專利名稱：具有殺狄斯瓦螨活性的組合幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有殺狄斯瓦螨活性的組合幾丁質(zhì)酶，及其在 殺狄斯瓦螨中的應(yīng)用，該組合幾丁質(zhì)酶包括幾丁質(zhì)酶ChiA和幾丁質(zhì)酶ChiB。
技術(shù)背景-
蜜蜂寄生螨一直是世界養(yǎng)蜂業(yè)最主要的危害之一，在全球范圍危害，目前除澳大利亞、 非洲部分地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨 (俗稱大蜂螨)(Fam "fifeWrac/or Anderson &Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼蟲的體液，造成蜜
蜂體質(zhì)下降，蜂群群勢衰弱；此外，蜂螨還傳播蜜蜂細(xì)菌和病毒病害。據(jù)報(bào)道，最近在美國
等國出現(xiàn)的蜜蜂蜂群崩潰失調(diào)病(CCD)也與蜂螨的危害有關(guān)。每年我國養(yǎng)蜂業(yè)僅蜂螨造成 的直接損失就達(dá)到幾個(gè)億人民幣，而且因防治蜂螨使用藥物造成蜂產(chǎn)品污染的間接損失更是 不可估量。
目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3種(l)物理機(jī)械法如蜂群的熱處理；(2) 化學(xué)防治法如使用殺螨劑如有機(jī)酸和香精等；(3)生物技術(shù)防治法包括蜜蜂飼養(yǎng)管理技 術(shù)。但是目前使用最廣泛的主要還是用藥物來防治大蜂螨，其中使用最為普遍的是一種以擬
除蟲菊酯類農(nóng)藥-氟胺氰菊酯為主要原料的殺螨劑"螨撲"(Apistan)。不可否認(rèn)，藥物治螨起 了一定的積極作用。但是，連續(xù)和大范圍使用導(dǎo)致的污染和抗藥性問題越來越嚴(yán)重。顯然單 靠藥物治螨是不夠的，還必須尋找其它途徑來防治蜂螨。
一些生物防治技術(shù)已應(yīng)用于防治蜂螨，如(1)割除雄蜂房法自從西方蜜蜂身體上發(fā)現(xiàn)
蜂螨，也發(fā)現(xiàn)蜜蜂對于蜂螨有清除行為，并可減輕蜂螨對蜂群所造成的危害。與此同時(shí)，養(yǎng) 蜂工作者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，減弱蜂螨對蜂群所造
成的危害。(2)使用抗螨除蟲多功能巢礎(chǔ)利用蜂螨繁殖于封蓋房，寄生于蜂體上這一生物 學(xué)特性，直接把殺螨藥物藏于蜂房中，阻斷蜂螨幼蟲在雄蜂房中正常羽化成成螨，從而達(dá)到 殺滅蜂螨這一目的。(3)人工選育抗螨新品種中華蜜蜂對于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群 內(nèi)雖曾發(fā)現(xiàn)蜂螨，但未給蜂群造成危害。而且西方蜜蜂對于蜂螨也有一定的清理行為，養(yǎng)蜂 工作者可以在蜂群中選擇對蜂螨有較強(qiáng)清理行為的蜜蜂為種群，定向培育抗螨性強(qiáng)的蜂群，
包括蜜蜂營養(yǎng)雜交(又稱為蜜蜂無性雜交)。(4)利用病原真菌綠僵菌(Meto/^z/, a"&op/Z"e)和/fi"w/e〃fl Z/ww/wo"http://對大蜂螨具有一定的防治效果。
但是，這些措施對蜂螨的控制效果并不令人滿意，如割除雄蜂房法很難徹底消除螨害；由于長期以來自養(yǎng)自繁的養(yǎng)蜂模式導(dǎo)致的蜜蜂嚴(yán)重混雜退化和近親繁殖衰退現(xiàn)象，培育抗螨 品系的穩(wěn)定性也不盡人意；病原真菌的應(yīng)用仍受制于更有效品系的篩選、蜂巢溫濕度、貯存 方法和施用技術(shù)。因此，養(yǎng)蜂界仍在嚴(yán)重依賴業(yè)已產(chǎn)生抗性和引起殘留的化學(xué)農(nóng)藥防治蜜蜂 害螨?？股睾突瘜W(xué)農(nóng)藥的濫用，已經(jīng)對我們的食品安全和國際貿(mào)易造成巨大的威脅。因此， 養(yǎng)蜂業(yè)急需安全防治蜂螨的替代防治方法，熱切期待環(huán)境友好的蜜蜂螨害防治新技術(shù)。
幾丁質(zhì)酶能夠催化水解幾丁質(zhì)，產(chǎn)生幾丁寡糖或幾丁二糖。在自然界中很多微生物可以 產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶具有廣泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍應(yīng)用；另外，幾 丁質(zhì)酶對殺蟲劑有增效作用，可加速害蟲的致病過程；幾丁質(zhì)酶還可抑制病原真菌的生長。 但是，到目前為止，未發(fā)現(xiàn)利用幾丁質(zhì)酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供了一種具有殺狄斯瓦螨活性的組合幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用，該組合幾丁質(zhì) 酶包括幾丁質(zhì)酶ChiA和幾丁質(zhì)酶ChiB。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)施的
本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌GEI的基因組DNA中克隆出一段基因堿基序列，該基因的編碼 蛋白對狄斯瓦螨具有比較強(qiáng)的毒性，幾丁質(zhì)酶活力為15.9 U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄 斯瓦螨，5天后死亡率為40%。經(jīng)過測序分析表明，該基因的開放讀碼框含有1692個(gè)堿基， 序列如SEQ ID NO.l所示，BLAST分析表明該基因與登錄號為AF454462.1的粘質(zhì)沙雷氏菌 幾丁質(zhì)酶基因c/zM的相似性為96%,由此認(rèn)為該基因?qū)儆趲锥≠|(zhì)酶基因c/z"類別，是一個(gè) 幾丁質(zhì)酶基因c/z"類的新序列，推測其編碼的幾丁質(zhì)酶ChiA為61.09KDa。
