專利名稱：：一種改進(jìn)的促進(jìn)小鼠克隆胚胎發(fā)育的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的方法，該方法為一種連續(xù)培養(yǎng)方法-D培養(yǎng)法，本發(fā)明還涉及兩種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的培養(yǎng)體系，使用所述培養(yǎng)體系獲得體細(xì)胞克隆動(dòng)物的方法，以及使用所述培養(yǎng)體系獲得胚胎干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)在很多物種中取得了成功，但是SCNT的效率仍然比較低。研究認(rèn)為，體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)的低效性在很大程度上是由供體核重編程不完全造成的(Jouneauetal.,2003；Latham2004)。為了提高重編程效率，人們研究嘗試了很多的方法，包括重構(gòu)胚的激活時(shí)機(jī)和DMSO的影響(Wakayamaetal.，2001)，胞質(zhì)分裂抑制劑的影響，去核和注核時(shí)機(jī)的影響(Wakayamaetal.，2003)，電融合法(Oguraetal.,2000)以及顯微操作技術(shù)方面包括壓電陶瓷輔助(PEM)的兩步法(Wakayamaetal.，1998)和一步法(OSM)(ZhouQetal.，2003)，但都沒(méi)有取得顯著的效果?？紤]到DNA甲基化和組蛋白乙酰化都是影響體細(xì)胞重編程和克隆胚胎發(fā)育的重要表觀遺傳標(biāo)記。人們研究了用病理學(xué)藥劑改變供體細(xì)胞和胚胎的表觀遺傳修飾來(lái)提高體細(xì)胞被卵胞質(zhì)重編程的能力。其中在SAH(S_腺苷同型半胱氨酸，S-adenosyl-homocysteine)和TSA(組蛋白去乙?；敢种苿?，trichostatinA)上的試驗(yàn)表明，SAH處理供體細(xì)胞后能夠顯著提高克隆胚胎的體外發(fā)育率，而TSA處理供體細(xì)胞或者重構(gòu)胚均能夠顯著提高克隆效率和重編程效率(Rybouchkinetal.,2006；Byeong-GyunJeonetal.,2008；Kishigamietal.，2006)o但是這些藥物對(duì)克隆胚胎長(zhǎng)期影響尤其是在治療性克隆中能否安全應(yīng)用還有待研究。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎發(fā)育有重要的影響。那么，改變體外培養(yǎng)條件或者優(yōu)化體外培養(yǎng)液是否可以提高克隆胚胎體外發(fā)育能力呢？ChatotCL等通過(guò)對(duì)小鼠2細(xì)胞胚胎阻滯的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中的葡萄糖在胚胎發(fā)育早期可能抑制一些關(guān)鍵的代謝過(guò)程，而谷氨酰胺是胚胎早期發(fā)育過(guò)程中首選的能量來(lái)源(ChatotCLetal.，1989)。傳統(tǒng)上認(rèn)定的那些在體外發(fā)育時(shí)2細(xì)胞發(fā)生阻滯或者不阻滯的小鼠品系的胚胎差異也可能與培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓有關(guān)(Hadietal.，2005)。KamjooM等比較了小鼠品系和培養(yǎng)液對(duì)正常受精囊胚凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遺傳來(lái)源和培養(yǎng)液中的化學(xué)物質(zhì)對(duì)凋亡的發(fā)生是同等重要的(Kamjooetal.，2002)。體細(xì)胞胞質(zhì)中的各個(gè)獨(dú)立區(qū)域和分子團(tuán)是依培養(yǎng)環(huán)境中成分的變化而重新定位的(Gajewskietal.，2003)，表觀遺傳狀態(tài)會(huì)受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，例如培養(yǎng)液中的血清能改變與基因組印跡相關(guān)的表觀遺傳信息(Khoslaetal.，2001)。小鼠合子中H19基因的表達(dá)可被體外培養(yǎng)環(huán)境所改變(Dohertyetal.，2000)。Michele等研究發(fā)現(xiàn)，與那些正常受精合子不同，克隆胚胎的囊胚率和多能性標(biāo)記0ct4mRNA在囊胚中的區(qū)域性分布高度依賴于核移植后的培養(yǎng)環(huán)境。第一個(gè)細(xì)胞周期以后，體細(xì)胞核的表觀遺傳修飾仍在繼續(xù)；重構(gòu)胚中核重塑的改變是有利于還是不利于建立合子基因程序要依賴于培養(yǎng)液中的特異的物質(zhì)(MicheleBoianietal.,2005)Heindryckx等用CZB、G1/G2和KSOM/G2培養(yǎng)克隆和孤雌胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，克隆胚胎和孤雌胚胎對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境非常敏感，選擇的培養(yǎng)液是否合適將顯著影響胚胎的體外發(fā)育(Heindryckxetal.