專利名稱：：一個植物組織特異以及發(fā)育后期表達的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物基因啟動子及其應用，提供了一個植物組織特異、生長發(fā)育后期特異的啟動子。屬于生物
技術領域：
。用于通過植物基因工程技術改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。
背景技術：
：植物基因啟動子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，啟動子一直是基因工程的研究熱點，選擇合適并有效表達的啟動子將為基因工程的研究奠定堅實的基礎。組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)經(jīng)常被應用于植物基因工程，但這些組成型啟動子使它們的下游基因持續(xù)表達以致跨度宿主植物的整個生命周期以及所有的組織器官，這不僅浪費宿主植物的能源，而且可能會導致宿主植物性狀的改變。組織特異啟動子可以使外源基因的表達只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性；誘導型啟動子可以使外源基因?qū)δ承┬盘柈a(chǎn)生響應，只在特殊信號刺激下表達。組織特異啟動子由于其表達的空間特異性而具有許多組成型啟動子所不具備的特點，將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達不但可以降低植物負擔、減輕對作物農(nóng)藝性狀的影響，還可以提高外源基因在特定部位的濃度，增加轉(zhuǎn)基因的效果。選擇合適的組織特異性或誘導表達啟動子一直以來都是植物基因工程研究的重點和難點。目前，已經(jīng)找到一些組織特異性或誘導表達啟動子，并發(fā)現(xiàn)其上存在的相應的順式因子。PrasenjitS.等發(fā)現(xiàn)水稻蔗糖合酶基因RSsl和rolC的啟動子均為韌皮部組織特異性啟動子，并可以驅(qū)動植物殺蟲蛋白基因的表達，為植物抗病工程提供了新途@(PrasenjitS.，DipankarC.，AnindyaS.Characterizationofvascular-specificRSslandrolCpromotersfortheirutilizationinengineeringplantstodevelopresistanceagainsthemipteraninsectpests·Planta，2007，226(2):429_442)。有些組織特異啟動子同時也是特異時期啟動子，例如種子、花器官特異啟動子。對于那些以收獲種子為目的植物來說，找到能在果實中特異表達的啟動子，對利用基因工程進行品質(zhì)改良、提高產(chǎn)量等有較大的意義。近年來，一系列的果實特異型啟動子被發(fā)現(xiàn)，研究較多的果實特異型啟動子主要包括E8、2A11/2A12、PG、MCPI、B33和ACC氧化酶啟動子等。其中果實特異啟動子E8被廣泛應用構(gòu)建植物基因高效表達載體(姚嶸，馬三梅.植物果實的特異型啟動子.生命的化學，2006，26(4):55-57.)。另外，花器官的發(fā)育是一個特殊以及復雜的過程，有很多特殊的啟動子參與其中。目前獲得的花器官組織特異性啟動子包括花藥特異性啟動子、花粉特異性啟動子、絨氈層特以異性啟動子等。人們利用這些特異啟動子專一抑制花器官中的相關基因表達，即可利用基因工程的方法創(chuàng)建雄性不育系。在植物和細菌中有一類含有三碳碳環(huán)的脂肪酸，包括環(huán)丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE-FAs)，但是在細菌中還沒有報道存在CPE-FAs。正是由于三碳碳環(huán)的存在，賦予這類脂肪酸特殊的物理化學性質(zhì)，從而滿足工業(yè)領域的一些特殊需要。例如，潤滑油的組分一般為含有16-18個碳的長鏈脂肪酸，但是長鏈飽和脂肪酸的融點較高，不能滿足發(fā)動機的需求，而長鏈不飽和脂肪酸又很容易氧化。環(huán)丙烷脂肪酸正好可以解決這一問題，三碳碳環(huán)的存在使其兼具有飽和和不飽和脂肪酸的特性。利用氫化作用使碳環(huán)打開，產(chǎn)生大量有甲基分支的脂肪酸。這將導致其具有不飽和脂肪酸及其酯的低溫特性，又沒有雙鍵的易氧化性，因此可以用于潤滑及相關領域。另外，環(huán)丙烯環(huán)在與親電子試劑的放熱反應中容易打開，環(huán)丙稀脂肪酸含量高的油，如臭蘋婆油可以在升高的溫度下聚合(Gontier，Eric,Thomasset,Brigitte,ffallington,Emma,Wilmer,Jeroen.PlantCyclopropaneFattyAcidSynthaseGenesandUsesThereof.UnitedStatesPatentApplication20080155714)。這種特性特別適用于聚合物的生產(chǎn)。另外，CPE-FAs和CPA-FAs還被認為參與植物的抑菌反應。一般認為，植物CPE-FAs由CPA-FAs通過去飽和作用合成。而CPA-FAs的合成反應由環(huán)丙烷脂肪酸合酶(也被稱為環(huán)丙烷合酶或不飽和磷脂甲基轉(zhuǎn)移酶)催化，包括對磷脂十六烷?；蚴送轷；p鍵的來自S-腺苷甲硫氨酸的亞甲基的加成。CPE-FAs和CPA-FAs在高等植物中并非廣泛分布，但是發(fā)現(xiàn)它們存在于有限的科的種子油中。包括錦葵科、梧桐科、木棉科和無患子科。