專利名稱：一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法。 背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，心腦血管的發(fā)病呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中心律失常是嚴(yán)重影響 患者生活和生存質(zhì)量的重大疾病。對(duì)其發(fā)病機(jī)理和治療藥物篩選的研究將為改善患者生活 質(zhì)量提供幫助。對(duì)心律失常的研究通常采用動(dòng)物模型的方法，主要通過(guò)結(jié)扎大小鼠心肌冠 狀動(dòng)脈的方法，在動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)心律失常。再通過(guò)對(duì)基因表達(dá)或病理的檢測(cè)，研究發(fā)病機(jī)理或 進(jìn)行抗心律失常藥物的篩選。雖然“冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法”所造成的心律失常效果較好，但其一 方面死亡率較高，另一方面無(wú)法進(jìn)行傳代，無(wú)法進(jìn)行心律失常對(duì)機(jī)體長(zhǎng)期影響的研究。對(duì)心 律失常的研究需要一種可滿足上述幾點(diǎn)的動(dòng)物模型。近年，發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)具有基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)作用的小分子非編碼RNA，稱為 “微小RNA(microRNA，miRNA) ”。通常，miRNA通過(guò)與特定mRNA的3非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，導(dǎo) 致mRNA降解或以mRNA為模版的翻譯過(guò)程受到抑制，從而達(dá)到負(fù)向調(diào)節(jié)某一基因表達(dá)的作 用。有研究表明在心律失常動(dòng)物模型的心肌中含量變化明顯，其可能參與了心肌 細(xì)胞的自律性調(diào)節(jié)，在對(duì)功能研究的同時(shí)，我們建立了一種能夠心律失常的小鼠 模型，該模型基于miR-3^轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)。(三)發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種具有可穩(wěn)定遺傳，心率失常出現(xiàn)較早，對(duì)機(jī)體是長(zhǎng)期 作用，符合臨床心律失常作用特點(diǎn)的心律失常動(dòng)物模型建立的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、構(gòu)建 pBluescript-miR3^ 質(zhì)粒選取 Pubmed 上 C57BL/6J 小鼠 Pre_miR3^ 序 列，以基因組為模板，利用含Ml I和Hind III酶切位點(diǎn)的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含 有該前體序列及其上下游側(cè)翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR產(chǎn)物與pBluescript 載體，CIP對(duì)載體去磷酸化，純化后，經(jīng)T4連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞 DH5 α，確定重組質(zhì)粒 pBluescript-miR328 ；2、建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型以Spe I雙酶切上述重組質(zhì)粒，電泳膠回收獲得 純化的顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件，該構(gòu)件包括心肌特異啟動(dòng)子α -MHC、pre-miR-328、側(cè)翼序 列和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；選取雌性B6小鼠將全部輸卵管依次置于含透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液 中分離受精卵，進(jìn)行體外培養(yǎng)，將經(jīng)顯微注射后成活的受精卵移植于見(jiàn)栓雌性ICR的輸卵 管壺腹部，待雌性ICR小鼠分娩，培養(yǎng)乳鼠；3、提取與篩選gDNA 將乳鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、異丙醇，以70%乙醇溶 液沖洗沉淀，加入170UL1XTE，震蕩混勻，以gDNA為模板，用篩選引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因 片段；4、總RNA的提取與RT-PCR 按Trizol試劑說(shuō)明進(jìn)行總RA提取，按逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō) 明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以篩選引物對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析；
5、建立心律失常的小鼠模型。本發(fā)明還有這樣一些技術(shù)特征
1、所述的構(gòu)建pBluescript-miR3^質(zhì)粒時(shí)Sal I和Hind III酶切上述PCR產(chǎn)物 與pBluescript載體3h，CIP對(duì)載體去磷酸化lh，純化后得到5ug產(chǎn)物，經(jīng)"Γ4連接酶將二 者連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α 50uL,涂板，次日，觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取7個(gè) 菌落進(jìn)行測(cè)序，確定重組質(zhì)粒pBluescript-miR328 ；2、所述的利用含Ml I和Hind III酶切位點(diǎn)的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含有 該前體序列及其上下游側(cè)翼序列的步驟包括用以下引物=ttGTCRAcATCTTCCTGTGTTGCCC, AGaAGCttAGAGGACAAGCATGAAT (下劃線示改造的酶切位點(diǎn))以小鼠基因組為模板，PCR擴(kuò)增 目的片段，該目的片段含前體序列及其上下游側(cè)翼序列；3、所述的電泳膠回收獲得純化的顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件的步驟包括用Spe I酶切 構(gòu)建的質(zhì)粒ioug，電泳將顯微注射片段與載體片段分開(kāi)，將凝膠中eooobp的顯微注射片段 進(jìn)行回收，用Qiangen膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，純化后的片段濃度為200ng/uL。