，2001)。由此可見，體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)小鼠各種來(lái)源的胚胎的發(fā)育是非常關(guān)鍵的，這也提示我們除了以上報(bào)道的提高克隆效率的方法外，研究和選擇更好的胚胎體外培養(yǎng)體系將是影響小鼠胚胎尤其是克隆胚胎體外發(fā)育的重要因素。因此，需要研究和篩選更好的胚胎體外培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基來(lái)提高克隆胚胎的發(fā)育率，利用新的培養(yǎng)方法可為克隆動(dòng)物的生產(chǎn)、以及克隆胚胎干細(xì)胞的獲得帶來(lái)新的發(fā)展契機(jī)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決以上問(wèn)題，我們將不同的培養(yǎng)液組合使用，各取優(yōu)點(diǎn)，尋找更能促進(jìn)小鼠克隆胚胎體外發(fā)育的培養(yǎng)液，我們首次發(fā)現(xiàn)一種連續(xù)培養(yǎng)方法-D培養(yǎng)法，能夠顯著地提高小鼠克隆胚胎的發(fā)育率。本發(fā)明提供了一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的方法，其特征在于，所述方法為一種小鼠克隆胚胎的體外連續(xù)培養(yǎng)方法-D培養(yǎng)法，所述方法包括以下步驟重構(gòu)胚胎經(jīng)激活后，于不含EDTA和谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到囊胚。該不含EDTA和谷氨酰胺的培養(yǎng)基是M16培養(yǎng)基或CZB-EG(不含EDTA和谷氨酰胺的CZB)培養(yǎng)基。重構(gòu)胚胎通過(guò)去除核移植受體的染色體，進(jìn)行核移植操作而獲得。重構(gòu)胚胎激活后即可稱為克隆胚胎。本發(fā)明涉及一種用于提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系由用于在重構(gòu)胚胎激活后將克隆胚胎培養(yǎng)發(fā)育到二細(xì)胞期的M16培養(yǎng)基以及用于將所述二細(xì)胞期的克隆胚胎培養(yǎng)發(fā)育到囊胚的KSOM培養(yǎng)基構(gòu)成。本發(fā)明還涉及另一種用于提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系由用于在重構(gòu)胚胎激活后將克隆胚胎培養(yǎng)發(fā)育到二細(xì)胞期的不合EDTA和谷氨酰胺的CZBjISCZB-EG，以及用于將所述二細(xì)胞期的克隆胚胎培養(yǎng)發(fā)育到囊胚的KSOM培養(yǎng)基構(gòu)成。本發(fā)明涉及一種用于提高NT-ESC(核移植胚胎干細(xì)胞)建系效率的方法，其特征在于，重構(gòu)胚胎經(jīng)激活后，在M16或不含EDTA和谷氨酰胺的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到囊胚，建立核移植胚胎干細(xì)胞系。利用本發(fā)明的培養(yǎng)體系獲得克隆動(dòng)物的方法包括在重構(gòu)胚胎在激活液中激活后，用所述培養(yǎng)體系進(jìn)行體外培養(yǎng)，即在M16培養(yǎng)基或者不合EDTA和谷氨酰胺的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚階段時(shí)，將其移植到代孕動(dòng)物的子宮中，獲得所述克隆動(dòng)物。利用本發(fā)明的培養(yǎng)體系獲得核移植胚胎干細(xì)胞的方法包括在重構(gòu)胚胎在激活液中激活后，用所述培養(yǎng)體系進(jìn)行體外培養(yǎng)，即在M16培養(yǎng)基或者不含EDTA和谷氨酰胺的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚階段時(shí)，分離核移植胚胎干細(xì)胞。由上所述，本發(fā)明提高了小鼠克隆胚胎的發(fā)育率和核移植胚胎干細(xì)胞的建系效率，為克隆技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用研究開辟了新的思路，有助于動(dòng)物克隆的研究；并且有助于動(dòng)物克隆的進(jìn)一步發(fā)展。具體實(shí)施例方式材料與方法1試劑除非特別說(shuō)明，本研究所用試劑均為Sigma(St.Louis,MO)公司產(chǎn)品。2試驗(yàn)動(dòng)物B6D2F1小鼠(CSTBL/eXDBA/^S12周)用來(lái)提供卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，C57BL/6(78周)和ICR雌鼠(812周)提供受精卵。812周ICR雌鼠還作為假孕受體。812周的ICR雄鼠一是用來(lái)做正常配種公鼠，二是結(jié)扎用作配假孕雄鼠。