專利名稱：非洲豬瘟病毒熒光定量pcr檢測試劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物病原檢測領(lǐng)域，尤其是一種以非洲豬瘟基因片段為靶 目標(biāo)設(shè)計(jì)的生物制劑，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR)技術(shù)檢測非洲豬瘤病毒(African swine fever virus, ASFV)中P54基因的方法，即非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑及其制備 方法和用途。
背景技術(shù)：
非洲豬瘟(African swine fever ， ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引 起的豬的一種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、 病死率高率，可高達(dá)100。％，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷 時(shí)極易誤診，表現(xiàn)高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。(William, Hess Adv. African swine fever: a reassessment [J]. Vet Sci Comp Med， 1981,25: 39 69)世界動(dòng)物組織(0IE)列為A類疫病，我國規(guī)定為動(dòng)物一類疾 病，受到世界各國的高度重視(孫懷昌.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999， 21(2) :117 U9)。
本病自1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)以來， 一直存在于撒哈拉以南的非洲國家， 1957年先后流傳至西歐和拉美國家，多數(shù)被及時(shí)撲滅，單在葡萄牙，西班 牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等 數(shù)十個(gè)國家流行，而且有不斷蔓延趨勢。2007年，亞美尼亞連續(xù)發(fā)生六起非 洲豬瘟，我國尚無該病。
非洲豬瘟在國際病毒分類委員會(huì)第四次報(bào)告中歸于虹彩病毒科，在該 委員會(huì)第五次報(bào)告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動(dòng)物痘病毒 亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病 毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表明它不屬于國際病毒分類委 員會(huì)所核定的任何一科，是個(gè)新科，1995年第9次國際病毒分類委員第六次 報(bào)告，將非洲豬瘟病毒列入"類非洲豬瘟病毒屬"，非洲豬瘟是唯一已知 的代表種。非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA 病毒。其基因組為末端共價(jià)閉合的單分子線狀雙鏈DNA,病毒基因組全長為 170kb 190kb，中央有125kb左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn) 重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長度差 異的主要原因(Rafacl， Yancz, Javier M, et a丄Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus [J]. Virology, 1995， 208:249 279) 。 ASF病毒基因組有5個(gè)編碼基因，包括假 定膜蛋白、分泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復(fù))以及蛋白修飾的 酶，整個(gè)基因組含有151個(gè)0RF，可以編碼150 200種蛋白質(zhì)，已從ASFV感 染的細(xì)胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研 究進(jìn)展，中國獸醫(yī)科技，1998 ,28 (11) :42 43)。
非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少 數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性。
ASFV P54蛋白是由E183L基因編碼的，約25kD的多肽，含有一段跨膜區(qū) 域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。P54蛋白可以在體外培養(yǎng)，并能感染細(xì) 胞。而且在感染細(xì)胞后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處短暫表達(dá)。P54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病 毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體時(shí)起著十分重要的作用(Rodriguez JM， Garcia Escudero African Swine Fever Virus Structural Protein p54 Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors to Assembly Sites. Journal of Virology, 2004 ，78 (8) : 4299 4313)。另外ASFV P54蛋白與8kD的輕鏈細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白DLC8存在特殊的交叉反應(yīng)，并在細(xì)胞 內(nèi)攝作用及病毒加工過程中起重要作用。感染病毒后復(fù)制早期，病毒可激 活細(xì)胞凋亡蛋白酶而誘發(fā)細(xì)胞脫噬作用(Alonso C ， J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54 Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding to Light—Chain Dynein. Journal of Virology 2001 ， 75 :9819 9827)。為了分析結(jié)構(gòu)蛋白P54在細(xì)胞脫噬 中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G將其在非洲綠猴腎細(xì)胞內(nèi) 短暫表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明可激活細(xì)胞凋亡蛋白酶，誘發(fā)細(xì)胞脫噬作用(Hernaez B ， Diaz Gil G. The African swine fever virus dynein-binding protein p54 induces infected cell apoptosis. FEBS Letters 2004 ， 569(123) :224 228)。但P54的突變體缺失13aa而失去激活細(xì)胞凋亡蛋白酶 的功能(Alejo A ， GAndr6s ， ML Salas. African Swine Fever Virus Proteinase Is Essential for Core Maturation and Infectivity Journal of Virology, 2003 ，77 :5571 557)。
