專利名稱：：一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種a-半乳糖苷酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
：a-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase，EC3.2.1.22)是催化a-半乳糖苷鍵水解的酶類，廣泛的分布于植物、動物和微生物體內(nèi)。它不但可以催化a-半乳糖苷類的寡糖，還可以催化含a-半乳糖苷鍵的多聚糖。該酶在飼料、食品、造紙和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，已分離篩選出許多產(chǎn)a-半乳糖苷酶的微生物，如大腸桿菌、芽胞桿菌、鏈霉菌、青霉、紅曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被抱霉、毛霉、根霉、黃曲霉、啤酒酵母等等。微生物a-半乳糖苷酶有較高的產(chǎn)量，特別是絲狀真菌，每升培養(yǎng)基可以分泌30g蛋白質(zhì)，它們產(chǎn)生的ct-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合適的酸堿度和良好的穩(wěn)定性從而最有利于技術(shù)應(yīng)用。因此產(chǎn)生a-半乳糖苷酶的真菌受到越來越廣泛的關(guān)注。豆粕是飼料工業(yè)中應(yīng)用最廣的植物性蛋白質(zhì)原料，一般在日糧中的用量為2530%。在豆類餅粕詞料中，含有57%的單胃動物不能消化的8-半乳糖苷的低聚糖，占豆粕中碳水化合物總量的40%左右，它們是一種抗營養(yǎng)因子，主要包括水蘇糖、棉子糖和毛蕊花糖。在單胃動物的腸道內(nèi)缺乏a-半乳糖苷酶，較高濃度的此類游離的水溶性低聚糖可能造成食糜黏度增高，對營養(yǎng)物的吸收和消化產(chǎn)生不利影響；同時這些低聚寡糖不能被家禽消化道的內(nèi)源酶降解，只有經(jīng)過消化道微生物發(fā)酵以后才能被利用。不僅消化能大大降低，而且在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生C02、CH,和H2等氣體，使畜禽的采食量下降，還產(chǎn)生脹氣等疾?。涣硗?，這些低聚寡糖還能剌激腸道蠕動，提高詞料通過消化道的速度，從而降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率；豆粕中還含有約14%的果膠，而果膠具有高度的粘性。這些粘性的多糖不但抑制營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，而且還能和腸道分泌的消化酶結(jié)合，降低消化酶活性，甚至還會引起腸粘膜形態(tài)和功能的變化。果膠中約7%的&-半乳糖苷具有良好的熱穩(wěn)定性，在普通的飼料調(diào)制加工過程也不會失活，同時亦不能被單胃動物的內(nèi)源酶消化。如果所有這些半乳糖苷都被a-半乳糖苷酶水解掉，則豆粕的代謝能含量會增加250千卡，即如果每千克日糧的代謝能含量為3000千卡，則總能量含量的增加為8.0%以上。在豆粕類飼料中添加a-半乳糖苷酶可以提高豆粕的代謝能，消除腸道的脹氣現(xiàn)象，增加動物的采食量。把a-半乳糖苷酶作為復(fù)合酶制劑的一個成分添加到飼料中會起到明顯的效果。在食品工業(yè)上，a-半乳糖苷酶可用于豆奶的發(fā)酵，水解豆奶中易使胃脹氣的蜜二糖和水蘇糖，從而獲得低a-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品，有利于人體消化。一種非處方的a-半乳糖苷酶口服液Beano，利用a-半乳糖苷酶緩解諸如脹氣等胃腸疾病。這些疾病是由高纖維的飲食所致。臨床研究表明，a-半乳糖苷酶對預(yù)防胃腸不適應(yīng)某些寡糖有極好療效。在制糖工業(yè)上，由于棉子糖的存在，造成糖蜜黏度增加，阻礙蔗糖晶體析出，產(chǎn)生大量廢糖蜜。使用a-半乳糖苷酶一方面可去除廢糖蜜中的棉子糖，產(chǎn)生半乳糖和蔗糖，提高蔗糖得率，另一方面可以減少在制糖過程中降溫與再加熱的費用，降低生產(chǎn)成本。a-半乳糖苷酶用于甜菜制糖工業(yè)中，可使甜菜廢糖蜜中所含的610%棉子糖水解7687%，分解生成的蔗糖和廢糖蜜中原來所含的蔗糖均能提取出來，使蔗糖產(chǎn)率提高34%。因此，這種工藝被稱為"無廢糖蜜制糖法"。甜菜上部因含棉子糖過多，往往不能利用而廢棄，采用酶法制糖后，則能充分利用，并且節(jié)約能源，縮短結(jié)晶時間，使加工能力和設(shè)備周轉(zhuǎn)率都有很大提高。在造紙工業(yè)中，使用a-半乳糖苷酶也是一種令人感興趣的選擇。阿拉伯木聚糖和半乳葡聚甘露聚糖是軟木中主要的半纖維素組分，a-半乳糖苷酶可以水解半纖維素類的半乳葡聚甘露聚糖，使a-半乳糖從其碳鏈骨架上分離下來。盡管單獨使用a-半乳糖苷酶處理造紙加工過程中的軟木紙漿對紙張的漂白沒有什么影響，但是軟木紙漿被木聚糖酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的處理后，可以提高紙張的漂白效果。目前，a-半乳糖苷酶在醫(yī)學界也引起廣泛的興趣。許多ct-半乳糖苷酶可以從B血細胞表面的糖蛋白水解a-1，3-D連接的末端半乳糖苷殘基，從而造成B型血到0型血的轉(zhuǎn)換。通過把B型血轉(zhuǎn)換成的0型血可以增加通用血型。Fabry疾病(X性連鎖隱性遺傳性溶酶體a-半乳糖苷酶缺乏性疾病)是一種糖代謝缺陷遺傳病，該疾病不但會導(dǎo)致疼痛，還影響腎臟、心包、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚，還會造成胃腸道癥狀。這種疾病是由人體的溶酶體a-半乳糖苷酶A缺乏造成的，從而造成糖磷脂的逐漸增加。a-半乳糖苷酶可以水解糖磷脂的末端a-半乳糖殘基，這種功能可以用于治療Fabry疾病。a-半乳糖苷酶作為一種新型的酶制劑，在許多領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景。目前，a-半乳糖苷酶主要是利用原菌株的發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量較低，成本較高。a-半乳糖苷酶的基因工程菌株目前報道也較少，主要還是在實驗室研究階段。因此，不斷提高菌種產(chǎn)酶水平，研究a-半乳糖苷酶合成的調(diào)控機制、酶基因的克隆和異源高效表達，進行產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用是今后發(fā)展的發(fā)展的主要方向。隨著分子生物學的發(fā)展，各種微生物來源的a-半乳糖苷酶基因從細菌、真菌中克隆并進行了功能表達分析，研究了這些基因的表達調(diào)控，并使其異源表達。許多表達系統(tǒng)已經(jīng)成功的用于a-半乳糖苷酶的異源表達，如大腸桿菌系統(tǒng)、畢赤酵母系統(tǒng)、啤酒酵母系統(tǒng)、絲狀真菌表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)等。