專利名稱：一種含蛋白酶體β5亞基(PSMB5)突變基因的細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)的領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)抗腫瘤新藥蛋白酶體抑制劑 硼替佐米高度耐藥的含PSMB5基因G322A， C326T聯(lián)合突變的白血病/淋巴瘤細(xì)胞株 JurkatBG322A/C326T，可用于硼替佐米等蛋白酶體抑制劑耐藥機(jī)制研究，與硼替佐米無交 叉耐藥的新一代蛋白酶體抑制劑的篩選及作用機(jī)制研究。
背景技術(shù)：
耐藥是腫瘤，特別是白血病治療中的一個(gè)難題，是白血病復(fù)發(fā)和難治的關(guān)鍵。蛋白 酶體是一個(gè)新的有效的抗癌治療的靶，蛋白酶體抑制劑可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)其它藥物的敏 感性，克服腫瘤細(xì)胞的耐藥，是一類新的具有廣譜抗腫瘤前景的新藥。硼替佐米是第一個(gè)應(yīng) 用于臨床的蛋白酶體抑制劑，選擇性抑制蛋白酶體13 5亞基(protesome beta 5subunit， PSMB5)上的糜蛋白酶樣活性位點(diǎn)，其單藥或與其他藥物聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤和一些非霍 奇金淋巴瘤亞型的臨床研究都獲得了較高的總體有效率和完全緩解率。國外學(xué)者的研究表 明，硼替佐米對(duì)急慢性白血病也具有潛在的治療價(jià)值。在國外臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，大部分單藥 應(yīng)用硼替佐米的患者都出現(xiàn)了耐藥，有一部分患者對(duì)硼替佐米治療無反應(yīng)。目前對(duì)硼替佐 米的耐藥機(jī)制研究尚不全面，主要集中在熱休克蛋白(heat shockprotein， HSP)等抑制凋 亡通路的上調(diào)方面。為明確蛋白酶體抑制劑應(yīng)用后的耐藥機(jī)制，我們先前采用體外長期、反 復(fù)、濃度遞增篩選的方法自T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病細(xì)胞系Jurkat建立了硼替佐米耐 藥的含有PSMB5基因G322A突變的細(xì)胞系JurkatB，并發(fā)現(xiàn)該突變與硼替佐米耐藥有關(guān)。我 們進(jìn)一步改進(jìn)篩選方法，將JurkatB細(xì)胞反復(fù)暴露于高濃度硼替佐米環(huán)境，將恢復(fù)生長的 細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，最終建立了 PSMB5基因G322A， C326T聯(lián)合突變的細(xì)胞株，該突變導(dǎo)致 蛋白酶體抑制劑硼替佐米與其作用靶PSMB5相互結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵丙氨酸Ala49，Ala50分別 被蘇氨酸(Thr49)和纈氨酸(Val50)替代，使得硼替佐米對(duì)PSMB5上的糜蛋白酶樣活性的 抑制作用較母體Jurkat細(xì)胞及先前得到的G322A突變株均顯著降低，從而表現(xiàn)出對(duì)硼替佐 米的高度耐藥性。 作為一類新的抗腫瘤藥，蛋白酶體抑制劑具有廣闊的抗腫瘤前景，但目前應(yīng)用于 臨床的蛋白酶體抑制劑硼替佐米主要對(duì)一部分骨髓瘤患者表現(xiàn)出較佳療效，同時(shí)也存在耐 藥問題，并且對(duì)白血病等其他腫瘤的療效尚不滿意，因此需要開發(fā)不同類型的蛋白酶體抑 制劑以針對(duì)不同的腫瘤。我們所建立的PSMB5基因G322A，C326T聯(lián)合突變的細(xì)胞株可以成 為篩選與硼替佐米無交叉耐藥、對(duì)白血病/淋巴瘤細(xì)胞有更佳療效的新型蛋白酶體抑制劑 的有力工具；也是新的蛋白酶體抑制劑作用機(jī)制研究的平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的PSMB5基因G322A， C326T聯(lián)合突變的細(xì)胞株，其 PSMB5基因和蛋白序列如下頁所示
突變的PSMB5基因序列CDS :265. . 1056 CDS :第322位點(diǎn)由野生型的G突變成A， 326位由C突變成T(粗體)。 1 aggactactt gcatgaccaa agccaagatg gcaggtacgt
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替代(粗體)。 1 malasvlerp lpvnqrgffg lggradlldl gpgslsdgls la即gwgvpe印giemlhgt
