專利名稱：微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二元酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化正烷烴和脂肪酸甲酯生產(chǎn)長鏈α，ω-二羧酸的方 法，尤其是發(fā)酵正十八烷(nC18)和/或十八碳脂肪酸甲酯，生產(chǎn)十八碳二羧酸(DC18)的方法。
背景技術(shù)：
十八碳二元酸(DC18)是一種化工上合成醫(yī)藥中間體和尼龍1818工程塑料及涂料 等的重要原材料。0(18是自然界中不存在，化工方法無法合成，生物合成法也難以生產(chǎn)的精細(xì)化工新 材料。由于能利用正烷烴生產(chǎn)相應(yīng)鏈長二元酸的微生物都偏愛同化和氧化C14以上的正烷 烴，尤其嗜好同化和氧化正十八烷而生長，因此難以生成和積累十八碳二元酸，至今為止， 還未見生物合成法從正十八烷(IiC18)生產(chǎn)DC18的專利。現(xiàn)有技術(shù)僅有從十八碳脂肪酸(即硬脂酸)發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二元酸(DC18)的報 道，其公開數(shù)據(jù)為搖瓶發(fā)酵96小時，DC18的含量最多只有29. 7g/L。技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化Cltl-C18正烷烴和/或脂肪酸甲酯生產(chǎn) α, ω-二羧酸的方法，尤其是高產(chǎn)DC18W方法。本發(fā)明所用的微生物菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8突變菌株， 是以一株氧化正烷烴生產(chǎn)混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報》20(1) =88-93, 1980)為出發(fā)菌株，經(jīng)過N+注入法誘變，以一種氧化酶活力篩選指示培養(yǎng)基篩選，經(jīng)過4次 反復(fù)誘變篩選出來的，具有對nC18和十八碳脂肪酸甲酯ω-氧化酶活力強(qiáng)，β-氧化酶活力 微弱，高產(chǎn)出的生產(chǎn)DC18的新菌株。具體篩選方法為將經(jīng)過N+注入法誘變的微生物菌種 液，用生理鹽水分別稀釋為10_5-10_7，吸取0. Iml稀釋好的菌液，涂布于10巴林糖度的麥芽 汁瓊脂培養(yǎng)平板上，每個稀釋度涂布3個平板，用黑紙包好，置于30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小 時，統(tǒng)計致死率。以原出發(fā)菌株為對照，對誘變后的菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)DC18的試驗(yàn)和產(chǎn)酸量 檢測。篩選出對正十八烷烴和/或十八碳脂肪酸甲酯ω-氧化酶活力強(qiáng)菌株即為熱帶假絲 —(Candida tropicalis)ly_8。本發(fā)明所述熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8已于2009年10月14日 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC NO =M 209226。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8的生理特性如下糖類的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。 同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-， 密二糖_，棉子糖_，松二糖+，菊芋糖_，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核 糖_，鼠李糖_，α -甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇_，甘露醇+，肌醇_，核糠醇+，半 乳糖醇_，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉_，丁二酸鈉+，乳酸鈣_。
生長素的需要生物素++，維生素B1++,維生素B2+,維生素B6+,維生素B12+,葉酸 +，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。其他硝酸鹽-，凍化牛奶_，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。形態(tài)特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，假菌絲多而長；在烷烴種子培養(yǎng)基培 養(yǎng)時，有一定數(shù)量的短假菌絲；而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時，大部分是單個橢圓細(xì)胞。本發(fā)明所述同步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二羧酸，特別是十八碳二羧酸的方法是以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) ly_8為發(fā)酵菌種，在以正十八烷和/或十八碳脂肪酸甲酯為發(fā) 酵基質(zhì)的培養(yǎng)液中同步發(fā)酵，生產(chǎn)α，ω-十八碳二元酸。同步發(fā)酵生產(chǎn)二元酸過程中所使用的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8 的種子培養(yǎng)方法如下種子培養(yǎng)基(1) IOBe'糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2) IOBe'糖度的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3)種子培養(yǎng)基包括=KH2PO4 6-12g/L，酵母膏3_8g/L，玉米漿3_8g/L，蔗糖 10-30g/L，尿素l_3g/L，自來水配制，自然PH0培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)ly-8酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上 (Φ15Χ180試管，每支裝6-7mL培養(yǎng)基，滅菌后放成斜面)，于28-30°C培養(yǎng)40小時。