DBA雄鼠、C57BL/6和ICR雌鼠和ICR雄鼠購(gòu)自北京維通利華有限公司。B6D2F1小鼠在本實(shí)驗(yàn)室繁殖獲得，所有小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境。3培養(yǎng)液表1各培養(yǎng)液組成成分<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>試驗(yàn)所用的培養(yǎng)液主要有CZB，M16，αMEM，KSOM。收集的卵母細(xì)胞暫時(shí)培養(yǎng)在CZB中，核移植胚胎分別培養(yǎng)在CZB，Μ16，αMEM,KS0M，M16+KS0M(D1)，αMEM+KS0M。重構(gòu)胚胎激活液為無(wú)鈣離子的CZB+10mMSrCl2+5μg/mlCB(細(xì)胞松弛素B)。卵母細(xì)胞收集用HEPES-CZB溶液，核移植操作在HEPES-CZB-CB溶液中進(jìn)行。4卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞收集812周齡的B6D2F1雌鼠和ICR雌鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素10單位(PMSG，寧波)，48小時(shí)后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素10單位(hCG，寧波)，注射后15小時(shí)斷頸處死小鼠，取下輸卵管，鏡下剝離膨大部，得到卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)。用透明質(zhì)酸酶(300U/ml，ICNPharmaceuticals,CostaMesa,CA)消化C0C，使顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞分離，用HEPES-CZB清洗二次，卵母細(xì)胞移入CZB培養(yǎng)液中，放置于37°C，5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顆粒細(xì)胞放于核移植操作液中，取卵母細(xì)胞后2030min進(jìn)行核移植操作。5正常受精卵和體細(xì)胞核移植(SCNT)克隆胚胎的制備C57BL/6(78周)和ICR雌鼠(812周)用上面的程序超排后分別與DBA/2、ICR雄鼠合籠，第二天早上檢栓，注射hCG后1819小時(shí)用上面描述取卵母細(xì)胞的方法取受精卵，分別培養(yǎng)在不同的培養(yǎng)液中觀察發(fā)育率。體細(xì)胞核移植操作均采用一步法(OSM)，具體操作步驟參照我們以前的報(bào)道(Zhouetal.,2001；Zhouetal.，2003)。重構(gòu)胚在CZB中孵育30min60min后進(jìn)行激活，SCNT重構(gòu)胚放到含5μg/mlCB的無(wú)鈣離子CZB中處理56小時(shí)，激活后的克隆胚胎培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)液中觀察并記錄發(fā)育情況。6受精胚胎和克隆胚胎試驗(yàn)程序表2受精胚胎試驗(yàn)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3克隆胚胎試驗(yàn)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>受精胚胎試驗(yàn)程序如表2所示。舉例而言，對(duì)于Dl試驗(yàn)組，首先將受精胚胎在M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至受精胚胎發(fā)育到2細(xì)胞期，然后在KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至受精胚胎發(fā)育到囊胚?？寺∨咛ピ囼?yàn)程序如表3所示。舉例而言，對(duì)于Dl試驗(yàn)組，首先將克隆胚胎在激活液中激活0h-5h后在M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育到2細(xì)胞期，然后在KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育到囊胚。7NT-ES細(xì)胞系的建立和干細(xì)胞培養(yǎng)NT-ES細(xì)胞系(核移植胚胎干細(xì)胞系)的建立和培養(yǎng)參照以前的報(bào)道(Zhaoetal.,2007)οNT-ES細(xì)胞系建系所用的白血病抑制劑因子(LIF，leukaemiainhibitoryfactor)濃度是2000U(Chemicon，ΜΑ)，而胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)所用的濃度是1000U。8胚胎移植SCNT囊胚移植到2.5天的ICR母鼠子宮中，妊娠母鼠在胚胎移植后19.5天剖腹產(chǎn)，出生后代經(jīng)ICR母鼠代孕。