4、所述的調(diào)整顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件的濃度至Ing 2ng/uL ；5、所述的首日13時(shí)選取雌性B6小鼠，注射PMSG 5IU(國(guó)際單位)/只；隔日12時(shí) 注射HCG 5IU/只，并與雄性B6小鼠合籠，同時(shí)將發(fā)情雌性ICR小鼠與結(jié)扎輸精管的雄性 ICR小鼠合籠，第四日將見(jiàn)栓雌性B6小鼠頸椎離斷處死，仰臥位開(kāi)腹，剪取輸卵管近卵巢端 0. 5cm置于生理鹽水中，將全部輸卵管依次置于含透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液中分離受精卵， 進(jìn)行體外培養(yǎng)，13時(shí)進(jìn)行顯微注射；(小鼠B6，全稱C57BL/6，在轉(zhuǎn)基因操作中常用來(lái)做供 卵小鼠；ICR，由于其母性較強(qiáng)，多用于受精卵回輸?shù)拇行∈?6、所沭的將經(jīng)顯微灃射后成活的警精卵移棺于見(jiàn)栓雌件ICR小鼠的輸卵管壺腹 部，3周后，ICR小鼠分娩，乳鼠生后3w用耳標(biāo)為其編號(hào)，并剪取0. 5cm尾尖進(jìn)行外源基因在 基因組整合的鑒定；7、所述的gDNA的提取與篩選時(shí)將乳鼠尾尖置于0. 5mL消化液中，55°C消化池；加 入等體積PCI，1. 5 X 104rpm離心IOmin,上清移入新管，加0. 4mL異丙醇，翻轉(zhuǎn)，離心5min ； 以70%乙醇溶液(V/V)沖洗沉淀，離心后晾干；加入170UL1XTE，震蕩混勻；8、所述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察外源轉(zhuǎn)基因是否整合入基因 組中。本發(fā)明的有益效果在于建立了一種可穩(wěn)定遺傳的心律失常模型，為后續(xù)的心律失 常研究及藥物篩選提供動(dòng)物模型。該模型具有可穩(wěn)定遺傳，心率失常出現(xiàn)較早，對(duì)機(jī)體是長(zhǎng) 期作用，符合臨床心律失常的作用特點(diǎn)。

圖1為顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件示意圖；圖2為轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠心肌組織含量的比較示意圖.具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明5
本發(fā)明的具體技術(shù)方案為l、pBluescript_miR328 質(zhì)粒的構(gòu)建選取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre_miR3^序列。以基因組為模板，利用含Ml I 和HindIII酶切位點(diǎn)的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含有該前體序列及其上下游側(cè)翼序列。Sal I和Hind III酶切上述PCR產(chǎn)物與pBluescript載體!3h，CIP對(duì)載體去磷酸 化lh，純化后，經(jīng)T4連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞(DH5ci)，涂板。次日， 觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取若干菌落進(jìn)行測(cè)序，確定重組質(zhì)粒pBlueSCript-miR328。2、miR_3^轉(zhuǎn)基因小鼠的建立以Spe I雙酶切上述重組質(zhì)粒，電泳膠回收獲得純化的顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件 (圖1)。該構(gòu)件包括心肌特異啟動(dòng)子a-MHC、pre-miR-328、側(cè)翼序列和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。調(diào) 整該構(gòu)件的濃度至Ing 2ng/uL。首日13時(shí)選取雌性B6小鼠，注射5IU PMSG ；隔日12時(shí)注射5IU HCG，并與雄性B6 小鼠合籠。同時(shí)將發(fā)情雌性ICR小鼠與結(jié)扎輸精管的雄性ICR小鼠合籠。第四日將見(jiàn)栓雌 性B6小鼠頸椎離斷處死，仰臥位開(kāi)腹，剪取輸卵管近卵巢端0. 5cm置于生理鹽水中。將全 部輸卵管依次置于含透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液中分離受精卵，進(jìn)行體外培養(yǎng)。13時(shí)進(jìn)行顯 微注射。將經(jīng)顯微注射后成活的受精卵移植于見(jiàn)栓的ICR的輸卵管壺腹部，術(shù)中注意操作 輕柔和保溫。3周后，ICR小鼠分娩。乳鼠生后3w用耳標(biāo)為其編號(hào)，并剪取0.5cm左右尾尖 進(jìn)行外源基因在基因組整合的鑒定。3、gDNA的提取與篩選將乳鼠尾尖置于0. 5mL消化液中，55°C消化3h。加入等體積PCI，1. 5X 104rpm離 心lOmin，上清移入新管，加0. 4mL異丙醇，翻轉(zhuǎn)，離心5min。以70%乙醇溶液沖洗沉淀，離 心后晾干。加入170uLlXTE，震蕩混勻。以gDNA為模板，用篩選引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因片段。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察外源轉(zhuǎn)基因是否整合入基因組中。4、總 RNA 的提取與 RT-PCR按Trizol試劑說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取，按逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以 miR-328篩選引物對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析。5、northern blot圖2為轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠心肌組織含量的比較示意圖，圖中以TO 做內(nèi)參照，轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織內(nèi)成熟miR-328明顯高于野生型心肌miR-328。