專利名稱：具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質(zhì)酶ChiB及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質(zhì)酶ChiB，及其在 殺狄斯瓦螨中的應(yīng)用。
技術(shù)背景-
蜜蜂寄生螨一直是世界養(yǎng)蜂業(yè)最主要的危害之一，在全球范圍危害，目前除澳大利亞、 非洲部分地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨 (俗稱大蜂螨)(J^roo(fifes/rM"w Anderson & Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼蟲的體液，造成蜜 蜂體質(zhì)下降，蜂群群勢(shì)衰弱；此外，蜂螨還傳播蜜蜂細(xì)菌和病毒病害。據(jù)報(bào)道，最近在美國(guó) 等國(guó)出現(xiàn)的蜜蜂蜂群崩潰失調(diào)病(CCD)也與蜂螨的危害有關(guān)。每年我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)僅蜂螨造成 的直接損失就達(dá)到幾個(gè)億人民幣，而且因防治蜂螨使用藥物造成蜂產(chǎn)品污染的間接損失更是 不可估量。
目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3種(l)物理機(jī)械法如蜂群的熱處理；(2) 化學(xué)防治法如使用殺螨劑如有機(jī)酸和香精等；(3)生物技術(shù)防治法包括蜜蜂飼養(yǎng)管理技
術(shù)。但是目前使用最廣泛的主要還是用藥物來(lái)防治大蜂螨，其中使用最為普遍的是一種以擬
除蟲菊酯類農(nóng)藥-氟胺氰菊酯為主要原料的殺螨劑"螨撲"(Apistan)。不可否認(rèn)，藥物治螨起 了一定的積極作用。但是，連續(xù)和大范圍使用導(dǎo)致的污染和抗藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。顯然單 靠藥物治螨是不夠的，還必須尋找其它途徑來(lái)防治蜂螨。
一些生物防治技術(shù)已應(yīng)用于防治蜂螨，如(l)割除雄蜂房法自從西方蜜蜂身體上發(fā)現(xiàn)
蜂螨，也發(fā)現(xiàn)蜜蜂對(duì)于蜂螨有清除行為，并可減輕蜂螨對(duì)蜂群所造成的危害。與此同時(shí)，養(yǎng) 蜂工作者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，減弱蜂螨對(duì)蜂群所造
成的危害。(2)使用抗螨除蟲多功能巢礎(chǔ)利用蜂螨繁殖于封蓋房，寄生于蜂體上這一生物
學(xué)特性，直接把殺螨藥物藏于蜂房中，阻斷蜂螨幼蟲在雄蜂房中正常羽化成成螨，從而達(dá)到
殺滅蜂螨這一目的。(3)人工選育抗螨新品種中華蜜蜂對(duì)于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群 內(nèi)雖曾發(fā)現(xiàn)蜂螨，但未給蜂群造成危害。而且西方蜜蜂對(duì)于蜂螨也有一定的清理行為，養(yǎng)蜂 工作者可以在蜂群中選擇對(duì)蜂螨有較強(qiáng)清理行為的蜜蜂為種群，定向培育抗螨性強(qiáng)的蜂群， 包括蜜蜂營(yíng)養(yǎng)雜交(又稱為蜜蜂無(wú)性雜交)。(4)利用病原真菌綠僵菌(AfetoA&WW am'犯; /Zfle)和Ao附;wom7對(duì)大蜂螨具有一定的防治效果。
但是，這些措施對(duì)蜂螨的控制效果并不令人滿意，如割除雄蜂房法很難徹底消除螨害；由于長(zhǎng)期以來(lái)自養(yǎng)自繁的養(yǎng)蜂模式導(dǎo)致的蜜蜂嚴(yán)重混雜退化和近親繁殖衰退現(xiàn)象，培育抗螨 品系的穩(wěn)定性也不盡人意；病原真菌的應(yīng)用仍受制于更有效品系的篩選、蜂巢溫濕度、C存 方法和施用技術(shù)。因此，養(yǎng)蜂界仍在嚴(yán)重依賴業(yè)己產(chǎn)生抗性和引起殘留的化學(xué)農(nóng)藥防治蜜蜂 害螨?？股睾突瘜W(xué)農(nóng)藥的濫用，已經(jīng)對(duì)我們的食品安全和國(guó)際貿(mào)易造成巨大的威脅。因此， 養(yǎng)蜂業(yè)急需安全防治蜂螨的替代防治方法，熱切期待環(huán)境友好的蜜蜂螨害防治新技術(shù)。
幾丁質(zhì)酶能夠催化水解幾丁質(zhì)，產(chǎn)生幾丁寡糖或幾丁二糖。在自然界中很多微生物可以 產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶具有廣泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍應(yīng)用；另外，幾 丁質(zhì)酶對(duì)殺蟲劑有增效作用，可加速害蟲的致病過(guò)程；幾丁質(zhì)酶還可抑制病原真菌的生長(zhǎng)。 但是，到目前為止，未發(fā)現(xiàn)利用幾丁質(zhì)酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種具有殺狄斯瓦螨活性幾丁質(zhì)酶ChiB，其編碼基因?yàn)閏fe'S及 幾丁質(zhì)酶ChiB在殺狄斯瓦螨中的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)施的
