專利名稱：：一種熱帶假絲酵母發(fā)酵分離阿拉伯糖的用途與高純度阿拉伯糖分離產物的制藥、保健用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及熱帶假絲酵母發(fā)酵分離阿拉伯糖的用途與高純度阿拉伯糖分離產物的制藥、保健用途。
背景技術：
：半纖維素是植物細胞壁中除纖維素之外的聚糖類，含量隨不同植物而有所差別，大致占植物體重量的20-35%，是地球上除纖維素之外最豐富的多糖。纖維素是完全由葡萄糖單元聚合成的均一性聚糖，而半纖維素則主要是由木糖以β-(1-4)糖苷鍵構成主鏈，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支鏈結構的非均一性聚糖。半纖維素的木聚糖主鏈一般含有50-150個木糖單位，無結晶結構，結合在纖維素微纖維的表面。半纖維素比纖維素容易水解得多，用稀酸在100_13(TC條件下，就很容易將半纖維素，水解生成以五碳糖為主要成分的半纖維素水解物。發(fā)酵半纖維素水解物生產市場容量大的木糖醇、乙醇等各類化工產品，是能夠大規(guī)模利用半纖維素資源的有效途徑。雖然用稀酸將半纖維素水解生成以單糖為主要成分的水解物的過程并不困難，但是，稀酸水解過程會伴隨產生一系列微生物代謝抑制物，要改善半纖維水解物的發(fā)酵性能，必須除去其中的微生物代謝抑制物，即脫毒過程是必不可少的。目前在半纖維素水解物中已鑒定的毒物成分已經有幾十種，其中代表性毒物包括三大類，即糠醛類化合物，如糠醛，5-羥甲基糠醛；脂肪酸類化合物，如甲酸，乙酸，丙酸；木質素降解生成的一系列含有苯環(huán)的化合物，如愈創(chuàng)木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已經報道真空蒸發(fā)，溶劑抽提，活性炭吸附，大孔樹脂吸附，離子交換樹脂處理，都可以脫去某些毒物，改善水解物的發(fā)酵性能。然而，一種物理或化學方法只能除去某一類有毒物質，通常需要聯(lián)合采用多種理化措施處理，半纖維水解物才能達到比較好的脫毒效果。但是，脫毒是一個耗費成本的過程，同時使用多種理化措施對半纖維素水解物進行脫毒處理，必須大幅度提高產物發(fā)酵的成本。事實上，自然界的一些微生物對半纖維素水解物中的某些毒物具有降解活性。例如，例如降解木質素及由木質素降解生成的一系列酚類化合物的白腐菌(林海陸鋼張慶娜，降解造紙廢水木質素菌種的篩選鑒定及應用，北京科技大學學報。2007，29(6)569-573；陶楊廖俊和羅學剛，生物制漿技術最新應用研究進展。纖維素科學與技術。2007，15(1):70-74，降解糠醛，5-羥甲基糠醛細菌，酵母(代書玲，張魯嘉，糠醛及其衍生物微生物降解(轉化)研究進展。氨基酸和生物資源2007，29(4)41-45；劉愛平許學書樊行雪，利用酵母生物轉化植物纖維為乙醇的研究進展。生物技術通訊，2004，15(2)193-196)，降解短鏈脂肪酸的子囊菌(何剛強堵國成劉立明，嗜熱子囊菌利用短鏈有機酸生產角質酶。生物工程學報，2008，24(5)821-828)近年有人開始嘗試以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶與過氧化物酶聯(lián)合處理木材酸水解物，能除去了大部分的單環(huán)酚性物(monoaromaticphenoliccopounds)0處理后的水解物用于乙醇發(fā)酵，結果葡萄糖消耗速率與乙醇生成速率提高了近5倍(JonssonJL,PalmqvistE,NilvebrantN0.,Detoxificationofwoodhydrolysateswithlaccaseandperoxidasefromthewhite-rotfungusTrametesversicolor.Appl.MicrobiolBiotechnol.1998，(49):691_697))。但復雜的毒物成分需要復雜的酶系的聯(lián)合降解，這無疑大大增加了脫毒的成本。Lopez等人以微生物ConichaetaligniariaNRRL30616發(fā)酵處理木質纖維稀酸水解物，不僅去除糠醛、5-羥甲基糠醛的效果顯著，同時也明顯減少了水解物中的酚類物質。經過這一菌株處理的水解物再用產乙醇酵母發(fā)酵，80h產生1.66%°乙醇，而未處理的去口沒有乙酉享產生(LopezJΜ,NicholsNN,DienBSetal.Isolationofmicroorganismsforbiologicaldetoxificationoflignocellulosechydrolysates.ApplMicrobiolBiotechnol.2004,64(1):125_131)。上述研究表明，利用微生物降解木質纖維水解物中復雜有毒物質是可能實現(xiàn)的。尤其是，如果能夠獲得一種同時具備降解半纖維水解物中的三大代表性毒物的代謝系統(tǒng)，即可以同時降解糠醛、脂肪酸及含有苯環(huán)結構化合物的微生物，并且這種微生物又不能利用木糖的話，那么直接利用這種微生物發(fā)酵半纖維水解物進行脫毒物質處理，就能有效克服現(xiàn)有理化脫毒方法工藝繁瑣、成本高的缺點，并具有環(huán)境友好的優(yōu)勢。此外，半纖維素容易水解，用稀酸或酶處理植物纖維材料，很容易生成以木糖、阿拉伯糖為主要糖類，還包括其它雜糖的水解物。只有將半纖維素水解物中的木糖、阿拉伯糖分別純化出來之后，它們才能實現(xiàn)各自的商業(yè)應用價值。純凈的木糖主要用途是制備木糖醇。木糖醇由木糖還原生成，具有甜度與蔗糖相當，無致齲性，在體內代謝不需胰島素參與，也不會造成血糖的急劇變化等重要特性，在防齲齒食品，糖尿病人食品具有重要的應用價值。純凈的阿拉伯糖不僅風味與蔗糖極為相近，它的許多特殊的功能也引起了人們的廣泛關注。