專利名稱：條件性毒性的工程化酶原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及生物學(xué)、生物化學(xué)、和蛋白質(zhì)工程這些領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉 及顯示條件性毒性(conditional toxicity)的毒性蛋白的酶原，這些酶原在非靶宿主生物 或細(xì)胞中是良性的，而在靶生物或細(xì)胞中是有毒性的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及對這些顯示條件 性毒性的毒素進(jìn)行設(shè)計、制造、和使用的方法。背景細(xì)菌性ADP-核糖基化毒素是由病原性細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白，它們通常被分泌到細(xì)胞 外的培養(yǎng)基并且通過改變真核細(xì)胞的代謝作用而導(dǎo)致疾病(Rappuoli and Pizza, 1991) 0 ADP-核糖基化毒素在將該ADP-核糖部分選擇性地連接至它們的靶蛋白之前使NAD分解成 其組成部分(煙酰胺和ADP-核糖)。在這些毒素的大多數(shù)中，這些靶是細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào) 節(jié)劑，并且由ADP-核糖基化所引起的對它們的活性干擾導(dǎo)致了關(guān)鍵細(xì)胞加工的嚴(yán)重失調(diào) 并且在大多數(shù)情況下最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。殺蟲性二元毒素的新家族(被命名為Vipl和Vip2)在營養(yǎng)生長階段已經(jīng)從芽 胞桿菌屬中分離出，其中Vipl可能靶向昆蟲腸細(xì)胞，和Vip2充當(dāng)將肌動蛋白核糖基化的 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。這種Vipl_Vip2 二元毒素在20-40ng/g餌料(diet)下是對抗玉米根 蟲(corn root worm)(玉米的重要害蟲)的有效殺蟲劑。Vipl_Vip2復(fù)合物代表著一類不同于經(jīng)典的A-B毒素(例如，霍亂毒素)的二元 毒素，這些經(jīng)典的A-B毒素必須組裝到復(fù)合物(由兩個功能不同的亞基或結(jié)構(gòu)域組成)中 用于發(fā)揮活性。在Vipl-Vip2類的二元毒素中每種多肽很明顯地是分開發(fā)揮功能的，其中 結(jié)合膜的IOOkDa的Vipl多聚體可推定結(jié)合著細(xì)胞表面受體并且有利于中這種52kDa的 Vip2 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的遞送以進(jìn)入靶玉米根蟲細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。Vipl和Vip2兩者均是 對抗玉米根蟲的最大活性所要求的。NAD-依賴的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶Vip2可能在Argl77 上修飾單體的肌動蛋白以阻斷聚合，導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架的損失和最終細(xì)胞死亡，這是 由于在體內(nèi)在肌動蛋白微絲之內(nèi)快速的亞基交換的緣故。1999年，Vip2的三維結(jié)構(gòu)得以解 決(Han et al. , 1999, Nature Structural Biology6 :932_936)。Han 等確定Vip2 蛋白 是混合的α/β蛋白并且被分成兩個結(jié)構(gòu)域，稱為N-結(jié)構(gòu)域(殘基60-265)和C-結(jié)構(gòu)域 (殘基266-461)，它們可能代表這些二元ADP-核糖基化毒素的全部類別。Han等鑒定了幾 種在Vip2-樣毒素的生物活性方面重要的結(jié)構(gòu)特征，包括在E428上的催化殘基，在Y307、 R349、E355、F397、和R400上的NAD結(jié)合殘基，使這種NAD結(jié)合袋穩(wěn)定的“STS基序”(殘基 386-388)、和由殘基E426和E428形成的NAD結(jié)合袋。因?yàn)閂ip2與其他二元毒素(例如，肉毒梭菌C2毒素(Clostridium botulinumm C2 toxin) (Aktories 等，1986)、產(chǎn)氣莢膜梭菌極微小毒素(Clostridium perfringens iota toxin) (Vandekerckhove 等，1987)、螺狀梭菌(Clostridium spiroforme)毒素(Popoff 禾口 Boquet, 1987)和由艱難梭菌所產(chǎn)生的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Popoff等，1988))的酶組分共 有顯著的序列相似性，Vip2代表肌動蛋白-ADP-核糖基化毒素家族。盡管這種Vipl_Vip2 二元毒素具有商業(yè)潛在性而成為特異且有效的玉米根蟲控制劑用于轉(zhuǎn)基因作物(例如，玉米)，在植物中Vipl-Vip2復(fù)合物的表達(dá)一直被以下事實(shí)制 約Vip2在植物細(xì)胞中表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育病理學(xué)和對該植物其本身的表型的改變。因 此，存在著總體需求來提供設(shè)計并制造顯示出條件性毒性活性的毒性蛋白，其中該毒素在 非靶宿主生物或細(xì)胞中作為酶原可以成為良性的，而在靶生物或細(xì)胞中是有毒的。