專利名稱：：堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質(zhì)的酶的總稱，是含有多種組分的復(fù)合酶。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中，但從植物中提取受到資源、技術(shù)水平的諸多限制而一直未能真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此微生物來源的果膠酶成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外對酸性果膠酶的研究已經(jīng)具有一定基礎(chǔ)，但是對堿性果膠酶尤其是果膠裂解酶(pectatelyase)的研究報(bào)道較少。堿性果膠酶是指最適作用pH在堿性范圍內(nèi)的果膠酵，是果膠酶研究領(lǐng)域中的新興內(nèi)容，主要應(yīng)用于紡織工業(yè)中用作對環(huán)境友好的生物催化劑，用柔和的酶生物精練代替?zhèn)鹘y(tǒng)的堿高溫蒸煮技術(shù)，實(shí)現(xiàn)綠色清潔生產(chǎn)，既可減少堿排放污染，又可降低加熱能耗和漂洗用水量，同時(shí)提高紡織物的加工和使用性能。因而隨著生物技術(shù)的不斷快速發(fā)展，堿性果膠酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用潛力也越來越受到大家的關(guān)注。從1972年Horikoshi，K.發(fā)表第一篇關(guān)于芽孢桿菌生產(chǎn)堿性果膠酶的論文開始，日本等國開始致力于堿性果膠酶的研究。印度MukeshKapoor于2001年報(bào)道了5aci""sMG-cp-2堿性聚半乳糖醛酸酶的生產(chǎn)、純化和酶學(xué)性質(zhì)，確定該菌株發(fā)酵活力為47u/mL，培養(yǎng)基優(yōu)化后活力提升為98u/mL，室溫時(shí)在pH7.012.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，可有效應(yīng)用于苧麻和菽麻纖維脫膠；德國學(xué)者2004年測定了果膠酶菌種5aciW^7ic/e/7/Zbr肌'sDSM13的基因組序列。美國、荷蘭、英國、西班牙等國的學(xué)者也分別對堿性果膠酶的菌種資源、發(fā)酵、純化方法、酶學(xué)性質(zhì)、分泌調(diào)控及分子生物學(xué)等內(nèi)容進(jìn)行了報(bào)道，研究對象除了上述芽孢桿菌之外，還包括一些植物病原菌，如菊歐文氏菌、洋蔥伯克霍爾德菌等。為了獲得高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)的堿性果膠酶產(chǎn)品，自1990年以來，國外學(xué)者把研究重點(diǎn)從篩選產(chǎn)堿性果膠酶菌種方面逐步轉(zhuǎn)向產(chǎn)酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是隨著1999年丹麥NovoNordisk(諾和諾德)堿性果膠酶Biopr印(是一種基因改良的芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵制成的酶制劑，其最適pH值為7.59.5，適用溫度為55。C左右)和堿性果膠裂解酶ScourzymeL(最佳pH值為7.59.5，對溫度的選用則根據(jù)pH值而定，如pH值在88.5時(shí)，溫度掌握在55'C60'C)的產(chǎn)品問世，人們將注意力越來越多地轉(zhuǎn)向了酶基因及其克隆技術(shù)的研究。西班牙、法國、荷蘭、曰本學(xué)者分別將5acL/7iAS(2000年)、￡nf77iac/iT5"a/7t/e/w'3937、77er/oto《av77ar/"/7a(海棲熱袍菌，2003年)、5sw'"iAsi/6z^7is(2002年)四種菌株的堿性果膠酶基因克隆到大腸桿菌中成功進(jìn)行了表達(dá)。國內(nèi)對果膠酶的研究始于20世紀(jì)60年代，1990年初開始對堿性果膠酶進(jìn)行研究，大量文獻(xiàn)對果膠酶菌種的篩選、傳統(tǒng)誘變育種、生產(chǎn)工藝和酶的工業(yè)應(yīng)用等方面做了報(bào)道，但關(guān)于堿性果膠酶的發(fā)酵、酶制劑制備和分子生物學(xué)遺傳育種方面的研究內(nèi)容較少。菌種主要是芽孢桿菌，如吉氏芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌No.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢桿菌WSH03-09、RK9等，此外還有嗜鹽嗜堿菌Wh7化a"ehi/7HF26等。2006年我國學(xué)者甄東曉等將"ostrit/i'咖5tercorsr/咖(耐熱梭狀芽孢桿菌)的耐熱果膠裂解酶基因p^劃克隆到表達(dá)載體pET28a然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)；同年，諸葛斌等利用溫控載體構(gòu)建了堿性果膠酶工程菌。越來越多的研究單位在基因工程菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的總體趨勢下進(jìn)行了堿性果膠酶分子生物學(xué)操作的有效嘗試，大多分子生物學(xué)操作或以大腸桿菌表達(dá)體系為主要內(nèi)容，或以枯草芽孢桿菌表達(dá)體系為研究對象，但大多載體和宿主的選擇在以生產(chǎn)為目的時(shí)均顯示了某種不足，例如溫控載體和穿梭質(zhì)粒的使用會因表達(dá)中需要溫度、誘導(dǎo)劑等條件而增加生產(chǎn)成本。