6、心電圖測(cè)定心電圖測(cè)定示意圖中表明轉(zhuǎn)基因小鼠的心電圖中出現(xiàn)心律不齊等心律 失常現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)構(gòu)建pBluescript-miR3^ 質(zhì)粒選取 Pubmed 上 C57BL/6J 小鼠 Pre_miR3^ 序列， 以基因組為模板，利用含Ml I和Hind III酶切位點(diǎn)的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含有該 前體序列及其上下游側(cè)翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR產(chǎn)物與pBluescript載體， CIP對(duì)載體去磷酸化，純化后，經(jīng)T4連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α， 確定重組質(zhì)粒 pBluescript-miR328 ；(2)建立miR-3^轉(zhuǎn)基因小鼠模型以SpeI雙酶切上述重組質(zhì)粒，電泳膠回收獲得純 化的顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件，該構(gòu)件包括心肌特異啟動(dòng)子α -MHC、pre-miR-328、側(cè)翼序列 和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；選取雌性B6小鼠將全部輸卵管依次置于含透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液中 分離受精卵，進(jìn)行體外培養(yǎng)，將經(jīng)顯微注射后成活的受精卵移植于見(jiàn)栓雌性ICR小鼠的輸 卵管壺腹部，待雌性ICR小鼠分娩；(3)提取與篩選gDNA將乳鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、異丙醇，以70%乙醇溶液 沖洗沉淀，加入170UL1XTE，震蕩混勻，以gDNA為模板，用篩選引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因片 段；(4)總RNA的提取與RT-PCR按Trizol試劑說(shuō)明進(jìn)行總RA提取，按逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以篩選引物對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析；(5)建立心律失常的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的構(gòu)建 pBluescript-miR328 質(zhì)粒時(shí) Sal 1 和 Hind III 酶切上述 PCR產(chǎn)物與 pBluescript 載體 3h， CIP對(duì)載體去磷酸化lh，純化后得到5ug產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感 受態(tài)細(xì)胞DH5 α 50uL,涂板，次日，觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取7個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序，確定重組質(zhì) 粒 pBluescript_miR3280
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的利用 含MlI和Hind III酶切位點(diǎn)的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含有該前體序列及其上下游側(cè)翼 序列的步驟包括用以下引物:ttGTCRAcATCTTCCTGTGTTGCCC, AGaAGCttAGAGGACAAGCATGAAT 以小鼠基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，該目的片段含前體序列及其上下游側(cè)翼 序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的電泳 膠回收獲得純化的顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件的步驟包括用Spe I酶切構(gòu)建的質(zhì)粒10ug，電泳 將顯微注射片段與載體片段分開(kāi)，將凝膠中6000bp的顯微注射片段進(jìn)行回收，用Qiangen 膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，純化后的片段濃度為200ng/uL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的調(diào)整 顯微注射用轉(zhuǎn)基因構(gòu)件的濃度至Ing 2ng/uL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的首日 13時(shí)選取雌性B6小鼠，注射PMSG 5IU/只；隔日12時(shí)注射HCG 5IU/只，并與雄性B6小鼠 合籠，同時(shí)將發(fā)情雌性ICR小鼠與結(jié)扎輸精管的雄性ICR小鼠合籠，第四日將見(jiàn)栓雌性B6 小鼠頸椎離斷處死，仰臥位開(kāi)腹，剪取輸卵管近卵巢端0. 5cm置于生理鹽水中，將全部輸卵 管依次置于含透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液中分離受精卵，進(jìn)行體外培養(yǎng)，13時(shí)進(jìn)行顯微注射。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的將經(jīng)顯微注射后成活的受精卵移植于見(jiàn)栓雌性ICR小鼠的輸卵管壺腹部，3周后，ICR小鼠分娩， 乳鼠生后3w用耳標(biāo)為其編號(hào)，并剪取0. 5cm尾尖進(jìn)行外源基因在基因組整合的鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的 gDNA的提取與篩選時(shí)將乳鼠尾尖置于0. 5mL消化液中，55°C消化池；加入等體積PCI， 1. 5X104rpm離心IOmin,上清移入新管，加0. 4mL異丙醇，翻轉(zhuǎn)，離心5min ；以70%乙醇溶 液V/V沖洗沉淀，離心后晾干；加入170UL1XTE，震蕩混勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法，其特征在于所述的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察外源轉(zhuǎn)基因是否整合入基因組中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種心律失常動(dòng)物模型建立的方法。首先構(gòu)建pBluescript-miR328質(zhì)粒，建立miR-328轉(zhuǎn)基因小鼠模型，然后提取與篩選gDNA，進(jìn)行總RA提取，按逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以miR-328篩選引物對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析，建立心律失常的小鼠模型。本發(fā)明的有益效果在于建立了一種可穩(wěn)定遺傳的心律失常模型，為后續(xù)的心律失常研究及藥物篩選提供動(dòng)物模型。該模型具有可穩(wěn)定遺傳，心率失常出現(xiàn)較早，對(duì)機(jī)體是長(zhǎng)期作用，符合臨床心律失常的作用特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102051380SQ20091007311
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者呂延杰, 楊寶峰, 馬寧, 高旭 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)