a-半乳糖苷酶主要是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，菌種主要來源于曲霉和犁頭酶。據(jù)報道，美國、丹麥和日本已有這方面的基因工程菌，并且還發(fā)酵了少量產(chǎn)品。但由于價格較高，目前只是用于實驗研究。利用工程菌株高效表達a-半乳糖苷酶，降低生產(chǎn)成本是生產(chǎn)飼料用a-半乳糖苷酶的發(fā)展方向。目前研究者已經(jīng)從黑曲霉，青霉，被孢霉，傘枝犁頭霉，里氏木霉等真菌中克隆獲得了相關(guān)a-半乳糖苷酶的基因，并進行了異源表達。但是，焦曲霉目前多為原菌發(fā)酵，還未見焦曲霉來源的ci-半乳糖苷酶基因報道。所以，克隆焦曲霉的a-半乳糖苷酶基因，獲得基因保守片段，進一步獲得基因全長及異源表達，對于豐富a-半乳糖苷酶的具有重要的分類學理論指導(dǎo)和工業(yè)生產(chǎn)的實踐意義。隨著大量的a-半乳糖苷酶的鑒定，純化及克隆表達的研究，該酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也受到越來越廣泛的重視。通過對堿性的a-半乳糖苷酶、27家族的a-半乳糖苷酶和36家族的a-半乳糖苷酶分別進行氨基酸序列的一致性分析，發(fā)現(xiàn)這三類a-半乳糖苷酶有兩個保守的基序(Motif)，一個是DD(/C)W，另一個為WD。第27家族的a-半乳糖苷酶的活性中心被預(yù)測含有兩個羧基集團，一個含羧基的氨基酸作為催化親核子，另一個作為催化質(zhì)子供體。其中1(*0被認為是27家族最保守基序YLKYDNC的一部分，這個D已經(jīng)被證明是催化親核子。在已廣泛使用的a-半乳糖苷酶中，仍存在一定缺陷，需要從新來源的菌株中獲得不同性質(zhì)的a-半乳糖苷酶的基因，在不同領(lǐng)域發(fā)揮理想作用。焦曲霉屬于子囊菌門，盤菌亞門，散囊菌目，發(fā)菌科，曲霉屬，目前無a-半乳糖苷酶基因的報道，多為原菌發(fā)酵生產(chǎn)a-半乳糖苷酶。另外，現(xiàn)有的技術(shù)中分離a-半乳糖苷酶的手段有限，主要是構(gòu)建基因組文庫或者是純化蛋白入手。這兩種方法都費時費力，效率較低，而且價格昂貴。不同物種中a-半乳糖苷酶的相似性較低，針對這樣的從未報道過a-半乳糖苷酶的菌株，要獲的基因序列比較困難。這也是一個種對于現(xiàn)有的方法去獲得未知新基因的挑戰(zhàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種a-半乳糖苷酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的a-半乳糖苷酶，來源于焦曲霉，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1中自N端起第21-438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)限定的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有a-半乳糖苷酶活性的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的a-半乳糖苷酶的編碼基因為如下l)、2)、3)或4)的基因1)序列表中序列2所示DNA分子；2)序列表中序列3所示DNA分子；3)在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述a-半乳糖苷酶的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且編碼所述a-半乳糖苷酶的DNA分子。上述3)和4)所示的基因可以是由自然變異產(chǎn)生的，也可以是人工誘變產(chǎn)生的。本發(fā)明的編碼基因中包括在序列2和3基礎(chǔ)上由于遺傳密碼子的兼并性而產(chǎn)生的新序列，遺傳密碼子的兼并性并不影響新序列編碼a-半乳糖苷酶。為了使上述(a)或(b)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或序列l(wèi)中自N端起第21-438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Poly-His2-10(通常為6個)H朋HHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(c)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對具體可為如下任一所述引物對1)一條引物序列如序列表中序列4所示，另一條引物序列如序列表中序列5所示；2)—條引物序列如序列表中序列6所示，另一條引物序列如序列表中序列7所示；3)—條引物序列如序列表中序列8所示，另一條引物序列如序列表中序列9所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體為在表達載體pET-30a(+)的多克隆位點插入序列表中序列2所示核苷酸序列得到的重組表達載體。所述載體可為表達載體或病毒載體。本發(fā)明的重組載體中可以含有增強子等調(diào)節(jié)序列，可以根據(jù)欲轉(zhuǎn)化的宿主細胞、所需的蛋白質(zhì)表達水平等因素迸行了靈活改造。所述重組菌可以是通過將上述任一所述重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母得到的。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌Rosetta。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種制備a-半乳糖苷酶的方法。本發(fā)明所提供的制備a-半乳糖苷酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述任一所述重組菌得到a-半乳糖苷酶。所述方法中，在所述發(fā)酵后，還可包括純化的步驟。所述純化是用Ni柱親合層析純化，其中用到的洗脫緩沖液具體可以為NTA-200緩沖液；所述NTA-200緩沖液由終濃度為20mmol/L的Tris-Cl緩沖液、終濃度為10%(體積百分含量)的終濃度200mmol/L的咪唑組成；NTA-200緩沖液的pH值為8.0;所述終濃度為各物質(zhì)在NTA-200緩沖液中的濃度。實驗證明，本發(fā)明制備a-半乳糖苷酶的方法中，重組菌產(chǎn)酶的能力為13.242ug/ml發(fā)酵液，得到的a-半乳糖苷酶的比活為3.02U/mg。該酶在42-50°C的溫度范圍內(nèi)都具有高的酶活性，最適作用溫度為5(TC;該酶具有很好的溫度穩(wěn)定性，在37。C保溫l小時，酶活仍保持在82.5%，在50。C保溫2min，酶活保持在78%，在50"C保溫4min，酶活保持在61%。該酶在PH值為6.0-9.0的范圍內(nèi)都具有高的酶活性，最適pH值為9.0;在pH值為6.0的條件下保溫l小時后，酶活為93.7%;在pH值為7.0的條件下保溫l小時后，酶活為79%;在pH值為8.0的條件下保溫1小時后，酶活為84.7%;在pH值為9.0的條件下保溫l小時后，酶活為85.3%。