9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.O軟件中的One-wayANOVA以及Fisher‘sExactTest進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有分析結(jié)果中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。結(jié)果D培養(yǎng)法可顯著提高小鼠體細(xì)胞克隆胚胎的體外發(fā)育率為了研究培養(yǎng)方法對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育的影響，我們比較了B6D2F1小鼠SCNT胚胎在不同的培養(yǎng)方法中的體外發(fā)育情況。結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)液對(duì)克隆胚胎的體外發(fā)育影響很大。在4細(xì)胞期就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的差異，其中，D1、αMEM,αMEM/KS0M中培養(yǎng)的胚胎4細(xì)胞率之間沒(méi)有顯著差異，而顯著高于CZB組(66.3%,P<0.05)，但與M16和KSOM組差異不顯著。同時(shí)，M16和KSOM組與CZB組也沒(méi)有顯著差異。但是到了桑葚胚，情況發(fā)生了變化，Dl組的桑葚胚率極顯著高于其它各組(P<0.01)，而aMEM/KSOM組只與M16組差異顯著，其余各組間沒(méi)有顯著差異。在囊胚期，Dl組的囊胚率(62.3士7.2%)極顯著高于其它各組(P<0.01)。結(jié)果表明，D培養(yǎng)法可顯著提高小鼠體細(xì)胞克隆胚胎的體外發(fā)育率。表4克隆胚胎和受精胚胎在不同培養(yǎng)方法中的體外發(fā)育率獲得胚胎培養(yǎng)基^~原核形2-細(xì)胞4-細(xì)胞胚桑葚胚數(shù)(％)嚢胚數(shù)的方法_胚數(shù)成數(shù)胚胎數(shù)胎數(shù)(％)__(%)核移植CZB91727047(66.3±8.9)"16(22.4±4.2)A10(14.5±1.9)Aa......αΜΕΜ..................................................91............................."74.....................——一73......................Τ^ΤδΙ)628(38^2±4^2)s:云.面......Μ6................................................................89.................................67.....................................66........................55(82^6±4.........3(88±4^7)Λ..............KSOM.......................................................92..................................78.......................................77.......................62'(80^2±6；2)"...27(34^7±8；7..........".....7(2^±7!7)Α—m(M16/KSOM................9................................70....................................69....................68(983Γ7)6一…"5'(79!'8±3；2)044'^23±75)H一).....................................................................................................Cxvil-M/KSOM95737367(91.5±4.7)b3(41.2i'10.9)'xb20(26.^^.4)'u體內(nèi)受精KSOM/^^^^75(92.6±2.9)a.........................................................................../.....................................38.......................................3838..........................................................38..................................................................