專利名稱：異養(yǎng)小球藻中污染細菌動態(tài)的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)小球藻中污染細菌動態(tài)的分子檢測方法，屬于微生物 分子技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景小球藻屬綠藻門，綠藻綱，綠藻目，卵胞藻科，小球藻屬。小球藻被稱之 為"藥效藻"、生理功能物質(zhì)的"生物反應(yīng)器"，是堿性全營養(yǎng)素食品。由于小球藻 對人體具有很好的保健作用，這種堪稱地球"生命源泉"的綠藻幾乎含有所有屬于人體健康營養(yǎng)的物質(zhì)豐富的小分子多肽蛋白質(zhì)由17種氨基酸組成、不飽和脂 肪酸、生物活性多糖及保持細胞正常生長因子、核酸、各種維生素、多種微量 元素、生物素、大量的葉酸與葉綠素等活性代謝物質(zhì)。小球藻能將人體內(nèi)有害 的重金屬、化學(xué)有害物質(zhì)(農(nóng)藥、化肥、抗生素等)有效清除，從而使免疫系 統(tǒng)的敏感性增強、致病因素排除；營養(yǎng)素的補充又為免疫功能的發(fā)揮提供充足 的能量。小球藻除了可以利用光能和C02進行正常的光合自養(yǎng)生長外，還可以在無光條件下利用有機碳源和02，進行異養(yǎng)生長繁殖。小球藻也能在光照條件下，利 用有機碳源進行混養(yǎng)培養(yǎng)。由于小球藻異養(yǎng)可以獲得比自養(yǎng)高的生物量，因此 異養(yǎng)培養(yǎng)在小球藻高密度培養(yǎng)方面有著重要應(yīng)用價值。異養(yǎng)小球藻細胞可利用有機碳源快速異養(yǎng)生長，而且異養(yǎng)小球藻細胞中還 含有大量的脂肪，這對于有機廢物合理利用，治理環(huán)境污染都具有十分重要的 意義。另外自養(yǎng)小球藻細胞轉(zhuǎn)化為異養(yǎng)生長后，細胞內(nèi)脂溶性化合物增多，高 溫下產(chǎn)油產(chǎn)氣效率更高，這對于探索石油和天燃氣的成因具有重要的理論意義， 具有很大的應(yīng)用潛力。由于異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)基含有豐富的有機碳，因此，異樣培養(yǎng)的小球藻較 易產(chǎn)生細菌污染，導(dǎo)致小球藻培養(yǎng)失敗或者影響小球藻的品質(zhì)。常規(guī)的污染細 菌檢測使用基于分離培養(yǎng)的平板計數(shù)(周德慶著，微生物學(xué)教程，高等教育出版社；1991， 184-202)，耗時耗力，準確度不高，不能滿足快速檢測和實時檢測 的要求。因此，開發(fā)不依賴于分離培養(yǎng)的污染細菌的動態(tài)、快速分子檢測技術(shù) 迫切而重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種異養(yǎng)小球藻中污染細菌 動態(tài)的分子檢測方法，能準確、快速地對異養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻污染細菌進行 分析檢測。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過酚/氯仿方法提取培養(yǎng)不同時間的異養(yǎng)小球藻 污染細菌的總DNA;以提取的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA為模板，用 27f/1492r引物進行細菌16S rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S rRNA擴增產(chǎn)物 為模板，以16SrRNA-V3區(qū)的358f/907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶 鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp的擴增產(chǎn)物；將550bp的擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠 電泳，獲取變性梯度凝膠電泳圖譜；通過對圖譜上的不同條帶進行回收、聚合 酶鏈反應(yīng)擴增、克隆測序、同源性分析檢測細菌種類，實現(xiàn)異養(yǎng)小球藻不同培 養(yǎng)時間的污染細菌檢測。
本發(fā)明的方法具體步驟如下
1、 通過酚/氯仿方法提取不同培養(yǎng)時間的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA。
2、 以提取的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進 行細菌16S rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S rRNA擴增產(chǎn)物為模板，以16S rRNA-V3區(qū)的358f/ 907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲 得550bp的擴增產(chǎn)物。
3、 將550bp的擴增產(chǎn)物加入到w/v為6X的聚丙烯酰胺凝膠中，進行變性 梯度凝膠電泳，變性梯度從上到下為35% -55%，電泳溫度保持60°(:，電壓15(^， 電泳6小時；電泳結(jié)束后，凝膠染色，拍照獲取變性梯度凝膠電泳圖譜。
4、 將變性梯度凝膠電泳圖譜中的優(yōu)勢條帶割下，以358f/卯7rm不帶GC 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp片段；對550bp片段進行 割膠純化，純化后的550bp片段與PUCm-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿
4菌感受態(tài)細胞中；將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細胞接種到涂有異丙基-P-D-硫代 半乳糖苷及5-溴-4-氯-3』引哚-P-D-半乳糖苷的平板上，37'C培養(yǎng)12-18小時，挑 取白色菌落，用PUCm-T載體引物T7/M13進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，對擴增結(jié)果 陽性的菌落進行測序；對測得的序列進行Blast分析，獲得異養(yǎng)小球藻中污染細 菌動態(tài)的檢測結(jié)果。