例如阿拉伯糖能夠抑制蔗糖酶的活性，從而抑制人體對蔗糖的吸收，可用于控制因食用蔗糖引起的血糖升高；阿拉伯糖具有抑制脂肪合成酶的活性，可用于預防肥胖。此夕卜，阿拉伯糖還可用作合成核苷類藥物的中間體，在醫(yī)藥工業(yè)中有應用范圍。然而，無論木糖或阿拉伯糖，只有達到很高的純度之后才可能體現(xiàn)出較高的商業(yè)價值。木糖、阿拉伯糖的分離純化，就成為其制造過程中極為重要的環(huán)節(jié)。美國專利6，086，681，(從溶液中回收木糖的方法，Methodforrecoveryofxylosefromsolutions,UnitedStatesPatent(2000)6，086，681)提供了一種以結晶工藝從植物纖維的稀硫酸水解物中分離木糖的方法，該法將純度為30-60%(對總糖)的木糖溶液濃縮到木糖過飽和，然后冷卻析出晶體木糖。不過這一發(fā)明沒有涉及如何分離殘余在母液中的木糖，也沒有涉及如何分離已知存在于水解物中的阿拉伯糖。美國專利6，872，316(木糖的回收，Recoveryofxylose,UnitedStatesPatent(2005)6，872，316)提供了一種納濾(nanofiltration)工藝提高植物纖維水解液中的木糖純度的方法。因為木糖能夠較容易地透過納濾膜，其它雜質如低聚糖、二價鹽，己糖，色素等則較多地被截留濾膜內側。因而植物纖維水解液的納濾透過液的木糖純度，可比原始水解液提高1倍以上，其后續(xù)的離子交換，脫色等工藝負擔也隨之減輕。在這一發(fā)明中，阿拉伯糖與木糖一樣容易透過納濾膜，因此它不能實現(xiàn)木糖與阿拉伯糖之間的分離。另外，納濾對于單糖的分離效果也是十分有限的。陽離子對單糖(或糖醇)有吸附作用，利用攜帶有陽離子材料作色譜填料分離不同的單糖或糖醇，是人們從多種單糖的混合溶液中分離目標單糖(或糖醇)的手段之一。美國專利6，506,89用甜菜根制備阿拉伯糖，MethodofpreparingL-arabinosefromsugarbeetpulp.UnitedStatesPatent(2003),6，506，897提供的一種制備阿拉伯糖的方法，包括了下幾個步驟a)用強堿溶液提取已經榨過糖的甜菜根。b)用強酸水解前一步驟所獲得的粗阿拉伯聚糖。c)酸水解液中和，過濾。d)用單價陽子樹脂(選用鈉，或鉀型)作為分離樹脂，色譜分離出阿拉伯糖組分。e)經陽、陰離子交換樹脂及吸附樹脂進一步純化所獲得的阿拉伯糖溶液。f)結晶回收晶體阿拉伯糖，純度98%以上。這一專利先用堿提取物料，再用酸水解的工藝顯然比較繁瑣，另外，專利中有介紹水解液中是否存在木糖，也沒有介紹如何分離木糖的問題。中國專利01816511.7(
專利名稱：弱酸陽離子交換樹脂色譜分離法從溶液中回收單糖；國際申請PCT/FI2001/0008482001.9.28；專利權人芬蘭，達尼斯科甜味劑股份有限公司；發(fā)明人H?；R，J云帕伊寧等)介紹了利用結合了Na+、Mg2+、H+或Ca2+型的弱酸性陽離子交換樹脂用于色譜分離，使用包括至少一個步驟的色譜分離的多步驟工藝，從含鼠李糖、阿糖、木糖和其混合物的單糖的溶液中回收選自鼠李糖、阿拉伯糖(阿戊糖)、木糖和其混合物的單糖的方法。這一專利的正文及附圖描述均顯示，它所提供的色譜分離方法中，其木糖組分與阿拉伯糖的組分并未完全分離。此外，它也未述及選擇性轉化糖為糖醇，以及如何進行糖醇與糖之間的分離問題。除了將陽離子交換樹脂上作為糖的色譜分離填料之外，一些結合了陽離子的無機材料也被用于糖類的分離純化。美國專利4，664，718從戊糖/己糖混合物中分離阿拉伯糖的方法；Chang；Chin-Hsiung,Processforseparatingarabinosefromapentose/hexosemixture()。UnitedStatesPatent(1987)，4，664，718介紹了以鈣Y-型沸石，或鈣X-型沸石作吸附齊U，從戊糖/己糖混合物中分離阿拉伯糖的方法，但這一專利沒有涉及分離回收木糖，或木糖醇。美國專利4，857，從其它醛糖混合物中分離阿拉伯糖的工藝；Kulptathipanja,Processforseparatingarabinosefromamixtureofotheraldoses,UnitedStatesPatent(1989)，4，857，642介紹用銨X-型沸石作吸附劑，從其它醛糖混合物中分離阿拉伯糖的方法。美國專利4，880，919從醛糖混合物中分離阿拉伯Hl^J工；Kulptathipanja,Processforseparatingarabinosefromamixtureofa1doses,UnitedStatesPatent(1989)，4，880，919介紹用鈣-銨型混合的陽離子交換樹脂作吸附劑分離阿拉伯糖。這兩個專利也均未涉如何回收木糖或木糖醇的問題。以水為洗脫劑，單糖、糖醇在陽離子樹脂(或沸石)上的色譜分離效果，取決于它們分子結構的親/疏水性能。具有相同碳原子數(shù)的同一類糖(例如，屬于五碳醛糖的木糖與阿拉伯糖)，或具有相同碳原子數(shù)的糖醇(如五碳的木糖醇與阿拉伯糖醇)之間，彼此互為同分異構體，而其化學性質十分相近，同一種陽離子樹脂對它們之間吸附能力的差異也就很小。所以，無論用陽離子樹脂(包括Na+、Mg2+、H+或Ca2+)直接分離半纖維素水解物中的五碳糖(木糖與阿拉伯糖)，或者是分離水解物經化學氫化后所生成的醇液(糖生成相應的醇)，都存在設備分離效率不高，產品的收率與純度偏低等難于解決的困難。為了提高分離效率，許多學者采用了生物發(fā)酵輔助純化的手段，即利用只能同化特定單糖的微生物選擇性除去不需要的糖類，使水解液中目標單糖的純度相對提高，以提高后續(xù)分離工序的效率。