我國堿性果膠酶研究總體起步較晚，在國外酶制劑公司80%的工業(yè)用酶都是由基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)獲得，發(fā)酵酶活較高、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的酶制劑工業(yè)生產(chǎn)背景下，必須進(jìn)行基因工程菌構(gòu)建體系和方法的研究以拓寬民族工業(yè)酶制劑的競爭和發(fā)展空間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種堿性果膠酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法，以獲得高產(chǎn)堿性果膠酶基因工程菌。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種堿性果膠酶基因工程菌，是將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因連接在表達(dá)載體pWB980上，并采用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化WB600得到的工程菌株。而且，所述枯草芽孢桿菌為B.swMto168，其堿性果膠酶基因的大小為1263bp。一種堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法包括如下步驟U).以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增堿性果膠酶基因；(2).將目的基因酶切后與載體連接，命名重組質(zhì)粒為pWB-ze76^i7;(3).重組質(zhì)粒pWB-/e7G5^轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主，構(gòu)建堿性果膠酶基因工程菌WB600/pWB-pWCi7,最終獲得枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因工程菌。而且，所述步驟[l]中用于PCR上游引物5'端含&il酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)后根據(jù)編碼框正確讀碼要求補(bǔ)充堿基C;下游引物5'端含^力I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得堿性果膠酶基因全長1263bp，其中信號肽部分63bp。而且，所述步驟[2]中pWB980分子量為3787bp，pWB-pe7&5i7大小為5045bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距120bp。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明探索了堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)條件，構(gòu)建了高產(chǎn)堿性果膠酶的基因工程菌株，建立了堿性果膠酶的發(fā)酵工藝，適用于工業(yè)化的生產(chǎn)和應(yīng)用，具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。2、本方法中所得到并表達(dá)的基因區(qū)別于己報(bào)道的該酶基因序列，并在個(gè)別氨基酸組成上有差異；工程菌發(fā)酵采用的培養(yǎng)基適用于工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)宿主為蛋白酶缺陷型，利于后期酶的分離純化和穩(wěn)定保藏。3、本發(fā)明拓寬堿性果膠酶分子生物學(xué)研究思路和領(lǐng)域，探索堿性果膠酶基因工程菌構(gòu)建的可操作對象，所構(gòu)建的工程菌發(fā)酵所產(chǎn)生的酶活達(dá)到330U/mL，比出發(fā)菌株堿性果膠酶活性提高了22倍。圖1是本發(fā)明基因工程菌中pWB980-G2"/的酶切驗(yàn)證電泳圖2是本發(fā)明基因工程菌WB600/pWB980-G2527對照攜帶空質(zhì)粒的出發(fā)菌株WB600/pWB980的堿性果膠酶的平板顯影圖3是本發(fā)明基因工程菌WB600/pWB980-G25"的生長曲線及酶生成曲線示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一、堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建從枯草芽孢桿菌(A^6rito)(保藏單位中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC10027)中分離出堿性果膠酶基因，設(shè)計(jì)引物(引物委托大連寶生物工程有限公司合成)是以pWB980為載體，以WB600為表達(dá)宿主。1、PCR擴(kuò)增目的基因GEUP5'-CCGGCATGCCATGAAAAAAGTGATGTTAGCTACG-3'GEDOWN5'-CACGCGTCGACTTAATTTAATTTACCCGCACC-3'根據(jù)NCBI報(bào)道，枯草芽孢桿菌&做6"fo168的堿性果膠酶基因1263bp設(shè)計(jì)引物，其中PCR上游引物5'端含Sa2I酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)后根據(jù)編碼框正確讀碼要求補(bǔ)充堿基C;下游引物5'端含Sp力I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得堿性果膠酶基因全長1260bp，其中信號肽部分63bp。以枯草芽孢桿菌的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在0.5mLEppendorf管中按以下順序分別加入各試劑擴(kuò)增體系(50jiL):ddH2037jiL，10xbuffer5.0[iL,dNTPs(2.5mmol/L)5單，上游引物GEUP(10nmol/L)0.75|iL，下游引物GEDOWN(l(Vmol/L)0.75&L,DNA模板1.0nL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5|_iL;擴(kuò)增程序95°C5min，1個(gè)循環(huán)；94°C45s，49°C45s，72°C90s，30個(gè)循環(huán)；72°ClOmin，1個(gè)循環(huán)。