采用本發(fā)明方法，可以準確、高效、動態(tài)、快速地對小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中 不同培養(yǎng)時間的污染細菌進行檢測，克服了傳統(tǒng)的平板計數(shù)檢測方法的檢測速 度慢、準確度不高、檢測前需要細菌培養(yǎng)等缺點。
本發(fā)明適合微藻培養(yǎng)過程中污染細菌的動態(tài)檢測。


圖1為本發(fā)明的方法流程圖。
圖2為本發(fā)明中異養(yǎng)小球藻不同培養(yǎng)時間(4天、7天)提取的污染細菌總 DNA。
圖3為本發(fā)明中異養(yǎng)小球藻不同培養(yǎng)時間(4天、7天)污染細菌的16SrRNA DGGE條帶。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。
圖l為本發(fā)明方法的流程框圖。如圖1所示，本發(fā)明首先在小球藻異養(yǎng)培
養(yǎng)過程中提取不同培養(yǎng)時間小球藻污染細菌的總DNA，然后PCR擴增細菌的
16SrRNA，再將16S rRNA擴增產(chǎn)物進行DGGE電泳，獲取圖譜，最后利用圖
譜上的不同條帶進行小球藻污染細菌的檢測。 本發(fā)明實施例按以下步驟進行
1.總DNA的提取
采用常規(guī)酚/氯仿(體積比24: 1)抽提法提取小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中不同
培養(yǎng)時間(4天、7天)的污染細菌總DNA。
2.16S rRNA的PCR擴增
2.1 16S rRNA全長的PCR擴增
5以所獲得的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)時間(4天、7天)的污染細菌 總DNA為模板，用細菌的通用引物27f: 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和1492r: 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3， PCR擴增細菌DNA的16S rRNA， 體系如下5 nL 10xPCR緩沖液(50 mmol/L Tris (三羥甲基氨基甲垸) 曙HCl(pH8.2)，18賺ol/L MgCl2，500mmol/L KC1, 0.1%甘油，1%的TritonX-lOO (聚 乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物，2fiL 10mmol/LdNTP, lpL基因組DNA 及2.5UTaq酶，用無菌去離子水補充體積至50pL。 PCR條件如下94'C預(yù)變性 5min; 94。C lmin， 55°C lmin， 72。C lmin ， 35個循環(huán)；72。C 5min。 1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。 2.2 16S rRNA- V3區(qū)的PCR擴增
(l)以2.1獲得的16S rRNA PCR產(chǎn)物為模板，以16S rRNA-V3區(qū)的358f/ 907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增；
引物358f: 5，陽CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3'
引物卯7rm: 5,-CCGTCAATTC(A/C) TTTGAGTTT-3，。
擴增體系如下5nL10xPCR緩沖液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2),18mmol/L MgCl2,500mmol/LKCl， 0.1%甘油，1%的TritonX-lOO), 25pmo1的358f及25pmo1 的卯7rm， 1.75|iL 10mmol/L dNTP， 2pL的16S rRNA及2.5U Taq酶，用無菌去 離子水補充體積至50pL。PCR反應(yīng)條件如下9fC預(yù)變性5 min， 94'C變性1 min， 65。C(一0.5。C/循環(huán))退火1 min， 72"延伸1 min， 20個循環(huán)；94。C變性1 min， 55。C退火1 min， 72。C延伸1 min， 5個循環(huán)；72。C延伸5 min。用1.5%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。最后獲得550bp的擴增產(chǎn)物，4'C保存?zhèn)溆谩?3.變性梯度凝膠電泳(DGGE)
將lOpL 550bp的擴增產(chǎn)物加入到w/v為6%的聚丙烯酰胺凝膠中，進行變 性梯度凝膠電泳，變性梯度從上到下為35% -55%，電泳溫度保持6(TC，電壓 150V，電泳6小時；
電泳結(jié)束后，凝膠硝酸銀染色，數(shù)碼相機拍照獲取變性梯度凝膠電泳圖譜。
試劑制備如下配制6% (w/v)聚丙烯酰胺凝膠，35%-55%變性梯度各100mL:35%膠 55%膠40%丙烯酰胺 15mL 15mL50xTAE電泳緩沖液 2mL 2mL去離子甲酰胺 14mL 22mL尿素 14.7g 23.lg去離子水定容至 lOOmL 100mL 4.污染細菌的檢測將變性梯度凝膠電泳圖譜中的優(yōu)勢條帶割下，經(jīng)無菌去離子水多次沖洗后 搗碎，加入TE緩沖液浸泡過夜。離心取上清作為PCR的模板，以358f/ 907rm不 帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行PCR擴增。弓I物3 5 8f: 5 ，-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'弓I物907rm: 5，—ATTACCGCGGCTGCTGG -3'。擴增體系5pL 10xPCR緩沖液(100mM Tris-HCl (pH9.0), 15mM MgCl2, 500mM KC1， 0.1%甘油，1%的TritonX-100) 1.25pL 20pM的引物358f， 1.25pL 20nM的引物907rm， 1.75pLdNTP， 4pL離心上清及0.5^LTaq酶，用無菌去離 子水補充體積至5(^L。PCR反應(yīng)條件如下94。C預(yù)變性5min; 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C lmin, 35個循環(huán)；72°C5min。獲得擴增產(chǎn)物550bp片段。