Nyun等人NyunHoPark,ShigekiYoshida,AkiraTakakashi,etal.AnewmethodforthepreparationofcrystallineL-arabinosefromarabinoxylanbyenzymatichydrolysisandselectivefermentationwithyeast.BiotechnologyLetters2001，23:411_416用來源于繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)培養(yǎng)物的粗酶液水解富含阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan，含28.阿拉伯糖，32.8%木糖)的玉米皮，結果有21.3%(w/w)阿拉伯糖，18.7%(w/w)木糖被水解出來。此外，水解物中還含有一些其它單糖及低聚糖。水解物用能夠代謝木糖，但不能代謝阿拉伯糖的土星擬威爾遜酵母(ffilliopsissaturnus)通氣培養(yǎng)96小時，結果95%%的阿拉伯糖在發(fā)酵液中保存下來，而木糖僅殘留量只相當于原始阿拉伯木聚糖重量的0.002%。這種發(fā)酵液經活性碳脫色，離子效換樹脂脫鹽，濃縮后結晶，所獲得的晶體中未檢測出木糖。用生物發(fā)酵選擇性地除去木糖的方法，雖然可以解決阿拉伯糖與木糖難于分離的困難，但卻浪費了寶貴的木糖資源。李道義等人李道義，閆巧娟，江正強等(中國農業(yè)大學)，酵母菌發(fā)酵玉米皮酸水解液制備結晶L-阿拉伯糖。食品科學，2007，28(4)125-127，用自己篩選的酵母菌株WYS15-3發(fā)酵玉米皮的稀酸水解物7天，結果選擇性地除去了水解液中的葡萄糖與木糖。發(fā)酵液經脫色，脫離子、濃縮結晶等步驟，獲得含量為97%的阿拉伯糖，得率為玉米皮干基的9.6%。按這一實驗所用的菌株與方法純化玉米皮水解液制備阿拉伯糖，不僅沒有利用木糖資源，而且生產過程太長(7天)。此外，由于所用酵母菌株不能同化水解液中的半乳糖，存在于阿拉伯糖過飽和溶液中的半乳糖，直接影響了阿拉伯糖的結晶收率。中國專利200510040433.0
專利名稱：一種從木糖母液或木糖水解液提取木糖和木糖醇的方法；發(fā)明人彭奇均提供了一種從木糖水解液或木糖母液中分離制備高純度木糖或木糖醇的技術。具體方法是以木糖水解液或木糖母液為原料，以釀酒酵母發(fā)酵除去其中的葡萄糖，以合成的專用鈣型陽離子樹脂作為色譜分離樹脂，以水為洗脫劑，通過模擬移動床使木糖與阿拉伯糖等雜質分離，得到富含木糖的組分。或者將富含木糖，阿拉伯糖的糖液直接氫化，使它們生成為相應的醇之后，再通過模擬移動床色譜分離，獲得不同的糖醇組分。但是，在本發(fā)明的舉例中，分離水解液(糖液)的過程未能將木糖與其它雜糖(主要是阿拉伯糖)徹底分離，將水解液中的糖加氫還原為糖醇之后再進行的色譜分離，也未能將不同的糖醇(主要是木糖醇與阿拉伯糖醇)徹底分離。此外，這一專利雖然已經使用了微生物除葡萄糖的技術，也介紹了糖液氫化后木糖醇的分離，但并沒有涉及如何選擇性地將木糖轉化為木糖醇，然后再將木糖醇與其它的糖分離的問題。由于以水為洗脫劑的離子色譜法在分離糖類方面的固有缺陷，人們也嘗試用其它的方法解決這一問題。美國專利2006010042從單糖混合物中分離與制備阿拉伯糖及木糖的工藝Hollingsworth；RawleI，Processforthepreparationandseparationofarabinoseandxylosefromamixtureofsaccharides；UnitedStatesPatentApplication，20060100423]利用單糖與酮或醛試劑反應，生成糖乙縮醛(acetalsofthe7saccharides)，根據(jù)不同的糖乙縮醛對極性、非極性有機溶劑溶解性能的差異，可以使不同的糖乙縮醛彼此分離，最后再分別將其水解為相應的單糖。不過，大量使用有機溶劑在工業(yè)生產中的缺點是顯而易見的。馮亞青等人介紹馮亞青，劉燕同，張曉東等，從L-阿拉伯樹膠提取L-阿拉伯糖，精細化工，2003，20(5):288-290，以微晶纖維素，或硅膠為固定相，以正丁醇、乙酸乙酯、異丙醇與水的混合物為流動相，連續(xù)進行二次色譜分離，最后可獲得含量99%的阿拉伯糖晶體。但是，本文并沒有使來源于植物細胞壁的半纖維素作原料，它所介紹利用有機溶劑作為流動相的色譜分離方法，在大規(guī)模工業(yè)性生產中也存在諸多的安全隱患。綜上所述可見，當前工業(yè)化生產木糖醇的化學工藝、或直接從半纖維水解物中分離阿拉伯糖，都無法解決木糖與阿拉伯糖之間難于分離的問題。此外，由于化學還原過程的非選擇性，以現(xiàn)有的化學工藝也無法直接利用半纖維素水解物同時制備出木糖醇與阿拉伯糖。微生物也能夠催化木糖生成木糖醇。利用微生物直接發(fā)酵半纖維素水解物生產木糖醇，由于具有節(jié)能，無需化學工藝所必不可少的木糖純化過程等優(yōu)勢，已經引起人們的極大關注。但目前發(fā)酵法生產木糖醇的效率還很低，盡管相關的研究報道甚多，但大多數(shù)仍局限于半纖維素水解物的制備方法，木糖醇發(fā)酵工藝優(yōu)化方面。從木糖發(fā)酵液制備結晶木糖醇方面的研究甚少，也沒有人研究發(fā)酵工藝木糖醇與阿拉伯糖制備相結合的問題。本發(fā)明人蔡愛華，張厚瑞，何成新等從蔗渣半纖維素水解物發(fā)酵液中分離純化木糖醇。食品科學。2006，27(7):136-139曾經介紹，蔗渣半纖維素水解物發(fā)酵液經超濾處理，超濾透過液經離子交換柱層析脫鹽之后，再經活性炭脫色，這種木糖醇液濃縮至可溶性固形物含量為80%，即可結晶得到含量>98.5%的木糖醇產品。本發(fā)明人在該報道中還注意到，結晶母液的阿拉伯糖濃度超過木糖醇濃度的45.0%，木糖濃度超過木糖醇濃度的12.6%時，它們都容易隨木糖醇一起結晶析出。如果發(fā)酵液中的木糖或阿拉伯糖超過這一濃度比例范圍，將難于通過結晶的方法有效純化出木糖醇。這一由發(fā)酵液制備結晶木糖醇工藝的特點是，將發(fā)酵液凈化處理之后直接濃縮結晶，得出木糖醇晶體產品，剩下難以進一步結晶純化，含有木糖醇，阿拉伯糖，木糖等成分的結晶母液。