專利名稱：一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于固定化果糖基轉(zhuǎn) 移酶的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚果糖(Fructooligosaccharides，簡(jiǎn)稱FOS)，又稱寡果糖或蔗果三糖族低 聚糖，分子式為G-F-Fn，n-1 3(G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)。它是由蔗糖和1 3 個(gè)果糖基通過P-2-l糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、 蔗果五糖及其混合物。它是利用微生物或植物中具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的酶作用 于蔗糖而得的，反應(yīng)過程可以用以下反應(yīng)式表示 G-F(庶)^G(衝+G—F(庶)+G-F-F (蔗果三撤+G-F-F-F (蔗果四糖)屮
G-F-F-F-F (蔗果五糖) 低聚果糖是一種保健食品，具有很多對(duì)人體有益的功能，如它熱量低，不 引起齲齒，潤(rùn)腸通便，是雙歧桿菌的增殖因子等。所以低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn) 對(duì)促進(jìn)我國低聚果糖研究和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的意義；目前國內(nèi)工業(yè)化生 產(chǎn)FOS的技術(shù)多為液體深層發(fā)酵法，即用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)能產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶 的微生物，從培養(yǎng)液分離收集菌絲體后，不經(jīng)任何處理，直接投入蔗糖溶液中， 使其轉(zhuǎn)化為FOS。但該法的缺點(diǎn)是產(chǎn)酶菌絲體只能利用一次，在FOS生產(chǎn)過程中， 由于菌絲體及其培養(yǎng)基成分的存在并參與反應(yīng)，不但使整個(gè)工藝繁雜，且成本
高。至于菌體細(xì)胞的代謝物就只能作為雜質(zhì)殘留在產(chǎn)品中，無法除去，也會(huì)影 響產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，大量生產(chǎn)低聚果糖中的主要問題是生產(chǎn)的產(chǎn)率不高，進(jìn) 而導(dǎo)致蔗糖酶解過程中果糖基轉(zhuǎn)移酶的成本過高，而酶的固定化技術(shù)為提高果 糖基轉(zhuǎn)移酶的使用效率、降低成本，提供了可能性。因?yàn)楣潭ɑ副扔坞x酶具 有較好的穩(wěn)定性，并且可以回收和重復(fù)使用，又便于連續(xù)化操作，因而可以大 大降低成本。
雖然固定化酶在很多方面優(yōu)于游離酶，但是只有少數(shù)固定化酶在工業(yè)中作 為催化劑，這主要是因?yàn)楣潭ɑ杀靖呋蚬潭ɑЧ畹仍蛳拗破涫褂?。進(jìn) 入90年代后，對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化也已出現(xiàn)了多種方法，但這些方法或者 是過于復(fù)雜或者是FOS產(chǎn)率過低，尚不能十分令人滿意。樹脂是工業(yè)上使用最廣 的材料之一，它價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度好，物化性能穩(wěn)定，容易再生，作為固定 化載體使用有廣闊的應(yīng)用前景。在果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化中雖曾有以D201樹脂 為載體，但酶活回收率僅為30.2%，遠(yuǎn)低于本發(fā)明81.24%的酶活回收率，所以本發(fā)明從多種樹脂中篩選出具有較好固定化效果的載體，以較低的成本、較溫和
及簡(jiǎn)單的操作條件獲得較高的酶活回收率，具有一定的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。 該方法過程簡(jiǎn)單，所制備的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶具有價(jià)格低廉，酶活力和酶活
回收率高等優(yōu)點(diǎn)，利用此法制備的固定化酶，最高酶活可達(dá)324U/g樹脂，酶活 回收率最高可達(dá)81.2%。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法， 包括游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化兩部分，工藝步驟如下
(1) 游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備
將產(chǎn)酶黑曲霉經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體，加菌體質(zhì)量5-10倍量的緩沖液 破壁提取其胞內(nèi)酶，冷凍離心，超濾濃縮得粗酶液，冰箱保藏備用；
