專利名稱：狗魚幼魚彈狀病毒實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，特別是涉及狗魚幼魚彈狀病毒實(shí)時(shí)熒 光RT-PCR檢測(cè)法和試劑盒。
背景技術(shù)：
根據(jù)國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)(International comittee on taxonomy ofviruses, ICTV)第8次報(bào)告，彈狀病毒科(lihabdoviridae)分為6個(gè)屬，包括感染植物的質(zhì)型彈狀 病毒屬(Cytorhabdovirus)和核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus),以及感染脊椎動(dòng) 物的水皰性口膜炎病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)、短晳熱病毒屬 (Ephemerovirus)和粒外彈狀病毒屬(也稱非毒粒蛋白彈狀病毒屬)(Novirhabdovirus)， 還有部分彈狀病毒尚未分類，如Sigma virus, Flanders virus等。迄今報(bào)道感染魚類的 彈狀病毒已有十幾種，包括傳染性造血器官壞死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus, IHNV)、__個(gè)生(Viralhaemorrhagic septicemia virus, VHSV) >
(Hirame rhabdovirus, HRV) >(Snakehead rhabdovirus, SHRV)、鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、狗魚幼魚彈狀病 毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、彈狀病毒 903/87 (Rhabdovirus 903/87，903/87)、鱖魚 彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)、胭脂魚彈狀病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鮭彈狀病毒沘/97 (ka trout rhabdovirus 28/97, STRV)等(Granoff and Webster, 1999 ；張奇亞和李正秋，1999 ；Zhang et al.，2000 Johansson et al.，2001， 2002)。在ICTV第6次報(bào)告上，SVCV, PFRV被列為水皰性口膜炎病毒屬暫定種(Wurmer et al.，1995)。在ICTV第7次報(bào)告中，正式把IHNV、VHSV, HRV、SHRV列為粒外彈狀病毒屬， SVCV、PFRV等仍歸為水皰性口膜炎病毒屬的暫定種(Walker et al.，2000)。其他魚類彈狀 病毒的分類地位尚未確定。隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，魚類病毒病已成為養(yǎng)殖魚類的最大病害。由于缺乏 有效的治療方法，魚類病毒性疾病的控制以預(yù)防為主，因而病毒的診斷與檢測(cè)技術(shù)研究成 了魚類病毒研究中非?；钴S的領(lǐng)域。魚類彈狀病毒有很強(qiáng)的致病性，特別是VHSV、IHNV、 HRV, SHRV和SVCV在世界各地廣泛流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因而這些病 毒的流行病學(xué)備受科研工作者的關(guān)注。狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)是一種與鯉春病毒血癥病毒(SVCV)同源性很高的病 毒，目前還未引起人們高度重視。PFRV主要在歐洲狗魚幼魚中流行(Wolf，1988)。1972年 該病毒在荷蘭感染狗魚幼魚，引起大規(guī)模死亡，第一株P(guān)FRV從此批患病的狗魚幼魚中分離 出來(lái)(De Kinkelin, 1973) ο PFRV與SVCV親緣關(guān)系最近，G蛋白的同源性> 70%。對(duì)PFRV、 SVCV及與它們血清學(xué)相關(guān)的魚類彈狀病毒G蛋白部分核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果 顯示它們形成4個(gè)基因型，PFRV和SVCV分別形成一個(gè)基因型，分別為基因型III和I，其他 病毒形成基因型II和IV (Stone et al. , 2003) 0 SVC主要感染鯉科魚類，被世界動(dòng)物衛(wèi)生 組織列為必須申報(bào)的疾病，中國(guó)農(nóng)業(yè)部將SVC列為二級(jí)動(dòng)物疫病。隨著對(duì)SVC的日益重視，對(duì)SVCV監(jiān)控力度的加大，這些與SVCV親緣關(guān)系高的病毒也將會(huì)越來(lái)越引起人們的重視。因 而尋找特異、靈敏快速的檢測(cè)方法，對(duì)于防控疾病的發(fā)生和發(fā)展十分關(guān)鍵。在中國(guó)，魚類病毒SVCV已經(jīng)引起人們高度的重視，并于每年春秋兩季對(duì)全國(guó)鯉魚 進(jìn)行SVCV監(jiān)測(cè)。但是與SVCV親緣關(guān)系很高的魚類病毒PFRV目前還沒(méi)有引起人們的重視， 沒(méi)有納入檢測(cè)的范圍。隨著與這2種病毒血清學(xué)相關(guān)的病毒相繼分離(Ahne，1975 ;Ahne et al. ,1982 ；Fijan et al. ,1984 ；Ahne and Thomsen,1986 ；Haenen and Davidse,1989 ； Jorgensen et al. ,1989；Rowley et al. ,2001 ；Stone et al. ,2003 ；Way et al. ,2003), 人們對(duì)這些病毒的關(guān)注會(huì)越來(lái)越多。因而需要建立切實(shí)可行的檢測(cè)方法。目前，鑒定PFRV及與其血清學(xué)相關(guān)的病毒一般采取先用敏感細(xì)胞分離，然后用血 清學(xué)方法鑒定的方式(De Kinkelin, 1973 ；Ahne, 1975 ；Ahne etal. , 1982 ；Fijan et al.， 1984 ；Ahne and Thomsen, 1986 ；Haenen and Davidse,1989 ；Jorgensen et al. , 1989 ； Rowley et al.，2001 ；Stone et al.，2003 ；Way et al. ,2003) 采用這種檢測(cè)方式不僅周 期長(zhǎng)，而且使用免疫學(xué)方法，如間接熒光抗體試驗(yàn)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，PFRV與SVCV之間 存在交叉反應(yīng)(J0gensen et al.，1989 ；Way，1991)，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光技術(shù)，是近年來(lái)新問(wèn)世的一種高敏感性的檢測(cè)技術(shù)，它融合了 PCR技術(shù) 的核酸高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接 探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果，它可以做到每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù) 據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，做到真正意義上的定量。