在有些植物中，CPE-FAs和CPA-FAs含量可以達到相當高的水平，蘋婆種子中的CPA-FAs可以達到脂肪酸總量的78%，荔枝種子中的CPA-FAs可以達到40%。但是，使用的最多、最廣泛的含有CPE-FAs和CPA-FAs的油是棉籽油，棉籽油中含有的CPE-FAs。目前，已經(jīng)獲得香蘋婆和荔枝的環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因(BaoΧ.M，KatzS.，PollardΜ.，OhlroggeJ.Carbocyclicfattyacidsinplants:BiochemicalandmoleculargeneticcharacterizationofcyclopropanefattyacidsynthesisofSterculiafoetida.PNAS,2002,99(10):7172_7177；Gontier,Eric,Thomasset,Brigitte,ffallington,Emma,WiImer,Jeroen.PlantCyclopropaneFattyAcidSynthaseGenesandUsesThereof.UnitedStatesPatentApplication20080155714)，但是關于這種基因的啟動子還沒有相關報道。棉花是世界重要的經(jīng)濟作物，也是利用基因工程進行遺傳改良較為成功的作物之一。自從1987年人類獲得第一株轉(zhuǎn)基因棉花以來，棉花基因工程的研究工作進展迅速，已經(jīng)培育出抗蟲、抗除草劑、抗病、抗鹽等優(yōu)良品種的高產(chǎn)品系。特別是轉(zhuǎn)抗蟲基因Bt的轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)普遍種植，在減少農(nóng)藥施用，降低生產(chǎn)成本、減輕勞動用工等方面都起到顯著的作用。但是現(xiàn)在生產(chǎn)中所采用的CaMV35S啟動子是組成型啟動子，其持續(xù)表達對受體植株可能造成負擔。如果改用特異啟動子，控制抗蟲基因只在特定部位如蕾、花、鈴中和特定時期如在棉花生長中后期高效表達，就能大大提高抗蟲效果。本發(fā)明的發(fā)明人獲得了陸地棉環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因的啟動子序列。由于棉花再生體系困難，一些研究小組采用模式植物煙草(HsuCY,CreechRG,JenkinsJN,MaDP.AnalysisofpromoteractivityofcottonlipidtransferproteingeneLTP6intransgenictobaccoplants.PlantSci1999；143:63_70·)或擬南芥(WangS,WangJW,YuN,LiChH,LuoB,GouJY,WangLJ,ChenXY.ControlofPlantTrichomeDevelopmentbyaCottonFiberMYBGene.ThePlantCell2004，16:2323_2334)來對棉花啟動子進行分析，其研究結(jié)果表明GUS報告基因完全可以在這些模式植物中正常表達。
發(fā)明內(nèi)容技術問題本發(fā)明的目的是提供了一個來源于棉花的組織特異、生長發(fā)育后期特異表達的啟動子。該啟動子使⑶S基因在莖基部、根以及花藥中特異表達，并且只在生長后期(生殖生長期)表達?？梢岳帽景l(fā)明啟動子構(gòu)建成各種植物表達載體，用于通過植物基因工程技術改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。技術方案本發(fā)明所提供的一個來源于棉花的植物組織特異以及發(fā)育后期特異的啟動子pCPA-FAS-2，來源于陸地棉(Gossypiumhirsutum)，含有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列或部份DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0.lXSSPE(15mMNaCl，ImMNaH2PO4,0.ImMEDTA)、0.1\550(15福妝(1，1.51111檸檬酸鈉)、0·1%SDS(十二烷基磺酸鈉)的溶液中，65°C條件下洗膜。序列表中的SEQIDNO.1由2688個堿基組成。自5，端第2659位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點，記為+1。其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-330至-323位堿基，而CAAT框位于-217至-221位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。