更確切 地說，存在著需求以便保護(hù)表達(dá)ADP-核糖基化毒素(例如，Vip2)的非靶生物或細(xì)胞免于 該毒素的副作用、并且在受到靶向的活系統(tǒng)(例如，昆蟲害蟲)之內(nèi)仍保持該毒性活性。當(dāng) 這種非靶生物在實(shí)驗(yàn)室中不容易進(jìn)行試驗(yàn)時(例如，植物)，存在著進(jìn)一步的需求來研究替 代品遺傳系統(tǒng)以便更加有效地對酶原進(jìn)行設(shè)計和測試。大多數(shù)天然存在的酶原將它們的前肽定位在N-端，考慮到該前肽區(qū)域的合成在 該催化單元之前這似乎是合理的，由此防止該酶原的任何過度激活(LaZUre，2002)。然 而，已經(jīng)報道來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的枯草桿菌蛋白酶型絲氨酸蛋白酶 (Aqualysin I)的C端前體序列妨礙了該前體的蛋白質(zhì)分解激活(Lee等，1992)。然而，阻 斷蛋白質(zhì)分解的激活確實(shí)沒有解決本發(fā)明所提出的問題。在這里，需要酶原，該酶原在活系 統(tǒng)(例如，植物)中是良性的，但是在靶生物系統(tǒng)(例如，以該植物為食的昆蟲害蟲)中被 蛋白質(zhì)分解性地激活。概述考慮到這些需求，本發(fā)明的目的是提供對毒性蛋白的酶原進(jìn)行設(shè)計、制造、并且使 用的方法，由此該酶原在非靶宿主生物或細(xì)胞中是良性的，并且其中該酶原能夠在靶生物 或細(xì)胞中被激活并且是有毒的。本發(fā)明的另一目的是提供對毒性蛋白的酶原進(jìn)行編碼的新 穎的核酸序列，這些毒性蛋白酶原在非靶宿主生物或細(xì)胞中是良性的，而在靶生物或細(xì)胞 中是有毒的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從這些核酸序列的表達(dá)中生成的新穎的酶原、和包含這些 酶原的組合物和配制品，它們在非靶宿主生物或細(xì)胞中是良性的，而在靶生物或細(xì)胞中是 有毒的。本發(fā)明進(jìn)一步提供能夠有效選擇的方法和遺傳系統(tǒng)用于對酶原前體進(jìn)行識別，其 中在這些前體中所包含的毒性蛋白是無活性的或基本上無活性的。在一方面，本發(fā)明提供了毒性蛋白的工程化的酶原，該酶原具有融合至該毒性蛋 白的C端或N端的多肽鏈延伸(extension)，其中該酶原在非靶生物或細(xì)胞中是良性的，并 且其中當(dāng)該酶原靶生物在靶生物或細(xì)胞中時該酶原被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘鞍?。在該方面的一個實(shí) 施方案中，該毒性蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。這種ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶典型地將靶生物或 細(xì)胞的肌動蛋白核糖基化。在另一個方面，本發(fā)明提供了工程化的酶原，其中這種ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶包括氨 基酸序列，該氨基酸序列具有與SEQ ID NO :9至少69%、或78%、或85%、或93%、或95% 的序列同一性，并且其中這種ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有催化殘基(該殘基對應(yīng)于SEQ ID NO 9的E428)、和NAD結(jié)合殘基(這些殘基對應(yīng)于SEQ ID NO 9的Y307、R349、E355、F397、和 R400)。在該方面的一個實(shí)施方案中，該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是殺蟲性的。在該方面的其他 實(shí)施方案中，這種殺蟲性ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是Vip2毒素。在該方面的其他實(shí)施方案中，這 種 Vip2 毒素選自下組SEQ ID NO :9、10、15、16、17、18、和 19。在一方面，本發(fā)明提供了酶原，其中該多肽鏈延伸包括氨基酸序列，該氨基酸序列 長度為至少21個殘基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)。在該方面的一個實(shí) 施方案中，該多肽延伸包括SEQ ID NO :6。
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在另一方面，本發(fā)明提供了酶原，其中該多肽鏈延伸包括SEQ ID NO :8。在又另一方面，本發(fā)明的多肽鏈延伸被融合至該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的C端。在另一方面，本發(fā)明提供了酶原，其中該非靶生物或細(xì)胞是植物或植物細(xì)胞。在 這一方面的一個實(shí)施方案中，該植物或植物細(xì)胞選自下組高粱、小麥、番茄、甘藍(lán)類作物 (cole crops)、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜(oilseed rape)、和玉 米。在又另一方面，本發(fā)明提供了酶原，其中該非靶生物或細(xì)胞是酵母。在該方面的一 個實(shí)施方案中，該酵母是釀酒酵母。在另一方面，本發(fā)明提供了酶原，該酶原包括SEQ ID NO 11或SEQ IDNO :12。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子(包括對本發(fā)明的酶原進(jìn)行編碼的核 酸序列)；包括該核酸分子的重組載體；包括該重組載體的酵母細(xì)胞；和包括該重組載體的 轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。