相對于其它的絲狀真菌來源的a-半乳糖苷酶，本發(fā)明酶具有中性偏堿性的特點。因此，本發(fā)明酶可應(yīng)用于更廣泛的工業(yè)生產(chǎn)中，為進一步工業(yè)化高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建也提供了實驗的素材，為豐富a-半乳糖苷酶來源的多樣性也提供了對比的序列和性質(zhì)研究參考。所以本發(fā)明酶及其編碼基因具有非常好的商業(yè)應(yīng)用價值的應(yīng)用潛力。圖1為a-半乳糖苷酶基因cDNA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為蛋白表達及純化的SDS電泳結(jié)果。圖3為酶學性質(zhì)曲線。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中使用的焦曲霉是焦曲霉(Aspergillusustus)(CGMCCNO.3.3534)，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。實施例l、a-半乳糖苷酶編碼基因的獲得1、通過設(shè)計簡并引物獲得酶編碼基因的部分序列焦曲霉屬于曲霉菌屬，因此搜尋現(xiàn)有的來源于曲霉菌屬的a-半乳糖苷酶基因蛋白序列，用多序列比對程序BLOCKS[http:〃blocks.fhcrc.org/block/make—blocks,html]分析，發(fā)現(xiàn)了兩段保守序列W(G/E)IDYLKYD和HPAEYWSGP?；谶@兩段保守序列，設(shè)計一對簡并引物，通過PCR從焦曲霉基因組DNA中擴增獲得部分a-半乳糖苷酶序列。根據(jù)兩個保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，使用DNA合成儀合成。以焦曲霉(Aspergillusustus)基因組DNA為模板進行PCR擴增。除了簡并引物和基因組DNA模板外，其他用于PCR擴增的試劑都購自上海申能博彩生物科技有限公司。通過PCR擴增。簡并引物序列如下-5，TGGGGCATCGACTAC(T/C)T(A/T/C/G)AA(A/G)TA(T/C)GA3，(序列4)5，GGGGCCGGACCAGTA(T/C)TC(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)GG(A/G)TG3，(序列5)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的試劑與條件10XPCRbuffer(含MgCl2)5u1d證mix(2.5畫1/U4u1Taq纖polymerase(3u/u1)1P1F(10Wnol/L)3u1R(10Mmol/L)3n1Template(焦曲霉基因組DNA)1u1ddH2033n1:§^1^TH~~PCR擴增條件194°C5min294°C45S362°C30s472°Clrainto230cycles572。ClOmin瓊脂糖電泳檢測，回收獲得約600bp片段，PCR產(chǎn)物直接測序，結(jié)果確定了570bp的DNA序列為部分a-半乳糖苷酶基因。2、完整的a-半乳糖苷酶編碼基因的克隆通過反向PCR(IPCR)、熱不對稱交錯PCR(Tail-PCR)克隆獲得了以上570bp基因片段的上下游區(qū)域。IPCR和Tail-PCR都是獲得已知序列兩端未知序列的有效手段，特別是Tail-PCR效率高，簡單，便宜，更是值得應(yīng)用的好方法。1)反向PCR獲得570bp序列的上游序列根據(jù)以上獲得的570bp的中間序列，設(shè)計了反向PCR的兩對嵌套引物，分別是:反向第一輪引物FNZTCTCCTCCGCATTAACCAAGACCFNFCACTCGCACAGGGAGAACTGGAA反向第二輪引物FWZCGAAACTCATCCCGCCGAATACTFWFTCCGCCATCCTCTTGTATCGTCCPCR程序反應(yīng)體系2XPCRbuffer(高GC)10u1dNTPmix(10mmol/L)1Taq(3u/u1)1u1Primerf(10Mmol/L)1U1Primerr(10Wnol/U1y1模板DNA1u1ddH202u1總體系20u1擴增條件(touch-downPCR)3rain94。C94°C60°C72°C94°C50°C72°C72°C45S30S90S45S30S90S5min-0.5s220cycles30cycles2)熱不對稱交錯PCR擴增570bp的下游序列根據(jù)以上獲得的570bp的中間序列，設(shè)計Tail-PCR的巢式特異引物對下游片段進行擴增。同時，用到的簡并引物(AD，arbitrarydegenerateprimers)也是成功的關(guān)鍵。它們分別為下游Tail-PCR:特異引物DSP1ACGACTTGGGCACTGCTAAA,(downspecialprimer)DSP2ACAAGGATCTCCTCCGCATT,DSP3AACCCGGACTATACCTTCAA.所用簡并引物ADWCAGNTGWTNGTNCTGTail-PCR程序反應(yīng)體系2XPCRbuffer(高GC)12.5n1dNTPmix(10mmol/L)lu1LATaq(5u/u1)1ti1SP(10Wnol/L)0.5ulAD(lOMmol/L)4ul模板DNA1u1ddH20_5.6u1總體系25ul擴增條件TAIL--PCR1(引物為:DSP1和AD)194°Clmin225°C2min59s-O.2s372°C2min30s494°Clmin566°C30s672°C2min30s794°Clmin866。C30s972°Clmin30s1094°Clmin1144°Clmin1272°C2min30s41372°ClOminTAIL-PCR2(引物為DSP2和AD)194°Clmin294。Clmin366°C30s472°Clmin594°Clrain666°C30s772°Clmin894°Clmin942°C30S1072°Clfflin1172°ClOminTAIL--PCR3(引物為D;194°Clmin294°C30s366°C30s472°Clmin594°C30s666。C30s772°Clmin894°C30s942°C30S1072°Clmin1172°ClOrain224cycles224cycles將TAIL-PCR3獲得的PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒(購自上海申能博彩生物技術(shù)有限公司)回收，連入PEASY-T3CloningVector(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10細胞，分離含有基因的菌株，測序。通過IPCR進一步獲得上游766bp的序列。通過TAIL-PCR確定獲得下游1221bp的序列。三序列被輸入DNASTAR軟件，并通過序列拼接程序組裝。獲得序列全長為2832bp。該2832bp為編碼基因的基因組序列，如序列表中SEQIDN0.3所示。將上述2832bp序列經(jīng)過內(nèi)含子分析[http:〃genes.mit.edu/GENSCAN.html]，發(fā)現(xiàn)拼接獲得的基因含有多段內(nèi)含子區(qū)域。