濃縮粗酶液用檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋至一定濃度并調(diào)節(jié)pH 3-7.6，游離果 糖基轉(zhuǎn)移酶稀釋酶液的酶活卯-120U/mL;
(2) 果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化
樹脂的預(yù)處理以大孔陰離子交換樹脂D380、 D296R、或D301-III (上述三種 樹脂全為南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品)為固定化載體，大孔陰離子交換樹脂先用蒸餾 水浸泡脹潤(rùn)，除雜，然后用質(zhì)量濃度4。/。的NaOH溶液浸泡4h,再用4%的HC1 溶液浸泡4h，然后用去離子水沖洗至中性，最后用樹脂2倍體積以上去離子水 浸泡，濕樹脂于4'C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 酶的固定化稱取0.5g所得濕樹脂于三角瓶中，加入10mL的游離果糖基 轉(zhuǎn)移酶稀釋酶液，在pH6.0 7.0、 20-3(TC下，以100-200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩吸附 2-8小時(shí)后取出；加入稀釋酶液總體積0.01%-0.05%的質(zhì)量濃度為25%的戊二醛 溶液，于4-l(TC、 60-80rpm緩慢振蕩下交聯(lián)4-8小時(shí)后，過濾，用緩沖溶液洗 漆，沖洗戊二醛殘留及未固定上的游離酶，直至洗出液中無酶活力，即得固定 化果糖基轉(zhuǎn)移酶，用緩沖液浸泡待用。
破壁提取酶的方法采用超聲波細(xì)胞破碎法或超高壓細(xì)胞破碎法，菌體破壁、 濃縮、及稀釋后稀釋酶液的酶活90-120U/mL。
游離果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測(cè)定 一定體積底物蔗糖濃度為10。/。(w/v) 0.05M、 pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液中，加入游離果糖基轉(zhuǎn)移酶，于直徑50mm、 100mL 的恒溫夾套酶反應(yīng)器中，5(TC下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，于沸水中煮沸10min終止反應(yīng)。
酶活力定義為每分鐘產(chǎn)生l^imol蔗果三糖(l-kestose)為一個(gè)酶活力單位。 合適的酶用量為2U/g蔗糖。
固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測(cè)定方法同游離果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測(cè)定方法。
固定化酶活回收率酶活回收率定義為回收的固定化酶活與所添加的固定化酶總酶活的比值。
本發(fā)明的有益效果
1. 本發(fā)明從多種樹脂中篩選出了具有較高固定化效率的大孔陰離子交換樹 脂D380、 D296R、 D301-III，操作過程簡(jiǎn)單，成本低，酶活回收率已達(dá)到較高水 平，制備的固定化酶可回收重復(fù)使用，可降低生產(chǎn)成本。
2. 本發(fā)明以樹脂為固定化載體，不僅因?yàn)檩d體材料價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度好， 物化性能穩(wěn)定，容易再生，另一方面，樹脂吸附酶間接可以起到提取作用，因 此對(duì)于粗酶液的純度沒有過高的要求，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但本 發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。 實(shí)施例1
1. 將產(chǎn)酶黑曲霉經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，離心收集菌體，菌體加5倍體積的緩 沖液經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎后，經(jīng)冷凍離心并超濾后得粗酶液。
2. 大孔陰離子樹脂用去離子水浸泡除雜，分別用4^NaOH、 4%HC1交替處 理各4h，用去離子水清洗多次至中性，用2倍體積以上去離子水浸泡備用。
3. 用濾紙吸干濕樹脂表面的水后稱取0.5g于三角瓶中，加入10mL稀釋酶液， 在2(TC下，以100rpm的轉(zhuǎn)速振蕩吸附2h后取出，加入稀釋酶液總體積0.01%的 25%濃度的戊二醛溶液，于4匸、60rpm緩慢振蕩下交聯(lián)4h后，用緩沖溶液洗滌， 直至洗出液中無酶活力，即得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
測(cè)定該固定化酶活力為162.48U/g，酶活回收率為81.2%。 實(shí)施例2
1. 將產(chǎn)酶黑曲霉經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，離心收集菌體，菌體加10倍體積的緩 沖液經(jīng)超高壓細(xì)胞破碎儀破碎后，經(jīng)冷凍離心并超濾后得粗酶液。
