專利名稱：扇貝急性病毒性壞死病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法
扇貝急'TO毒性i^E病^^酸，擴(kuò)增檢測試劑^^檢測方法
駄領(lǐng)敏
本發(fā)明屬于貝^原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具術(shù)步及一種扇貝急性病毒性i^E^毒(AVNV， Acute Viral N國isVirus)核酸離擴(kuò)增檢測i敘U敘微測方法c 背景駄
自20跟己90年代以來，怖孑Ll貝的:^腳^Et^我國北方辭直海區(qū)3i^暴發(fā)(累積應(yīng)亡率高達(dá) 90%以上)，給扇貝#31 ^了巨大的經(jīng)游員失，并嚴(yán)重阻礙了這一產(chǎn)業(yè)的機(jī)賺。AVNV是引娜 孑固貝夏季大夫艱^E亡的直鶴原。目前，對于AVNV^^鋪效的治^r法，樹亍扇貝 #§1技術(shù) 是最W^的預(yù)P^t施，而這主對繊于早期的'^I檢測。因此，研發(fā)鵬、M、靈敏和實(shí)用的檢測技 術(shù)，加強(qiáng)苗種和成貝鵬以及^M7K^^鴻的監(jiān)測，對明確病 #播途徑，制^t^的防治措施，以保
障扇貝靜她的鶴撫賣賺具^m意義。
目前，對于A麗的檢測方法主要包括傳鄉(xiāng)彌理學(xué)施、電子顯微鏡獄、免疫學(xué)施(主要 ^免疫吸附微ELISA、間接免疫熒光檢測法)和被電鏡,[I聚^^;鵬(PCR)等。這 些檢測方法有徵萬需要辦才料希恪熟貞，操作鋭，費(fèi)用高，有敏微斜頓求高，樹則時(shí)間長，有
些方法靈繊不高，特異性不強(qiáng)，M性樹氐。因此，操作人員掌握關(guān)鍵的檢測fe7^feg大，難以用于
瓛ll樹則，限制了a^^術(shù)在u^的檢測、被的細(xì)。
環(huán)介導(dǎo)^M擴(kuò)增(Loopmediated Isothermal Amplification,簡^LAMP技術(shù))，^fi^來^M^的 一種^W離異核斷段的技術(shù)，由于其操作簡便、'腿、靈敏、特異蹈駢可用于鵬檢測辦點(diǎn)， 因 #51^實(shí)踐中具 的自價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了^艮已有檢則獄的S^限性，石雕'J一種扇貝急'醜毒性i^穀亥M^ 擴(kuò)增檢測試劑敘微測施，鵬貝急醜毒性i^毒的檢測更繊、靈敏、鵬、錢和方便。
本發(fā)明^S于2000年由Notomi等發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)^T增技術(shù)。本發(fā)明針對AVNV基因保守序列 的6個(gè)區(qū)段，設(shè)計(jì)4斜寺異引物并利用一種具有髓換活性的DNA聚彌，在一定a^T又報(bào)Ma行 ^a擴(kuò)增。禾,該4條LAMP引物，可以特異粗魁廣增麟AVNV待檢樣品的有幾因片段，所粒 的優(yōu)化LAMP樹則體系保證飽則結(jié)果的鵬性、糊性和穩(wěn)定性。砂激壯優(yōu)柳設(shè)計(jì)，將檢測方法 標(biāo)準(zhǔn)化，配套化，同時(shí)將檢測試齊瞧中于規(guī)范的淑U盒中，Jli乓扇貝急'醜毒性i^毒的基因診臓 劑紐檢測施。
本發(fā)明的扇貝急I^毒性^E病毒的基因診,U盒由下列部件構(gòu)成
(1) 研磨液，l管，內(nèi)裝SEMP采樣液，SEMP采微由以下組傷^賊1M的三羥甲基錢甲垸 (Tris-HCl， pH8.0): 0.5 15fe、； 0.5 M的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA): 0.5 15份；10%的十二^§1
,(SDS): 0.5 15份；統(tǒng)基乙醇0.01 0.5份；平衡舊10 30份；雙穀JC:定糊100份；
(2) 核翻提液A， l管，內(nèi)裝濃度為4M的乙M， pH為5,2;(3) 核,提液B， l管，內(nèi)^7乂乙醇；
(4) 核,提液C， l管，內(nèi)裝70%的乙瞎