自5，端第-2294至-2290位，-147至-143位，-37位至-33位堿基為干旱或黑暗誘導元件ACGI1ATERDI；自5，端第-2272至-2267位，-2038至-2033位，-1344至-1339位堿基為抗病反應相關表達元件BIHD10S；自5，端第-2642位至-2638位，第-2389位至-2385位，第-1915位至-1911位，第-1331位至-1327位，第-568位至-564位堿基為銅離子誘導表達元件CUREC0RECR；自5，端第-2537位，-2519位，-2505位，-2383位，-2340位，-2329位，-2140位，-1247位，-1208位，-1163位，-974位，-915位，-741位，-524位，-236位堿基為植物特有的鋅指蛋白DOF基因的結(jié)合元件D0FC0REZM；自5，端第-1686位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位堿基為種子中儲存蛋白特異元件EB0XBNNAPA；自5，端第-2552位，-2333位，-1675位，-1574位，-1150位，-910位，-546位，-490位，-314位堿基為病原菌誘導表達元件GT-I；自5，端第-403位，-2378位堿基為干旱響應元件MYB2C0NSENSUSAT；自5，端第-1680位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位堿基為冷脅迫響應元件MYCCONSENSUSAT；自5，端第-2519位，-2140位，-1247位堿基為根結(jié)特異元件0SE1R00TN0DULE；自5，端-2406位，-2334位，-2142位，-2032位，-994位，-547位堿基為花器官特異元件P0LLEmLELAT52；自5，端第-945位，-480位堿基為糖響應元件WB0XHVIS01；自5，端第-481位堿基為水楊酸誘導元件WB0XATNPR1。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明啟動子的表達載體和宿主菌以及擴增啟動子任一片段的引物。本發(fā)明提供了一個棉花組織特異以及生長發(fā)育后期特異的啟動子pCPA-FAS-2，擬南芥轉(zhuǎn)基因證明發(fā)現(xiàn)PCPA-FAS-2能賦予⑶S基因在莖生長點以及花藥中特異表達，并且只在生長后期(生殖生長期)表達。表現(xiàn)出器官特異、時期特異表達模式。pCPA-FAS-2的深入研究用于通過植物基因工程技術改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。有益效果1.本發(fā)明首次獲得了一個全新的棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶啟動子。棉花是世界重要的經(jīng)濟作物，棉籽油含有多種特殊的脂肪酸，如環(huán)丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE-FAs)。這些脂肪酸能夠滿足一些特定工業(yè)領域的需求，如潤滑油的生產(chǎn)。本發(fā)明獲得的棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因的啟動子是一個全新的啟動子，BLAST顯示沒有同源性。2.本發(fā)明獲得了一個棉花組織特異以及生長發(fā)育后期特異啟動子。組織特異、表達時期特異啟動子由于其表達的時空特異性而具有許多組成型啟動子所不具備的特點，將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位、定時表達不但可以降低植物負擔、減輕對作物農(nóng)藝性狀的影響，還可以提高外源基因在特定部位的濃度，增加轉(zhuǎn)基因的效果。因此，選擇合適的組織特異性或誘導表達啟動子一直以來都是植物基因工程研究的重點和難點。本發(fā)明中的啟動子pCPA-FAS-2是一個組織特異、表達時期特異的棉花啟動子。它可以使目的基因在只生長發(fā)育后期，莖基部、根以及花藥中特異表達，該啟動子可以應用于農(nóng)業(yè)生物育種和基因工程以改善植物品質(zhì)和其他有益的生產(chǎn)性狀。3.更好了解植物環(huán)丙烷合酶基因的表達調(diào)控以及作用機理。由于植物油越來越廣泛地應用于工業(yè)、食品加工業(yè)，利用脂肪酸代謝途徑中的一些關鍵基因可以改善油的品質(zhì)，并富集特定的脂肪酸種類。所以對于植物脂肪酸代謝途徑的研究一直是生物研究中的熱點。雖然利用大腸桿菌的相似序列已經(jīng)獲得了一些植物的環(huán)丙烷合酶基因，但是對這類基因的啟動子研究鮮有報道。而植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用。植物基因的啟動子是重要的順式作用元件，能指導全酶與模版的正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄的形式，并決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶類型，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。所以通過對啟動子的研究可以深入了解這類基因的表達調(diào)控以及作用機理，并為該基因的進一步應用奠定基礎。四圖1，圖2pCPA-FAS_2啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥植株后的⑶S染色結(jié)果。⑶S基因主要在莖基部以及根中表達。圖3，圖4pCPA-FAS_2啟動子轉(zhuǎn)擬南芥植株的花器官染色結(jié)果。⑶S基因主要在花藥中表達。五具體實施例方式下列實施方式中未注明具體條件的實驗方法均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海英俊生物技術有限公司合成，所用的內(nèi)切酶、聚合酶等均購自寶生物工程有限公司。本實驗所用的生物材料包括陸地棉(Gossypium.hirsutum)品種為柯字棉312(UdallJ.A.