專利名稱：一種酸性蛋白酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種酸性蛋白酶的制備方法，屬于生物酶工程領域。
背景技術：
蛋白酶是一類使肽鍵斷裂的水解酶，用途廣泛，種類繁多，是主要的工業(yè)化酶制劑 品種之一，主要用于飼料、皮革、醫(yī)藥和釀造工業(yè)，其產(chǎn)量約占整個酶制劑產(chǎn)量的60%。根據(jù) 蛋白酶的活性中心和作用的最適PH值，可將其分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白 酶和酸性蛋白酶。酸性蛋白酶是一類最適作用pH為2 4的蛋白酶類，主要來源于動物的 器臟(胃蛋白酶等)和微生物分泌產(chǎn)生。酸性蛋白酶發(fā)現(xiàn)于20世紀初，很多真菌都具有產(chǎn) 酸性蛋白酶的能力，如黑曲(Aspergillus niger)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、米 曲霉(Aspergillusoryzae)等。自1卯4年吉田首次發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生酸性蛋白酶以來，國 內(nèi)外對微生物發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶進行了廣泛而深入的研究。隨著對酸性蛋白酶的研究的深入，酸性蛋白酶的應用也得到了拓展。目前，酸性蛋 白酶已經(jīng)在飼料生產(chǎn)、白酒釀造、皮革工業(yè)得到了非常廣泛的應用。在飼料工業(yè)上，酸性蛋 白酶在微酸性環(huán)境下可分解動物或植物蛋白質(zhì)為小肽和氨基酸，可以補充動物體內(nèi)同源酶 的不足，促進動物的消化吸收和生長發(fā)育，增強抗病能力，提高飼料的利用率，降低飼料成 本。它是一種消化酶，一般不單獨使用，都是以復合酶的形式做為飼料添加劑加入飼料。根 據(jù)不同動物和同一種動物不同發(fā)育階段以及飼料中蛋白質(zhì)含量多少來確定，酸性蛋白酶用 量配制復合酶制劑。在白酒生產(chǎn)中，白酒生產(chǎn)是多種微生物共酵.酸性蛋白酶加入白酒生 產(chǎn)的料醅中，分解料醅中的蛋白質(zhì)為小肽或氨基酸，促進白酒生產(chǎn)菌群的生長，促進產(chǎn)酒和 產(chǎn)香味物質(zhì)的能力，因此酸性蛋白酶也是白酒生產(chǎn)不可缺少的一種酶。要得到優(yōu)質(zhì)的酸性蛋白酶，產(chǎn)酶菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基是關鍵，本發(fā)明以一株黑曲霉 菌株為出發(fā)株，采用纖維素酶、溶菌酶和蝸牛酶組成的復合酶制備原生質(zhì)體，并通過UV誘 變，篩選出的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，在最佳優(yōu)化的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到酸性蛋 白酶。其菌株的誘變方法獨特并且高效，而后采用固體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基簡單且來源廣泛； 投資少、能耗低；底物抑制效應較弱，產(chǎn)物的產(chǎn)率較高；產(chǎn)酶具有較高的溫度和PH值穩(wěn)定 性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酸性蛋白酶的制備方法。本發(fā)明所說的酸性蛋白酶的制備方法，是用黑曲霉為出發(fā)菌株，采用復合酶制備 原生質(zhì)體并經(jīng)過紫外線誘變篩選高產(chǎn)菌株，再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到酸性蛋白酶。本發(fā)明的技術解決方案如下1. 一種酸性蛋白酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)誘變處理單孢子懸液制備在斜面培養(yǎng)基上加入無菌水，用接種環(huán)刮取培養(yǎng)物表面的孢子，制成粗制的孢子懸液。將此懸液振蕩20min，過濾懸液，制成孢子濃度約IO6個/ml的單孢 子懸液，將孢子懸液涂布于平板培養(yǎng)。將平板培養(yǎng)好的菌絲體用組合酶于室溫下處理，過濾離心收集原生質(zhì)體，并調(diào) 節(jié)原生質(zhì)體濃度，用紫外誘變處理。(2)生產(chǎn)菌株的篩選將經(jīng)誘變后的菌株培養(yǎng)，挑取菌落顏色淡化、形態(tài)異?；蜴咦迂S滿的菌株，斜面保 存。將菌落初篩獲得的變異菌株接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，選取多產(chǎn)酸性蛋白酶 的突變菌株，進行下一步搖瓶復篩。選出酸性蛋白酶產(chǎn)量最高的菌株。