取 一支上述培養(yǎng)好的ly-8菌種全部刮入裝有30mL烷烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于 28-300C 220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40-48小時，作為搖瓶發(fā)酵種子或取兩支上述培養(yǎng)好 的ly-8斜面菌種全部刮入裝有500mL培養(yǎng)基的5000mL三角瓶中，于220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖 床28-30°C培養(yǎng)44-48小時，菌株生長光密度OD達(dá)到0. 8，作為一級種子罐的種子。同步發(fā)酵生產(chǎn)二元酸的方法如下發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組成為堿金屬磷酸鹽5_12g/L(最好為6_9g/L)、 NaClO. 5-2. 5g/L(最好為 1-1. 8g/L)、醋酸鈉 2_6g/L(最好是 3_7g/L)、硝酸鹽 2-lOg/L(最 好為3-8g/L)、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素100-250單位/mL(最好為 120-200單位/mL)、尿素l_5g/L以及一些公知的營養(yǎng)源。上述堿金屬磷酸鹽可從ΚΗ2Ρ04、 NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中選一種。發(fā)酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85_70% (V/V) 的發(fā)酵培養(yǎng)基。用本發(fā)明的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌株生產(chǎn)長鏈二元酸，特別 是DC18的具體方法是把培養(yǎng)好經(jīng)過鏡檢，沒有雜菌的菌種液，按發(fā)酵培養(yǎng)基20-25% (V/V) 的用量，接入PH 5. 5-9.0，最好為6. 0-7. 8的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸 甲酯與85-70% (V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。將上述混合物在24-34°C，最好在27-31°C 通氣發(fā)酵72-170小時。第一階段，體系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產(chǎn)二元 酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以下，以產(chǎn)酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在 8. 0以下，只產(chǎn)酸，不長菌體，120小時以后，PH控制在8. 4以下，繼續(xù)生產(chǎn)二元酸。從70小 時以后，每天補(bǔ)加一定量的正烷烴和/或脂肪酸甲酯，使發(fā)酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯 的含量始終>5%。
發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，回收正烷烴和/或脂肪酸甲酯，放出中間清液，菌體 層經(jīng)膜分離除去菌體。合并清液，加入0. 7%活性炭，在85°C左右脫色40分鐘，板框壓濾， 除去活性炭，脫色清液加熱至70°C，加HCL或濃H2SO4至PH3，進(jìn)行酸化結(jié)晶，冷卻至30°C后， 壓濾，用水洗滌，空氣吹干。烘干，得白色DC18。用本發(fā)明的ly-8突變菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)各種單一二元酸，其中在IOL發(fā)酵 罐中，發(fā)酵生產(chǎn)DC18時，發(fā)酵150小時，DC18的產(chǎn)量可達(dá)115g/L，nC18轉(zhuǎn)化率為60. 8%, DC18 純度為95%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.(1).取一接種環(huán)的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌體，涂布在 Φ 15X180大試管固體麥芽汁斜面，30°C培養(yǎng)兩天。(2).取上述菌種一支，接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C，220 轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)46小時。種子培養(yǎng)基中，KH2PO4 8g/L，酵母膏5g/L，玉米漿3g/L， 蔗糖30g/L，尿素3g/L，自來水配制，PH 5.0，110°C滅菌30分鐘。(3)在裝有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接入3. 5mL上述種子液，接三瓶， 在220轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時用NaOH調(diào)一次PH至7. 7。發(fā)酵培養(yǎng)基混合 液中含 KH2PO4 8g/L,NaCl lg/L,NaAC 5g/L，酵母膏 2g/L，玉米漿 2. 