目前，針對ASFV的檢測和診斷技術(shù)主要有兩大類，即基于病毒抗原、 抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法和包括病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的核酸檢測 技術(shù)。試驗(yàn)方法的選擇主要依據(jù)本國或本地區(qū)的疾病情況而定。在沒有ASF 但又懷疑該病存在的國家，實(shí)驗(yàn)室診斷必須應(yīng)用無感染性的診斷方法，即 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測病毒基因組DNA和應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)檢測血清抗體。用免疫學(xué)方法檢測抗體可以了解病毒感染以及疾病 發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，然而，由于抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出 現(xiàn)，因此，抗體檢測在作為快速控制ASFV暴發(fā)的方法時(shí)存在局限性。PCR可 以檢測出各種樣本(血液、糞便、分泌物、組織切片)中ASFV的遺傳物質(zhì)DNA， 從而實(shí)現(xiàn)早期診斷，在ASFV的診斷和檢測中具有重要的作用。
近幾年發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法將PCR與熒光檢測結(jié)合起 來(李維彬等，非洲豬瘟病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立. 寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)，2007， 28)。在熒光定量PCR中，常使用的熒光標(biāo)記有 SYBRGreenI和TaqMan探針兩種。前者在分析中熒光值常受到線性擴(kuò)增產(chǎn)物 (由一側(cè)引物延伸到底)和引物二聚體等的影響(ChenY丄HUC JandZhao M Q. Construction of realtime quantitative polymerase chain reaction platform with SYBRGreen I (J).Practical Journal of Medicine & Pharmacy, 2004 ， 21 (11) :997 999)，從而使定量的準(zhǔn)確性和靈敏度 降低。而以TaqMan探針在定量靈敏度方面要優(yōu)于前者，但存在探針設(shè)計(jì)、 合成技術(shù)要求高和實(shí)驗(yàn)成本高的不足。Scott M Reidb和Geoffrey H等在2003 年以ASFV VP72為目的基因，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，將熒光探 針與PCR方法結(jié)合起來，使實(shí)驗(yàn)更加快速靈敏簡便，可用于快速檢測疑似非 洲豬瘟的病例，作為鑒別診斷的有效方法(King DP ， Reid SM. J Virol Methods , 2003 ，107(1) :53 61)，但對于P54基因的熒光定量PCR技術(shù)， 現(xiàn)無論在國內(nèi)還是國外都尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
6本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測非洲豬瘟P54基兇的非
洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種非洲豬瘟病
毒熒光定量PCR檢測試劑，包含一對特異性引物和一條特異性探針，擴(kuò)增
目標(biāo)長度為218bp，引物和探針序列為
上游引物ASFV P54-l: 5， -GCAATGGGCAGAAGTCACT-3， 下游引物ASFV P54-2: 5， -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3， 探針ASFVP54-probe: 5， -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3，。 所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，包括以下步
驟
(1)選擇非洲豬瘟病毒的P54基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其基因片 段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為
GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC;
(2) 根據(jù)P54基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；
(3) 探針的合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告 基團(tuán)是FAM， 3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA;
(4) 設(shè)計(jì)含內(nèi)切酶位點(diǎn)的非洲豬瘟病毒的P54基因PCR擴(kuò)增引物，以 之構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-P54，引物序列如下
上游引物pET-P54-l: 5， -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3， 下游引物pET-P54-2: 5， -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3，；
(5) 經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳 條件、引物及探針的特異性和靈敏度。