同時(shí)該技術(shù)在密閉系統(tǒng)內(nèi)完成檢測(cè)，不需 要常規(guī)PCR的電泳觀察環(huán)節(jié)，減少了對(duì)工作環(huán)境的污染，降低假陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生。因此，自從 該技術(shù)建立以來(lái)，迅速、廣泛地應(yīng)用于植物、動(dòng)物和人類的寄生蟲，病毒和細(xì)菌等病原的檢 測(cè)研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠快速、高靈敏度的狗魚幼魚 彈狀病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)方法，所述方法包括利用特異性探針和引物對(duì)，以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，所述引物對(duì)為能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對(duì)，并且分別 含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5，-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探針為能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互 補(bǔ)、且長(zhǎng)度為20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)
告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述探針含有kq ID No. 3所示的序列，Seq ID No. 3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
優(yōu)選的，所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為 TAMRA0本發(fā)明的檢測(cè)方法中，RT-PCR反應(yīng)的引物終濃度優(yōu)選為0. 9 1. 1 μ mol/L，更優(yōu) 選1 μ mol/L,探針終濃度優(yōu)選為0. 4 0. 6 μ mol/L,更優(yōu)選0. 5 μ mol/L。所述RT-PCR的反應(yīng)的退火溫度優(yōu)選為55°C 60°C，更優(yōu)選60°C。本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，所述RT-PCR的反應(yīng)條件包括50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C 預(yù)變性％iin，40個(gè)循環(huán)94°C變性15s，60°C退火及收集熒光信號(hào)lmin。本發(fā)明開公開了一種狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的檢測(cè)試 劑盒，所述試劑盒含有能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對(duì)，所述引物 對(duì)分別含有ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列。進(jìn)一步地，所述檢測(cè)試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，并且所述試劑盒還含有能 與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)、且長(zhǎng)度為20 40bp 的寡核苷酸探針，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。優(yōu)選的，所述探針含有kq ID No. 3所示的序列。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX，3’端標(biāo)記的熒光淬滅 基團(tuán)為TAMRA。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法和試劑盒用于檢測(cè)PFRV時(shí)，比RT-PCR/PCR及 細(xì)胞培養(yǎng)(TCID5tl)檢測(cè)方法的靈敏度高；其中所用的特異性的引物對(duì)和探針，能夠在PFRV、 HRV、IHNV, VHSV, SVCV, IPNV和VNNV病毒中特異性地檢測(cè)出PFRV病毒；重復(fù)性好，可穩(wěn)定 地進(jìn)行檢測(cè)；靈敏度高，相應(yīng)的靈敏度為101· 5TCID5qij


圖1為不同引物和探針濃度對(duì)擴(kuò)增曲線的影響結(jié)果圖；圖2為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)PFRV的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3為PFRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4為PFRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)時(shí)熒光技術(shù)，是近年來(lái)新問(wèn)世的一種高敏感性的檢測(cè)技術(shù)，它融合了 PCR技術(shù) 的核酸高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接 探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果，它可以做到每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù) 據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，做到真正意義上的定量。同時(shí)該技術(shù)在密閉系統(tǒng)內(nèi)完成檢測(cè)，不 需要常規(guī)PCR的電泳觀察環(huán)節(jié)，減少了對(duì)工作環(huán)境的污染，降低假陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生。因此， 自從該技術(shù)建立以來(lái)，迅速、廣泛地應(yīng)用于植物、動(dòng)物和人類的寄生蟲，病毒和細(xì)菌等病原 的檢測(cè)研究中。目前已經(jīng)進(jìn)行該項(xiàng)研究的魚類病毒有ISAV(Munir and Kibenge，2004)、 KHV (Gilad et al. ,2004), Betanodavirus (ValIe et al. ,2005), SVCV (張利峰等，2005 ； Yue et al. ,2007)、VHSV (Chico et al.，2006)、IHNV(Dhar et al.，2008)、IPNV(Bowers et al. ,2008)和VNNV(羅衛(wèi)等，2008)。而本發(fā)明則建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)PFRV。