發(fā)明人當時顯然沒有意識到木糖醇發(fā)酵與阿拉伯糖提取結合的問題。丁興紅等人丁興紅夏黎明影響半纖維素發(fā)酵液中分離純化木糖醇關鍵因子的研究。中國食品學報。2006，6(6):87-90以木糖醇溶液與半纖維素發(fā)酵液為研究對象，考察了木糖醇初始濃度、殘?zhí)?阿拉伯糖)、晶種和結晶溫度對木糖醇結晶動力學的影響，并確定了木糖醇初始質量濃度為750g/L，結晶溫度為-4°C。在木糖醇溶液中添加1%。木糖醇晶種，能縮短結晶誘導期的延續(xù)時間，提高結晶速度。木糖醇溶液中少量的阿拉伯糖能提高木糖醇結晶速度，但當阿拉伯糖質量濃度高于120g/L時，木糖醇晶體的純度會降低。這篇報告所述工藝路線，也是將凈化后的發(fā)酵液直接濃縮，濃縮液直接結晶制出木糖醇產品。雖然它提到了發(fā)酵液中阿拉伯糖的存在將影響木糖醇晶體的純度，但并沒有論述木糖醇與阿拉伯糖之間的分離問題。應國清等人應國清，王普，張峰，虞炳鈞發(fā)酵法生產木糖醇的分離純化工藝。中國醫(yī)藥工業(yè)雜志。2002，33(3):117—123則在含有殘余木糖的發(fā)酵液(轉化液)中加入一定濃度的NaOH，沸水回流約2h，將殘留在發(fā)酵液中的木糖降解為相應的酸和并生成相應的鹽類，再用陰、陽離子交換樹脂除去鹽，最后濃縮結晶得到木糖醇晶體。這一工藝顯然不考慮回收發(fā)酵液中的其它糖類。我們用鈣型陽離子樹脂對木糖、阿拉伯糖及木糖醇進行色譜分離的過程中發(fā)現(xiàn)，木糖與阿拉伯糖的色譜峰大部分相互重疊，但是，這兩種糖與木糖醇的色譜峰卻基本不重疊(圖3)。顯然，木糖醇-阿拉伯糖(糖-醇)之間的色譜分離效率，要比木糖-阿拉伯糖(糖-糖)之間的分離效率高得多。如果我們能夠選擇性地將半纖維素水解物中的木糖轉化為木糖醇，并使阿拉伯糖不參與反應，那么就可以實現(xiàn)將對原料木糖-阿拉伯糖的分離，轉變成為對產品木糖醇_阿拉伯糖的分離，木糖與阿拉伯糖之間的分離難題也就迎刃而解了。某些酵母菌具有代謝消耗葡萄糖，轉化木糖生成木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的特性。原來以木糖_阿拉伯糖_葡萄糖為主要成分為半纖維素水解物，經這種微生物發(fā)酵之后就會轉變?yōu)橐阅咎谴糭阿拉伯糖為主要成分的發(fā)酵液。于是，用這種酵母對半纖維素水解物進行一次發(fā)酵，不僅能達到生物轉化(木糖轉化為木糖醇)與生物純化(細胞代謝消耗除去葡萄糖，木糖醇與阿拉伯糖的純度相對提高)的雙重效果，而且后續(xù)的產物色譜分離的效果也將得到有效改善。此外，對發(fā)酵液的一次色譜分離過程，事實上同時純化了木糖醇與阿拉伯糖兩個產品，從而避免了單純生產木糖醇或阿拉伯糖時對原料選擇的嚴格限制，并提高原料的綜合利用水平，節(jié)約了生產成本。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的半纖維素水解物理化脫毒工藝所存在的過程煩瑣，成本高的問題。本發(fā)明的內容包括發(fā)明人自造紙廠，木糖廠，糠醛廠周圍土壤污泥樣富含培養(yǎng)、分離、篩選，獲得能有效改善木質纖維水解物發(fā)酵性能的兩個分離物S-7和Lj-3。發(fā)明人鑒定分離物S-7屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，它在2006年9月18日被保存到中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCNOM206098，不能利用木糖；分離物Lj-3屬于西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)，它在2006年9月18日被保存到中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M206097，利用木糖的能力極微弱。發(fā)明人用這種脫毒活性新菌株建立了半纖維水解物的生物脫毒法；將脫毒活性菌株與發(fā)酵木糖生成木糖醇微生物混合接種，實現(xiàn)半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵生產木糖醇；將脫毒活性菌株與發(fā)酵木糖生成乙醇的微生物混合接種，實現(xiàn)半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵生產乙醇。上述兩種酵母的保藏信息參見本專利申請所附的兩份保藏受理通知書。屬于本發(fā)明的兩個生物脫毒活性菌株S-7(CCTCCNO:M206098)和Lj_3(CCTCCNO:M206097)，其分離篩選、及分類鑒定的過程如下用蔗渣半纖維素水解物為分離培養(yǎng)基的基本成分，適當真空后用堿調節(jié)pH5-6。如果制成平板，外加瓊脂20g/L作為固形劑。從紙漿廠廢水污染的環(huán)境采集的土壤、淤泥作分離樣品。250ml三角瓶裝量25ml，接入廢水或淤泥分離樣品約lg，30°C，200rpm搖瓶富集培養(yǎng)72h。取有菌體生長的培養(yǎng)液在同一培養(yǎng)基平板上劃線分離，選擇能夠快速生長的類型，轉到斜面保存。斜面培養(yǎng)物轉移到半纖維稀酸水解物中并在搖瓶條件下培養(yǎng)24小時，離心除去菌體，然后接入能夠同化木糖的酵母菌株進行發(fā)酵，選留那些能夠有效改善半纖維素稀酸水解物發(fā)酵性能的脫毒活性菌株。如此經過十余個批次的樣品分離，獲得改善半纖維素水解物發(fā)酵性能活性最強的兩個分離物，編號分別為S-7和Lj-3。高效液相色譜的檢測結果表明，S-7和Lj-3對半纖維素稀酸水解物中的代表性毒物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分離得到的兩個菌株于4°C冷藏或凍干法保藏。