5g/L，尿素 1. 8g/L，蔗糖 15g/L，青霉素170單位/mL,以及正十八烷150mL/L,自來水配制，PH 7. 2，110°C滅菌30分 鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用HCl調(diào)PH至3，用120mL乙醚抽提，除去乙醚，得白色結(jié)晶，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定，計算二元酸含量。結(jié)果DC18產(chǎn)量平均為65. 8g/L。實(shí)施例2.按實(shí)例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴使用IiC12 (純度99% )，結(jié)果DC12產(chǎn)量為 72g/L，純度 98. 3%0實(shí)施例3.按照實(shí)例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴用IiC14(純度98. 5% )，結(jié)果DC14產(chǎn)量為 75g/L，純度為 98. 1% ο實(shí)施例4.按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用IiC16 (純度99 % )，結(jié)果DC16的產(chǎn)量為52g/L，純 度為97. 5%。實(shí)施例5.按照實(shí)例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴改用十八碳脂肪酸甲酯，結(jié)果DC18產(chǎn)量 為46. 2g/L，純度為92%。實(shí)施例6.(1).發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基按照實(shí)例1。(2).把30mL培養(yǎng)2天的液體種子液，接入裝有500mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)110°C滅菌 30分鐘的3000mL三角瓶中，共3瓶，29士 1°C，于220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40小時，得 到0D(X30，620nm波長)為0. 81的液體種子液作為發(fā)酵罐種子。(3).把(2)中培養(yǎng)好經(jīng)鏡檢無雜菌的1500mL種子液，接入裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121°C滅菌30分鐘的IOL自動發(fā)酵罐中，調(diào)PH 7. 1，加入900mLnC18，在29士 1°C，650rpm，罐 壓lkg/cm2，通氣量1 1，開始發(fā)酵。30小時以內(nèi)，PH控制在7. 1以下，30-65小時，PH控 制在7.5以下，65-120小時，PH控制在8.0以下，120小時以后到發(fā)酵結(jié)束，PH控制在8. 5 以下；在60、90和120小時分別補(bǔ)加nC18為400、400和200mL。發(fā)酵150小時，DC18的產(chǎn)量 為 115g/L，nC18 轉(zhuǎn)化率為 60. 8%0 發(fā)酵結(jié)束后，加NaOH至PHlO，加熱至80°C，破乳后，放置分層，降溫至20°C，放置過 夜，回收上層nC18101g，放出中層清液，菌體層抽濾，合并清液，稀釋后加熱至65°C，加入濃 H2SO4調(diào)至PH3，酸化結(jié)晶。降溫至25-30°C后，抽濾，洗滌，抽空，烘干，得732. 6g DC18產(chǎn)品， 后處理收率為91 %，產(chǎn)品純度為95 %。
權(quán)利要求
1.一種微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于所用的微生物為熱帶假 絲酵母(Candida tropicalis) ly_8，該菌種已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCC NO :M209226。
2.如權(quán)利要求1所述微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) ly_8為發(fā)酵種子，在以正十八烷和/或十八碳脂肪酸甲酯為發(fā) 酵基質(zhì)的培養(yǎng)液中同步發(fā)酵，生產(chǎn)α，ω-十八碳二元酸。
3.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的發(fā)酵 種子是由熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)基培 養(yǎng)，獲得一級種子罐的種子；所使用的固體斜面培養(yǎng)基為10個巴林糖度的麥芽汁加2%瓊 脂制成；液體培養(yǎng)基為10個巴林的麥芽汁；混合液體種子培養(yǎng)基包含KH2P046-12g/L，酵母 膏3-8g/L，玉米漿3-8g/L，蔗糖10-30g/L，尿素l_3g/L，自來水配制，自然PH。
4.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的同步 發(fā)酵過程如下發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組成為堿金屬磷酸鹽5-12g/L、NaCl 0. 5-2. 5g/L、醋酸鈉2_6g/L、 硝酸鹽2-10g/L、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素100-250單位/mL、尿素l_5g/ L，其中堿金屬磷酸鹽從KH2PO4、NaH2P04、K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽從鉀或鈉鹽中選 一種；發(fā)酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)的 發(fā)酵培養(yǎng)基；具體發(fā)酵操作方法為具體方法是把培養(yǎng)好經(jīng)過鏡檢、沒有雜菌的菌種液，按發(fā)酵培養(yǎng)基20-25% (V/V)的 用量，接入PH 5. 