2. 大孔陰離子樹脂用去離子水浸泡除雜，分別用4%NaOH、 4%HC1交替處 理，用去離子水清洗多次至中性，用2倍體積以上去離子水浸泡備用。
3. 用濾紙吸干濕樹脂表面的水后稱取lg于三角瓶中，加入10mL稀釋酶液， 在3(TC下，以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩吸附8h后取出，加入稀釋酶液總體積0.05%的 25%濃度的戊二醛溶液，于1(TC、 60卬m緩慢振蕩下交聯(lián)8h后，用緩沖溶液洗滌， 直至洗出液中無酶活力，即得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
測(cè)定該固定化酶活力為151.64U/g,酶活回收率為75.820/。。 實(shí)施例3固定化酶的分批反應(yīng)-
取0.5g固定化酶，置于250mL蔗糖濃度為10。/。(w/v)0.05M、 pH5.0的擰檬酸-磷酸底物溶液中，于恒溫夾套酶反應(yīng)器中，5(TC下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，于沸水中煮 沸10min終止反應(yīng)，然后將固定化酶過濾用緩沖液沖洗，用于下一批反應(yīng)，如此 循環(huán)使用，該固定化酶可重復(fù)使用10次。
權(quán)利要求
1、一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于包括游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化兩部分，工藝步驟如下(1)游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備將產(chǎn)酶黑曲霉經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體，加菌體質(zhì)量5-10倍量的緩沖液破壁提取其胞內(nèi)酶，冷凍離心，超濾濃縮得粗酶液，冰箱保藏備用；濃縮粗酶液用檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋至一定濃度并調(diào)節(jié)pH 3-7.6，游離果糖基轉(zhuǎn)移酶稀釋酶液的酶活90-120U/mL；(2)果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化樹脂的預(yù)處理以大孔陰離子樹脂D380、D296R、或D301-III為固定化載體，大孔陰離子樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤(rùn)，除雜，然后用質(zhì)量濃度4％的NaOH溶液浸泡4h，再用4％的HCl溶液浸泡4h，然后用去離子水沖洗至中性，最后用樹脂2倍體積以上去離子水浸泡，濕樹脂于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；酶的固定化稱取0.5g所得濕樹脂于三角瓶中，加入10mL的游離果糖基轉(zhuǎn)移酶稀釋酶液，在pH 6.0～7.0、20-30℃下，以100-200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩吸附2-8小時(shí)后取出；加入稀釋酶液總體積0.01％-0.05％的質(zhì)量濃度為25％的戊二醛溶液，于4-10℃、60-80rpm緩慢振蕩下交聯(lián)4-8小時(shí)后，過濾，用緩沖溶液洗滌，沖洗戊二醛殘留及未固定上的游離酶，直至洗出液中無酶活力，即得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，用緩沖液浸泡待用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于破壁提取酶的方法采用超聲波 細(xì)胞破碎法或超高壓細(xì)胞破碎法，菌體破壁、濃縮、及稀釋后稀釋酶液的酶活 90-120U/mL。
全文摘要
一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化兩部分，本發(fā)明篩選出了大孔陰離子樹脂D380、D296R、或D301-III為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用先吸附后交聯(lián)的方法進(jìn)行固定化；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低，酶活回收率已達(dá)到較高水平，制備的固定化酶可回收重復(fù)使用，可降低生產(chǎn)成本。載體材料價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度好，物化性能穩(wěn)定，容易再生，樹脂吸附酶間接起到提取作用，因此對(duì)于粗酶液的純度沒有過高的要求，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，所得固定化酶酶活回收率可達(dá)81.2％以上，可循環(huán)使用10次。
文檔編號(hào)C12N11/06GK101560511SQ20091002690
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者濤 張, 波 江, 馬玉紅 申請(qǐng)人:江南大學(xué)