(5) TE緩沖液，l管，內(nèi)裝TE緩沖液(lOmMTris-HCl和lmMEDTA， pH8.0);
(6) LAMP^S^液，l管，內(nèi)裝LAMP^Z液，包括雙蒸^C、 MgCl2、 dNTP、 Betaine (甜 )、 Tris-HCl 、 KC1 、 MgS04、 (NH^SQ^ Triton X-100、 LAMP內(nèi)引物AVNV-FIP和AVNV-BJP、 LAMP 夕卜弓胸AVNV-F3和AVNV-B3以及5對DNA聚娜；
(7) 顯色劑，l管，內(nèi)裝核麟料GeneFinder頂；
(8) 陽'M照核酸，l管，內(nèi)裝AVNV陽'I4^粒DNA;
(9) 研磨棒，4支；
(10) 盒子；
(11) 一i^^:子中的泡沫板，其上有Mi^各小管的多個(gè)/J吼。
上述的LAMP弓物是鵬AVNV基因保守EJ^列設(shè)計(jì)的，LAMP弓嫩設(shè)計(jì)的軟件是PrimerExplore 4.0 (http:〃primercxplora:jp /elamp4.0.0/index. html) 。 LAMP弓l物的DNA序歹收口下 AVNV-FIP: 5'-GACATCTGGCGGTArnTCAATATGTmTGCAGnTAAATCTCCCAAC AVNV-BIP: 5'-GGTTAGArCTACAATTGCGCCArnTCACCATrcrnTGACACAGG AVNV-F3: 5'-GTGCTGAGACGGAATGTG AVNV隱B3: 5'-TGGATGACACCCTTATGC
用本發(fā)明J^淑lj^^測扇貝急'醜毒性i^毒的方法，按下列步lia行
(1) TO貝樣品的夕瞎膜、腎^FMI楚且雜勺0.02 0.06g置于離心管中，力口入200nL研磨液，用 研磨驗(yàn)樣品充分磨碎致狀；
(2) 4執(zhí)開磨好的樣品以5000 10000r/min，離心2 5min，取100pL上清體^f 的離心管中；
(3) 力口入核^i取液A中鵬為4M的乙,，上下顛倒混勻，再加入核^i取液B中-20 。C 予敏令的^7jC乙醇，并上下顛倒充分混合，以10000 15000r/min離心5 10min，小ll棄上清液保留沉淀 物；
(4) 用核^I取液C中濃度為70%的乙醇洗滌±^沉淀物，然后以10000 15000r/min離心5 10 min，棄上清液保留沉淀物；
(5) 重復(fù)步驟(4) 一次，然后將離心管底M:淀物置于室溫晾干，力口入50 100nLTE緩沖液溶 M^淀物，ff^品的核酸；
(6) 將Jd^樣品核酸和陽'l4Xt照核^"AVNV陽'I4M粒DNA于95 。C保溫3 5 min，讓DNA雙 艦爐鏈，然后再ffiiia于蹄燭中2 5min，目的劍吏繊廳鵬呈兩條單艦態(tài)。
(7) ^Lh^d3ijS的樣品核酸和陽'teXt照核酸分別置預(yù)的小管中，向齡小管中分別力DALAMP 鵬瓶并混勻；
(8) 將J^小管于59 64T保溫45 70min，然后于80T保溫3 5min進(jìn)行LAMPg;
(9) LAMP ffi^束后，向^M、管中力口入GeneFinder1^并混勻，然后肉目歐見^i孵品的LAMP ^i^果，如腿恭ffe則^^樣品的AVNV檢測結(jié)果為陽性，如驟示橙黃色則^i^樣品的AVNV樹則結(jié)果為陰性。
本發(fā)明的有^^^在于在試齊瞼中包括AVNV檢測所需的SEMP采樣液、核,提液、LAMP 反應(yīng)液和顯色劑等試齊訴口器材，使得A麗fi^測育辦簡便、'鵬陏序鵬行，實(shí)現(xiàn)了檢測過程的程 m^n標(biāo)準(zhǔn)化；本發(fā)明的試劑^^檢測方法是以t離AVNV基因保守,列設(shè)計(jì)的4條LAMP弓鵬為 主體設(shè)計(jì)的，使AVNV檢測完全具有了LAMP技糊便腿、靈敏、特異和可用節(jié)貼湯檢測的特點(diǎn)； {頓本發(fā)明的微1^^檢測方法在2小時(shí)內(nèi)就可5^g AVNV的檢測，檢測過禾玩需昂貴的儀器設(shè)備如 PCR儀稱^^像系統(tǒng)，僅需要水^I咼^M浴和離心機(jī)即可，具w^r用于^t湯檢測的優(yōu)點(diǎn)，而且檢測