61 ttlafkfrhg vivaadsrat agayiasqtv kkviei叩yl lgtmaggtvd csfwerllar
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181 sgatfsvgsg svyaygvmdr gysydleveq 3ydl3r:raiy qatyrdaysg gavnlyhvre
241 dgwirvssdn vadlhekysg stp 突變的功能性PSMB5蛋白序列野生型49， 50位的丙氨酸分別被蘇氨酸和纈氨酸 替代(粗體)。1 tttlafkfrh gvivaadsra tegayiasqt vkkviei叩y llgtmaggtv dcsfwerlla
61 rqcriyelrn kerisvaaas kllanmvyqy kgmglsmgtm icgwdkrgpg lyyvdsegnr
121 isgatfsvgs gsvyaygvmd rgysydleve qaydlarrai yqatyrdays ggmmlyhvr
181 edgwirvssd nvadlhekys gstp
本發(fā)明的另一 目的是提供該類細(xì)胞株的建立方法 1.將以前所建立的硼替佐米耐藥細(xì)胞系JurkatB暴露于高濃度lOOOnM的硼替佐 米，72h后換無硼替佐米的培養(yǎng)液，細(xì)胞生長恢復(fù)后再次暴露于硼替佐米環(huán)境，每個(gè)循環(huán)收 集恢復(fù)生長的細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行PSMB5基因PCR產(chǎn)物直接測序，并轉(zhuǎn)化克隆測序載體進(jìn)行 克隆測序，直到PCR直接產(chǎn)物測序有PSMB5基因322 (G/A) ， 323 (C/T) ， 326 (C/T)的雙峰突 變，克隆測序發(fā)現(xiàn)有兩種新的突變體C323T和G322A， C326T聯(lián)合突變體。
2.繼續(xù)將有新突變的細(xì)胞系應(yīng)用1000nM硼替佐米篩選，直到PCR產(chǎn)物測序?yàn)閱畏?的G322A， C326T聯(lián)合突變體。 3.應(yīng)用極限稀釋法自G322A， C326T突變細(xì)胞建立單克隆株JurkatB-G322A/ C326T，并再次測序確認(rèn)。 4.將所篩選的單克隆G322A， C326T突變細(xì)胞株JurkatB-G322A/C326T培養(yǎng)于無 硼替佐米環(huán)境2個(gè)月以上，再次測序確認(rèn)該突變的穩(wěn)定性。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)不同類型蛋白酶體抑制劑交叉耐藥性的研究工 具。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)與硼替佐米無交叉耐藥性，對(duì)白血病/淋巴瘤細(xì)
胞有更好療效的新型蛋白酶體抑制劑篩選工具及作用機(jī)制的研究平臺(tái)。


高度耐硼替佐米的JurkatB細(xì)胞的PSMB5基因的測序結(jié)果演變過程見
附1.對(duì)照J(rèn)urkat的PSMB5基因序列為322G， 323C， 326C ;圖2. JurkatB2/1000-lm
的PSMB5基因PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果為322為G與A混合雙峰，323為C與T混合
雙峰，326為C與T混合雙峰；圖3. JurkatB2/1000-lm的PSMB5基因測序克隆之一為323T ;圖4. JurkatB2/1000-lm的PSMB5基因測序克隆之二為322A聯(lián)合，326T ;圖 5. JurkatB2/1000-3m的PSMB5基因PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果322A聯(lián)合326T。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1PSMB5突變白血病/淋巴瘤細(xì)胞株的建立 含野生型PSMB5基因的Jurkat細(xì)胞，在體外從低濃度開始，逐漸遞增，反復(fù)篩選得 到G322A突變的耐藥細(xì)胞株JurkatB，繼續(xù)增加篩選濃度至1000nM，在該濃度反復(fù)多次篩 選，同時(shí)恢復(fù)生長的細(xì)胞進(jìn)行PSMB5基因PCR產(chǎn)物直接測序和克隆測序，直到獲得PCR產(chǎn)物 直接測序結(jié)果為單峰的G322A， C326T聯(lián)合突變體。