應(yīng)用同樣的方法本發(fā)明人從粘質(zhì)沙雷氏菌&/ra"a mwce;ycera GEI的基因組DNA中克隆 出一段基因堿基序列，應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達(dá)該基因，對該基因 的編碼蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性、生物測定表明，該基因的編碼蛋白對狄斯瓦螨具有比較強(qiáng)的毒 性，該蛋白酶活力為14.5 U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40%。 經(jīng)過測序分析表明，該基因的開放讀碼框含有1500個(gè)堿基，序列如SEQ ID N0.2所示，BLAST 分析表明該基因與登錄號為Z36295.1的粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因c/ '5的相似性為96%， 由此認(rèn)為該基因?qū)儆趲锥≠|(zhì)酶基因c/z詔類別，是一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因c/z/5類的新序列，推測 其編碼的幾丁質(zhì)酶ChiB為55.53kDa。
本發(fā)明還通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶ChiA與ChiB在殺狄斯瓦螨時(shí)候，兩者具有協(xié)同效應(yīng)， 當(dāng)幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB組合使用的時(shí)候，其表現(xiàn)的對狄斯瓦螨毒性比單獨(dú)使用任一種幾丁 質(zhì)酶ChiA或者ChiB都高，對狄斯瓦螨具有高致死率。將上述幾丁質(zhì)酶ChiA (15.9U/mL) 與幾丁質(zhì)酶ChiB (14.5U/mL)等體積混合后，該組合酶的酶活力達(dá)到34.8 U/mL，沾染該組合酶的狄斯瓦螨，在5天后，蜂螨的死亡率達(dá)到了 93.3%。將上述酶活力的幾丁質(zhì)酶ChiA和 幾丁質(zhì)酶ChiB，按照體積比1: 2和2: 1混合后發(fā)現(xiàn)，其酶活力分別為29.4U/ml和30.2U/ml， 5天后，沾染組合酶的狄斯瓦螨，蜂螨的死亡率分別為83.3%和85.2%。由此可以證明幾丁質(zhì) 酶ChiA和幾丁質(zhì)酶ChiB兩者之間具有協(xié)同作用。在組合酶中，兩種酶的含量比在其他比例 的情況下，協(xié)同作用這種能力是存在的，兩者含量比的關(guān)系與其協(xié)同作用的大小有關(guān)(表征 為組合酶的酶活力和對狄斯瓦螨的致死率)，最佳比例的混合才能使得協(xié)同作用的表征出對狄 斯瓦螨的致死率達(dá)到最高，但是只要兩種酶都同時(shí)存在，該組合酶是具有協(xié)同作用這種能力 的。
本發(fā)明組合幾丁質(zhì)酶的使用可以直接應(yīng)用幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB混合一起作為制劑使 用，也可以將上述兩個(gè)幾丁質(zhì)酶的編碼基因轉(zhuǎn)入同一或者不同的工程菌中、轉(zhuǎn)入蜜蜂中或者 將兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因融合后，在轉(zhuǎn)入目的生物當(dāng)中，表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因，應(yīng)用于狄斯瓦螨的 防治。
本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌Swrar/a wflrce"em GEI中克隆得到的新的幾丁質(zhì)酶ChiB的編碼 基因和幾丁質(zhì)酶ChiA的編碼基因，其編碼蛋白都對狄斯瓦螨具有較高的毒性，在幾丁質(zhì)酶 ChiB活力為14.5U/ml，沾染該酶的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40%，幾丁質(zhì)酶ChiA活力為 15.9U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40%。當(dāng)將幾丁質(zhì)酶ChiA和 幾丁質(zhì)酶ChiB混合后，該組合液表現(xiàn)的對狄斯瓦螨致死率比單獨(dú)使用任一種幾丁質(zhì)酶ChiA 或者ChiB都高。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)對環(huán)境友好的蜜蜂螨害防治新技術(shù)提供了途徑，可廣泛 的應(yīng)用于防治蜜蜂螨害，可以將本發(fā)明幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB的編碼基因轉(zhuǎn)入同一或者不同 的工程菌中、轉(zhuǎn)入蜜蜂中或者將兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因融合后，在轉(zhuǎn)入目的生物當(dāng)中，表達(dá)幾丁 質(zhì)酶基因，應(yīng)用于狄斯瓦螨的防治，從而實(shí)現(xiàn)生物安全防治蜜蜂螨害，克服了化學(xué)藥物的抗 性和殘留等等問題。
本發(fā)明所述的沙雷氏菌GEI w"rc"cem GEI于2009年5月6日，保藏于中國
典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCCM209097。


圖1是從粘質(zhì)沙雷氏菌株&rrartamflrc"cera GEI基因組中擴(kuò)增得到c/ "基因，1. c/z" PCR產(chǎn) 物；M.DL2000DNA Marker;
圖2是從粘質(zhì)沙雷氏菌株warc"cew GEI基因組中擴(kuò)增得到cW萬基因，1. c/ '5 PCR產(chǎn) 物；M.DL2000DNA Marker;