所述(5)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為 25pmol/uL， 50uL體系中加入luL引物及探針，引物及探針的特異性使 其可區(qū)別于豬源其它病毒，靈敏度達(dá)到15個(gè)拷貝。
所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在檢測非洲豬瘟病毒方面
7及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在繪制非洲豬瘟病毒熒光
定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途。
所述的繪制非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途，繪制非
洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線包括以下步驟
(1) 重組質(zhì)粒pET-P54的定量，并換算成拷貝數(shù)；
(2) 重組質(zhì)粒pET-P54的梯度稀釋；
(3) 以所述的引物及探針對各濃度梯度重組質(zhì)粒pET-P54進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光PCR檢測，記錄數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明的有益效果是研究建立特異、敏感、安全、準(zhǔn)確、快速的檢
測方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究具有重要意義。對樣品中的低 含量的非洲豬瘟病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測的方法必須 具備高敏感、高特異性和高準(zhǔn)確性。


圖1為重組質(zhì)粒pET-P54及不同病毒DNA實(shí)時(shí)熒光PCR曲線。 圖2為標(biāo)準(zhǔn)模板熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。 圖3為ASFV P54標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種非洲豬瘟病 毒熒光定量PCR檢測試劑，包含一對特異性引物和一條特異性探針，擴(kuò)增 目標(biāo)長度為218bp，引物和探針序列為
上游引物ASFV P54-1: 5， -GCAATGGGCAGAAGTCACT-3， 下游引物ASFV P54-2: 5， -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3， 探針ASFVP54-probe: 5， -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3，。 所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，包括以下步
驟
(1)選擇非洲豬瘟病毒的P54基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其基因片 段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC;
(2) 根據(jù)P54基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；
(3) 探針的合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告 基團(tuán)是FAM， 3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA;
(4) 設(shè)計(jì)含內(nèi)切酶位點(diǎn)的非洲豬瘟病毒的P54基因PCR擴(kuò)增引物，以 之構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-P54，引物序列如下
上游引物pET-P54-1: 5' -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3' 下游引物pET-P54-2: 5， -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3，；
(5) 經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳 條件、引物及探針的特異性和靈敏度。
所述(5)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為 25pmol/pL， 50yL體系中加入lyL引物及探針，引物及探針的特異性使 其可區(qū)別于豬源其它病毒，靈敏度達(dá)到15個(gè)拷貝。
所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在檢測非洲豬瘟病毒方面 及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在繪制非洲豬瘟病毒熒光 定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途。
所述的繪制非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途，繪制非 洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線包括以下步驟
(1) 重組質(zhì)粒pET-P54的定量，并換算成拷貝數(shù)；
(2) 重組質(zhì)粒pET-P54的梯度稀釋；
(3) 以所述的引物及探針對各濃度梯度重組質(zhì)粒pET-P54進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光PCR檢測，記錄數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例1非洲豬瘟病毒DNA的提取
發(fā)明中使用的非洲豬瘟病毒■為意大利Institut zo叩rofilattic sperimenTALE DELLA SARDEGNA惠贈(zèng)，按照Roche旋轉(zhuǎn)柱DNA提取試劑盒說 明書提取病毒DNA。
9實(shí)施例2 ASFV P54基因PCR擴(kuò)增引物與Taqman檢測引物及探針的設(shè)計(jì)與 合成
根據(jù)GenBank ASFV P54基因序列(GenBank收錄號(hào)DQ028323)，設(shè)計(jì)、 合成含BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的引物，以擴(kuò)增P54全序列長 度為552bp的片段，引物序列如下
pET-P54-1: 5， -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3，(畫橫線處表示引入的 BamHI酶切位點(diǎn))