本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌wflrcesce/w GEI的基因組DNA中克隆出一段基因堿基序 列，應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達(dá)該基因，對(duì)該基因的編碼蛋白進(jìn)行純 化、復(fù)性、生物測(cè)定表明，該基因的編碼蛋白對(duì)狄斯瓦螨具有比較強(qiáng)的毒性，該蛋白酶活力 為14.5U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40%。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析表明， 該基因的開放讀碼框含有1500個(gè)堿基，序列如SEQ ID NO.l所示，BLAST分析表明該基因 與登錄號(hào)為Z36295.1的粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因^/￡的相似性為96%，由此認(rèn)為該基因 屬于幾丁質(zhì)酶基因AW類別，是一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因A/S類的新序列，推測(cè)其編碼的幾丁質(zhì) 酶ChiB為55.53kDa。
本發(fā)明所述的幾丁質(zhì)酶ChiB由于具有殺狄斯瓦螨的活性，可以作為一種制劑使用，或者 將該幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入對(duì)環(huán)境無(wú)害的工程菌中，或者轉(zhuǎn)入蜜蜂中，來(lái)防治蜜蜂的螨害。
本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌&/7Ym'" m^r^cem GEI中克隆得到的新的幾丁質(zhì)酶ChiB的編碼 基因，其編碼蛋白都對(duì)狄斯瓦螨具有較高的毒性，在幾丁質(zhì)酶ChiB活力為14.5U/ml，沾染 該酶的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40°/。，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境友好的蜜蜂螨害防治新 技術(shù)提供了途徑，將本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶作為一種制劑或者該幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入對(duì)環(huán)境無(wú)害的 工程菌中，或者轉(zhuǎn)入蜜蜂中，從而實(shí)現(xiàn)安全、無(wú)毒的生物防治蜜蜂螨害提供了途徑。
本發(fā)明所述的沙雷氏菌GEI Serrato warcwcera GEI于2009年5月6日，保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址中國(guó)武漢市武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCCM209097。


基因組中擴(kuò)增得到c/z/S基因，1. c/z^ PCR產(chǎn) 物；M.DL2000DNA Marker;
圖2是SDS-PAGE分析幾丁質(zhì)酶ChiB重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，1.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)/pET-32a(+)重組菌；3.未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiB; 4. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重組菌；
圖3是SDS-PAGE分析復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶ChiB重組蛋白，1. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiB重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重組菌的包涵體蛋
白的復(fù)性蛋白；
圖4是不同濃度的NGA在A=550nm條件下的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖5是不同濃度的BSA在A=595nm條件下的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖6幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)酶ChiB復(fù)性蛋白液對(duì)狄斯瓦螨的毒性測(cè)定，A.幾丁質(zhì)酶ChiB; B.蛋白 溶解液；C.透析液；
具體實(shí)施例子
以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋，但不是對(duì)本發(fā)明的限制
本發(fā)明所述的粘質(zhì)沙雷氏菌株Se/ra"a ma/r^ce似GEI是本發(fā)明人從從化中蜂工蜂中腸 中分離得到，此菌于2009年5月6日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址 中國(guó)武漢市武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCCM209097。 一、幾丁質(zhì)酶c/zW基因的克隆和測(cè)序。