2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化(1).將PCR擴(kuò)增得到的目的基因;WOi7分別用ss2I和sp力I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(該試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)純化。(2).將pWB980質(zhì)粒(該質(zhì)粒購自TAKARA公司)經(jīng)ssJI和sp力I雙酶切、純化后與第(l)歩的純化產(chǎn)物通過連接試劑盒(該試劑盒購自TAKARA公司)在16'C的條件下連接12h，得到重組質(zhì)粒pWB-pe瓜幼。pWB980分子量為3787bp，pWB-peJ&5Z/大小為5045bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距120bp。雙酶切體系10xHbuffer2fxL，DNA/pWB9808|il，I1.2^L,5b/11.2^L,ddH207.6pL。37'C酶切過夜，目的基因酶切產(chǎn)物直接回收，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳后切膠回收。連接體系SolutionI5pL，載體DNAlpL，目的基因化L，16。C作用12h。(3).將10叱的pWB-peJ6^^7化學(xué)轉(zhuǎn)化40禮枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含卡那霉素(50Pg/mL)的LA平板上，從抗性平板上挑選抗性菌落進(jìn)行saJI和s;力I雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，特異性條帶大小與目的基因1263bp兩種堿性果膠酶基因大小相同。3、堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，構(gòu)建成為工程菌株WB600/pWB-pe/G2<5^，與對照菌WB600/pWB980分別接種于2mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37。C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按8。/。的接種量轉(zhuǎn)接于裝有5mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37。C水浴振蕩培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液12000rpm離心保留上清液，測定酶活。二、發(fā)酵培養(yǎng)方法在LA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，挑取活化的WB600/pWB-pe/G25"接種到LB種子培養(yǎng)基中，裝液量50mL/250mL三角瓶，37°C，200r/min培養(yǎng)16h，然后按2%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉3%，豆餅粉4%，(NH4)2SO40.4o/0，MgS04.7H200.03%，NaC030.02%,K2HP040.4%,KH2PO40.4%，pH7.5),裝液量lOOmL/500mL擋板三角瓶，37°C，180r/min培養(yǎng)24h。各培養(yǎng)基中均含Kan50Pg/mL。三、堿性果膠酶活力的測定酶活力單位定義lmL酶液在45°C，pH為9.0條件下，每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生mol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。測定方法酶液制備果膠酶菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液。用緩沖液稀釋不同倍數(shù)，和原液平行測定；酶活測定方法反應(yīng)體系中包括粗酶稀釋液20nL，0.2。/。聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2mol/L)緩沖液(pH9.0，含有0.44mmol/L的CaCl2)2mL，反應(yīng)條件為45。C溫育15min，用3mL0.03mol/L的磷酸終止反應(yīng)，在235nm處測定其吸光度值。酶空白將2mL上述緩沖體系配制的底物保溫2min后，依次加入3mL0.03mol/L的磷酸和20nL與實(shí)驗(yàn)樣相同稀釋倍數(shù)的滅活的酶液，混勻。其他操作與實(shí)驗(yàn)樣相同。OD235x106xdilutionfactorxvolumeofmixture計(jì)算酶活力(u/mL)=-103xtx4600xbxvolumeofenzymepreparation式中4600(Lmol"cm")—不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)t(min)—酶促反應(yīng)時(shí)間(在酶反應(yīng)的線性范圍內(nèi))b(cm)—比色杯厚度經(jīng)簡化酶活力(u/ml)=3.6232*稀釋倍數(shù)*00235本方法中所得到并表達(dá)的堿性果膠酶基因與已報(bào)道的該酶基因序列相似性98.89%，氨基酸序列相似性99.76%，氨基酸組成差異為Ala45Ser;Luria-Bertani培養(yǎng)基發(fā)酵分析顯示，工程菌株及野生菌株的發(fā)酵過程相似，發(fā)酵7h前后達(dá)到穩(wěn)定生長期，在指數(shù)生長時(shí)期，發(fā)酵液pH由7.0略有下降直至6.5，指數(shù)期后期及穩(wěn)定期發(fā)酵液pH逐漸上升到8.5;堿性果膠酶在指數(shù)期伴隨菌體的迅速生長而大量合成，穩(wěn)定期前期最高酶活性達(dá)到240260U/mL且酶活性穩(wěn)定；優(yōu)化培養(yǎng)基選用適用于工業(yè)生產(chǎn)的玉米粉、豆粕為主要碳源、氮源，具體配方為玉米粉4°/。