pET-P54-2: 5， -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3，(畫橫線處表示引入的Xhol 酶切位點(diǎn))
根據(jù)GenBank ASFV P54基因序列(GenBank收錄號(hào)DQ028323)，設(shè)計(jì)、 合成特異性的引物及Taqman探針，以檢測P54，探針熒光基團(tuán)選取FAM， 淬滅基團(tuán)選取TAMRA，探針及引物序列如下
ASFV P54-probe: 5， -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3， 上游引物ASFV P54-1: 5， -GCAATGGGCAGAAGTCACT-3， 下游引物ASFV P54-2: 5， -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3，
所有引物及探針均委托invitrogen公司合成。
實(shí)施例3: ASFV P54目的基因的擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增使用的rTaq聚合酶及dNTP均為TaKaRa產(chǎn)品，PCR儀是BIO-RAD
公司出品。
1 PCR反應(yīng)混合液的配制
以實(shí)施例1中提取的病毒DNA為模板，以實(shí)施例2中設(shè)計(jì)的P54擴(kuò)增 引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選取50txL如下PCR反應(yīng)體系
10XBuffer(含MgCl2) : 5 P L;模板病毒DNA: 1 ii L;上游引物(25pmo1/ u L): luL;下游引物(25pmol/uL) : 1 u L; dNTPs: l"L(10腿ol/L); Taq聚 合酶0. 5uL (2. 5U/uL);雙蒸水補(bǔ)齊。
2 PCR反應(yīng)程序?yàn)?94。C預(yù)變性3min;
94。C變性30s， 55。C退火40s， 72。C延伸60s，共5個(gè)循環(huán)； 94。C變性30s， 60。C退火40s， 72。C延伸60s，共30個(gè)循環(huán); 72。C延伸6min;4。C保溫6min。
取10u LPCR產(chǎn)物進(jìn)行P/o的瓊脂糖凝膠電泳，120V電泳25分min紫外檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例4 ASFV P54目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
DNA片段回收使用的玻璃奶回收試劑盒為博大泰克公司產(chǎn)品，內(nèi)切酶、連接酶為Fe歷ntas產(chǎn)品。
將實(shí)施例3中凝膠電泳獲得的目的條帶切割下來，照DNA片段玻璃奶回收試劑盒說明，純化回收目的DNA片段。將目的基因P54 (552bp)和載體質(zhì)粒pET 28b分別用限制性內(nèi)切酶BamH 1/XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如為
目的基因P54的雙酶切體系目的基因P54: IOUL;
BamH 1: 2";
Xh0 I: 2UL;
Buffer BamH: 2pL;雙蒸水4uL.
載體質(zhì)粒pET 28b的雙酶切體系載體質(zhì)粒pET 28b: 4uL;BamH I: 2yL;Xho 1: 2uUBuffer BamH: 2 p U雙蒸水IOpL。
將整個(gè)酶切體系37'C，水浴作用3h。
用DNA片段玻璃奶回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，并以適宜比例連接，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，利用Kan抗性篩選重組轉(zhuǎn)化體。以ASFV P54目的基因擴(kuò)增引物和BamH I/Xho I對重組轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒委托華大基因測序。重組質(zhì)粒序列含有如SEQ ID NO. l所示檢測序列。
實(shí)施例5 ASFV P54目的基因重組質(zhì)粒pET-P54的稀釋與定量
將重組質(zhì)粒pET-P54依次進(jìn)行10 1012稀釋，使用SHIMADZM公司BIO-SPECMIN DNA分析儀對各稀釋度質(zhì)粒質(zhì)量進(jìn)行測定，并按照如下公式將
質(zhì)粒質(zhì)量換算成拷貝數(shù)
X(g/u L廳)X6. 02X 1023
重組質(zhì)粒長度(bp) X2X324. 5實(shí)施例6 ASFV P54目的基因的熒光PCR檢測
熒光PCR試劑是TaKaRa公司的rTaq聚合酶及dNTP，實(shí)時(shí)熒光PCR儀是ABI PRISM 7000型，熒光PCR管和管蓋購自ABI公司。
1 PCR反應(yīng)混合液的配制
以實(shí)施例4中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-P54，非洲豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、傳染性胸膜肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA為模板，以實(shí)施例2中設(shè)計(jì)的P54熒光引物及探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，選取50uL如下PCR反應(yīng)體系
lOXBuffer (含MgCl2) : 5uL;模板質(zhì)?；虿《綝NA: 1 u L;上游引物(25pmol/p L): lu L;下游引物(25pmol/u L): 1 " L;探針(25pmo1/u U :luL; dNTPs: liiL(10mmol/L); Taq聚合酶0. 5ixL (2. 5U/uL);雙蒸水補(bǔ)齊。
2 PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 95 °C 預(yù)變性10min;
94°C 變性15s， 6CTC退火延伸lmin，共40個(gè)循環(huán)；
退火、延伸階段采集數(shù)據(jù)。3結(jié)果分析
在ABI公司提供的分析軟件SDS version 2.0的Analyze界面下選擇FAM熒光標(biāo)記，TAM淬滅標(biāo)記。若樣品種含有如SEQ ID NO. 1所示序列，熒光PCR即可檢測出陽性擴(kuò)增曲線。非洲豬瘟病毒DNA、重組質(zhì)粒pET-P54的△Rn曲線出現(xiàn)陽性增長，而以豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、傳染性胸膜肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA為模板的ARn曲線及陰性對照均為平的直線，這表明引物和TaqMan探針的特異性很高。從圖1可見，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線。熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線基線平整，無引物二聚體產(chǎn)生；對數(shù)區(qū)較明顯，斜率大且固定(為平行線)，為較理想的擴(kuò)增曲線，表明本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測ASFV