結(jié)果肉眼可以判別；與AVNV己有檢測技糊比，本發(fā)明的試劑舒B樹則方法具有更高的特異性、靈敏 性和便捷性，MM ， ^3i程稀及有毒試劑，鵬乍人員和環(huán)凝,常錢，檢測靈i^低 至30個(gè)病毒拷貝；^f頓本發(fā)明的i敘U^^檢測方法，可以在劍牛相鵬陋的實(shí)^^tJI^行AVNV
檢測，；b^優(yōu)于傳^n常規(guī)的生物^^測方法?？傊?，^ffl本發(fā)明的^im^銜則方法可以簡便、',、
靈敏而特異地檢測感染AVNV的扇貝，也可以用于檢測其它生鵬帶AVNV的瞎況，而且可以用豫 駄解境的監(jiān)測，具撤高的實(shí)用價(jià)值。
以下iffil具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)j說明。
本發(fā)明的試齊嗆由以下鄉(xiāng)賊(4樣份)
(1) 研磨液，l管，內(nèi)裝800mLSEMP采祥液，SEMP采樣液的^tE在于是由lM的三羥甲基錢 甲烷(Tris-HCl， pH8.0) 10份，0.5M的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 1份，10%的十二^8^, (SDS) 10份，J儘乙醇O.Ol份，平衡酚20份，以)5^7K定額ij100份而成。
(2) 核魁由提液A， l管，內(nèi)裝400mL4M乙酸鈉(NaAc， pH5.2)。
(3) 核,提液B， l管，內(nèi)裝800pL^7]C乙醇。
(4) 核m提液C， l管，內(nèi)裝800mL70。/。的^7K乙醇。
(5) TE緩沖液，l管，內(nèi)裝200mLTE緩沖液(lOmMTris-HCl和lmMEDTA， pH8.0)。
(6) LAMPSiS液，l管，內(nèi)裝100LAMP a^液，^(#|1在于它的纟5^￡分和比例如下弓胸 AVNV-FIP和AVNV-BIP各1.6mM，引物AVNV-F3和AVNV-B3各0.2MM，dNTP1.6mM， MgCl26mM， Betaine 1 M, Tris-HCl 20 mM， KC110mM， MgS042mM， (nh4》SO410mM， Triton X-100 0.1%， 聚饑0,35U/mL。
(7) 顯色劑，l管，內(nèi)裝8ML50倍離的核m^料GeneFinder氣
(8) 陽fiXt照核酸，l管，內(nèi)裝8MLAVNV陽'I4J^粒DNA。
(9) 研磨棒，4支。
(10) 盒子(78x78x50 mm)。
(11) 一i嫉^ ^子中的泡沫板，泡 與戰(zhàn)盒子的底面大小，高22 mm，有三列空，第一列和 第二列都是3個(gè)空，孔徑10mm，第三列5個(gè)空，孔徑5.5mm， J^各小管方爐i^小孔中。i敘搶中戶腿的LAMP弓胸的DNA序列如下 AVNV-FIP: 5'-GACATCTGGCGGTATnTCAATATGTTnTGCAGTnAAATCTCCCAAC AVNV-BIP: 5'-GGTrAGATCTACAArTGCGCCArnTCACCATrCTnTGACACAGG AVNV-F3: 5'-GTGCTGAGACGGAATGTG AVNV-B3: 5'-TGGATGACACCCTTATGC
該試劑盒中的陽'斷照核^m含AVNV核酸的DNA質(zhì)粒。具^i^作是在PCRSi^，用試劑 盒回收相關(guān)片段，然后雜到質(zhì)米孅體上，轉(zhuǎn)入^^桿菌五o^中，經(jīng)氨節(jié)^#^￥板擴(kuò)力歸，^陬 附性克隆，進(jìn)一步酶切和測序齒正，提取陽性克隆的質(zhì)粒并測定質(zhì)粒DNA濃度，繊到104個(gè)拷貝，即 可作為陽艦照核酸。
鄉(xiāng)例2
本發(fā)明的扇貝急',毒性^^毒LAMP檢測方法 4頓 例1中的i敘臉，按下列步 i3t行
(1) 取怖孑1^貝的夕瞎膜組織約0.1經(jīng)置于離心管中，力口入200^研磨液，用研磨樹各樣品充分 磨碎致狀o
(2) )l執(zhí)開磨好的樣品以10000i/min離心2min，取100^上清體 的離心管中。
(3) 力口入100mL核^I取液A，上TM到混勻，再加入200nL核^i取液b (誦20T預(yù)冷)上下 顛倒充分混合，以12000 r/min離心10 min，小心棄上清液，保留沉淀物。