，豆粕3%，(NH4)2S040.4%，MgSO4.7H2O0.03%，F(xiàn)eS040.01o/o，K2HP040.4%，KH2P040.4%，發(fā)酵培養(yǎng)條件37'C，200rpm，搖瓶培養(yǎng)24h酶活達(dá)到330U/mL，比出發(fā)菌株堿性果膠酶活性提高了22倍?！?10〉天津科技大學(xué)<120>堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法〈130〉20090424<160〉3<170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211>34〈212〉DNA〈213>引物l-GEUP〈400〉1ccggcatgccatgaaaaaagtgatgttagct￡LCg34〈210〉2〈211〉32〈212〉DNA〈213〉引物2-GEDOWN〈400〉2cacgcgtcgacttaatttaatttacccgcacc32<210>3〈211〉1263<212>DNA〈213〉基因pelG2521〈400〉3atgaa犯犯gtga_tgtt3gctELCggCtttgtttttaggattgactccagctggcgcg咖60gcagctgatttaggccaccagacgttgggatccaatgatggctggggcgcgtactcgacc120ggcacgacaggcggggca已a(bǔ)agcatcgtcctc犯atgtgtataccgtcag180cagcttgtctcggcattaggg鄉(xiāng)g犯3Cgttatatcaag240gg犯cgattgacatgaacgtctgaagccgcttggtctaaa300gatccggagtatgatttggaaaagcctatgatcctagcac3tggggC^EL360<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種堿性果膠酶基因工程菌，其特征在于是將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因連接在表達(dá)載體pWB980上、并采用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化WB600得到的工程菌株。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的堿性果膠酶基因工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為5.犯to7&168，其堿性果膠酶基因的大小為1263bp。3、一種如權(quán)利要求1所述的堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括如下步驟(1).以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增堿性果膠酶基因；(2).將目的基因酶切后與載體連接，命名重組質(zhì)粒為pWB-p^&5iV;(3).重組質(zhì)粒pTO-peJ&5S7轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主，構(gòu)建堿性果膠酶基因工程菌WB600/pWB-pW6^i7，最終獲得枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因工程菌。4、根據(jù)權(quán)利3要求所述的堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟[l]中用于PCR上游引物5'端含5bJI酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)后根據(jù)編碼框正確讀碼要求補(bǔ)充堿基C;下游引物5'端含5^I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得堿性果膠酶基因全長1263bp，其中信號肽部分63bp。5、根據(jù)權(quán)利3要求所述的堿性果膠酶枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟[2]中pWB980分子量為3787bp，pWB-pe^^5i7大小為5045bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距120bp。全文摘要本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法，包括從產(chǎn)堿性果膠酶的菌株中分離染色體DNA、設(shè)計(jì)引物、PCR獲得目的基因、構(gòu)建重組質(zhì)粒、在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，基因序列測定及對比分析。本方法中所得到并表達(dá)的基因區(qū)別于已報(bào)道的該酶基因序列，并在個(gè)別氨基酸組成上有差異；工程菌發(fā)酵采用的培養(yǎng)基適用于工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)宿主為蛋白酶缺陷型，利于后期酶的分離純化和穩(wěn)定保藏，工程菌發(fā)酵液酶活性較出發(fā)菌株提高22倍，達(dá)到330U/mL。文檔編號C12R1/125GK101531988SQ20091006861公開日2009年9月16日申請日期2009年4月24日優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日發(fā)明者王春霞,靜肖,路福平,郝育杰申請人:天津科技大學(xué)