，SwansonJ.M.,HalleK.,etal.AglobalassemblyofcottonESTs.GenomeRes.,2006,(16):441-450)，擬南芥品種為哥倫比亞型(LinX，KaulS，RounsleyS，SheaTP，BenitoMI,TownCDiFujiiCYiMasonTiBowmanCLiBarnsteadM,FeldblyumTViBuellCRiKetchumKA，LeeJ，RonningCM，KooHL，MoffatKS，CroninLA，ShenM，PaiG，VanAkenS,UmayamL，TallonLJ,GillJE,AdamsMD,CarreraAJ,CreasyTH,GoodmanHM,SomervilleCR,CopenhaverGP，PreussD，NiermanWC，White0，EisenJA，SalzbergSL，F(xiàn)raserCM，VenterJC.Sequenceandanalysisofchromosome2oftheplantArabidopsisthaiiana.Nature1999；16；402(6763):761_8.)。棉花與擬南芥都在培養(yǎng)箱中生長。光照強度為130μmo1photonsπΓΥ1，濕度為65%。(一)棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2啟動子序列的克隆以及序列分析根據(jù)一個棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2(GENBANK登陸號為ΑΑΤ74601)設計了3個反向引物(5‘-GAAGGAAAATATCACTGGTAGCATA-3‘；5‘-ACATATAGGAGCCAGGTAAGTGTTT-3‘；5‘-TTTTATCCCACCTCCGATCACCGCC-3‘)用來獲得基因的5，末端。參照Paterson等的方法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractioncotton(Gossypiumspp.)GenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRepl993；11122-7.)提取柯字棉312葉片的核基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRV對所提取的核基因組DNA進行酶解。然后用染色體步行法克隆棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2的啟動子序列。采用clontech公司的GenomeWalker試劑盒并按試劑盒說明書進行操作，具體方法為首先將限制性內(nèi)切酶酶解后產(chǎn)生的不同長度的DNA片段與接頭連接，得到帶有接頭的基因組DNA文庫；然后以含有接頭的基因組DNA文庫作為模板，在外側(cè)接頭引物APl:5‘-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘和外側(cè)基因特異引物GSPl5‘-GAAGGAAAATATCACTGGTAGCATA-3‘的引導下，進行第一輪PCR擴增；再以第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，在內(nèi)側(cè)接頭引物AP25'-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3‘和內(nèi)側(cè)基因特異引物GSP2:5'-ACATATAGGAGCCAGGTAAGTGTTT-3‘的引導下，進行第二輪的PCR擴增。第二輪PCR擴增結(jié)束后，用維特潔公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴增片段，然后將純化的DNA片段連接至載體pGEM-TEasy中(Promega公司)，轉(zhuǎn)化E.coliJM109(大連寶生物公司)感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，測序由ABI310DNA測序儀完成(AppliedBiosystemInc.，F(xiàn)osterCity,TX,USA)。結(jié)果以EcoRV酶解的棉花核基因組DNA片段庫為模板，經(jīng)過兩輪PCR擴增后，獲得一個長度為3.2kb的DNA片段，其中含有序列表中SEQIDNO.1的DNA序列。與已克隆的CPA-FAS-2的cDNA序列進行比較，結(jié)果該3.2kb的DNA片段含有CPA-FAS-2cDNA序列5’端編碼區(qū)的513個核苷酸，即5’端編碼區(qū)部分重疊，表明所克隆到的長度為3.2kb的DNA片段就是目標基因CPA-FAS-2的啟動子序列，將該啟動子命名為pCPA-FAS-2。而將上述含有pCPA-FAS-2的重組克隆載體命名為pGEM_TEasy-pCPA-FAS_2。用PLACE(HigoK,UgawaY,IwamotoΜ,KorenagaΤ.Plantcis-actingregulatoryDNA-elements(PLACE).NuclAcidsRes1999;27:297-300.)禾口PlantCARE(LescotΜ,DehaisP,ThijsG,MarchalK,MoreauY,VandePeerY,RouzeP,RombautsS.PlantCARE,adatabaseofplantcis-actingregulatoryelementsandaportaltotoolsforinsilicoanalysisofpromotersequences.NuclAcidsRes2002;30:325-7.)