(4) 力口入100ML核^^取液C洗滌沉淀物，然后以12000r/min離心5min，小A棄去上清液，保 留沉淀物。
(5) 重復(fù)步驟(4) 一次，然后將離心管底^:淀物于室溫晾干，力口入50MLTE緩沖液溶lf^淀 物，得到樣品的核酸。
(6) 將J^樣品核酸和陽14^照核^^95。C保溫5min，立刻置于冰上2min。
(7諏2nL J^樣品核酸和陽'l4Xt照核齢別置ffi的小管中,向^t中分別加入23 mLLAMP 鵬瓶混勻。
(8) 將，小管于60 保溫60 min，然后于80 T保溫3 min進(jìn)行LAMP ^j3Z。
(9) LAMP ^SI^束后，向^^小管中力口入2 pL顯色劑，并混勻，然后肉鵬見穀皮測樣品的LAMP Si^果，如親恭絶則^i^樣品的AVNV樹則結(jié)果為陽性，如^M示橙黃色則^i^樣品的AVNV 檢則結(jié)果為陰性。<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研^^f
<120>扇貝急f彌毒性壞死病毒核酸^^擴(kuò)增檢測試劑^^檢測方法
<160> 4
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> AX序列
<220>
<223>根據(jù)扇貝急性病毒性壞死病毒基因組序列和等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求而設(shè)計(jì)，用 作扇貝急性病毒性i^E病毒等顯擴(kuò)增檢測的FIP弓嫩
<400> 1
gacatctggc ggtattttca atatgttttt gcagtttaaa tetcccaac 49
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
〈13> AX序列
<220>
<223>根據(jù)扇貝急性病毒性壞死病毒基因組序列和，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求而設(shè)計(jì)，用 作扇貝急性病毒性壞死病毒等顯擴(kuò)增檢測的BIP弓胸
<400> 2
ggttagatct acaattgcgc cattttcacc attcttttga cacagg 46
<210> 3 <211> 18
<212> DNA <213> AX序列<220>
<223>根據(jù)扇貝急性病毒性壞死病毒基因會游列和^M擴(kuò)增弓胸設(shè)計(jì)要求而設(shè)計(jì)，用 作扇貝急'醜毒性WE病毒離擴(kuò)增檢測的F3引物
<400> 3
gtgctgagac ggaatgtg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> AX序列
<220>
〈23>根據(jù)扇貝急性病毒性壞死病毒基因鄉(xiāng)，列和#^擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求而設(shè)計(jì)，用 作扇貝急性病毒性頓病毒等顯擴(kuò)增檢測的B3引物
<400> 4
tggatgacac ccttatgc 18
權(quán)利要求
1.一種扇貝急性病毒性壞死病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒，其特征是該試劑盒包括(1)研磨液，1管，內(nèi)裝SEMP采樣液；(2)核酸抽提液A，1管，內(nèi)裝濃度為4M的乙酸鈉，pH為5.2；(3)核酸抽提液B，1管，內(nèi)裝無水乙醇；(4)核酸抽提液C，1管，內(nèi)裝70％的乙醇；(5)TE緩沖液，1管，內(nèi)裝TE緩沖液，包括10mM Tris-HCl和1mMEDTA，且pH為8.0；(6)LAMP反應(yīng)液，1管，內(nèi)裝LAMP反應(yīng)液，包括雙蒸水、MgCl2、dNTP、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Triton X-100、LAMP內(nèi)引物AVNV-FIP和AVNV-BIP、LAMP外引物AVNV-F3和AVNV-B3以及Bst DNA聚合酶；(7)顯色劑，1管，內(nèi)裝核酸染料GeneFinderTM；(8)陽性對照核酸，1管，內(nèi)裝AVNV陽性質(zhì)粒DNA；(9)研磨棒，4支；(10)盒子；(11)一塊裝于盒子中的泡沫板，其上有放置上述各小管的多個(gè)小孔。