1. 粘質(zhì)沙雷氏菌株GEI的培養(yǎng)
從LB平板上挑取粘質(zhì)沙雷氏菌單菌落接種至4mLLB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜 (28 'C,200r/min);培養(yǎng)物按3%接種量轉(zhuǎn)接至含10 mL培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶，培養(yǎng) 至OD620-2。
2. 細(xì)菌基因組DNA的提取
常規(guī)試劑盒(TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京TIANGEN公司)提取粘質(zhì)沙雷 氏菌株GEI基因組DNA。
3. 引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)國(guó)外已克隆的粘質(zhì)沙雷氏菌的幾丁質(zhì)酶基因c/ '5 (accessionnumber :Z36295.1)序 列，以粘質(zhì)沙雷氏菌菌株GEI基因組DNA為模板，以Primer Premier 5.0禾tl DNASTAR軟 件輔助，分別設(shè)計(jì)的引物。引物序列作用擴(kuò)增片段 長(zhǎng)度
引物BFor: 5 ， -ATGAATTC ATGTCCACACGTAAAGCCGT-3' Rev: 5'-GAGCTCTTACGCTACGCGGCCCACCT-3'擴(kuò)增1500bp
注劃線標(biāo)注的分別是限制性酶切位點(diǎn)￡C0/ I, I。
4. PCR擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因
以粘質(zhì)沙雷氏菌基因組為模板，引物B，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因片段，PCR反應(yīng) 體系及循環(huán)設(shè)定如下
ddH20 18.7
10 x PCR buffer 2.5
■P Mix (10 mmol/L) 0.5
Primer-for (20 (amol/L) 1 (jL
Primer-rev (20 |xmol/L) 1 [jL
DNA模板 1 fjL Easy-A high fidelity cloning enzyme 0.3
Total volume 25 |tiL
充分混勻，按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C變性5 min進(jìn)入循環(huán)，94'C變性30 s， 55°C退火30 s, 72°C延伸1 min 30 s， 30個(gè)循環(huán)后于72°C繼續(xù)延伸10min。反應(yīng)完成后， 以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，回收用引物B PCR擴(kuò)增出的目的片段，引物B擴(kuò)增 的目的片段的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，將片段分別命名為chiB。 5.回收的基因片段chiB與克隆載體的體外連接
膠回收基因片段ch氾，然后與克隆載體pMD18-T Vector連接
(1)在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 pL。
pMDl8陽(yáng)T Vector 1
DNA回收片段 1 |iL
ddH20 3 )iL
Total volume 25
(2) 加入5pL (等量)的Ligation Mix。
(3) 16 'C反應(yīng)30分鐘。注)①室溫(25°C)也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。 ②5分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。
6. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化co"DH5a感受態(tài)細(xì)胞
(1) 取出1管感受態(tài)細(xì)胞50|aL，于冰上緩慢旋轉(zhuǎn)融化；
(2) 加入IO nL上一步驟的連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰 浴30min;
(3) 42°C熱休克45 s，不要搖動(dòng)離心管；
(4) 立即將離心管轉(zhuǎn)移到冰上，放置1 min;
(5) 加入450 pL平衡到室溫的無(wú)菌SOC培養(yǎng)基；
(6) 于37°C, 200r/min水平振蕩1 h;
(7) 取25-100 不同體積的菌液鋪于預(yù)熱的LB平板(含有常規(guī)濃度的Amp、 IPTG、 X-Gal)上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
7. 幾丁質(zhì)酶c/u'S基因陽(yáng)性克隆鑒定和測(cè)序