按照《酵母菌鑒定手冊》(青島海洋大學出版社)一書提供的方法，鑒定了S-7和Lj-3的細胞、菌落與生理生化特征(表1，表2)。分離物S-7的生理、生化特征與《酵母菌鑒定手冊》中所描述的東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分離物Lj_3的生理、生化特征與同一書中所述的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentals)完全相同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3，和5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增S-7和Lj-3的26SrDNAD1/D2區(qū)域核酸序列(方法參照KurtzmanCP,FournewCandidaspeciesfromgeographicallydiverselocations.AntonievanLeeuwenhoek,2001,79353-361)0測定擴增產物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotideBLAST)。搜索結果表明，S-7的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核酸序列，與GenBank現(xiàn)有Issatchenkiaorientalis同一區(qū)域核酸序列同源性均達100%；Lj-3與其中與Issatchenkiaoccidentalis同一區(qū)域核酸序列的同源性達到100%。根據(jù)上述的細胞、菌落形態(tài)、生理生化與分子生物學特征的可以確定，S-7的分類地位屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)；Lj-3的分類地位屬于的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)。東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCCNO:M206098，它的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核苷酸序列在GenBank的登記號為EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834296；西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3在CCTCC的保藏號為CCTCCNO:M206097，它的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核苷酸序列的GenBank登記號為EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834298。表1分離物S-7、Lj-3的細胞與菌落形態(tài)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7(CCTCCNO:M206098)26SrDNADl/D2區(qū)域的核酸序列(GenBank登記號EF030708)1taagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaga61gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgt121ggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtggga181tgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa241gcgggtggtaaattccatctaaggctaaatactggcgagagaccgatagcgaacaagtac301tgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttga361aagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgc421tctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctggaacgtg481gctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggactgcggcc541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj-3(CCTCCNO:M206097)的26SrDNAD1/D2區(qū)域核酸序列(GenBank登記號EF030710)ltatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg61gcaaaagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagttgtagattgcaggttggagtct121ttgtggaagcgtgtgtctaagtcccttggaacagggtgccattgagggtgagagccccgt181gagacgcgtgcggaagctgtaaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagct241ctaagtgggtggtaaattccatctaaggctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaa301gtactgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattg361ttgaaagggaagggtattgggctcgacatgggatttgcgcaccgctgctccttgtgggcg421gcgctctgtgcttttcctgggccagcatcggtttttgccgcaggagaaggcgtgctggaa481tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcgagatgctgcgtgcggggaccgaggactgc541gacatctgtctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgtaa本發(fā)明按下述方法制備所需要的半纖維素水解物將甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸稈粉碎至適當粒度，按固液比167加入0.33%(w/w)的稀硫酸或稀鹽酸溶液，攪拌均勻，在耐酸的壓力容器內加熱至100130°C，維持0.53小時。水解結束后濾除殘渣，濾液即為半纖維素水解物。用固體碳酸鈣或氫氧化鈣將半纖維素稀酸水解液調至PH值38，可直接或濃縮后再進行生物脫毒。一般地，較高酸濃度的條件可以使用較低的水解溫度，或相應縮短水解時間，較低的酸濃度則必須提高水解溫度或延長水解時間。本發(fā)明按下述方法培養(yǎng)用于半纖維水解物生物脫毒，木糖醇發(fā)酵，乙醇發(fā)酵的微生物菌種脫毒菌株種子液的培養(yǎng)將CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097的斜面培養(yǎng)物接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為搖瓶容量的20%，在27--30°C，轉速200rmp條件下?lián)u床培養(yǎng)1218小時，即可獲得可用于脫毒的種液。種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖50g/L，MgS04.7H202g/L,K2HP044g/L，KH2P046g/L，酵母膏5g/L。發(fā)酵木糖生成木糖醇的菌株種子液培養(yǎng)所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067，它在2005年6月15日被保存到中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCN0:M205067，分類命名為熱帶假絲酵母l-18Candidatropicalis1-18,(見發(fā)明專利“熱帶假絲酵母菌株的分離及其用于木糖醇生產的方法”，發(fā)明專利申請?zhí)?00510037580.2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分與培養(yǎng)條件同脫毒菌株種子培養(yǎng)。發(fā)酵木糖生成乙醇的菌株種子液培養(yǎng)所用的菌株為保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)的嗜單寧管囊酵母(Pachysolentannophilus)CICC1770，培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件同發(fā)酵木糖生成木糖醇的菌種培養(yǎng)。本發(fā)明按下述方法進行半纖維素水解物生物脫毒半纖維素水解物總糖含量為420%(w/w)，其中還原性單糖占總糖含量>90%以上，以木糖為主成分。用堿液(氫氧化鈣，氨水等)調節(jié)至PH3-7，按10%(v/v)接種量接入培養(yǎng)好的CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097種子液，在2535°C，通氣條件下發(fā)酵脫毒520小時，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集離心沉淀的菌體重復用于下一批新鮮的半纖維素水解物脫毒，離心上清液可直接或者濃縮后用于木糖醇發(fā)酵，或乙醇發(fā)酵。本發(fā)明按下述方法發(fā)酵脫毒后的半纖維素水解物生產木糖醇已經過CCTCCNO:M206098，或CCTCCNO:M206097發(fā)酵脫毒過的半纖維素水解物，真空濃縮至木糖約150g/L，氨水調節(jié)至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發(fā)酵的半纖維素水解物培養(yǎng)基。木糖醇發(fā)酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5%(v/v)接種量接入熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067種子液，200rmp，33°C進行發(fā)酵至木糖消耗完。收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養(yǎng)基中繼續(xù)新一輪的木糖醇發(fā)酵，離心上清液用于制備木糖醇。