軟件對棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶的啟動子的核苷酸序列(序列表中的SEQIDNO.1)進行序列分析。用上述軟件對CPA-FAS-2基因啟動子中的順式作用元件進行搜索、預測，結(jié)果該啟動子中含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列。其中，將CPA-FAS-2的cDNA序列的第一個堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(記為+1)，即序列表中SEQIDNO.1自5，端的第2659位堿基，自5，端第-2294至-2290位，-147至-143位，-37位至-33位堿基為干旱或黑暗誘導元件ACGTATERD1(SimpsonSD,NakashimaK,NarusakaY,SekiΜ,ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK.Twodifferentnovelcis—actingelementsoferdl,aclpAhomologousArabidopsisgenefunctionininductionbydehydrationstressanddark-inducedsenescence.PlantJ.33:259_270(2003)；自5'端第-2272至-2267位，-2038至-2033位，-1344至-1339位堿基為抗病反應相關表達7u#BIHD10S(LuoH,SongF,GoodmanRM,ZhengΖ·Up—regulationofOsBIHDl,aricegeneencodingBELLhomeodomaintranscriptionalfactor,indiseaseresistanceresponses.PlantBiol(Stuttg)·7:459_468(2005)·；自5，端第-2642位至-2638位，第-2389位至-2385位，第-1915位至-1911位，第-1331位至-1327位，第-568位至-564位堿基為銅離子誘導表達元件CUREC0RECR(KropatJ,TotteyS,BirkenbihlRP,DepegeN,HuijserP,MerchantS.AregulatorofnutritionalcoppersignalinginChlamydomonasisanSBPdomainproteinthatrecognizestheGTACcoreofcopperresponseelement.ProcNatlAcadSciUSA.10218730-18735.(2005))；自5’端第-2537位，-2519位，-2505位，-2383位，-2340位，-2329位，-2140位，-1247位，-1208位，-1163位，-974位，-915位，-741位，-524位，-236位，堿基為植物特有的鋅指蛋白DOF基因的結(jié)合兀件D0FC0REZM(YanagisawaS,SchmidtRJDiversityandsimilarityamongrecognitionsequencesofDoftranscriptionfactors.PlantJ17209-214(1999))；自5，端第-1686位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位堿基為種子中儲存蛋白特異元件EBOXBNNAPA(StalbergK，EllerstomΜ,EzcurraI,AblovS,RaskL.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage-proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds.Planta199515-519(1996)；自5，端第-2552位，-2333位，-1675位，-1574位，-1150位，-910位，-546位，-490位，-314位堿基為病原菌誘導表達元件GT-I(ParkHC,KimML,KangYH,JeonJM,YooJH,KimMC,ParkCY,JeongJC,MoonBC,LeeJH,YoonHW,LeeSH,ChungWS,LimCO,LeeSY,HongJC,ChoMJ.Pathogen-andNaCl-inducedexpressionoftheSCaM~4promoterismediatedinpartbyaGT-IboxthatinteractswithaGT-l-liketranscriptionfactor.PlantPhysiol2004;135:2150-2161·);自5’端第-403位，-2378位堿基為干旱響應元件MYB2C0NSENSUSAT(AbeH,UraoT,ItoΤ,SekiΜ,ShinozakiK,Yamaguchi-Shinozaki.