在平板上進(jìn)行抗性篩選，挑取經(jīng)PCR初步鑒定的含有與目的片段相同大小的大腸桿菌轉(zhuǎn) 化子，命名為轉(zhuǎn)化子pMD18-T-chiB。將上述轉(zhuǎn)化子委托上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。得 到幾丁質(zhì)酶c/n'5基因的核苷酸序列，幾丁質(zhì)酶c/^基因的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示， 由1500bp的堿基組成，推定其編碼蛋白幾丁質(zhì)酶ChiB為55.53kDa， BLAST分析表明該基 因與登錄號(hào)為Z36295.1的粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因c/2/萬(wàn)的相似性為9611/。，由此認(rèn)為該基 因?qū)儆趲锥≠|(zhì)酶cWB基因類別，是一個(gè)幾丁質(zhì)酶c/h'B基因的新序列。 二、幾丁質(zhì)酶cW5基因的原核表達(dá)和表達(dá)蛋白的純化、復(fù)性和酶活性測(cè)定 1.幾丁質(zhì)酶基因cW5在￡. co/z' BL21(DE3)中的表達(dá)
(1) 提取重組質(zhì)粒pMD18-T-chiB (TIANGEN質(zhì)粒小提取試劑盒，北京TIANGEN公司)。
(2) 重組質(zhì)粒pMD18-T-chiB的酶切，然后膠回收基因片段chiB。
pMD18-T-chiB建立如下酶切反應(yīng)體系
ddH20 28
10 xM Buffer 6pL
pMD18-T-chiB 20
￡boi I 3 |iL
Sac I 3 (xL
Total volume 60 |_iL
(3)基因片段chiB與pET-32a(+)表達(dá)載體的連接。將膠回收的目的基因片段與載體DNA以適當(dāng)?shù)谋壤⑦B接反應(yīng)，以達(dá)到最佳連接效
果。T4DNALigase應(yīng)最后加入，輕輕混勻反應(yīng)體系，16°C連接過(guò)夜。反應(yīng)體系如下
10 x T4 DNA Ligase Buffer 18.5 |aL
pET-32a(+) 0.5 iiL
基因片段chiB 5 nL
T4 DNA Ligase 1 |jL
Total volume 25 |aL
(4) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. co//BL21(DE3)。
(5) 大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性克隆鑒定。 對(duì)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子應(yīng)用引物B進(jìn)行快速PCR篩選，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，
在合適大小(1500bp)處出現(xiàn)特異性擴(kuò)増條帶的樣品即為陽(yáng)性克隆，獲得轉(zhuǎn)入基因片段cWS的 ￡ <:0//8]^21(0￡3)陽(yáng)性克隆命名為BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB。
(6) 用IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3)/pET-32a(+)-ch氾的目的蛋白的大量表達(dá)。 取活化后的重組大腸桿菌培養(yǎng)物(BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB),按3%比例接種至新鮮
LB (CW)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6oo為0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L， 37°C， 200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。
(7) 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
取0.2 mL上述誘導(dǎo)后發(fā)酵液至1.5 mL潔凈離心管中，離心得菌體，加入50 雙蒸水 與50 ^L2xSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，沸水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)幾 丁質(zhì)基因c/z/5在大腸桿菌中的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過(guò)IPTG的誘導(dǎo) BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB表達(dá)了幾丁質(zhì)酶ChiB。
對(duì)照為轉(zhuǎn)入空載體pET-32a ( + )的BL21 (DE3)菌(未用IPTG誘導(dǎo)和用IPTG 誘導(dǎo))，以及未用IPTG誘導(dǎo)的克隆子pET-32a(+)-chiB，由于載體pET-32a(+)其自帶編碼一 個(gè)20.4 kDa的蛋白標(biāo)簽，因此經(jīng)過(guò)IPTG的誘導(dǎo)的克隆子pET-32a(+)-ch舊的表達(dá)蛋白大概為 75.93 kDa，如圖2所示，克隆子pET-32a(+)-chiB經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了幾丁質(zhì)酶Ch氾， 而其他三個(gè)對(duì)照沒有表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiB。 2.重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiB的純化和復(fù)性