本發(fā)明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發(fā)酵生產木糖醇真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100-150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨水)調至pH3-pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養(yǎng)基，分裝于三角瓶；取培養(yǎng)好的株CCTCCNO:M206098種子液，或者CCTCCNO:M206097的種子液，并與等體積的CCTCCN0:M205067種子液混合，然后按5%(v/v)和用種量接入半纖維素水解物中，搖瓶培養(yǎng)至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步脫毒發(fā)酵。如此不斷地循環(huán)，直至酵母細胞不能利用。對預先進行脫毒處理后獲得的半纖維素水解物后續(xù)進行木糖醇發(fā)酵和制備阿拉伯糖的方法包括如下步驟S1.對經過CCTCCNO:M206098發(fā)酵脫毒的半纖維素水解物真空濃縮至木糖約150g/L，氨水調節(jié)至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發(fā)酵的半纖維素水解物培養(yǎng)基；S2.木糖醇發(fā)酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5%(v/v)接種量接入CCTCCNOM205067種子液，200rmp，33°C進行發(fā)酵至木糖消耗完；S3.收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養(yǎng)基中繼續(xù)新一輪的木糖醇發(fā)酵，離心上清液制備木糖醇；S4.對木糖醇發(fā)酵液除去細胞后，經離子交換凈化，再用鈣型陽離子樹脂進行色譜分離，獲得純凈的木糖醇分流，所述分流的木糖醇發(fā)酵液經濃縮、結晶，獲得結晶木糖醇；S5.分流木糖醇發(fā)酵液后，獲得阿拉伯糖分流發(fā)酵液，對阿拉伯糖分流發(fā)酵液用銨型陽離子樹脂進行色譜分離，提高阿拉伯糖純度，再通過濃縮、結晶，獲得結晶阿拉伯糖。利用半纖維素水解物進行同步脫毒發(fā)酵生產木糖醇和阿拉伯糖的方法包括如下步驟S1.真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100-150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨水)調至pH3-pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養(yǎng)基；S2.取培養(yǎng)好的CCTCCNO:M206098種子液，并與等體積的CCTCCNO:M205067種子液混合，然后按5%(v/v)和用種量接入半纖維素水解物中，搖瓶培養(yǎng)至木糖消耗完；S3.離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步脫毒發(fā)酵；如此不斷地循環(huán)，直至酵母細胞不能利用；S4.對木糖醇發(fā)酵液除去細胞后，經離子交換凈化，再用鈣型陽離子樹脂進行色譜分離，獲得純凈的木糖醇分流，所述分流的木糖醇發(fā)酵液經濃縮、結晶，獲得結晶木糖醇；S5.分流木糖醇發(fā)酵液后，獲得阿拉伯糖分流發(fā)酵液，對阿拉伯糖分流發(fā)酵液用銨型陽離子樹脂進行色譜分離，提高阿拉伯糖純度，再通過濃縮、結晶，獲得結晶阿拉伯糖。本發(fā)明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發(fā)酵生產乙醇同步脫毒發(fā)酵生產乙醇所用的半纖維素水解物的培養(yǎng)基，與同步脫毒發(fā)酵生產木糖醇的培養(yǎng)基相同。取培養(yǎng)好的株CCTCCNO:M206098種子液，或者CCTCCNO:M206097的種子液，與等體積的CICC1770種子液混合，然后按5%(v/v)和用種量接入半纖維素水解物培養(yǎng)基搖瓶中，培養(yǎng)至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞循環(huán)用于發(fā)酵新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)同步脫毒發(fā)酵，如此不斷地循環(huán)，直至酵母細胞不能利用。蒸餾回收離心上清液中的乙本發(fā)明用高效液相色譜法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物中的代表性毒物質，及主要酚類物質降解活性。選擇乙酸、糠醛及愈創(chuàng)木酚作為半纖維素水解物中不同類型抑制物的代表，將這三種化合物一起加入到普通酵母培養(yǎng)基中，并接入脫毒活性菌株(CCTCCNO:M206097,或CCTCCNO:M206098)進行發(fā)酵。利用這三種化合物均在198nm處均有較強的紫外吸收的特點，在如下色譜條件WaterS486高效液相色譜儀，ZORBAXXDB-C18色譜柱，流動相甲醇磷酸(0.2%，w/w)=7525(v/v)，對比檢測這三種化合物在發(fā)酵前后的含量變化，判斷這兩個菌株對這三種代表性有毒成分均具有降解活性(圖1)。由于酚類化合物在270nm附近均有強的紫外吸收，故以270nm為檢測波長，以高效液相對比檢測操作1的蔗渣半纖維素水解物、操作3的經東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物脫毒，經西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物(圖2)。并分析這一檢測波長條件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纖維素水解物經生物脫毒處理之后，其中的糠醛及許多有毒的酚類物質已被降解。