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCelll563-78(2003))；自5，端第-1680位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位堿基為冷脅迫響應元件MYCCONSENSUSAT(ChinnusamyV，OhtaM,KanrarS,LeeBH,HongX,AgarwalM,ZhuJK.ICEl:aregulatorofcold—inducedtranscriptomeandfreezingtoleranceinArabidopsis.GenesDev.171043-1054(2003))；自5，端第-2519位，-2140位，-1247位堿基為根結(jié)特異元件0SElR00TN0DULE(ViewegMF,FruhlingΜ,QuandtHJ,HeimU,BaumleinH,PuhlerA,KusterH,AndreasMP.ThepromoteroftheViciafabaL.IeghemoglobingeneVfLb29isspecificallyactivatedintheinfectedcellsofrootnodulesandinthearbuscule-containingcellsofmycorrhizalrootsfromdifferentlegumeandnonlegumeplants.MolPlantMicrobeInteract.1762-69(2004).)；自5，端-2406位，-2334位，-2142位，-2032位，-994位，-547位堿基為花器官特異元件P0LLEN1LELAT52(FilichkinSA,LeonardJM,MonterosA,LiuPP,NonogakiH.Anovelendo-beta—mannanasegeneintomatoLeMAN5isassociatedwithantherandpollendevelopment.PlantPhysiol.1341080-1087(2004))；自5’立溝第-945位，-480位堿基為糖響應元件WB0XHVIS01(SunC.，PalmqvistS.，OlssonH.，BorenM.,AhlandsbergS.,JanssonC.AnovelWRKYtranscriptionfactor,SUSIBA2,participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugar-responsiveelementsoftheisolpromoter,PlantCell2003；15:2076_2092)；自5'端第-481位堿基為水楊酸誘導元件WB0XATNPRl(YuD,ChenC,ChenZEvidenceforanimportantroleofWRKYDNAbindingproteinsintheregulationofNPRlgeneexpression.PlantCell2001；13:1527_1540)。表lpCPA-FAS-2啟動子序列中的調(diào)控元件分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>①N代表A，C，G或T;R代表A或G代表A或T；(二)構(gòu)建CPA-FAS-2啟動子序列與⑶S基因融合的重組載體并轉(zhuǎn)化擬南芥為檢測啟動子在以柯字棉312基因組為模板，用正向引物(5'CGAAGCTTGGTCGAGTGAGATGAAGTACATCAT-3‘帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點)和反向引物(5‘CCGGATCCGGATCCCACCTCCGATCACCGCCACT-3‘，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點)擴增啟動子片段，并在序列兩段分別添加上限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI的識別位點。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化目的片段，測序驗證所得到的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用HindIII和BamHI進行酶切，與經(jīng)相同酶雙酶切的植物表達載體pBIlOl.1(Clontech公司)連接。將以上獲得的啟動子片段連接在β-葡聚醛酸酶(⑶S)基因的上游5’端獲得重組載體，命名為pBI-pCPA-FAS-2:⑶S，用凍融法將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。用花浸染方法(CloughSJ,BentAF.Floraldip:ASimplifiedMethodforAgrobacterium-MediatedTransformationofArabidopsisthaiiana.PlantJ1998;16:735_743)轉(zhuǎn)化擬南芥，分單株收獲擬南芥種子。將所有種子在含有40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選，挑選綠色植株移栽至營養(yǎng)土中生長。用PCR方法進一步檢測轉(zhuǎn)基因植株。收獲轉(zhuǎn)基因工程植株種子。將轉(zhuǎn)基因工程植株種子播種于含有40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基。挑選綠色植株移栽至營養(yǎng)土中生長并用于啟動子功能以及特征研究。將轉(zhuǎn)基因株系植株進行組織化學染色以檢測⑶S基因的表達位置和特征。(三)⑶S活性的組織化學定位分析⑶S活性的組織化學定位分析方法為取在溫室中生長的pBI-pCPA-FAS-2:⑶S擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗全株，將植株根部洗凈。參考Jefferson等的熒光組織化學定位法(JeffersonRA,KavanaghΤΑ,BevanMff.GUSfusions:p-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ1987；63901-7.)