因?yàn)楸磉_(dá)的重組蛋白在大腸桿菌中是以不溶性的包涵體形式存在，而包涵體往往是沒有 生物活性的，所以需要對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性。Invitrogen公司的蛋白復(fù)性試劑盒(Protein RefordingKit)能夠在弱酸性條件下溶解大腸桿菌中的包涵體重組蛋白，并在中性的環(huán)境中對(duì) 溶解的蛋白透析兩次第一次利用加入還原劑的透析液促使蛋白二硫鍵的正確形成，第二次除去多余的還原劑。蛋白復(fù)性試劑盒已經(jīng)成功的應(yīng)用于細(xì)菌的堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、 綠色熒光蛋白和葡糖苷酸酶的重組蛋白。具體過(guò)程如下
1) 制備包涵體
① 取上述含目的蛋白(幾丁質(zhì)酶ChiB)誘導(dǎo)菌液，4。C， 6500 rpm離心15 min，棄上 清；
② 將沉淀完全重懸于0.1倍菌液體積的lxIB洗滌液，反復(fù)混勻；
③ 在細(xì)胞裂解的過(guò)程中將重懸的溶液置于冰上以防止蛋白受熱裂解，可選擇超聲波裂解 或French Press法裂解細(xì)胞。其中超聲波裂解細(xì)胞是更廣泛應(yīng)用的一種方法，但利用 此方法細(xì)胞的裂解率較低，并且也不適用于大量細(xì)胞的裂解(超出50 g)。無(wú)論選擇 何種方法，都必須將細(xì)胞置于冰上；
細(xì)胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制劑，每40mL混和液加入5mL的含有 EDTA的蛋白酶抑制劑Cocktail Set II或lmL的蛋白酶抑制劑Cocktail Set III (選 做)；
⑤10000 rpm離心lOmin收集包涵體；
◎棄上清，將沉淀(內(nèi)有包涵體)用0.1倍菌液體積的1 xIB洗滌液完全重懸；
⑦ 重復(fù)步驟5收集沉淀；
⑧ 將上述沉淀再次用0.1倍菌液體積的1 xIB洗滌液完全重懸，并將重懸液轉(zhuǎn)移至重 量己知的干凈的離心管中；
◎ 10000 rpm離心lOmin收集包涵體，棄上清，并將離心管倒置在紙巾上以完全除去 多余的液體；
⑩離心管稱重，減去管中以得到包涵體的凈重。 一般來(lái)說(shuō)，OD600為3時(shí)收集的菌液， 并且不溶性蛋白在細(xì)胞中的含量為10-40%時(shí)，每毫升菌液中有1-4 mg的包涵體。
2) 蛋白的溶解和重新折疊
①根據(jù)包涵體的重量計(jì)算所需的溶解液量，溶解包涵體使其在溶解液中的濃度為10-20 mg/ml，溶解液按如下配方在室溫下配制
10 x IB Solubilization buffer 5 mL
ddH20 44.5 mL
30% N-lauroylsarcosine 0.5 mL'
DTT 50 |aL
Total 50 mL
②將配制的溶解液加入收集有包涵體的離心管中，輕微混和。大的片斷用槍頭反復(fù)打碎；
③室溫靜置15min;
室溫10000 rpm離心10 min離心，轉(zhuǎn)移上清(內(nèi)有溶解蛋白)于干凈的離心管中 (避免碎片)。
3)透析
① 透析袋處理，過(guò)程如下-
a把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20 cm)的小段；
b在大體積的2% (W/V)碳酸氫鈉和lmmol/LEDTA (pH8.0)中將透析袋煮 沸10min;
c用蒸餾水徹底清洗透析袋；
d 放在lmmol/LEDTA (pH8.0)中將之煮沸10min。
冷卻后，存放于4'C，
必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋必須戴手套； e用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈；
② 準(zhǔn)備透析液(為樣品的50倍，如樣品量為15mL，則需透析液750 mL，因透析兩 次故共需透析液1.5 L)，按以下配方配制
50 x IB dialysis Buffer 30 mL
ddH20 1.5 L
(1 MDTT ) 150
Total 1.5L
③4°C透析至少3h以上，換新的透析液繼續(xù)透析3h以上； 按上步驟制備透析液，但不加DTT; 用不加DTT的透析液再透析一次。 4)氧化還原以促使二硫鍵的形成
為促使蛋白的二硫鍵的正確形成，可以在透析液中加入氧化劑和還原劑繼續(xù)透析，經(jīng) 常用的氧化還原劑為氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽，比較經(jīng)濟(jì)的方法是使用CuS04或 NaSe03，但使用這種方法所形成的不正確的二硫鍵比前者高。因此本論文中使用氧化性谷胱 甘肽和還原性谷胱甘肽。
① 如上制備透析液，但加入氧化還原劑，于4°C保存(其中還原性谷胱甘肽和氧化性 谷胱甘肽的濃度分別為ImM和0.2 mM);
② 繼續(xù)于4°C透析蛋白過(guò)夜
③ 如有必要，繼續(xù)于室溫或37°C透析蛋白以提高二硫鍵的形成率。另有一種替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽的濃縮液，并直接加 到目標(biāo)蛋白中，反應(yīng)后透析再除去多余的氧化還原劑.