本發(fā)明用對比生物發(fā)酵的方法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物的脫毒效果用CCTCCNO:M205067對比發(fā)酵經CCTCCNO:M206097,或經CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發(fā)酵產物木糖醇；或用CICC1770對比發(fā)酵經CCTCCNOM206097，或經CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發(fā)酵產物乙醇?？梢园l(fā)現(xiàn)，經過本發(fā)明所提供的生物菌株及脫毒方法處理后的半纖維水解物，無論用于木糖醇發(fā)酵或乙醇發(fā)酵，發(fā)酵物的產量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本發(fā)明提供的生物脫毒菌株及生物脫毒方法能有效地提高半纖維素水解物的發(fā)酵性能。本發(fā)明突出的實質性特點和顯著進步是1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并提供的東方伊薩酵母CCTCCNO:M206097，西方伊薩酵母CCTCCNO:M206098這兩個菌株，對半纖維水解物中三大代表性微生物代謝抑制物以醋酸為代表的有機酸，以糠醛為代表的糖類降解產物，及以愈創(chuàng)木酚為代表的酚類化合物，均同時具有降解活性，它們對半纖維水解物均具有突出的生物脫毒活性。2.本發(fā)明利用東方伊薩酵母CCTCCNO:M206097，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物降解半纖維素水解物中的多種有毒成分，事實減少了基質中的雜質。與傳統(tǒng)的理化脫毒工藝相比，用本發(fā)明對半纖維素水解物進行脫毒，顯然具有簡捷、低成本、及環(huán)境14友好的突出優(yōu)勢。3.本發(fā)明提供的兩個脫毒活性菌株，其中CCTCCNO=M206097完全不能同化木糖、CCTCCNO=M206098對木糖的代謝能力也十分微弱，利用它們對半纖維素水解物脫毒，并并不會造成其中的木糖損失。由于這一特點，將它們與發(fā)酵木糖生成木糖醇，或發(fā)酵木糖生成乙醇的微生物置于同一發(fā)酵系統(tǒng)中，可實現(xiàn)半纖維水解物脫毒過程與木糖醇發(fā)酵，或與乙醇發(fā)酵相偶聯(lián)，極大地簡化發(fā)酵半纖維素水解物生產木糖醇發(fā)酵，或生產乙醇的工藝。具體而言，本發(fā)明還提供了一套通過發(fā)酵半纖維素水解物生產木糖醇，與從半纖維素水解物提取阿拉伯糖相結合的新方法，有效解決了化學工藝生產木糖醇的過程中，以及由半纖維素水解物提取阿拉伯糖的過程中，由于木糖與阿拉伯糖之間化學性質相近帶來的分離效率低，產品收率低，或使用有機溶劑帶來的安全隱患。與現(xiàn)有從發(fā)酵液制備木糖醇的工藝相比，本發(fā)明多收獲了阿拉伯糖；與現(xiàn)有的阿拉伯糖的生產工藝相比，本發(fā)明多收獲了木糖醇。本發(fā)明對于提高資源利用率，降低木糖醇及阿拉伯糖生產成本方面的優(yōu)勢十分明顯。本發(fā)明的整個過程包括用酸或酶水解富含木聚糖的原料，獲得以木糖，阿拉伯糖為主成分，同時含有葡萄糖，甘露糖，半乳糖等雜糖的水解物。這種水解物經除去微生物生長抑制物的脫毒處理之后，接入能夠同化利用葡萄糖，專一性地轉化木糖為木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的酵母菌株。當發(fā)酵液木糖濃度低至一定限度之后停止發(fā)酵，得到以木糖醇與阿拉伯糖為主成分的發(fā)酵液。發(fā)酵液經細胞分離，離子交換脫鹽，脫色之后適當濃縮，直接用鈣型陽離子樹脂為吸附劑，以純水為洗脫劑進行色譜分離，分別得到純度99%以上的高純度木糖醇液，及以阿拉伯糖一雜糖溶液。高純度木糖醇液減壓濃縮，降溫結晶獲得晶體木糖醇。阿拉伯糖一雜糖溶液改用銨型陽離子交換樹脂為吸附劑，仍以純水為洗脫劑進行色譜分離，獲得純度1較高的阿拉伯糖液。最后將阿拉伯糖濃縮結晶，獲得晶體阿拉伯糖。雖然上述色譜分離過程可以在填充了陽離子樹脂的固定色譜柱上完成，但工業(yè)化的模擬移動床色譜裝置能有效提高分離效率。用于本發(fā)明的半纖維素水解物是按如下方法制備的。將富含半纖維素的材料如玉米皮(cornfiber)、玉米芯(corncob),蔴·(sugarcanebagasse)等，以質量分數(shù)為0.5-2.5%(w/w)的稀硫酸，或鹽酸，以酸液能夠浸泡過物料為宜，在110-140°C條件下水解0.5-2.5h。水解后收集液體部分，用Ca(OH)2或CaCO3調節(jié)至pH3_pH4，除去沉淀，上清液再用相當于原料重量1一3%的活性碳吸附處理。濾去活性碳的溶液再依次通過陽離子，陰離子交換樹脂凈化，濃縮后即得到可用于發(fā)酵的半纖維素水解物。本發(fā)明按如下的方法，在發(fā)酵罐內利用酵母細胞選擇性地催化將半纖維素水解物中的木糖經生物催化轉化為木糖醇，而阿拉伯糖不參與生物催化反應。本發(fā)明所指的微生物主要是熱帶假絲酵母。這種酵母能夠利用半纖維素水解物中的葡萄糖，半乳糖，甘露糖等六碳糖作為碳源生長，而不會生成相應的糖醇；對于五碳醛糖，熱帶假絲酵母能夠轉化木糖為木糖醇，卻不能利用同屬五碳醛糖的阿拉伯糖。本發(fā)明實際使用的菌株由本發(fā)明人篩選的，并保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的熱帶假絲酵母菌株CandidatropicalisCCTCCM20506專利申請?zhí)?200510037580.2，發(fā)明者周玉恒,張厚瑞,蔡愛華,覃香香,陳海珊申請人:唐傳生物科技(廈門)有限公司