-atoAD-adc基因簇插入到染色體SSIll區(qū)域內(nèi)。如下所述通過PCR法擴(kuò)增 該SSIll區(qū)域的DNA序列。進(jìn)行PCR時使用引物13和14(序列編號18和19)。另外，任何一個引物在末 端均添加有XbaI位點(diǎn)。模板DNA使用谷氨酸棒桿菌R的染色體DNA。染色體DNA的提取使用Isoplant 11(日本基因公司制造)，按照附帶的操作規(guī)程來進(jìn)行。PCR使用LA Taq HS DNA聚合 酶(TAKARA公司制造)，在PCR反應(yīng)3 (94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 3分鐘、30個循 環(huán))的條件下進(jìn)行。PCR反應(yīng)液的組成如下所示。反應(yīng)液組成(10 X) PCR 緩沖液 IOyL2.5mM dNTP 混合液 8 μ L模板 DNA 2 μ L (DNA 含量為 500ng 以下)上述兩種引物 各0.5 μ 1(最終濃度為0.2 μ M)LA Taq HS DNA 聚合酶0.5 μ L滅菌蒸餾水79 μ L將以上物質(zhì)混合并進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用如上所述生成的反應(yīng)液，用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測到包含 SSIll區(qū)域的約2.0kb的DNA片段。將上述用限制性內(nèi)切酶XbaI處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物與用XbaI進(jìn)行限制性內(nèi)切 酶處理后的染色體基因?qū)胗觅|(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，第8卷， 243-254 (2004)，(日本特開2006-124440)]混合，并向其中添加Mighty克隆試劑 盒(TAKARA公司制造)，然后按照操作說明書進(jìn)行反應(yīng)。使用該連接液通過氯化 鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) JM109，并篩選保持有含有目的基因片段的質(zhì)粒 DNA的大腸桿菌株，由此得到插入有包含SSIll區(qū)域的長約2.0kb的DNA片段的質(zhì)粒 pCRA725-SSIll(序列編號 20)。使用5’末端磷酸化的引物15和16 (序列編號21和22)，以質(zhì)粒pCRC203為模 板，通過PCR法擴(kuò)增thl-atoAD-adc基因簇。使用擴(kuò)增后的反應(yīng)液3 μ L，用0.8%的瓊 脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測到在tac啟動子上連接有thl、atoAD和adc基因的約3.8kb的DNA片段。將該DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并使用Minehite凝膠提取 試劑盒(QIAGEN公司制造)從凝膠中回收。將該DNA片段IOOng與預(yù)先在EcoRV處理 后用堿性磷酸酶(TAKARA公司制造)脫磷酸化后的pCRA725-SSIll IOng混合，并通過 DNA連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)。使用該連接液通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)JM109,并篩選保持有含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌株，由此得到質(zhì)粒 pCRA725-SSIlI-ACE(圖 1、序列編號 23)。染色體基因?qū)胗幂d體pCRA725是不能在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)R內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒。使用pCRA725_SSIll_ACE，通過電脈沖法[Agric. BioLChem.,第 54 卷，443-447 (1990)和 Res.Microbiol.，第 144 卷，181-185 (1993)]分 別轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) R和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)R IdhA 突變體[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，第 8 卷，243-254 (2004)]，并 通過含有卡那霉素50yg/mL的A瓊脂培養(yǎng)基[(NH2)2C0 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 · 7H20 0.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4 · 7H20+0.042 % (w/v) MnSO4 · 2H201mL、0.02% (w/v)生物素溶液 lmL、0.01% (w/v)硫胺素溶液 2mL、酵 母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g和瓊脂15g(每IL)]篩選基因?qū)?入株。將得到的基因重組菌株分別命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ACEl 和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ACE2。制作將上述(1)項(xiàng)得到的連接有tac啟動子的包含adh基因的約1.2kb的DNA片 段插入到谷氨酸棒桿菌的可自主復(fù)制的質(zhì)粒pCRBl[American Chemical Society Symposium Series 862 Fermentation Biotechnology，American Chemical Society, Washington, 175-191 (2003)]的EcoRI位點(diǎn)上的質(zhì)粒。具體而言，將連接有tac啟動子的包含adh基 因的EcoRI DNA片段IOOng與預(yù)先在EcoRI處理后用堿性磷酸酶脫磷酸化的pCRBl IOng 混合，并通過DNA連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)。使用該連接液通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Escherichia coli) JM109,并篩選保持有含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌株，由 此得到質(zhì)粒pCRC204(圖2、序列編號24)。通過電脈沖法，用質(zhì)粒pCRC204轉(zhuǎn)化谷氨酸 棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ACEl 禾口谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ACE2。使用含有50 μ g/mL卡那霉素和5 μ g/mL氯霉素的A瓊脂培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化株。 得到的基因重組株分別命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ISOl和谷氨酸