(3)酸性蛋白酶的生成將搖瓶篩得到的菌株先經(jīng)過種子培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入固體發(fā)酵培養(yǎng)基恒溫發(fā)酵培養(yǎng)。 發(fā)酵完畢后抽提后用氯化鈉和硫酸銨混合鹽析，后經(jīng)干燥得到酸性蛋白酶。本發(fā)明所采用纖維素酶、溶菌酶和蝸牛酶組成的復合酶制備原生質(zhì)體，并通過UV 誘變的方法篩選出的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，并在最佳優(yōu)化的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得 到酸性蛋白酶，發(fā)酵液用混合鹽析法處理，純化程度高，得到的產(chǎn)品純度高，含量高。該方法 操作簡單、又節(jié)省成本，該法將在酸性蛋白酶的工業(yè)化大生產(chǎn)中有良好的應用前景。
權利要求
1.一種酸性蛋白酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)誘變處理單孢子懸液制備在斜面培養(yǎng)基上加入無菌水，用接種環(huán)刮取培養(yǎng)物表面的孢子，制成 粗制的孢子懸液。將此懸液振蕩20min，過濾懸液，制成孢子濃度約IO6個/ml的單孢子懸 液，將孢子懸液涂布于平板培養(yǎng)。將平板培養(yǎng)好的菌絲體用組合酶于室溫下處理，過濾離心收集原生質(zhì)體，并調(diào)節(jié)原 生質(zhì)體濃度，用紫外誘變處理。(2)生產(chǎn)菌株的篩選將經(jīng)誘變后的菌株培養(yǎng)，挑取菌落顏色淡化、形態(tài)異?；蜴咦迂S滿的菌株，斜面保存。 將菌落初篩獲得的變異菌株接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，選取多產(chǎn)酸性蛋白酶的 突變菌株，進行下一步搖瓶復篩。選出酸性蛋白酶產(chǎn)量最高的菌株。(3)酸性蛋白酶的生成將搖瓶篩得到的菌株先經(jīng)過種子培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入固體發(fā)酵培養(yǎng)基恒溫發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵 完畢后抽提后用氯化鈉和硫酸銨混合鹽析，后經(jīng)干燥得到酸性蛋白酶。
2.根據(jù)權利(1)中的所述斜面培養(yǎng)基為=NaNO30.2%, K2HPO4 0.1%, KCl 0. 05%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 001 %，蔗糖3%，瓊脂1. 5%，pH 6. 7 ；斜面平板培養(yǎng)時間為18h，誘 變組合酶為纖維素酶蝸牛酶溶菌酶=0.7% 0.2% 0. 1%，室溫處理時間為池； 原生質(zhì)濃度為106CFU/ml ；紫外誘變處理時間為45s。
3.根據(jù)權利O)中所述的初始發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮13.0g，豆餅粉4. 0g，蛋白胨1. Og, 酵母膏 1. 5g, NH4NO3 0. 5g, KH2PO4 0. 2g, FeSO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, H209. OmL, pH5. 5。
4.根據(jù)權利(3)中所述的種子培養(yǎng)基為麩皮5.36%,KH2PO4 0. 15%,CaCl2 0. 005%； 固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮17. 79g，豆餅粉4. 53g，KH2PO4 0. 205g, H2O 9. OmL, ρΗ5· 5 ；恒溫發(fā) 酵溫度為30°C，時間為48h ；抽提溫度為40°C，氯化鈉為0. 2mol/L，硫酸銨為0. 02mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酸性蛋白酶的制備方法。本發(fā)明采用復合酶制備原生質(zhì)體，并通過UV誘變，篩選出的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，在最佳優(yōu)化的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到酸性蛋白酶液，并用混合鹽析法處理得到高純度的酸性蛋白酶。該方法操作簡單、又節(jié)省成本，該法將在酸性蛋白酶的工業(yè)化大生產(chǎn)中有良好的應用前景。
文檔編號C12N9/62GK102071183SQ20091015464
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權日2009年11月23日
發(fā)明者吳菁 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司