應(yīng)用極限稀釋法建立G322A， C326T聯(lián) 合突變單克隆株，再次測序確認(rèn)，在無硼替佐米環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)2月后再次測序確認(rèn)G322A， C326T突變的穩(wěn)定性。實(shí)施例2不同類型蛋白酶體抑制劑交叉耐藥性的研究 1.流式細(xì)胞術(shù)分析印oxyketone類蛋白酶體抑制劑carfilzomib，PR-047等和硼 替佐米作用后JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞周期分布 取指數(shù)生長期Jurkat、 JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞懸液1 X 105/ml，分別接種于24 孔板，每孔含lml，37°C、5% 0)2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加入50nM硼替佐米作用24h， 收集細(xì)胞懸液離心、去上清，加75%冰乙醇打勻固定，0 4t:過夜，離心、去上清，PBS洗滌 2次，RNA酶作用15min，加PI (碘化丙錠)、精胺作用15min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106/ml，流 式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期分析。 2.苔盼蘭拒染法或MTT比色法檢測carfilzomib， PR-047和硼替佐米作用后 JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞活性 取指數(shù)生長期Jurkat、 JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞懸液1 X 105/ml，分別接種于24 孔板或96孔板，37。C、5X 0)2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的carfilzomib， PR-047，硼替佐米，藥物濃度0. lnM至100uM，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取藥物作用濃度，苔盤蘭染 色法或MTT比色法檢測活細(xì)胞。存活率％=試驗(yàn)孔活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照孔活細(xì)胞數(shù)X100X，耐 藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC5。/敏感細(xì)胞IC5。。
3.流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡分析 取指數(shù)生長期Jurkat、JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞懸液1 X 105/ml，分別接種于24 孔板，每孔含lml ， 37°C 、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加入不同濃度carf ilzomib， PR-047,硼替佐米作用24h、48h，收集細(xì)胞懸液離心、去上清。1-5X 105細(xì)胞沉淀加入500 y 1 的Binding Buffe懸浮細(xì)胞，力口入2 ii 1 AnnexinV—FITC混勾后，力口人5 ii 1 Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5-15min ;用流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC的綠色熒光 通過FITC通道(FL1)檢測；PI紅色熒光通過PI通道(FL3)檢測。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)未經(jīng)凋 亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。
實(shí)施例3與硼替佐米無交叉耐藥性新型蛋白酶體抑制劑的篩選
檢測其它蛋白酶體抑制劑5_amino_8_hydroxyquinoline， Pralatrexate以及新 合成或提取的化合物等對(duì)Jurkat和JurkatB/G322A/C326T細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，殺傷毒 性，凋亡誘導(dǎo)等作用，篩選對(duì)白血病/淋巴瘤細(xì)胞具有高效作用的藥物，具體方法參見實(shí) 施例2.