(Corynebacterium glutamicum)IS02。另外，這些基因重組株在日本千葉 縣木更津市上總鐮足2-5-8(郵政編碼292-0818)的獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評 價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏中心進(jìn)行保藏(保藏日2008年4月15 實(shí)施例2使用谷氨酸棒桿菌
權(quán)利要求
1.一種具有異丙醇生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過將下述(a) (d)的基因?qū)?入棒狀細(xì)菌而得到，(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因；(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中，使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號13的堿基序列的DNA、或具有與序列編號13的 堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活 性的多肽的DNA，作為(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號14的堿基序列的DNA、或具有與序列編號14的 堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸輔 酶A轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA，作為(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A :乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶 活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號15的堿基序列的DNA、或具有與序列編號15的 堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的多 肽的DNA，作為(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶活性的酶的外源性基因；使用在嚴(yán)格條件下與具有序列編號16的堿基序列的DNA、或具有與序列編號16的 堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且編碼具有異丙醇脫氫酶活性的多肽 的DNA，作為(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)化體，其中，(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因、(b)編碼具有乙酰 乙酰輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因、(C)編碼具有乙酰乙酸脫 羧酶活性的酶的外源性基因、和(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因， 相同或不同，為來源于選自由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、 金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁 醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁酉享梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、 巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum) > 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) > 尸毒梭 菌(Clostridium cadaveris) > 叚破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)禾口真氧產(chǎn)堿桿菌 (Ralstonia eutropha)組成的組中的微生物的基因。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，(b)編碼具有乙酰乙酰 輔酶A:乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶的外源性基因?yàn)閬碓从诖竽c桿菌(Escherichiacoli) 的基因，和/或(d)編碼具有異丙醇脫氫酶活性的酶的外源性基因?yàn)閬碓从诔嗉t球菌 (Rhodococcus ruber)的基因。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，棒狀細(xì)菌選自由棒狀桿菌 屬細(xì)菌、短桿菌屬細(xì)菌和節(jié)桿菌屬細(xì)菌組成的組。
6.谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) ISOl轉(zhuǎn)化體(保藏編號NITE BP-561)、或谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) IS02轉(zhuǎn)化體(保藏編號為NITEBP-562)。
7. —種制造異丙醇的方法，包括將權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在含有糖類 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，和從培養(yǎng)物中回收異丙醇的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有異丙醇生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過將下述(a)～(d)的基因?qū)氚魻罴?xì)菌而得到(a)編碼具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)活性的酶的外源性基因；(b)編碼具有乙酰乙酰輔酶A乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Acetoacetyl CoA:acetateCoA transferase)活性的酶的外源性基因；(c)編碼具有乙酰乙酸脫羧酶(Aeetoacetate decarboxylase)活性的酶的外源性基因；(d)編碼具有異丙醇脫氫酶(Isopropanol dehydrogenase)活性的酶的外源性基因。
文檔編號C12P7/04GK102016006SQ20098011464
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者乾將行, 湯川英明 申請人:財(cái)團(tuán)法人地球環(huán)境產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)