將內(nèi)含子部分去除，通過DSGENE軟件進行0RF查找，發(fā)現(xiàn)1314bp的開放閱讀框(SEQIDNO.2)。3、cDNA結(jié)構(gòu)分析用QIAGENRNeasyPlantMini試劑盒(RNeasyPlantMiniKit,Cat.no.74903)，提取焦曲霉(Aspergillusustus)CGMCCNO.3.3534的總RNA;利用MBI反轉(zhuǎn)錄i式劑盒(Fermentas:RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit,#K1621)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA;以cDNA為模板，用如下引物進行PCR擴增QF:ATGTTACTTTCAGTGATCGTCATTA，(序列6)QR:TTAGTTGCTATAATATGTCCCATTC(序列7)，將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，獲得的片段大小1.3Kb左右，標示為J-gale。PCR產(chǎn)物膠回收，連入PEASY-T3CloningVector,轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10細胞，分離含有基因的菌株，測序，獲得的cDNA序列如序列表中SEQIDN0.2所示。SEQIDNO.2所示核苷酸序列編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1所示由438個氨基酸組成，自N端起第1-20位氨基酸殘基為信號肽，第21-438位氨基酸殘基為酶。該閱讀框編碼了一段信號肽和一個成熟蛋白，通過SignalP程序和多序列比對，確定信號肽N端的可能切割位點為Ala20-Leu21。該關(guān)于成熟活性蛋白的N端位置的數(shù)據(jù)對于蛋白質(zhì)在異源表達系統(tǒng)中的表達是必要的。利用P印tideMass程序確定了成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的預(yù)測分子量為49kDa。通過ProtPar柳[http:〃us.expasy.org/tools/protparam.html]予貞測該成熟蛋白的理論等電點約為5.36。IPCR獲得基因中間序列的上游至起始密碼子534bp，TAIL-PCR獲得基因中間序列的下游直至終止密碼子前318bp。在NCBI的GeneBank中利用BLAST服務(wù)器[http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast]進行相似性分析。結(jié)果表明酶的氨基酸序列(SEQIDNO.1自N端起第1-438位氨基酸殘基)顯示與褐腐菌(Postiaplacenta)的假定蛋白(Genebank號為XP—002469401)的低一致性(58%)，與雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)的糖基水解酶第27家族的蛋白(Genebank號為XP—001881346)的低一致性(54。/。)，并且具有和簡青霉(Penicilliumsimplicissimum)的已知a-半乳糖苷酶(Genebank號為CAA08915)的低一致性(37%)。因此可以確定這個來源于焦曲霉的開放閱讀框編碼了一個新的a-半乳糖苷酶，將該酶命名為J-GALC。實施例2、基因工程表達獲得a-半乳糖苷酶及該酶的酶學性質(zhì)分析一、基因工程表達獲得a-半乳糖苷酶1、a-半乳糖苷酶編碼基因的制備用QIAGENRNeasyPlantMini試劑盒(RNeasyPlantMiniKit,Cat.no.74903)，提取焦曲霉(Aspergillusustus)(CGMCCNO.3.3534)的總RNA;利用MBI反轉(zhuǎn)錄試齊U盒(Fermentas:RevertAidFirstSt環(huán)dc腿SynthesisKit,瓶1621)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA;以cDNA為模板，用如下引物進行PCR擴增JYF:(￡<%RI)GAATTCATGTTACTTTCAGTGATCGTCAT(序列8)JYR:(淑I)GCGGCCGCTTAGTTGCTATAATATGTCCCAT(序列9)將PCR擴增產(chǎn)物進行測序鑒定，測序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示。2、重組表達載體構(gòu)建回收步驟1獲得的PCR產(chǎn)物，連接PEASY-T3CloningVector,挑取克隆測序鑒定。將測序結(jié)果序列如序列表中SEQIDN0.2所示的陽性重組質(zhì)粒記作pT3-J-galo將陽性重組質(zhì)粒pT3-J-gal用EcoRI，Notl雙酶切，回收約1.3kb的片段，以EcoRI、Notl雙酶切原核表達載體pET-30a(+)并回收；基因片段與載體片段16'C過夜連接，得到重組表達載體pET-J-gal。熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，涂布于含有100ugkan/mL的LB培養(yǎng)基平板上。挑取陽性克隆，用液體LB(Kan)培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行測序鑒定，得到插入基因序列和結(jié)構(gòu)正確的重組表達載體pET-J"-galo3、重組菌的構(gòu)建大腸桿菌Rosetta購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒pET-J-gal及pET-30a(+)空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，涂于含卡那霉素的LB(簡稱LB-kan)平板，37。C至長出單菌落。分別挑單菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切鑒定正確，得到陽性重組菌。將轉(zhuǎn)入pET-J-gal的陽性重組菌記作R-pET-J-gal。將轉(zhuǎn)入pET-30a(+)的重組菌記作R-pET-30a(+)。4、重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)過夜。按l兔體積轉(zhuǎn)接于100mlLB-kan液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)至OA。。為0.60.8。加入IPTG(終濃度O.2mmol/L)在25。C誘導(dǎo)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)1.5小時，得到100ml發(fā)酵液。5、蛋白的提取取步驟4中誘導(dǎo)培養(yǎng)后的100ml發(fā)酵液，離心收集菌體，按菌液Tris-HC1緩沖液(20Mra，pH8.0)=10:1的比例重懸菌體，超聲波破碎細胞，破碎后離心收集上清液和菌體，得到10ml上清液。