圖3是SDS-PAGE分析幾丁質(zhì)酶ChiA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，1.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)/pET-32a(+)重組菌；3.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)/pET-32a(+)-chiA; 4. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiA重組菌
圖4是SDS-PAGE分析幾丁質(zhì)酶ChiB重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，1.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)重組菌2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)/pET-32a(+)重組菌；3.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiB; 4. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重組菌；
圖5是SDS-PAGE分析復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶ChiA重組蛋白，1. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiA重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiA重組菌的包涵體蛋
白的復(fù)性蛋白；
圖6是SDS-PAGE分析復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶Ch舊重組蛋白，1. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重組菌的包涵體蛋 白的復(fù)性蛋白；
圖7是不同濃度的NGA在A=550nm條件下的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖8是不同濃度的BSA在A=595nm條件下的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖9是幾丁質(zhì)酶ChiA復(fù)性蛋白液、幾r質(zhì)酶ChiB復(fù)性蛋白液以及幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB復(fù) 性蛋白液組合對狄斯瓦螨的毒性測定，A.幾丁質(zhì)酶ChiA; B.幾丁質(zhì)酶ChiB; C.幾丁質(zhì)酶 ChiA和ChiB復(fù)性蛋白液組合(體積比l: 1); D.蛋白溶解液；E.透析液；
具體實(shí)施例子-
以下對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋，但不是對本發(fā)明的限制
本發(fā)明所述的粘質(zhì)沙雷氏菌株5Wr加'fl wflrc^cms GEI是本發(fā)明人從從化中蜂工蜂中腸 中分離得到，此菌于2009年5月6閂，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,地址 中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC M 209097。 一、幾丁質(zhì)酶c/ W、 cWfi基因的克隆和測序。
1. 粘質(zhì)沙雷氏菌株GEI的培養(yǎng)
從LB平板上挑取粘質(zhì)沙雷氏菌單菌落接種至4mLLB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜 (28 °C，200r/min);培養(yǎng)物按3%接種量轉(zhuǎn)接至含lOmL培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶，培養(yǎng) 至OD620 2。
2. 細(xì)菌基因組DNA的提取
常規(guī)試劑盒(TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京TIANGEN公司)提取粘質(zhì)沙雷 氏菌株GEI基因組DNA。
3. 引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)國外已克隆的粘質(zhì)沙雷氏菌的幾丁質(zhì)酶基因c/ L4 (accession number: Z36294.1)序歹J， c/ '￡ (accession number : Z36295.1)序列，以粘質(zhì)沙雷氏菌菌株GEI基因組DNA為模板， 以Primer Premier 5.0和DNASTAR軟件輔助，分別設(shè)計(jì)的引物。
引物序列作用擴(kuò)增片段 長度
引物AFor:5'匿ATGGATCCATGCGCAAATTTAATA-3' Rev: 5'-GCGGCCGCTTATTGAACGCCGGCGC-3，擴(kuò)增1692bp
引物BFor:5，-ATGAATTCATGTCCACACGTAAAGCCGT-3， Rev: 5' -GAGCTCTTACGCTACGCGGCCCACCT-3'擴(kuò)增1500bp
注劃線標(biāo)注的分別是限制性酶切位點(diǎn)￡co/ 1,I,五coJ I, Sac I。 4. PCR擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因、
以粘質(zhì)沙雷氏菌基因組為模板，引物A (引物B)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增cAM (cW5)基 因片段，PCR反應(yīng)體系及循環(huán)設(shè)定如下
ddH20 18.7 |xL
10 x PCR buffer 2.5 |_iL
dNTP Mix (10 mmol/L) 0.5
Primer-for (20 (xmol/L) 1
Primer-rev (20 ,ol/L) 1 (xL