復(fù)性完成后對(duì)復(fù)性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖3所示，表明復(fù)性蛋白是較純的幾 丁質(zhì)酶ChiB。 3.酶活性的測(cè)定方法。
酶活力測(cè)定釆用改良的還原糖法，其原理為可溶性殼聚糖酶解后釋放出還原糖，還原糖 與3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑反應(yīng)變色，于分光光度計(jì)550 nm處測(cè)定其光吸收值，以N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)為標(biāo)準(zhǔn)糖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活力(單位U)定義為在37 'C反應(yīng)條件下，每分鐘釋放lng還原糖所需要的酶量 為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。 (l)NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取7支25mL刻度的試管，按表加入各種試劑，振蕩混勻，在沸水浴加熱10min，隨即 放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加20mL水稀釋，混勻，在550nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。以 OD550值為縱坐標(biāo)，NAG量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。
管號(hào)0123456
NAG標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.20.40.60.81.01.2
蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.8
DNS試劑(ml)3.03.03.03.03.03.03.0
相當(dāng)NAG量(mg)00.20.40.60.81.01.2
(2) 樣品處理:測(cè)定取25 mL試管加入1 mL膠體幾丁質(zhì)和1 mL復(fù)性蛋白(幾丁質(zhì)酶ChiB)， 振蕩混均后于37 。C水浴中反應(yīng)10min，立即進(jìn)入沸水浴1 min滅活，冷卻至室溫；加 入3.0mLDNS試劑，振蕩混勻，沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，于分光光度計(jì)550nm 處測(cè)定光吸收值，對(duì)照NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖含量，折算成酶活力單位，重復(fù)三 次。測(cè)試結(jié)果表明含有幾丁質(zhì)酶ChiB的蛋白復(fù)性液的酶活為14.5 U/ml。
(3) 各種試劑的制備
酶活力測(cè)試的NAG標(biāo)準(zhǔn)液為1 mg/mL，制備方法稱O.lg N-乙酰葡萄糖胺于適量水中 溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容，即得lmg/mL標(biāo)液。
酶活力測(cè)試的DNS試劑的制備方法取3， 5-二硝基水楊酸6.3 g，加入2 mol/L的NaOH 溶液262 mL加至500 mL含185 g酒石酸鉀的熱水中，再加入結(jié)晶酚和亞硫酸鈉各5 g，攪拌 混勻加蒸餾水定容至1000 mL。酶活力測(cè)試的膠體幾丁質(zhì)的制備方法在1(TC下，將幾丁質(zhì)5g放入研缽中，加丙酮40 mL研磨10min。邊研磨邊緩緩加入預(yù)冷濃HC1 200 mL，充分研磨，使呈糊狀，于4'C放置 24 h。用玻璃棉過(guò)濾，將濾液緩緩加入到盛有1000 mL 50%乙醇(v/v)的燒杯中，邊加邊劇 烈攪拌，然后靜置，待膠體幾丁質(zhì)析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)。用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾 丁質(zhì)至pH7，以蒸餾水定容至500mL，冷藏備用。
復(fù)性蛋白的SDS-PAGE分析和酶活測(cè)定表明，幾丁質(zhì)酶ChiB的編碼基因表達(dá)了幾丁質(zhì) 酶，并且經(jīng)過(guò)復(fù)性，得到了具有活性的幾丁質(zhì)酶ChiB。 4.復(fù)性蛋白的濃度測(cè)定
本論文利用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定，具體過(guò)程如下
(1) 在離心管中分別加入0.5mg/mL的BSA (牛血清白蛋白)5 ^L、 10 ^L、 15 ^L、 20 ^L,以0.15 mM/L的NaCl補(bǔ)足至200 ^L，以200 pL的0.15mM/L的NaCl作為 空白對(duì)照；
(2) 每管加入2mL考馬斯亮藍(lán)G-250，振蕩混勻，室溫放置2 min;
(3) 用lcm光徑的比色杯測(cè)BSA的A595，用A595對(duì)BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度作圖并繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4) 取50 的待測(cè)蛋白稀釋為2mL并測(cè)定其A奶，利用BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)蛋 白的濃度。