測定⑶S活性，具體方法為⑶S組織化學染色以5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-Dglucuronicacid(X-Gluc)作為底物。將整株擬南芥用90%的丙酮充分脫色處理后，浸泡在GUS反應液中(含50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，IOmmol/LEDTA,2mmol/L鐵氰化鉀，2mmol/L亞鐵氰化鉀，2.Ommol/LX-gluc及0.2%TritonX-100)，37°C溫育13天，直至著色達到足夠強度。再將擬南芥植株用70-100%系列乙醇脫色以去掉葉綠素，最后解剖鏡下鏡檢。⑶S組織化學染色的結(jié)果顯示，在幼苗期⑶S基因不表達，而在生長后期即生殖發(fā)育期，⑶S基因表現(xiàn)為組織特異性表達。如圖1-4所示，在轉(zhuǎn)基因植株中，⑶S基因在莖基部以及根中的表達很強(圖1，圖2)，另外，在花器官中也檢測到GUS基因的表達，表達部位主要集中在花藥中(圖3，圖4)。上述GUS熒光組織化學定位結(jié)果表明了CPA-FAS-2基因在植物體內(nèi)的表達為組織以及表達時期特異性。序列表〈110〉江蘇省農(nóng)業(yè)科學院〈120〉一個植物組織特異以及發(fā)育后期表達的啟動子及其應用〈130〉說明書<140>00<141)2009-06-05<160>3<170>PatentInversion3.1<210>1<211>2688<212>DNA<213>Gossypiumhirsutum(陸地棉)〈220〉<221>gene〈222〉⑴··(2688)〈223〉〈400〉1ggtcgagtgagatgaagtacatcatctttctatttataggttaggaagagactattagta60attttagacattgtgccaacaagaattagatatggttagaatttatgaaaaattgttcaa120aaaagttttgagattttaaaaagatatatattaaaagcaaattttatttcataggcttaa180tatatcctttaacacatttttctatgtagtgtatgtattaatttatcgtctaatttaata240tttatatttgatagaaattatatattttggtactcaaaggtaactgtgttaattatttag300tgtcgaattaagagggccaaagctagaaaaaagtatgcatgcaacaaaatttgaacccaa360aattacgtaacattatttatcaattttgtcatttcaaccaaaattatatttaaatctttt420atcagtttttaataactttattatacaactagcttggactccttagttgtttgtgtgcat480taatattataatattttttaattacttaatgatttgagaaagatatgatttcgaggttat540taaatgtgtctttactcaaaatatatttaagtttaaaataattttaatattatcgatatt600aacagggtgacagatcatattgtcaaagaaactcaaggcgaaatggaacaattaattatt660cataaggaaccaccaggtattacgagagatttattgaaggatgatatctatcacgatata720tgtccattacttgagggagattagtaccgatgtaactttagtttaagactatattgtttt780atttaccaatatatatatatatattaagtttaaaaacctactaaatataattctagtttt840gatctttataatttatttaacttaattataaatagaagtataattaattttaatattgta900tttttagtatatatttaatatattcatgcatacttcaatatatcaatttttagagcatat960attatttaagctaaatatcacatgaaaatattgatgtaaaattaaaatacatttgtatat1020gcatgtattcatataaaaattattgattttattcaacaaaaatataacatataataatat1080tattggaaataaaataagtctaaatgcattgatattattaaaataaatatatttttttaa1140aaattaattaataaattaaatgtagcaacatttttttatgtaagcaacatgtattgttaa1200tattatgttacttcgtattattataataattaaaaaatatatagtttctattttagattt1260tatattaaacaaaattaaatttaaattataattcggaattttttattccaaatttgtcac1320tatatttgtactgaagggtgaagtcaaaaaaatttgttaggggtcaaaattaaattttaa1380tttttaataacctatatctttataatttttaaaagattgaattaaatatttaccattttt1440aggaagagccaaagcgcaattttacctttactaatttaaaattttaaaatttctaaaaga1500cctaaatggataatttttcactttagagggagtcggggctgcctctaccagcccccttag1560atccaccactgaatttaccttaaataatttttttaaatatagtcaatagctacaagtggc1620agattattatcgtgacaaatgacagtttataaactatgccacatagaaattctttttttt1680tgtcgaaaccaaagtgtccaccgccagtaatagtgactaatcctctcgtcatgggtgctc1740cccaaagaggtaaacgattagccataaaatgtattccattcctatgagtggggatttctt1800ttcttttatgtaacattataatgctacagtatatatatgattgtcttcacccacacggtg1860aatatactataatcaagttttcttattacgactctacttatgcgtaaaaaaaatataaaa1920gctatcaatatctttaacgataagttgagattttgagaattttaaaaattcaagttcgaa1980gtttcatttcacatgcggattttcaattgaatttttttttgattaagtctcgtatgtgta2040tgagaactacatacttaaatgaaactaattaataataaaatattaaatatgtacaaatag2100attaaattgcaagaaaaataaaattaaaatacgaaaagacatttttttaaaatttctcta2160aaccagttggtaatcaattgacttgtaacaccaacttaatcaagagtttaaataataata2220tcgatactctatttaaatttattctcgtataagttcaactgtattatgattttcaaacac2280atgtgcaatgtaaggatatggggttttaattataatttgtgattattttataaatatcat2340ttcagaaaattttaagatataatattaaaataatctttctcgatttccaattttaacata2400tatatattatatcaccatcgggaaagcaatttagaatcaattgagcactataatgcactg2460caactgctagtgttgaattttaagtgaaactttcgaagcattacttcttcgtaaaacgta2520ggtttcaacttctttcaagcctttcatcaaacatggcatctacattttagtttccacttt2580ctttctgaagataaatgatgatttgggttgggtttttttggacgtaagtgcaggtcaagc2640agtgtcacggcggcagtgatggaagtggcggtgatcggaggtgggatc2688<210>2<211>33<212>DNA〈213〉人工〈220〉<221>CPA-FAS-2啟動子序列正向引物〈222〉⑴··(33)〈223〉<400>2cgaagcttggtcgagtgagatgaagtacatcat33<210>3<211>34<212>DNA〈213〉人工〈220〉〈22DCPA-FAS-2啟動子序列反向引物〈222〉⑴··(34)<223><400>3ccggatccggatcccacctccgatcaccgccact3權(quán)利要求一個植物組織特異以及發(fā)育后期表達的啟動子，其特征在于，含有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；2)可與序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，與序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交的條件為0.1XSSPE或0.1XSSC、質(zhì)量體積比0.1%SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的啟動子，其特征在于，該啟動子能在植物莖基部、根以及花藥中特異表達。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的啟動子，其特征在于，該啟動子能夠使目的基因在生長發(fā)育后期即生殖生長期表達。5.含有權(quán)利要求14之一所述啟動子的表達載體。6.含有權(quán)利要求14之一所述啟動子的宿主菌。7.權(quán)利要求14之一所述啟動子在植物品質(zhì)改良及植物抗性改良中的應用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明涉及一個植物組織特異以及發(fā)育后期表達的啟動子及其應用，屬于生物
技術領域：
。本發(fā)明獲得了一個棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶的啟動子序列，長度為2.6Kb。Place分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及銅離子誘導表達元件、病原菌誘導表達元件、干旱響應元件、冷脅迫響應元件等。還存在一些根特異表達元件以及花器官特異元件。GUS染色后發(fā)現(xiàn)該啟動子使目的基因在生長發(fā)育后期特異表達，同時表達部位只限于莖基部、根以及花藥。文檔編號C12N1/21GK101831424SQ200910036110公開日2010年9月15日申請日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日發(fā)明者張保龍,方先文,楊郁文,高媛媛申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院