DNA模板 1 jxL Easy-A high fidelity cloning enzyme 0.3
Total volume 25
充分混勻，按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C變性5 min進(jìn)入循環(huán)，94'C變性30 s， 55'C退火30s，72'C延伸1 min 30 s， 30個(gè)循環(huán)后于72°C繼續(xù)延伸10 min。反應(yīng)完成后， 以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，分別回收引物A，弓I物BPCR擴(kuò)增出的目的片段，引 物A擴(kuò)增的目的片段的檢測結(jié)果如圖1所示，引物B擴(kuò)增的目的片段的檢測結(jié)果如圖2所示， 將片段分別命名為cfe4， cWS。
5.回收的基因片段c/7L4， cWS分別與克隆載體的體外連接 膠回收基因片段cW乂、 c/n'S
(1)在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 nL。pMD18-T Vector 1
DNA回收片段 lpL
ddH20 3 jxL
Total volume 25 |tiL
(2) 加入5pL (等量)的Ligation Mix。
(3) 16 'C反應(yīng)30分鐘。
注)①室溫(25°C)也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。 ②5分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。
6. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化co//DH5a感受態(tài)細(xì)胞
(1) 取出1管感受態(tài)細(xì)胞50 hL,于冰上緩慢旋轉(zhuǎn)融化；
(2) 加入10 ^L上一步驟的連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰 浴30min;
(3) 42°C熱休克45 s，不要搖動(dòng)離心管；
(4) 立即將離心管轉(zhuǎn)移到冰上，放置1 min;
(5) 加入450 平衡到室溫的無菌SOC培養(yǎng)基；
(6) 于37°C， 200r/min水平振蕩1 h;
(7) 取25-100 不同體積的菌液鋪于預(yù)熱的LB平板(含有常規(guī)濃度的Amp、 IPTG、 X-Gal)上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
7. 幾丁質(zhì)酶c/zL4、 cW5基因陽性克隆鑒定和測序
在平板上進(jìn)行抗性篩選，挑取經(jīng)PCR初步鑒定的含有與目的片段相同大小的大腸桿菌轉(zhuǎn) 化子，分別命名為pMD18-T-chiA,pMD18-T-ch舊。將上述轉(zhuǎn)化子委托上海英俊生物技術(shù)有限 公司測序。得到幾丁質(zhì)酶A"基因和幾丁質(zhì)酶cWS基因的核苷酸序列，幾丁質(zhì)酶dz"基因 的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，由1692bp的堿基組成，推定編碼蛋白幾丁質(zhì)酶ChiA為 61.09 kDa， BLAST分析表明該基因與登錄號為AF454462.1的粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因 C/z"的相似性為96%,由此認(rèn)為該基因?qū)儆趲锥≠|(zhì)酶c/j"基因類別，是一個(gè)幾丁質(zhì)酶c/zL4 基因類的新序列。幾丁質(zhì)酶c/n'5基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2，所示1500bp的堿基組成， 推定其編碼蛋白幾丁質(zhì)酶ChiB為55.53kDa， BLAST分析表明該基因與登錄號為Z36295.1 的粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因c/n'B的相似性為96%，由此認(rèn)為該基因?qū)儆趲锥≠|(zhì)酶基 因類別，是一個(gè)幾丁質(zhì)酶c/n'3基因類的新序列。二、幾丁質(zhì)酶c/z"、 CWS基因的原核表達(dá)和表達(dá)蛋白的純化、復(fù)性和酶活性測定 1.幾丁質(zhì)酶基因在五.co/!' BL21(DE3)中的表達(dá)
(1) 分別提取重組質(zhì)粒pMD18-T-chiA,pMD18-T-chiB (TIANGEN質(zhì)粒小提取試劑盒，北 京TIANGEN公司)。
(2) 重組質(zhì)粒pMD18-T-chiA，pMD18-T-chiB的酶切，然后膠回收基因片段chiA， chiB。
pMD18-T-chiA建立如下酶切反應(yīng)體系
ddH20
10 x H Buffer
0.1%BSA
pMD18-T-chiA
Sac I
22 (iL 6 |aL 6 (jL 20 3 & 3
Total volume
pMD18-T-chiB建立如下酶切反應(yīng)體系:
ddH20
10 x M Buffer pMD18-T-chiB
■Sac I
60
28
6 |jL 20
3
3
Total volume
60
(3)基因片段chiA, chiB分別與pET-32a(+)表達(dá)載體的連接。
將膠回收的目的基因片段與載體DNA以適當(dāng)?shù)谋壤⑦B接反應(yīng)，以達(dá)到最佳連接效 果。T4DNALigase應(yīng)最后加入，輕輕混勻反應(yīng)體系，16°C連接過夜。反應(yīng)體系如下
10 x T4 DNA Ligase Buffer
pET-32a(+)
基因片段c/z"或
T4 DNA Ligase 5 |xL 5 (iL
1 nL
Total volume 25 |jX
(4) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co//BL21(DE3)。