實(shí)施例11材料與方法1. 1病毒及細(xì)胞PFRV為F4株，由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所贈(zèng)送，SVCV和IHNV參考株由英國(guó) CEFAS的OIE參考實(shí)驗(yàn)室B. Hill教授惠贈(zèng)；VHSV參考株由挪威國(guó)家獸醫(yī)研究所OIE參考實(shí) 驗(yàn)室Roar Gudding博士惠贈(zèng)、IPNV、HRV、VNNV由本室分離。IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV 和 PFRV 分別用 EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、 FHM和BF-2細(xì)胞擴(kuò)增。SSN-I細(xì)胞購(gòu)自泰國(guó)Kasetsart大學(xué)水生動(dòng)物健康研究所，RTG-2 細(xì)胞由水生生物研究所贈(zèng)送，BF-2細(xì)胞由檢疫研究所(布雷西亞)細(xì)胞保藏中心贈(zèng)送， CHSE-214細(xì)胞、EPC細(xì)胞由英國(guó)環(huán)境、漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)研究中心贈(zèng)送、FHM細(xì)胞由德國(guó) 慕尼黑大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所贈(zèng)送，CO細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所贈(zèng) 送。EPC、C0、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2細(xì)胞均用含10%胎牛血清的199培養(yǎng)液培 養(yǎng)，SSN-I細(xì)胞用含10% FBS的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種病毒后，用加抗生素(100IU/mL青 霉素；100 μ g/mL鏈霉素)的相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)。1. 2設(shè)備與試劑ABI7500 熒光定量 PCR 儀；試劑盒 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit、TaKaRa One Step RNA PCR Kit均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。1. 3引物和探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank 中 PFRV G 基因(AJ538069)，使用 Primer Express 3. 0 (Applied Biosystems,Foster City,CA)和 Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物和 Taqman 熒光探針。 并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST驗(yàn)證特異性后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合 成。引物和探針序列見(jiàn)表1。表IPFRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和探針
權(quán)利要求
1.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法， 所述方法包括利用特異性探針和引物對(duì)，以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反 應(yīng)，其特征在于所述引物對(duì)為能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對(duì)，并 且分別含有Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No.2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探針為能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)、且 長(zhǎng)度為20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基 團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述探針含有^^皿No.3所示的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告 基團(tuán)為HEX，3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述RT-PCR反應(yīng)的引 物終濃度為0. 9 1. 1 μ mol/L,探針終濃度為0. 4 0. 6 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)的 退火溫度為55°C 60°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)條件包括50°C 反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性％iin，40個(gè)循環(huán)94°C變性15s，60°C退火及收集熒光信號(hào)lmin。
7.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所 述試劑盒含有能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)分別含 有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3，。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)，并且所述試劑盒還含有能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對(duì)之間的 序列相同或互補(bǔ)、且長(zhǎng)度為20 40bp的寡核苷酸探針，并且所述探針的5’端和3’端分別 標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述探針含有％(1ID No. 3所示 的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告 基團(tuán)為HEX，3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
全文摘要
本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒利用特異性的引物對(duì)和探針，能夠特異性地檢測(cè)出PFRV病毒；重復(fù)性好，可穩(wěn)定地進(jìn)行檢測(cè)；靈敏度高，相應(yīng)的靈敏度為101.5TCID50。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102108414SQ200910189339
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者何俊強(qiáng), 劉葒, 盧體康, 鄭曉聰, 陳紅蓮 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心