將550bp片段用上海生工生物技術(shù)公司的UNIQ-10柱按照操作指南進行割 膠純化，然后將純化后550bp片段與PUCm-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸 桿菌感受態(tài)細胞中；將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細胞接種到涂有異丙基-(3-D-硫 代半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3』引哚-(3-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上，37。C培養(yǎng) 12-18小時，挑取白色菌落，用PUCm-T載體引物T7/M13進行聚合酶鏈反應(yīng)擴 增，對擴增結(jié)果陽性的菌落提取質(zhì)粒進行16S rRNA測序。對測得的序列在http:〃 www.ncbi.nlm.nih.gov上采用Blast軟件進行序列同源性比對，獲得異養(yǎng)小球藻中 污染細菌動態(tài)的檢測結(jié)果。采用本發(fā)明的方法對異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻中的污染細菌成功地進行了檢測。圖2 為異養(yǎng)小球藻不同培養(yǎng)時間(4天、7天)提取的污染細菌總DNA，圖2中1 泳道為培養(yǎng)4天小球藻污染細菌的總DNA， 2泳道為培養(yǎng)7天小球藻污染細菌 的總DNA， 3泳道為陰性對照。圖3中d4為小球藻在異養(yǎng)培養(yǎng)4天所帶細菌的 DGGE條帶，d7為小球藻在異養(yǎng)培養(yǎng)7天所帶細菌的DGGE條帶。對d4和d7 中的4條帶分別割膠回收、克隆測序后經(jīng)過16SrRNA序列同源性分析，污染細 菌的最相1以菌株如下5"cz.〃ws sp. MH46， 5ac/〃附s"6"fo strain M-2， S""'〃W51 sp. Dl ， Ba"7/w5 ra6"7k strain EHFS1—SConCCHa，見表1 。
表l
DGGE條帶 相似菌株 相似度 1 (EU430406)^3dsp,固46 (EU 182874) ~~
2(EU430407)5ac"/w"wfo/fc strain M-2 (EU333948) 99%
3(EU430408)5ac/〃wsp.Dl (EU281631) 99%
4(EU430409)5ac/〃j ra&/fc strainEHFSl—SConCCHa (EU071587) 99%
8
權(quán)利要求
1、一種異養(yǎng)小球藻中污染細菌動態(tài)的分子檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)通過酚/氯仿方法提取不同培養(yǎng)時間的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA；2)以提取的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進行細菌16S rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S rRNA擴增產(chǎn)物為模板，以16SrRNA-V3區(qū)的358f/907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp的擴增產(chǎn)物；3)將550bp的擴增產(chǎn)物加入到w/v為6％的聚丙烯酰胺凝膠中，進行變性梯度凝膠電泳，變性梯度從上到下為35％-55％，電泳溫度保持60℃，電壓150V，電泳6小時；電泳結(jié)束后，凝膠染色，拍照獲取變性梯度凝膠電泳圖譜；4)將變性梯度凝膠電泳圖譜中的優(yōu)勢條帶割下，以358f/907rm不帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp片段；對550bp片段進行割膠純化，純化后的550bp片段與PUCm-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞中；將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細胞接種到涂有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的平板上，37℃培養(yǎng)12-18小時，挑取白色菌落，用PUCm-T載體引物T7/M13進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，對擴增結(jié)果陽性的菌落進行測序；對測得的序列進行Blast分析，獲得異養(yǎng)小球藻中污染細菌動態(tài)的檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)小球藻中污染細菌動態(tài)的分子檢測方法，通過酚/氯仿方法提取培養(yǎng)不同時間的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA；以提取的異養(yǎng)小球藻污染細菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進行細菌16S rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S rRNA擴增產(chǎn)物為模板，以16S rRNA-V3區(qū)的358f/907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp的擴增產(chǎn)物；將550bp的擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，獲取變性梯度凝膠電泳圖譜；通過對圖譜上的不同條帶進行回收、聚合酶鏈反應(yīng)擴增、克隆測序、同源性分析檢測細菌種類，實現(xiàn)異養(yǎng)小球藻不同培養(yǎng)時間的污染細菌檢測。本發(fā)明準確、高效、動態(tài)、快速地進行了在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻污染細菌的分析檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101665836SQ20091019627
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者張風(fēng)麗, 李志勇, 繆曉玲, 錢文倩 申請人:上海交通大學(xué)