6、a-半乳糖苷酶r-J-GALC的Ni柱純化及SDS-PAGE檢測將步驟5得到的上清液用Ni柱親合層析純化。步驟如下1)取親和層析樹脂Ni-NTAAgarose1.5-2ml，加入已放好墊片的塑料管中，待樹脂全部沉積到一起時，放入上層墊片，壓緊，這樣就灌好一個親和層析柱，備用。2)將柱子垂直擺放在4"C冰箱中，加入水15-20ml。3)流盡后加入23ml0.lmol/L硫酸鎳(第一次使用時可以不加)。4)流盡后加入1520mlNTA-O緩沖液平衡柱子。5)流盡后即可加入上清液，此時帶有組氨酸標簽的蛋白可以與樹脂上的鎳結(jié)合。6)上清液全部流盡后，仍用NTA-0緩沖液20ml清洗柱子。7)取IOmlNTA-200緩沖液沖洗柱子，洗脫液回收，得到10ml洗脫液。分別收集重組菌R-pET-30a(+)和重組菌R-pET-J-gal在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體，用相應(yīng)等體積的Tris-HC1緩沖液重懸，得到菌體懸浮液，用于SDS-PAGE檢測；分別收集重組菌R-pET-J-gal菌體破碎后上清和沉淀，然后進行SDS-PAGE檢測；收集重組菌R-pET-J-gal菌體破碎后上清用NTA-200洗脫的洗脫液，然后進行SDS-PAGE檢測。取20uL洗脫液加入2X蛋白電泳緩沖液20uL混合，5min煮沸，SDS-PAGE檢測；各取20u1上清液和菌體懸液做SDS-PAGE檢測。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖2所示。表明，經(jīng)誘導(dǎo)后有蛋白的誘導(dǎo)表達，純化后得到單一條帶，且分子量與預(yù)測的理論分子量一致。圖2中，泳道1表示重組菌R-pET-30a(+)在誘導(dǎo)結(jié)束的菌體懸浮液，泳道2表示重組菌R-pET-J-gal在誘導(dǎo)前的菌體懸浮液，泳道3表示重組菌R-pET-J-gal在誘導(dǎo)后的菌體懸浮液，泳道4表示重組菌R-pET-J-gal菌液離心收集菌體后經(jīng)緩沖液重懸破碎后的菌體，泳道5表示重組菌R-pET-J-gal菌液離心收集菌體后經(jīng)緩沖液重懸破碎后的上清，泳道6表示重組菌R-pET-J-gal菌體破碎后上清經(jīng)NTA200純化洗脫液，泳道M表示Marker。將NTA200純化洗脫液中的蛋白進行定量分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，每毫升洗脫液中含有a-半乳糖苷酶132.42!ig，換算得到每毫升發(fā)酵液中含有活性a-半乳糖苷酶13.242wg。每毫升發(fā)酵液中活性a-半乳糖苷酶量=(132.42ug/ml洗脫液X10)/100ml發(fā)酵液43.242wg/ml發(fā)酵液。7、酶活的測定以對硝基酚-a-D-吡喃半乳糖(pNPG)為底物，經(jīng)酶解后測定釋放的對硝基酚(pNP)含量，獲得a-半乳糖苷酶活力。a-半乳糖苷酶活性定義為l分鐘內(nèi)分解pNPG產(chǎn)生lymolpNP的酶量作為1個酶活單位(1U)。具體的檢測方法如下PNPG溶于O.1M、pH值為9.0的(甘氨酸-氫氧化鈉)緩沖液中，使其終濃度為20腿ol/L。將步驟6得到的10ml洗脫液用0.1M、pH值為9.0的(甘氨酸-氫氧化鈉)緩沖液稀釋100倍，作為酶活測定的酶液。將lmL酶液和lmL20mM的pNPG混合，搖勻；在溫度為5(TC、pH值為9.0的條件下，溫育15min后，加入2mL1M的Na2C(V溶液來終止反應(yīng)。在nm處測其吸光值，以對硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。對照管以O(shè).1M、pH為9.0的(甘氨酸-氫氧化鈉)緩沖液代替酶液進行測定。甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液由終濃度為3.75g/L的甘氨酸和終濃度為1.28gg/L的NaOH組成；所述終濃度為各物質(zhì)在緩沖液中的濃度。繪制酶活標準曲線，獲得酶活計算公式每毫升洗脫液中酶活的計算公式如下酶活性(U/ml洗脫液)=(196.74X+0.5174)XN/(15X1000)x:405nm處光吸收值；15:反應(yīng)15min;N:將洗脫液稀釋成酶液的稀釋倍數(shù)(即100)實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，每毫升洗脫液中含有0.4個單位的酶活。本發(fā)明發(fā)酵表達得到的蛋白具有a-半乳糖苷酶的活性。每毫升發(fā)酵液中酶活數(shù)量的計算公式如下(0.4U/ml洗脫液)X10ml洗脫液酶活(U/ml發(fā)酵液)=-100ral(發(fā)酵液總體積)計算得到，每毫升發(fā)酵液中含有0.04個單位的酶活，即0.04U/ml發(fā)酵液。由步驟6中的"每毫升洗脫液中含有a-半乳糖苷酶的克數(shù)"及步驟7中的"每毫升洗脫液中酶活數(shù)"換算(+[132.42yg/ml洗脫液])，得到本發(fā)明酶比活為3.02U/mg。二、酶學性質(zhì)分析以下酶活測定中，都是將實驗一中步驟6得到的用NTA-200洗脫的洗脫液稀釋100倍后，得到的稀釋液作為酶液進行測定的。用O.1M、pH值為9.0的(甘氨酸-氫氧化鈉)緩沖液進行稀釋的。a-半乳糖苷酶活性定義為l分鐘內(nèi)分解pNPG產(chǎn)生lyraolpNP的酶量作為l個酶活單位(1U)。1、酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性1)最適溫度在不同溫度下測定酶活，方法如下pNPG溶于O.1M、pH值為9.0的(甘氨酸-氫氧化鈉)緩沖液中，使其終濃度為20mmol/L。將lmL酶液和lmL20mM的pNPG混合，搖勻；在不同溫度(37、42、45、50、55、60、65°C)、pH值為9.0的條件下，溫育15rain后，加入2mL1M的Na2C03溶液來終止反應(yīng)。在405nm處測其0D值，以對硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。將溫度為50°C、PH值為9.0的條件下，測得的酶活為0.4U/ml洗脫液，記作100%，其余不同條件下的酶活均是其與"溫度為5CTC、pH值為9.0的條件下"測得的酶活的相對值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，本發(fā)明酶在42-5(TC的溫度范圍內(nèi)都具有高的酶活性，其中在5(TC時酶的活性最高(圖3A)。2)溫度穩(wěn)定性溫度穩(wěn)定性檢測將洗脫液在37°(3和5(TC下分別保持0.5min，lmin,2rain，4min，8min,10min,20min，30min,40min，55min,60min后，禾希0.4U/ml洗脫液，記作100%，其余各不同條件下測得的酶活均是與"未經(jīng)保溫的洗脫液在溫度為5(TC、pH值為9.0的條件下測得酶活"的相對值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，洗脫液在37i:保溫l小時，酶活仍保持在82.5%，在50'C保溫2min，酶活保持在78%，在5(TC保溫4rain，酶活保持在61%(圖3B)。