(5) 大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的陽性克隆鑒定。 對長出的轉(zhuǎn)化子應(yīng)用引物A或者引物B進(jìn)行快速PCR篩選，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢
測擴(kuò)增結(jié)果，在合適大小處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶的樣品即為陽性克隆，分別獲得轉(zhuǎn)入基因片段&"的￡. co/!'BL21(DE3)陽性克隆，命名為BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA，獲得轉(zhuǎn)入基因 片段c&5的￡. co/z'BL21(DE3)陽性克隆命名為BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB。
(6) 分別用IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA和BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB的目的蛋
白的大量表達(dá)。
取活化后的重組大腸桿菌培養(yǎng)物(BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA或者 BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB)，按3%比例接種至新鮮LB (Car"培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 為0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L， 37°C， 200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。
(7) 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
取0.2 mL上述誘導(dǎo)后發(fā)酵液至1.5 mL潔凈離心管中，離心得菌體，加入50 pL雙蒸水 與50 pL 2xSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，沸水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測幾 丁質(zhì)基因c/z^和AW在大腸桿菌中的表達(dá)，檢測結(jié)果如圖3和圖4所示，經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo) BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA表達(dá)了幾丁質(zhì)酶ChiA， BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB表達(dá)了幾丁 質(zhì)酶ChiB。
對照為轉(zhuǎn)入空載體pET-32a ( + )的BL21 (DE3)菌(未用IPTG誘導(dǎo)和用IPTG 誘導(dǎo))，以及未用IPTG誘導(dǎo)的克隆子pET-32a(+)-chiA禾Q pET-32a(+)-chiB，由于載體 pET-32a(+)其自帶編碼一個(gè)20.4 kDa的蛋白標(biāo)簽，因此經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)的克隆子 pET-32a(+)-chiA的表達(dá)蛋白大概為81.5kDa， pET-32a(+)-chiB的表達(dá)蛋白大概為75.93 kDa， 如圖3、圖4所示，克隆子pET-32a(+)-chiA和pET-32a(+)-chiB經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了幾 丁質(zhì)酶ChiA和ChiB，而其他三個(gè)對照沒有表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB。 2.重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiA, ChiB的純化和復(fù)性
因?yàn)楸磉_(dá)的重組蛋白在大腸桿菌中是以不溶性的包涵體形式存在，而包涵體往往是沒有 生物活性的，所以需要對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性。Invitrogen公司的蛋白復(fù)性試劑盒(Protein RefordingKit)能夠在弱酸性條件下溶解大腸桿菌中的包涵體重組蛋白，并在中性的環(huán)境中對 溶解的蛋白透析兩次第一次利用加入還原劑的透析液促使蛋白二硫鍵的正確形成，第二次 除去多余的還原劑。蛋白復(fù)性試劑盒已經(jīng)成功的應(yīng)用于細(xì)菌的堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、 綠色熒光蛋白和葡糖苷酸酶的重組蛋白。具體過程如下
1)制備包涵體
① 取上述含目的蛋白(幾丁質(zhì)酶ChiA或者幾丁質(zhì)酶ChiB)菌液，4'C， 6500rpm離心 15min，棄上清；
② 將沉淀完全重懸于0.1倍菌液體積的lxIB洗滌液，反復(fù)混勻；
③ 在細(xì)胞裂解的過程中將重懸的溶液置于冰上以防止蛋白受熱裂解，可選擇超聲波裂解或French Press法裂解細(xì)胞。其中超聲波裂解細(xì)胞是更廣泛應(yīng)用的一種方法，但利用 此方法細(xì)胞的裂解率較低，并且液不適用于大量細(xì)胞的裂解(超出50 g)。無論選擇 何種方法，都必須將細(xì)胞置于冰上； 細(xì)胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制劑，每40 mL混和液加入5mL的含有 EDTA的蛋白酶抑制劑Cocktail Set II或lmL的蛋白酶抑制劑Cocktail Set III (選 做)；
10000 rpm離心lOmin收集包涵體；
棄上清，將沉淀(內(nèi)有包涵體)用0.1倍菌液體積的1 xIB洗滌液完全重懸；