“(97^287...............p(M'T6/KSOM；.....................................60.......................................60—60...........................................................59..................................................................57(94^29-同列中肩注不同字母表示差異顯著(P<0.05)D-法對(duì)SCNT(B6D2F1)胚胎到期發(fā)育的影響為測(cè)定Dl法培養(yǎng)的克隆囊胚的后期發(fā)育情況，我們將Dl法培養(yǎng)的克隆囊胚進(jìn)行了移植，移植后19.5天解剖到3只克隆小鼠，體重分別為2.IOg,1.32g，1.54g，而胎盤分別是0.27g，0.20g，0.llg，與KOSM培養(yǎng)的克隆囊胚移植后獲得的克隆小鼠的體重和胎盤重量類似。Dl組的胎兒出生率幾乎是KOSM的2倍(1.5%vs.0.857%)0結(jié)果表明，Dl培養(yǎng)法可顯著提高小鼠體細(xì)胞克隆胚胎的到期發(fā)育率。不同培養(yǎng)方法對(duì)NT-ESCs建系效率的影響為進(jìn)一步檢測(cè)Dl培養(yǎng)法對(duì)體細(xì)胞重編程的影響，我們比較了不同培養(yǎng)方法獲得的克隆囊胚的核移植胚胎干細(xì)胞系的建系效率。結(jié)果顯示，Dl組的退化囊胚比率比αΜΕΜ和KSOM組低，建系效率是αMEM組的兩倍還多，也比KSOM組高。而且，Dl培養(yǎng)法獲得的克隆囊胚的比率顯著高于其他培養(yǎng)法，因此從重構(gòu)胚開始計(jì)算，Dl培養(yǎng)法可以顯著提高NT-ESCs的建系效率。表5不同培養(yǎng)方法的NT-ESCs建系效率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>同列中肩注不同字母表示差異顯著(P<0.05)培養(yǎng)液中EDTA和Glutamine對(duì)克隆胚胎發(fā)育的影響為了弄清楚為何M16和KSOM組合可以提高克隆胚胎的體外發(fā)育而其他培養(yǎng)也例如αMEM/CZB+KS0M卻不能提高SCNT胚胎的體外發(fā)育率，我們對(duì)CZB和Μ16的組成成分進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Μ16中沒(méi)有EDTA和Glutamine，是否正是由于缺乏這兩個(gè)成分才使M16+KS0M促進(jìn)了SCNT胚胎的體外發(fā)育呢？因此我們?cè)贑ZB中去除了EDTA或/和Glutamine，對(duì)SCNT胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，培養(yǎng)在Dl培養(yǎng)體系和CZB-Gln-EDTA(即去除了EDTA和Glutamine成分的CZB培養(yǎng)基)+KS0M培養(yǎng)體系中的體細(xì)胞核移植的桑葚胚和囊胚率都顯著高于其它各組，培養(yǎng)在CZB-Gln-EDTA(即去除了EDTA和Glutamine成分的CZB培養(yǎng)基)+KSOM培養(yǎng)體系中的體細(xì)胞核移植的桑葚胚和囊胚率分別是61.2%和52.5%。CZB+KS0M組中的囊胚率最低(15.9%)，與CZB-Gln(即去除了Glutamine成分的CZB培養(yǎng)基)+KSOM組差異不顯著，但顯著低于CZB-EDTA(即去除了EDTA成分的CZB培養(yǎng)基)+KSOM組，由此可見，去除了EDTA后的CZB與KSOM聯(lián)合應(yīng)用也能在一定程度上提高克隆胚胎的發(fā)育，但是仍達(dá)不到Dl組的效果，只有去除EDTA和Glutamine后的培養(yǎng)效果才與Dl組相同。為了進(jìn)一步證明M16+KS0M促進(jìn)SCNT體外發(fā)育是因?yàn)镸16中不含有EDTA和Glutamine，我們?cè)贛16中添加了0.IlmM的EDTA(Sigma)和1.OmM的Glutamine(Sigma)后再聯(lián)合KSOM對(duì)SCNT胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加了EDTA和Glutamine的M16+KS0M喪失了促進(jìn)SCNT胚胎體外發(fā)育的能力(18.6%(添加)vs.62.3%(未添加))。研究表明，證明培養(yǎng)液中添加EDTA和Glutamine不利于克隆胚胎的早期(晚期2細(xì)胞之前)發(fā)育。M16+KS0M組合培養(yǎng)液正是因?yàn)镸16不含有EDTA和Glutamine才具備了提高SCNT胚胎體外發(fā)育的能力。因此，本發(fā)明的D培養(yǎng)法，包括Dl培養(yǎng)法以及D2培養(yǎng)法，Dl培養(yǎng)法即，在重構(gòu)胚胎經(jīng)激活后，在M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到囊胚；D2培養(yǎng)法即，重構(gòu)胚胎經(jīng)激活后，在不含乙二胺四乙酸和谷氨酰胺的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到囊胚。參考文獻(xiàn)[1]A.Jouneau,andJ.P.Renard，Reprogramminginnucleartransfer.CurrOpinGenetDev13(2003)486-91.