利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，并繪制BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，計(jì)算后幾丁 質(zhì)酶B的復(fù)性蛋白濃度為1.95嗎/VL。
三、重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶ChiB對(duì)蜜蜂狄斯瓦螨的毒殺作用測(cè)定。
將上述步驟二中得到的重組表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiB的復(fù)性蛋白液，測(cè)定復(fù)性蛋白液對(duì)蜜蜂 狄斯瓦螨的毒殺作用； 1.生物測(cè)定的方法如下 參照(Tsagou"a/.，2004)的方法，并有所修改。
(1) 從被大蜂螨感染的意蜂蜂群中取回巢脾，盡量從多個(gè)蜂箱中取。
(2) 采集蜂螨的方法用鑷子打開巢脾上的蜂房，用毛筆或者小刷子輕輕從幼蟲和蛹上收集 大蜂螨。
(3) 準(zhǔn)備9 cm的一次性培養(yǎng)皿，并在底部各鋪一張滅好菌的濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中放4只工 蜂的白眼蛹作為大峰螨的食物來(lái)源。
(4) 將收集到的大蜂螨放入培養(yǎng)皿中(一個(gè)培養(yǎng)皿中放20頭)收集到后的一個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。(5) 測(cè)定時(shí)采用浸泡的方法用毛筆尖挑起蜂螨，并將蜂螨完全浸沒在lmL的幾丁質(zhì)酶復(fù) 性蛋白(幾丁質(zhì)酶ChiB)溶液(1.5mL離心管)中10s，處理完畢后將蜂螨放回裝有 蜂蛹作為食物的培養(yǎng)皿中詞養(yǎng)。
(6) 如果在處理的過(guò)程中發(fā)生蜂螨死亡的情況，則將該蜂螨棄去不用。每個(gè)處理重復(fù)3次。
(7) 對(duì)照組使用蛋白溶解液，透析液處理大蜂螨，重復(fù)3次。
(8) 培養(yǎng)皿置于黑暗的培養(yǎng)箱(RQH—Ol人工氣候箱)中，溫度和濕度控制在32°C， 80%RH。
(9) 每天記錄和觀察大蜂螨的存活情況。使用毛筆尖刺激螨，如果螨對(duì)刺激沒有反應(yīng)，則認(rèn) 為螨己經(jīng)死亡。如果發(fā)現(xiàn)蜂蛹有死亡的情況也要及時(shí)更換。
2.生物測(cè)定的結(jié)果如下
幾丁質(zhì)酶的活力測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，ChiB活力為14.5 U/mL。對(duì)螨進(jìn)行的生物測(cè)定結(jié)果顯示 (圖6)，幾丁質(zhì)酶ChiB處理蜂螨時(shí)(幾丁質(zhì)酶活力14.5 U/mL)， 5天后蜂螨的死亡率為40%， 表明幾丁質(zhì)酶對(duì)狄斯瓦螨具有毒性作用。序列表
<110>廣東省昆蟲研究所
<120>具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質(zhì)酶ChiB及其應(yīng)用
<160>1
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213>粘質(zhì)沙雷氏菌(5"e/ra"a warcesre"j GEI)
<220>
<221>CDS
<222> (1)…(1500)
<400>1
atgtccacacgt333gCCgttsttgggtattattttattccaaccaacca60
tacaccgagtccgatacctccatcgtgccattcccggtatccaac3tcscgccggccaaa120
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tacatcacctctgcgccgggttcagacagcgcctggctga鄉(xiāng)tgggccgcgtagcgtaa1500
權(quán)利要求
1.一種具有殺狄斯瓦螨(Varroa destructor Anderson&amp;Trueman)活性的幾丁質(zhì)酶ChiB，其特征在于編碼所述幾丁質(zhì)酶ChiB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 權(quán)利要求l所述幾丁質(zhì)酶ChiB在殺狄斯瓦螨中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質(zhì)酶ChiB及其應(yīng)用。本發(fā)明從粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens GEI的基因組DNA中克隆出一段基因堿基序列，應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達(dá)該基因，對(duì)該基因的編碼蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性、生物測(cè)定表明，該蛋白對(duì)狄斯瓦螨具有毒性，幾丁質(zhì)酶活力為14.5U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為40％。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析表明，該基因是一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因chiB類的新序列。本發(fā)明可用于蜜蜂的螨害防治方面。
文檔編號(hào)C12N9/42GK101613683SQ20091003964
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者爽 涂, 韓日疇 申請(qǐng)人:廣東省昆蟲研究所