2、酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性1)最適pH值在不同pH值下測定酶活，pH值是通過如下緩沖液調(diào)節(jié)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH3.0);乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH4.0，pH5.0);磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(p服.O，pH7.0，pH8.0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0，pH10.0)。酶活測定方法如實驗l中1)中所述，溫度為5(TC，溫育時間為15min。將溫度為5(TC、pH值為9.0的條件下，測得的酶活為0.4U/ml洗脫液，記作100%，其余不同條件下的酶活均是與"溫度為50'C、pH值為9.0條件測得的酶活"的相對值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如圖3C所示，表明ci-半乳糖苷酶的活性隨pH的變化而變化。酶在pH9.0時表現(xiàn)最佳活性，在pH值為7.0的條件下仍具有55.6%的活性，在pH值為8.0的條件下具有66.6y。的活性。與現(xiàn)有的來源于絲狀真菌的a-半乳糖苷酶相比，報道的酶大多最適pH值在4.0至8.0之間，本發(fā)明酶在堿性條件下酶活相對較高。2)pH值穩(wěn)定性方法將洗脫液在不同的pH值條件下37'C溫育l小時至冰上，然后在溫度為50°C、pH值為9.0的條件下測定其酶活，溫育時間為15min。不同的pH值條件為pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。將未處理洗脫液在溫度為5(TC、pH值為9.0的條件下，測得的酶活為0.4U/ml洗脫液，記作100%，其余不同條件下的酶活均是其與"未處理洗脫液在溫度為50°C、pH值為9.0的條件下測得的酶活"的相對值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，本發(fā)明酶在pH值6.0-9.0之間具有較好的穩(wěn)定性，在pH值為6.0的條件下保溫l小時后，酶活為93.7%;在pH值為7.0的條件下保溫1小時后，酶活為79%;在pH值為8.0的條件下保溫1小時后，酶活為84.7%;在pH值為9.0的條件下保溫l小時后，酶活為85.3y。(圖3D)。<120>—種a-半乳糖苷酶及其編碼基因<160〉9<210〉1<211>438〈212〉PRT<213>曲霉屬焦曲霉(A5/ar^'"ys〃Wws)<400〉1MetLeuLeuSerVallieVallieSerSerLeuAlaAlaLeuAlaGly151015ArgAlaSerAlaLeuAspAlaGlyValGlyLysLeuProLysLeuGly202530TyrAsnThrPheAsnAlaPheGlyCysAsnTyrAspGluAspValVal354045LeuSerGinAlaLysAlaMetLysAlaLeuGlyLeuValAspLeuGly505560TyrLysSerPheLeuPheAspAspCysMetThrGluLysThrArgAsp65707580SerAsnGlyArgLeuValAlaAspAlaGluLysPheProHisGlyLeu859095LysGinLeuThrSerGinLeuLysSerLeuGlylieSerSerSerAla100105110TyrSerAspAlaGlyHisTrpThrCysAlaGlyTyrProGlySerTyr115120125GlyHisGluAlaGinAspLeuGluSerTrpGluAsnTrpGlyPheAsp130135140TyrLeuLysTyrAspAsnCysPhelieProPheAspAsnValThrGin145150155160GluAsnValTyrGlyArgTyrLysArgMetAlaAspAlalieAlaAsp165170175ArgAlaAlaArgLysProHisSerLysSerPheGinPheSerLeuCysTrp195200SerTrpArgValAsnGlyAsplie210215SerlielieAsnThrAlaSerPhe225230GlyArgAsnAspPheAsplieLeu245GluProHisGlyAsnMetThrTyr260ThrTrpAlaLeuLeuLysSerPro275280AsnlieThrArgGinSerLeuGlu290295ArglieAsnGinAspProHisVal305310TrpGlylieAsnProAspTyrThr325TyrTrpThrGlyAsnSerSerTyr340ThrLeuAspThrProGinSerMet355360AlalieArgAlaGlyArgLeuTyr370375ThrHisAsnGlyThrAlaTyrArg385390HisGlyValAlaAlaLeuLeuLeu405GlyLeuGluProTyrCysAlaGly420GlyThrTyrTyrSerAsn435<210〉2<211〉1314<212〉DNA185190lieTrpAlaArgGinLeuGlyGin205LysProTrpTrpSerSerlieAla220lieSerSerAlaThrAspPheTyr235240GluValGlyAsnTyrGlyGinGly250255AspGluGluLysSerHisPheThr265270LeuLeulieSerAlaAsnLeuAla285lieLeuSerAsnLysAspLeuLeu300GlyAlaSerlieSerProPheArg315320PheAsnGluThrHisProAlaGin330335GlyValValPheMetLeuLeuAsn345350ThrPheAsnLeuThrGluSerTrp365AspValTyrAspMetTrpSerHis380AsnlieThrValAspLeuProPro395400AsnAspAlaGlyProGluGinGly410415TrpTrpGinCysSerTyrProAsn425430〈213〉曲霉屬焦曲霉(As/ei^7'77〃swsz^s)<400>2atgttactttcagtgatcgtcattagtagtcttgctgcccttgctggccgtgcatcggcg60ctcgatgccggtgtcggcaagcttccaeiELgcttggatacaatacgttcaatgccttcgga120tgcaattacgacgaggatgtcgtgctttcccaeigccaaggcsatgasggctxtcggtctc180gtcgacctagggtataagtcgtttctgttcgatgattgcatga_ctg3g33aacccgcgat240tcaaacggccgattsgtsgccgacgccgagaagttccctcatggactgaaacaacttacc300tcacaactcaagtcacttgggatatcgtccagcgcatactccgatgccggcc3ttggax;8360tgtgctgggtatcccggatcatacggccacga^gcgc犯gacctagagtcctggg卿at420tgggggttcgactacctcaagt3Cg3t33Ctgcttcatccccttcgacaacgtcacccag480gagaatgtctatggacgataceiagaggatggcggatgctatagccgatcgcgctgcgaga540aaacctcactccaagtcgttccagttctccctgtgcgagtgggggtggcaacagccctgg600atctgggcgcgccagttgggcc卿gctggcgcgtcaacggcgacattaagccgtggtgg660agttctattgcgsgta_tcatcaacacggca_tcgtttatttcctctgctacggacttttac720ggtcgcaatgactttgatatcctggaggttgggaactacgggcagggcgagccacatggg780朋C3tg3Cttacg3cg3ggaaaagagccactttacgacttgggcactgct3朋gtCgCCg840ttgcttatcagcgccaatctggccasceitc3cccga_C3gaigtcttgagattctttccaac900a_aggatctcctccgcatta_aCC肌g3CCCCcacgtcggagccagca_ttagtxccttccgc960tggggcatcaa_cccggact3taccttcaacga犯ctcatcccgcccagtactggaccggc1020aactcgagttatggtgtggtattcatgctcctgaatacgctcgacacaccccaatccatg1080accttcaatctcacggagagctgggccatccgcgctgggag3C"tgt3Cg3tgtctacgac1140atgtggagccaca_cgca_caa_tgggacggcatatcggaacBttacggttgatttaccgccg1200catggagtcgcggcgctccttctgaatgatgcaggaccag3gC3gggtggcctggagccg1260tactgtgccgggtggtggcagtgttcgtatCCg組gggELcatattatagcaac1314<210>3<211>2832〈212〉DNA〈213〉曲霉屬焦曲霉(Aspe2^i77wsf/"ws)<400〉3tacsggtgstCCCCC3tCtttC3tCt33t3cccaattgggagtcaaaatagcttggtccgtctccacggtatgatccccgC3tt3333ttgctgcccttgggatacaatagttcaatgccgaaggctctcggtgctgcacgtacggcacsatactgtctcaccggggtcgaccacggggcgggtctggct3tgstcgacsggatggggcsctggccgtgcgtaggttgggttcggatgcaggtctcgtcgccccccaagtcsgcggggacccgagatgcacccgcagctttgcaaatgccgaggcggcttaaaatcgccgC3C33CC3tgatcggcgctcttggctgcctattacgscgaacctagggtaccctcattcattccgtgtctttggacgcagtcccgcgtggtgtcgctcgagggcctccaa3t3tCCC33tatgtcaggaattactttcaggatgccggtgcaaagttcgtggatgtcgtgtaagtcgttt33C3tttC3ttc3gsggct3gggatctctcgctaagcatttactaggttctgggsaacggtataaggcgctgatcgtcattcggcaagctgttctgatttctttcccasgctgttcgatgtC3tC3C33tgtaatcccagcscggtatatsgstctcatcggcgcactcggtgtgggggtagggcaccgaaccgggcccttagtagtctttccaaagcttgtttcatagcccaaggcaat3ttgc3tgac60120180240300360420徹540600660720780tgagtacgtacttttattgagacagacttcattatgctactctgttaatactatcctcgcaggasaacccgcgsttcaaacggccgattagtagccgscgccgagasgttccctcatggactgasacascttacctcacaactcaagtcacttgggatatcgtccagcgcatactccgatgccggccattggacatgtgctgggtatcccggatcatacggccacgaagcgcaagscctagagtcctgggagaattgggggttcgactacctcaagtscgataactgcttcatccccttcgacaacgtcacccaggagastgtctatggacgettacsagaggatggcggatgctettsgccgatcgcgctgcgagaaaacctcactccaagtcgttccagttctccctgtgcgagtgggggtggcaacsgccctggatctgggcgcgccagttgggccagagctggcgcgtcaacggcgacattaagccgtggtggagttctattgcgagtatcatcaacacggcatcgtttatttcctctgctacggacttttacggtcgcaatgactttgatatcctggaggttgggaactacgggcagggcgagccscatgggaacatgacttacgacgaggaaaagagccactttacgacttgggcactgctasagtcgccgttgcttatcagcgccaatctggccaacatcacccgacagagtcttgagattctttccaacsaggatctcctccgcattaaccaagacccccacgtcggagccagcattagtcccttccgctggggcatcaacccggactataccttcaacgaaactcstcccgcccagtactggaccggcasctcgagttatggtgtggtattcatgctcctgaatacgctcgacacaccccaatccatgaccttcaatctcacggagagctgggccatccgcgctgggagactgtacgatgtctscgacatgtggagccacacgcacsatgggacggcatatcggaacsttacggttgatttaccgccgcatggagtcgcggcgctccttctgaatgatgcaggaccagagcagggtggcctggagccgtactgtgccgggtggtggcagtgttcgtatccgaatgggacatattatagcaactaaaacggcgattgsagtttctgtagcgtggctttgasccaagttaatgacttggatgtccaactgtagctactcagttagaagaactagatccacctattcgcagagttgatstaatgagcttgcatatgctaccaattgggggattctscccgtcgtatcagcaatgctgtttgagtgtagtaataaaggacaagcatgtgtccgcatatctsactaggasggatactcsttcggtttattgatcaagatagaatttaaattgtacctgagctagacacactctgcacgacacttccatctgccatggccttggcgcttgtatatatgtcagtaaacttaattcccttgagcccttattgccttgagaacctagscatcsaggcccagtcaactattattagcsctatggasttacgcctatgcccacgaccatcataatcttgacatccaacccgacccagaggatgatggtcttcttcagaatctacttatgcttggtaaggatcaaagaggagttctacgaagcgtctagaagttaccattcccccggggacccagtgaatataatatggttaacaaacatatcattatcatgctagcaaggcaaaaactacaaaaacgtacacaagtagggsttgcatgtggtccccgcgaiactacttascttaccgggcgtggcttsaaccggatagasatcgagggggtcgacccggtgagccctctacccctgggttattagtctggggggcggagccsaacctgggggttaaaggggagagtgtacatttcctgttacaagccagacccatcaatacctggacaaactatattccttagatctctcgcttagacagtgaggtccagagtcttctccgaacgssacctaggascgctaasacct2832〈210〉4〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>mis-feature〈222〉(15，16，18，20)〈223〉『t或c，n二a或g或c或t，n二a或g，n=c或t8409009601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402100216〇22202280234024002460252025802640270027602820〈400>4tggggcatcgactannantn22<210>5〈211>23〈212〉DNA<213〉人工序列<221〉mis_feature<222>(15，17，19，21)〈223〉n二t或c，n二a或g或c或t，n二a或g或c或t，n二a或g<400〉5ggggccggaccag城ngngntg23<210>6<211>25<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>〈400〉6atgttactttcagtgatcgtcatta25<210〉7<211〉25<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400〉7ttagttgctataatatgtcccattc25<210>8<211〉29<212〉腿<213>人工序列<220>〈223〉<400>8gaattcatgttactttcagtgatcgtcat29<210>9<211>31〈212>腿<213〉人工序列<220><223><400>9gcggccgcttagttgctataatatgtcccat3權(quán)利要求1、一種α-半乳糖苷酶，是如下a)、b)或c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1中自N端起第21-438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)限定的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求1所述a-半乳糖苷酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述a-半乳糖苷酶的編碼基因為如下l)、2)、3)或4)所示的基因1)序列表中序列2所示DNA分子；2)序列表中序列3所示DNA分子；3)在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述ot-半乳糖苷酶的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且編碼所述a-半乳糖苷酶的DNA分子。4、擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下任一所述引物對1)一條引物序列如序列表中序列4所示，另一條引物序列如序列表中序列5所示；2)—條引物序列如序列表中序列6所示，另一條引物序列如序列表中序列7所示；3)—條引物序列如序列表中序列8所示，另一條引物序列如序列表中序列9所示。6、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在表達載體pET-30a(+)的多克隆位點插入序列表中序列2所示核苷酸序列得到的重組表達載體。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是通過將權(quán)利要求6或7所述的重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母得到的。9、一種制備a-半乳糖苷酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求6或8所述重組菌得到a-半乳糖苷酶。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵后，包括純化的步驟。全文摘要本發(fā)明公開了一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因。該α-半乳糖苷酶，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1中自N端起第21-438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)限定的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明酶應(yīng)用于更廣泛的工業(yè)生產(chǎn)中，為進一步工業(yè)化高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建也提供了實驗的素材，為豐富α-半乳糖苷酶來源的多樣性研究也提供了對比的序列和性質(zhì)研究參考。所以本發(fā)明酶及其編碼基因具有非常好的商業(yè)應(yīng)用價值的應(yīng)用潛力。文檔編號C12N9/40GK101659947SQ200910093200公開日2010年3月3日申請日期2009年9月25日優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日發(fā)明者李卓夫,李富偉,楊祿良,段文娟,王曉睿,寧謝申請人:北京挑戰(zhàn)農(nóng)業(yè)科技有限公司