5-9.0的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/ V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中，將上述混合物在M_34°C，通氣發(fā)酵72-170小時；第一階段，體 系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產(chǎn)二元酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以 下，以產(chǎn)酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在8. 0以下，只產(chǎn)酸，不長菌體，120小 時以后，PH控制在8. 4以下，繼續(xù)生產(chǎn)二元酸；從70小時以后，每天補(bǔ)加一定量的正烷烴和 /或脂肪酸甲酯，使發(fā)酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯的含量始終> 5%。
5.如權(quán)利要求4所述微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的同步 發(fā)酵過程中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組成為堿金屬磷酸鹽6-9g/L、NaCl 1-1. 8g/L、醋 酸鈉3-7g/L、硝酸鹽3-8g/L、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素120-200單位/ mL、尿素l_5g/L ；其中堿金屬磷酸鹽從KH2P04、NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽 從鉀或鈉鹽中選一種；發(fā)酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)的 發(fā)酵培養(yǎng)基；具體發(fā)酵操作方法為具體方法是把培養(yǎng)好經(jīng)過鏡檢，沒有雜菌的菌種液，按發(fā)酵培養(yǎng)基20-25% (V/V)的 用量，接入為Ph為6. 0-7.8的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中；將上述混合物在27-31°C通氣發(fā)酵72-170小時。第一階段， 體系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產(chǎn)二元酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以下，以產(chǎn)酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在8. 0以下，只產(chǎn)酸，不長菌體，120小 時以后，PH控制在8. 4以下，繼續(xù)生產(chǎn)二元酸。從70小時以后，每天補(bǔ)加一定量的正烷烴 和/或脂肪酸甲酯，使發(fā)酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯的含量始終> 5%。
6.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵正十一烷生產(chǎn)十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，回收正烷烴和/或脂肪酸甲酯，放出中間清液，菌體 層經(jīng)膜分離除去菌體。合并清液，加入0. 7%活性炭，在85°C左右脫色40分鐘，板框壓濾， 除去活性炭，脫色清液加熱至70°C，加HCL或濃H2SO4至PH 3，進(jìn)行酸化結(jié)晶，冷卻至30°C 后，壓濾，用水洗滌，空氣吹干。烘干，得白色DC18。
7.應(yīng)用權(quán)利要求2 6所述微生物同步發(fā)酵正十八烷生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征 在于在以Cltl-C18的單一或混合正烷烴為基質(zhì)的培養(yǎng)基中同步發(fā)酵，生產(chǎn)相應(yīng)的Cltl-C18Ci， ω- 二元酸。
8.應(yīng)用權(quán)利要求2 6所述微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)十八碳二羧酸方法，其特征在于其中 發(fā)酵基質(zhì)使用十八碳脂肪酸甲酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物發(fā)酵正十八烷和硬脂酸甲酯生產(chǎn)十八碳二元酸的方法。所用微生物為一株熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)突變菌株ly-8，保藏號為CCTCC NOM 209226。其特點(diǎn)是在微生物菌種接入正烷烴和脂肪酸甲酯為基質(zhì)的培養(yǎng)基后，30小時內(nèi)，pH控制在7.1以下，30-80小時內(nèi)，pH控制在7.5以下，80-144小時，pH控制在8.0以下，發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)與基質(zhì)鏈長相同的二羧酸。當(dāng)本方法用于發(fā)酵正十八烷生產(chǎn)十八碳二元酸時，在10L發(fā)酵罐中，發(fā)酵150小時，DC18的產(chǎn)量達(dá)到115g/L，轉(zhuǎn)化率為60.8％，DC18純度為95％。
文檔編號C12P7/44GK102115769SQ200910256590
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者曹務(wù)波, 曹荀梅子, 陳遠(yuǎn)童 申請人:曹務(wù)波