12P54具有較好的準(zhǔn)確性。圖1中曲線部分對應(yīng)擴(kuò)增模板按照右側(cè)端由上至下
依次為重組質(zhì)粒pET-P54和兩種ASFV P54陽性樣品DNA，平的多條直線為古典豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、傳染性胸膜肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA為模板的擴(kuò)增曲線和陰性對照。實(shí)施例7 ASFV P54目的基因的熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成
選取實(shí)施例5中102 108倍稀釋的pET-p54質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模版，按照實(shí)施例6中的條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)在熒光定量PCR儀中輸入相應(yīng)濃度梯度的質(zhì)?？截悢?shù)。通過這7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品得到的反應(yīng)數(shù)據(jù)，所有反應(yīng)信息資料被ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴(kuò)增儀收集并儲(chǔ)存于其附件電腦(含相應(yīng)的分析軟件)中，反應(yīng)結(jié)束后該電腦根據(jù)陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增情況，以Ct值為縱坐標(biāo)，pET-p54質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對應(yīng)各循環(huán)閾值(Ct值)見下表。
表l熒光定量PCR各拷貝數(shù)對應(yīng)Ct值質(zhì)粒拷貝數(shù)Copies of the Ct值(平均值)Ct val: (Me^Tplasmid1.48X10111. 48X10"'1. 48X1091. 48X1081. 48X1071.48X1061.48X105陰性對照(Negative control)2結(jié)果分析
圖2為生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒模板的熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，從圖中可見，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線。熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線基線平整，無引物二聚體產(chǎn)生；對數(shù)區(qū)較明顯，斜率大且固定(為平行線)，為較理想的擴(kuò)增曲線。圖2中曲線部分按照右側(cè)端由上至下模板拷
10. 9413. 0416. 5220. 5224. 1526. 3828. 58N/A貝數(shù)依次為L48X1011， 1.48X10y， 1.48X101U， 1.48X10Y， 1.48X10、1.48X 106, 1.48X 105,平的直線為陰性對照。反應(yīng)體系中含有1.48X105至1.48X10u質(zhì)粒時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)呈線性關(guān)系(圖3)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3. 115，截距為47.472，直線方程為Y=-3.115X+47.472，其中Y代表Ct值，X代表質(zhì)粒的模板的拷貝數(shù)對數(shù)值；一致性系數(shù)為0.991。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效果好，結(jié)果具有很高的可靠性。另外，研究中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)體系中含有低于15個(gè)拷貝時(shí)，能夠擴(kuò)增出陽性曲線，即本發(fā)明中的引物、探針對熒光定量PCR測定P54基因有較好的敏感性，靈敏度可達(dá)到15個(gè)拷貝。
本發(fā)明設(shè)計(jì)使用的引物及探針，建立了編碼非洲豬瘟病毒P54蛋白的基因的快速簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，可用于非洲豬瘟病毒核酸的快速檢測，檢測時(shí)間僅為數(shù)小時(shí)，可直接應(yīng)用于口岸對進(jìn)境豬相關(guān)制品的診斷和檢疫技術(shù)，為無ASF國家的進(jìn)口檢疫工作提供了可靠、有效的技術(shù)條件。
本發(fā)明選用T叫Man作為探針對非洲豬瘟P54基因建立了實(shí)時(shí)熒光定量
PCR檢測體系，通過條件優(yōu)化和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，得到了較理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測效果。它克服了傳統(tǒng)PCR費(fèi)時(shí)、易污染，擴(kuò)增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)，可對樣品中的核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，近年來又被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性與定量檢測。
本發(fā)明以ASFV DNA為模板，設(shè)計(jì)P54的PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并對其定量，以之作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，從而獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，本發(fā)明中還收集了古典豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、傳染性胸膜肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA來進(jìn)行交叉反應(yīng)，從而確證了熒光定量PCR引物的特異性。