[2]T.ffakayama,andR.Yanagimachi,Effectofcytokinesisinhibitors,DMSOandthetimingofoocyteactivationonmousecloningusingcumuluscellnuclei.Reproduction122(2001)49-60.[3]S.Wakayama,J.B.Cibelli,andT.Wakayama,EffectoftimingoftheremovalofoocytechromosomesbeforeorafterinjectionofsomaticnucleusondevelopmentofNTembryos.CloningStemCells5(2003)181-9.[4]A.Ogura,K.Inoue，K.Takano,T.Wakayama,andR.Yanagimachi，Birthofmiceafternucleartransferbyelectrofusionusingtailtipcells.MolReprodDev57(2000)55-9.[5]T.Wakayama,A.C.Perry,M.Zuccotti，K.R.Johnson,andR.Yanagimachi，F(xiàn)ull-termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei.Nature394(1998)369-74.[6]Q.Zhou，J.P.Renard，G.LeFriec，V.Brochard，N.Beaujean,Y.Cherifi,A.Fraichard,andJ.Cozzi,Generationoffertileclonedratsbyregulatingoocyteactivation.Science302(2003)1179.[7]B.P.Enright，C.Kubota，X.Yang，andX.C.Tian，EpigeneticcharacteristicsanddevelopmentofembryosclonedfromdonorcellstreatedbytrichostatinAor5-aza-2丨-deoxycytidine.BiolReprod69(2003)896—901.[8]B.G.Jeon，G.Coppola，S.D.Perrault，G.J.Rho,D.H.Betts，andW.A.King,S-adenosy!homocysteinetreatmentofadultfemalefibroblastsaltersX-chromosomeinactivationandimprovesinvitroembryodevelopmentaftersomaticcellnucleartransfer.Reproduction135(2008)815-28.[9]K.L.Jones,J.Hill，T.Y.Shin,L.Lui,andM.Westhusin,DNAhypomethylationofkaryop1astsforbovinenucleartransplantation.MolReprodDev60(2001)208-13.[10]S.Kishigami,E.Mizutani,H.Ohta,T.Hikichi,N.V.Thuan,S.Wakayama,H.T.Bu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yǎng)基或者不含乙二胺四乙酸和谷氨酰胺的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期，然后換成KSOM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚階段時(shí)，將其移植到代孕動(dòng)物的子宮中，獲得所述克隆動(dòng)物。8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的培養(yǎng)體系在獲得核移植胚胎干細(xì)胞、克隆動(dòng)物中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述核移植胚胎干細(xì)胞是小鼠核移植胚胎干細(xì)胞，所述克隆動(dòng)物是克隆小鼠。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的方法，該方法為一種連續(xù)培養(yǎng)方法-D培養(yǎng)法，本發(fā)明還涉及兩種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的培養(yǎng)體系，本發(fā)明還涉及使用所述培養(yǎng)體系獲得克隆動(dòng)物的方法，以及使用所述培養(yǎng)體系獲得胚胎干細(xì)胞的方法。本發(fā)明提高了小鼠克隆胚胎的發(fā)育率和核移植胚胎干細(xì)胞的建系效率，為克隆技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用研究開辟了新的思路，并且有助于動(dòng)物克隆的進(jìn)一步發(fā)展。文檔編號(hào)C12N5/16GK101798567SQ20091007744公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2009年2月11日優(yōu)先權(quán)日2009年2月11日發(fā)明者代相鵬,周琪,王柳,郝捷申請(qǐng)人:北京華盛興邦生物技術(shù)有限公司