實(shí)施例4與硼替佐米無交叉耐藥性新型蛋白酶體抑制劑的作用機(jī)制研究
1.凋亡蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(NF-K b， I k B-a ， Caspase， BCL-2等凋亡相關(guān)蛋白 的檢測 將培養(yǎng)的指數(shù)生長期細(xì)胞各1X107，加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)不同的時(shí)間；收集 細(xì)胞，先放置液氮中5min，再放入37t:水浴5min，交替3次。13000r/min離心15min，取 上清，抽取總蛋白，進(jìn)行蛋白定量蛋白印跡(Western)實(shí)驗(yàn)明確Jurkat細(xì)胞和JurkatB/ G322A/C326T細(xì)胞經(jīng)新型蛋白酶體抑制劑作用后，細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。
2.藥物作用后蛋白酶體核心蛋白糜蛋白酶樣活性、胰蛋白酶樣活性，多肽-谷氨 酰_多肽水解酶活性檢測 將培養(yǎng)的指數(shù)生長期細(xì)胞各1X107，加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)不同的時(shí)間；收集 細(xì)胞，提取總蛋白，測定各對(duì)照和藥物處理組總蛋白中20S蛋白酶體的蛋白水解酶活性(測 定特異性底物水解受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光)，計(jì)算酶活性抑制率。抑制率1%= (A對(duì)照-A加 藥)/A對(duì)照X100% (對(duì)照指空白處理組)。
權(quán)利要求
一種含G322A，C326T聯(lián)合突變的蛋白酶體β5亞基(PSMB5)基因的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株，其PSMB5基因和蛋白序列如下所示，突變的PSMB5基因序列CDS265..1056CDS第322位點(diǎn)由野生型的G突變成A，326位由C突變成T(粗體)。1aggactactt gcatgaccaa agccaagatg gcaggtacgt ccttttagaa tttaaggtta61 gtgaagccat ctatttcccc gacccccttc agtgaaaatg gtctttcgca tctggccctt121 ctttttggag gcgtgcttgc cagcagtcaa aatggctcca ttccggaata gatttaatag181 gaagtgaagc tgtgacggcg aggcgttgcc cggcctatct ttgctaggcg ttctcagaat241 tagttctttc tgcccacact agacatggcg cttgccagcg tgttggagag accgctaccg301 gtgaaccagc gcgggttttt cggacttggg ggtcgtgcag atctgctgga tctaggtcca361 gggagtctca gtgatggtct gagcctggcc gcgccaggct ggggtgtccc agaagagcca421 ggaatcgaaa tgcttcatgg aacaaccacc ctggccttca agttccgcca tggagtcata481 gttgcagctg actccagggc tacagcgggt gcttacattg cctcccagac ggtgaagaag541 gtgatagaga tcaacccata cctgctaggc accatggctg ggggcacagt ggattgcagc601 ttctgggaac ggctgttggc tcggcaatgt cgaatctatg agcttcgaaa taaggaacgc661 atctctgtag cagctgcctc caaactgctt gccaacatgg tgtatcagta caaaggcatg721 gggctgtcca tgggcaccat gatctgtggc tgggataaga gaggccctgg cctctactac781 gtggacagtg aagggaaccg gatttcaggg gccaccttct ctgtaggttc tggctctgtg841 tatgcatatg gggtcatgga tcggggctat tcctatgacc tggaagtgga gcaggcctat901 gatctggccc gtcgagccat ctaccaagcc acctacagag atgcctactc aggaggtgca961 gtcaacctct accacgtgcg ggaggatggc tggatccgag tctccagtga caatgtggct1021 gatctacatg agaagtatag tggctctacc ccctgaaaga gggtggatgc agctgcttgt1081 gtttcttggg gtgactgtca ttggtaatac ggacacagtg acccatcctc catcctattt1141 atagtggaag ggccttcaat tgtatcagta ctttttttta agctctggca cattgacctc1201 tatgtgttac cagtcattaa tgagctgctg cagaggtgac tatttgtttt actttcttgg1261 atgttaacat tacactactc actactcaat ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa a突變的PSMB5前體蛋白序列野生型108，109位的丙氨酸分別被蘇氨酸和纈氨酸替代(粗體)。