⑦ 重復(fù)步驟5收集沉淀；
⑧ 將上述沉淀再次用0.1倍菌液體積的1 x IB洗滌液完全重懸，并將重懸液轉(zhuǎn)移至重 量已知的干凈的離心管中；
⑨ 10000rpm離心10min收集包涵體，棄上清，并將離心管倒置在紙巾上以完全除去 多余的液體；
⑩ 離心管稱重，減去管中以得到包涵體的凈重。 一般來說，OD600為3時(shí)收集的菌液， 并且不溶性蛋白在細(xì)胞中的含量為10-40%時(shí)，每毫升菌液中有l(wèi)-4mg的包涵體。
2)蛋白的溶解和重新折疊
①根據(jù)包涵體的重量計(jì)算所需的溶解液量，溶解包涵體使其在溶解液中的濃度為10-20 mg/ml，溶解液按如下配方在室溫下配制
10 x IB Solubilization buffer 5 mL
ddH20 44.5 mL
30% N-lauroylsarcosine 0.5 mLDTT 50
Total 50 mL
② 將配制的溶解液加入收集有包涵體的離心管中，輕微混和。大的片斷用槍頭反復(fù)打 碎；
③ 室溫靜置15min;
室溫10000 rpm離心10 min離心，轉(zhuǎn)移上清(內(nèi)有溶解蛋白)于干凈的離心管中 (避免碎片)。
3)透析
①透析袋處理，過程如下
a把透析袋剪成適當(dāng)長度(10-20 cm)的小段；b 在大體積的2% (W/V)碳酸氫鈉和lmmol/LEDTA (pH8.0)中將透析袋煮 沸10min;
C 用蒸餾水徹底清洗透析袋；
d 放在lmmol/LEDTA (pH8.0)中將之煮沸10min。
冷卻后，存放于4'C，
必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋必須戴手套； e用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈；
② 準(zhǔn)備透析液(為樣品的50倍，如樣品量為15mL，則需透析液750 mL，因透析兩 次故共需透析液1.5 L)，按以下配方配制
50 x IB dialysis Buffer 30 mL
ddH20 1.5 L
(1MDTT ) 150
③ 4°C透析至少3h以上，換新的透析液繼續(xù)透析3h以上； 按上步驟制備透析液，但不加DTT;
⑤用不加DTT的透析液再透析一次。 4)氧化還原以促使二硫鍵的形成
為促使蛋白的二硫鍵的正確形成，可以在透析液中加入氧化劑和還原劑繼續(xù)透析，經(jīng) 常用的氧化還原劑為氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽，比較經(jīng)濟(jì)的方法是使用CuS04或 NaSe03,但使用這種方法所形成的不正確的二硫鍵比前者高。因此本論文中使用氧化性谷胱 甘肽和還原性谷胱甘肽。
① 如上制備透析液，但加入氧化還原劑，于4°C保存(其中還原性谷胱甘肽和氧化性 谷胱甘肽的濃度分別為ImM和0.2 mM);
② 繼續(xù)于4°C透析蛋白過夜；
③ 如有必要，繼續(xù)于室溫或37°C透析蛋白以提高二硫鍵的形成率，最后得到復(fù)性蛋白 液。
另有一種替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽的濃縮液，并直接加 到目標(biāo)蛋白中，反應(yīng)后透析再除去多余的氧化還原劑.
復(fù)性完成后對復(fù)性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖5、圖6所示，表明復(fù)性蛋白是較
純的幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB。
3.酶活性的測定方法。
酶活力測定采用改良的還原糖法，其原理為可溶性殼聚糖酶解后釋放出還原糖，還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑反應(yīng)變色，于分光光度計(jì)550 nm處測定其光吸收值，以N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)為標(biāo)準(zhǔn)糖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活力(單位U)定義為在37 'C反應(yīng)條件下，每分鐘釋放lpg還原糖所需要的酶量 為l個(gè)酶活力單位(U/mL)。 (l)NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取7支25mL刻度的試管，按表加入各種試劑，振蕩混勻，在沸水浴加熱10min，隨即 放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加20mL水稀釋，混勻，在550nm波長下測OD值。以 OD550值為縱坐標(biāo)，NAG量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。
管號0123456
NAG標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.20.40.60.81.01.2
蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.8
DNS試劑(ml)3.03.03.03.03.03.03.0
相當(dāng)NAG量(mg)00,20.40.60.81.01.2
(2) 樣品處理測定取25 mL試管加入1 mL膠體幾丁質(zhì)和1 mL復(fù)性蛋白(幾丁質(zhì)酶ChiA、 幾丁質(zhì)酶ChiB或者ChiA和ChiB的組合(體積比l: 1、 1: 2、 2: 1)，振蕩混均后于 37 X:水浴中反應(yīng)10min，立即進(jìn)入沸水浴1 min滅活，冷卻至室溫；加入3.0 mLDNS 試劑，振蕩混勻，沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，于分光光度計(jì)550 nm處測定光吸 收值，對照NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖含量，折算成酶活力單位，重復(fù)三次。測試結(jié) 果表明含有幾丁質(zhì)酶ChiA的蛋白復(fù)性液的酶活為15.9U/ml，含有幾丁質(zhì)酶ChiB的蛋 白復(fù)性液的酶活為14.5 U/ml，按體積比1: 1、 1: 2、 2: 1混合的幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB 的組合液的酶活分別為34.8U/ml、 29.4 U/ml、 30.2 U/ml。