建立ASFV P54的快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，靈敏度可達(dá)到15個(gè)拷貝，檢測時(shí)間縮短為幾個(gè)小時(shí)。同時(shí)，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，為P54基因的定量提供了可靠依據(jù)。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的
14有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(SEQUENCE LISTING)
〈110〉天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心
〈120〉非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和用途
〈130〉
〈160> 1
<170〉 Patentln version 3. 5
〈210〉 1
<211> 219
〈212〉 DNA
<213> 非洲豬瘟病毒(Afican Swine Fever Virus)〈220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (1)..(219)
<400〉 1
gcaatgggca gaagtcactc cacaaccagg tacctctaaa ccggctggag cgactacagc 60
aagtgcaggc aaaccagtca cgggcagacc ggcaacaaac agaccagcaa ca助caaacc 120
agtcacggac aacccagtta cggacagact agtcatggca actggcgggc cagcggccgc 180
acctgcggcc gcgagtgctc atccgactga gccttacac 219
1權(quán)利要求
1、一種非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑，其特征在于，包含一對特異性引物和一條特異性探針，擴(kuò)增目標(biāo)長度為218bp，引物和探針序列為上游引物ASFV P54-1∶5’-GCAATGGGCAGAAGTCACT-3’下游引物ASFV P54-2∶5’-GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3’探針ASFV P54-probe5’-FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3’。
2、 權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)選擇非洲豬瘟病毒的P54基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC;(2) 根據(jù)P54基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；(3) 探針的合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM， 3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA;(4) 設(shè)計(jì)含內(nèi)切酶位點(diǎn)的非洲豬瘟病毒的P54基因PCR擴(kuò)增引物，以之構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-P54，引物序列如下上游引物pET-P54-l: 5， -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3'下游引物pET-P54-2: 5' -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3，；(5) 經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳條件、引物及探針的特異性和靈敏度。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述(5)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為25pmol/uL， 50uL體系中加入ltiL引物及探針，引物及探針的特異性使其區(qū)別于豬源其它病毒，靈敏度達(dá)到15個(gè)拷貝。
4、 權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在檢測非洲豬瘟病毒方面及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑在繪制非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的繪制非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途，其特征在于，繪制非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線包括以下步驟(1) 重組質(zhì)粒pET-P54的定量，并換算成拷貝數(shù)；(2) 重組質(zhì)粒pET-P54的梯度稀釋；(3) 以權(quán)利要求1所述的引物及探針對各濃度梯度重組質(zhì)粒pET-P54進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，記錄數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和用途，設(shè)計(jì)合成了一套特異性的引物及Taqman探針，用來檢測豬相關(guān)制品中的ASFV P54。發(fā)明中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為ASFV P54的定量檢測提供了標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明建立了一種快速簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，檢測時(shí)間僅為數(shù)小時(shí)，檢測下限可達(dá)15個(gè)拷貝，可直接應(yīng)用于口岸對進(jìn)境豬相關(guān)制品的診斷和檢疫技術(shù)，為無ASF國家的進(jìn)口檢疫工作提供了可靠、有效的技術(shù)條件。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101463396SQ200910067620
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者侯艷梅, 霞 張, 琳 李, 妍 肖, 董志珍, 趙祥平, 陳本龍, 黃金海 申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心