1 malasvlerp lpvnqrgffg lggradlldl gpgslsdgls laapgwgvpe epgiemlhgt61 ttlafkfrhg vivaadsrat agayiasqtv kkvieinpyl lgtmaggtvd csfwerllar121 qcriyelrnk erisvaaask llanmvyqyk gmglsmgtmi cgwdkrgpgl yyvdsegnri181 sgatfsvgsg svyaygvmdr gysydleveq aydlarraiy qatyrdaysg gavnlyhvre241 dgwirvssdn vadlhekysg stp突變的功能性PSMB5蛋白序列野生型49，50位的丙氨酸分別被蘇氨酸和纈氨酸替代(粗體)。1 tttlafkfrh gvivaadsra tagayiasqt vkkvieinpy llgtmaggtv dcsfwerlla61 rqcriyelrn kerisvaaas kllanmvyqy kgmglsmgtm icgwdkrgpg lyyvdsegnr121 isgatfsvgs gsvyaygvmd rgysydleve qaydlarrai yqatyrdays ggavnlyhvr181 edgwirvssd nvadlhekys gstp
2. 根據(jù)權(quán)利1所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株，其特 征在于PSMB5基因外顯子322到326位點(diǎn)突變。
3. 根據(jù)權(quán)利1所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株，其特 征在于優(yōu)選G322A， C326T聯(lián)合突變，功能性PSMB5蛋白野生型49， 50位的丙氨酸分別被蘇 氨酸和纈氨酸替代。
4. 根據(jù)權(quán)利1所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株建立過 程包括(1) 將從低濃度開始，逐漸遞增，反復(fù)篩選建立的硼替佐米耐藥白血病/淋巴瘤細(xì)胞系 JurkatB反復(fù)暴露于高濃度1000nM的硼替佐米，每個(gè)循環(huán)收集恢復(fù)生長的細(xì)胞，提取RNA進(jìn) 行PSMB5基因PCR產(chǎn)物直接測序，并轉(zhuǎn)化克隆測序載體進(jìn)行克隆測序，直到PCR直接產(chǎn)物測 序有PSMB5基因322 (G/A) ， 323 (C/T) ， 326 (C/T)的雙峰突變。(2) 繼續(xù)將有新突變的細(xì)胞系應(yīng)用lOOOnM硼替佐米篩選，直到PCR產(chǎn)物測序?yàn)閱畏宓?G322A， C326T聯(lián)合突變體。(3) 應(yīng)用極限稀釋法自G322A，C326T突變細(xì)胞建立單克隆株JurkatB-G322A/C326T，并 再次測序確認(rèn)。(4) 將所篩選的單克隆G322A，C326T突變細(xì)胞株JurkatB-G322A/C326T培養(yǎng)于無硼替 佐米環(huán)境2個(gè)月以上，再次測序確認(rèn)該突變的穩(wěn)定性。
5. 根據(jù)權(quán)利1所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株，用于 其它蛋白酶體抑制劑與硼替佐米交叉耐藥性的研究，與硼替佐米無交叉耐藥的蛋白酶體抑 制劑的篩選，與硼替佐米無交叉耐藥的新合成蛋白酶體抑制劑的篩選，與硼替佐米無交叉 耐藥的蛋白酶體抑制劑和新合成的蛋白酶體抑制劑的作用機(jī)制研究。
6. 根據(jù)權(quán)利5所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株的應(yīng) 用，其特征在于優(yōu)選其它蛋白酶體抑制劑與硼替佐米交叉耐藥交叉耐藥性的研究。
7. 根據(jù)權(quán)利5所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株的應(yīng) 用，其特征在于優(yōu)選與硼替佐米無交叉耐藥的蛋白酶體抑制劑及新合成的蛋白酶體抑制劑 的篩選。
8. 根據(jù)權(quán)利5所述的含PSMB5基因突變的蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥細(xì)胞株的應(yīng) 用，其特征在于優(yōu)選與硼替佐米無交叉耐藥的蛋白酶體抑制劑及新合成的蛋白酶體抑制劑 的作用機(jī)制研究。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的含蛋白酶體β5亞基(PSMB5)突變基因的白血病/淋巴瘤細(xì)胞株及其在抗腫瘤新藥蛋白酶體抑制劑開發(fā)和研究中的應(yīng)用，該細(xì)胞株存在PSMB5基因G322A，C326T聯(lián)合突變，(其突變圖譜見圖5)，導(dǎo)致PSMB5蛋白49位、50位的丙氨酸分別被蘇氨酸和纈氨酸替代，表現(xiàn)出對(duì)硼替佐米高度耐藥，可用于其它蛋白酶體抑制劑與硼替佐米交叉耐藥性的研究，與硼替佐米無交叉耐藥的蛋白酶體抑制劑和新合成的蛋白酶體抑制劑的篩選及作用機(jī)制研究。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101768573SQ20091004486
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者呂書晴, 周虹, 楊建民, 王健民, 許曉倩, 陳志龍, 陳莉, 龔勝藍(lán) 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)