(3) 各種試劑的制備
酶活力測試的NAG標(biāo)準(zhǔn)液為1 mg/mL，制備方法稱O.lg N-乙酰葡萄糖胺于適量水中 溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容，即得lmg/mL標(biāo)液。
酶活力測試的DNS試劑的制備方法取3， 5-二硝基水楊酸6.3 g，加入2 mol/L的NaOH 溶液262 mL加至500 mL含185 g酒石酸鉀的熱水中，再加入結(jié)晶酚和亞硫酸鈉各5 g，攪拌 混勻加蒸餾水定容至1000 mL。
酶活力測試的膠體幾丁質(zhì)的制備方法在1(TC下，將幾丁質(zhì)5g放入研缽中，加丙酮40 mL研磨10min。邊研磨邊緩緩加入預(yù)冷濃HC1 200 mL，充分研磨，使呈糊狀，于4。C放置 24 h。用玻璃棉過濾，將濾液緩緩加入到盛有1000 mL 50%乙醇(v/v)的燒杯中，邊加邊劇烈攪拌，然后靜置，待膠體幾丁質(zhì)析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)。用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾 丁質(zhì)至pH7，以蒸餾水定容至500mL,冷藏備用。
復(fù)性蛋白的SDS-PAGE分析和酶活測定表明，幾丁質(zhì)酶ChiA和幾丁質(zhì)酶ChiB的編碼基 因表達(dá)了幾丁質(zhì)酶，并且經(jīng)過復(fù)性，得到了具有活性的幾丁質(zhì)酶ChiA和幾丁質(zhì)酶ChiB。 4.復(fù)性蛋白的濃度測定
本論文利用考馬斯亮藍(lán)法對蛋白的濃度進(jìn)行測定，具體過程如下
(1) 在離心管中分別加入0.5mg/mL的BSA5pL、 10 pL、 15 pL、 20 pL，以0.15 mM/L 的NaCl補(bǔ)足至200 nL，以200 pL的0.15mM/L的NaCl作為空白對照；
(2) 每管加入2mL考馬斯亮藍(lán)G-250，振蕩混勻，室溫放置2 min;
(3) 用lcm光徑的比色杯測BSA的A595，用A595對BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度作圖并繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4) 取50 nL的待測蛋白稀釋為2mL并測定其八595，利用BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測蛋 白的濃度。
利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的濃度，并繪制BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，計(jì)算后幾丁 質(zhì)酶A的復(fù)性蛋白濃度為2.05嗎年L，幾丁質(zhì)酶B的復(fù)性蛋白濃度為1.95pg爾L。 三、重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiA， ChiB對蜜蜂狄斯瓦螨的毒殺作用測定。
將上述步驟二中得到的重組表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiA， ChiB的復(fù)性蛋白液，分別測定以下 五種方式的復(fù)性蛋白液對蜜蜂狄斯瓦螨的毒殺作用(l)幾丁質(zhì)酶ChiA的復(fù)性蛋白液；(2)幾 丁質(zhì)酶ChiB的復(fù)性蛋白液；(3)幾丁質(zhì)酶ChiA復(fù)性蛋白液和幾丁質(zhì)酶Ch氾復(fù)性蛋白液，按 體積比1: 1混合的組合液；(4)幾丁質(zhì)酶ChiA復(fù)性蛋白液和幾丁質(zhì)酶ChiB復(fù)性蛋白液，按 體積比l: 2混合的組合液；(5)幾丁質(zhì)酶ChiA復(fù)性蛋白液和幾丁質(zhì)酶ChiB復(fù)性蛋白液，按 體積比2: l混合的組合液； 1.生物測定的方法如下
參照(TsagoueM/.,2004)的方法，并有所修改。
(1) 從被大蜂螨感染的意蜂蜂群中取回巢脾，盡量從多個(gè)蜂箱中取。
(2) 采集蜂螨的方法用鑷子打開巢脾上的蜂房，用毛筆或者小刷子輕輕從幼蟲和蛹上收集
大蜂螨。
(3) 準(zhǔn)備9 cm的一次性培養(yǎng)皿，并在底部各鋪一張滅好菌的濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中放4只工 蜂的白眼蛹作為大蜂螨的食物來源。
(4) 將收集到的大蜂螨放入培養(yǎng)皿中(一個(gè)培養(yǎng)皿中放20頭)收集到后的一個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行領(lǐng)啶。(5) 測定時(shí)采用浸泡的方法用毛筆尖挑起蜂螨，并將蜂螨完全浸沒在lmL的幾丁質(zhì)酶復(fù) 性蛋白溶液(1.5mL離心管)中10 s，處理完畢后將蜂螨放回裝有蜂蛹作為食物的培養(yǎng) 皿中飼養(yǎng)。
(6) 如果在處理的過程中發(fā)生蜂螨死亡的情況，則將該蜂螨棄去不用。每個(gè)處理重復(fù)3次。
(7) 對照組使用蛋白溶解液，透析液處理大蜂螨，重復(fù)3次。
(8) 培養(yǎng)皿置于黑暗的培養(yǎng)箱(RQH — Ol人工氣候箱)中，溫度和濕度控制在32°C， 80%RH。
(9) 每天記錄和觀察大蜂螨的存活情況。使用毛筆尖刺激螨，如果螨對刺激沒有反應(yīng)，則認(rèn) 為螨己經(jīng)死亡。如果發(fā)現(xiàn)蜂蛹有死亡的情況也要及時(shí)更換。
2.生物測定的結(jié)果如下