2. 如權(quán)利要求1中所述的試劑盒，其特征在于4條LAMP引物的DNA 序列如下AVNV-FIP:AVNV-BIP:AVNV-F3: 5'陽GTGCTGAGACGGAATGTG; AVNV-B3:5'-TGGATGACACCCTTATGC 。
3. —種檢測扇貝急性病毒性壞死病毒的方法，其特征是使用權(quán)利要求 1中所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(1) 取樣品扇貝的外套膜、腎或肝胰腺組織0.05 0.1 g，置于離心 管中，加入200 pL研磨液，用研磨棒將樣品充分磨碎至漿狀；(2) 將研磨好的樣品以5000 10000r/min離心2 5 min，取100 |xL上清液置于新的離心管中；(3) 加入核酸抽提液A中濃度為4M的乙酸鈉，上下顛倒混勻，再 加入核酸抽提液B中-20°(3預(yù)冷的無水乙醇并充分混合，以10000 15000 r/min離心5 10min，棄上清液保留沉淀物；(4) 用核酸抽提液C中濃度為70%的乙醇洗滌上述沉淀物，然后以 10000 15000 r/min離心5 10min，棄上清液保留沉淀物；(5) 重復(fù)步驟(4) 一次，然后將上述離心管底部的沉淀物于室溫晾 干，再加入50 100pLTE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品的核酸；(6) 將上述樣品核酸和陽性對照核酸一AVNV陽性質(zhì)粒DNA于95°C 保溫3 5min，立刻置于碎冰中2 5 min;(7) 取上述處理后的樣品核酸和陽性對照核酸分別置于新的小管中， 向每個(gè)小管中加入LAMP反應(yīng)液，并混勻；(8) 將上述小管于59 64°C保溫45 70 min，然后于80 。C保溫3 5 min進(jìn)行LAMP反應(yīng)；(9) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，向每個(gè)小管中加入GeneFinderTM，并混勻， 然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)結(jié)果，如果顯示綠色則表示該樣品的 AVNV檢測結(jié)果為陽性，如果顯示橙黃色則表示該樣品的AVNV檢測為陰 性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種扇貝急性病毒性壞死病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法。試劑盒包括SEMP采樣液、核酸抽提液、LAMP反應(yīng)液、顯色劑和AVNV陽性對照核酸等試劑和多種器材。檢測方法是以扇貝急性病毒性壞死病毒基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的4條引物對扇貝急性病毒性壞死病毒的特異性核酸片段進(jìn)行定性檢測，簡便快速，靈敏度高，特異性好，特別是方便用于現(xiàn)場的快速檢測。利用本發(fā)明僅需一個(gè)水浴鍋即可在2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測出扇貝和養(yǎng)殖水體中低至30個(gè)拷貝的病毒粒子?？捎糜谏蓉愷B(yǎng)殖過程中各時(shí)期的病毒跟蹤檢測，有望替代組織病理學(xué)方法、電子顯微鏡技術(shù)、免疫學(xué)方法和PCR檢測等方法。
文檔編號C12Q1/70GK101633962SQ200910017490
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月9日
發(fā)明者任偉成, 張慶利, 王崇明, 蔡玉勇, 倢 黃 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所