幾丁質(zhì)酶的活力測定數(shù)據(jù)顯示，幾丁質(zhì)酶ChiA, ChiB活力分別為15.9U/mL， 14.5 U/mL， 當(dāng)幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB組合時(shí)，幾丁質(zhì)酶的活力提高了很多，體積比為l: l的情況下達(dá) 到了 34.8 U/ml，體積比為1: 2禾P 2: 1其酶活分別達(dá)到了 29.4U/ml和30.2U/ml。對螨進(jìn)行 的生物測定結(jié)果顯示(圖9)，當(dāng)單獨(dú)施用幾丁質(zhì)酶ChiA, ChiB處理蜂螨時(shí)(幾丁質(zhì)酶活力 分別為15.9 U/mL， 14.5 U/mL)， 5天后蜂螨的死亡率分別為40%， 40%。當(dāng)測定幾丁質(zhì)酶ChiA 和ChiB按照體積比l: 1 (34.8 U/mL)、 1: 2 (29.4U/ml)、 2: 1 G0.2U/ml)組合后，在5 天后，蜂螨的死亡率分別達(dá)到了 93.3%、 83.3%和85.2%，組合酶與單獨(dú)使用幾丁質(zhì)酶(ChiA 或者ChiB)相比差異顯著，說明幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB協(xié)同效應(yīng)，其組合后的幾丁質(zhì)酶活力 和殺螨能力得到了顯著的提高，因此如果將本發(fā)明所述的幾丁質(zhì)酶ChiA， ChiB的編碼基因 轉(zhuǎn)入同一或者不同的工程菌中、轉(zhuǎn)入蜜蜂中，或者將兩種幾丁質(zhì)酶融合后轉(zhuǎn)入工程菌或者蜜 蜂等目標(biāo)生物當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)兩種酶同時(shí)被用于防治蜜蜂的螨害，從而達(dá)到安全、高效的防治螨 害。序列表
<110>廣東省昆蟲研究所
<120>具有殺狄斯瓦螨活性的組合幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211>1692
<212>DNA
<213>粘質(zhì)沙雷氏菌(5^ra"a wc^c^ce似GEI)
<220>
<221>CDS
<222> (1) ...(1692)
<400>1
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<211>1500
<212>DNA
<213>粘質(zhì)沙雷氏菌(5"e/rafe 顏rcesce"s GEI)
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<222〉 (1).,.(1500)
<400>2
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tacatcacctctgcgccgggttcagacagcgcctggctgaaggtgggccgcgtagcgtaa1500
權(quán)利要求
1.一種具有殺狄斯瓦螨(Varroa destructor Anderson&amp;Trueman)活性的組合幾丁質(zhì)酶，其特征在于該組合幾丁質(zhì)酶含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列編碼的幾丁質(zhì)酶ChiA和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列編碼的幾丁質(zhì)酶ChiB。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶ChiA酶活力為15.9 U/mL，所述的幾丁質(zhì)酶ChiB的酶活力為14.5U/mL，所述的組合幾丁質(zhì)酶是上述幾丁質(zhì) 酶ChiA與幾丁質(zhì)酶ChiB的按照體積比為1: 2~2: 1混合而成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的組合幾丁質(zhì)酶是幾丁質(zhì)酶ChiA 和幾丁質(zhì)酶ChiB按照體積比1: 1混合而成。
4. 權(quán)利要求1所述的組合幾丁質(zhì)酶在殺狄斯瓦螨中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有殺狄斯瓦螨活性的組合幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用，該組合幾丁質(zhì)酶包括幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB。本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌GEI的基因組DNA中克隆出一段基因堿基序列，應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達(dá)該基因，對該基因的編碼蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性、生物測定表明，該蛋白對狄斯瓦螨具有毒性，幾丁質(zhì)酶活力為14.5U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40％。經(jīng)過測序分析表明，該基因是一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因chiB的新序列。應(yīng)用同樣的方法克隆到一個(gè)對狄斯瓦螨具有毒性的幾丁質(zhì)酶基因chiA類的新序列，實(shí)驗(yàn)證實(shí)幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB之間具有協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明可組合用于蜜蜂的螨害防治。
文檔編號C12N9/42GK101613685SQ20091003964
公開日2009年12月30日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者爽 涂, 韓日疇 申請人:廣東省昆蟲研究所