在該方面的一個實(shí)施方案中，該酵母細(xì)胞是釀酒酵母。在又另一 實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是玉米植物或玉米植物細(xì)胞。在又另一方面，本發(fā)明提供了制造毒性蛋白的酶原的方法，該方法包括以下步驟 a)設(shè)計從該毒性蛋白的一端延伸的多肽鏈；b)形成表達(dá)質(zhì)粒的庫，這些表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn) 入遺傳系統(tǒng)時將表達(dá)包括該多肽鏈的酶原前體；c)在天然地易受該毒性蛋白影響的遺傳 系統(tǒng)中表達(dá)該酶原前體；d)回收在步驟(c)中存活的遺傳系統(tǒng)的生物或細(xì)胞；e)將這些前 體從步驟(d)的這些生物或細(xì)胞中分離；f)對這些前體測試針對靶生物或細(xì)胞的生物活 性；并且g)鑒定作為酶原的這些具有生物學(xué)活性的前體。在該方面的一實(shí)施方案中，該毒 性蛋白是殺蟲性的肌動蛋白核糖基化的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。在該方面的其他實(shí)施方案中， 該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是Vip2毒素。在該方面的又另一實(shí)施方案中，該Vip2毒素選自下 組SEQ ID N0:9、10、15、16、17、18、和19。在該方面的其他實(shí)施方案中，該庫包括多個隨機(jī) 的氨基酸序列，這些序列具有至少21個殘基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ； W)殘基。在該方面的又另一實(shí)施方案中，該遺傳系統(tǒng)是真核生物或細(xì)胞。在該方面的其他 實(shí)施方案中，該遺傳系統(tǒng)是酵母。在又另一實(shí)施方案中，該酵母是釀酒酵母。在該方面的其 他實(shí)施方案中，該靶生物或細(xì)胞是真核的或原核的。在又另一實(shí)施方案中，該靶生物或細(xì) 胞是昆蟲或昆蟲細(xì)胞。在該方面的其他實(shí)施方案中，該昆蟲或昆蟲細(xì)胞是屬于根螢葉甲屬 (Diabrotica)的。在又另一實(shí)施方案中，該昆蟲或昆蟲細(xì)胞是玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera西方玉米根蟲)、長角葉甲(D. Iongicornis北方玉米根蟲)、或D. virgifera zeae (墨西哥玉米根蟲)。在該方面的其他實(shí)施方案中，該酶原在該靶細(xì)胞中是具有生物學(xué) 活性的。在另一方面，本發(fā)明提供了遺傳系統(tǒng)，該遺傳系統(tǒng)允許有效識別毒性蛋白的工程 化的酶原，其中在該前體中這種毒性蛋白是無活性的或基本上無活性的，并且其中該酶原 在非靶宿主生物或細(xì)胞中是良性的，并且其中當(dāng)該酶原靶生物在靶生物或細(xì)胞中時該酶原 被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘鞍?。在該方面的一?shí)施方案中，該遺傳系統(tǒng)作為針對非靶生物或細(xì)胞的替 代品。在另一實(shí)施方案中，這種工程化的酶原包括從該毒性蛋白的C端或N端延伸出的多 肽鏈。在該方面的又另一實(shí)施方案中，該遺傳系統(tǒng)是酵母，并且該非靶生物或細(xì)胞是植物或 植物細(xì)胞。在該方面的其他實(shí)施方案中，該植物或植物細(xì)胞是玉米。在該方面的又另一實(shí) 施方案中，該靶生物是病原性細(xì)胞或生物，并且該毒性蛋白是肌動蛋白核糖基化的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。在又另一方面中，提供了包含本發(fā)明的新酶原的藥用組合物。此類藥用組合物作 為例如抗癌劑應(yīng)當(dāng)具有療效。本發(fā)明的其他目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)在考慮以下詳細(xì)說明時將會變得清楚。這些附圖的幾份視圖的簡要說明

圖1是Vip2毒素的模型，它證明了前肽概念。A 顯示了 NAD的Vip2_NAD復(fù)合物 在Vip2的C端酶結(jié)構(gòu)域之內(nèi)結(jié)合在劈開部分(cleft)上。B:顯示了 C端多肽鏈(存在于 proVip2(箭頭1和2)中，作為干擾該NAD結(jié)合部位)的延伸的可能效應(yīng)。分子繪圖程序 WebLab ViewerPro 3. 7 (Accelrys, San Diego, CA)用于將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可視化。Vip2 同等物 可見于在PDB數(shù)據(jù)庫，登錄號為IQSl。圖2是體內(nèi)遺傳系統(tǒng)的例證，用于選擇功能失常的Vip2變體。使用質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化釀 酒酵母的感受態(tài)細(xì)胞，這種質(zhì)粒攜帶對天然Vip2蛋白或無活性的Vip2突變體(E428G)進(jìn) 行編碼的基因。在轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞在具有棉子糖的板上進(jìn)行鋪板，提供了來自GALl啟動 子的滲漏表達(dá)。圖3是在誘變之后所選擇的前肽序列。在對21個氨基酸殘基進(jìn)行隨機(jī)化之后所選 擇的核心前肽序列(4-4-12)和在第二輪誘變之后所選擇的proVip2序列。單一的核苷酸 突變(A至T)產(chǎn)生了在該前肽區(qū)域中第九個氨基酸(E至V)的取代。在易錯PCR過程中所 獲得的核苷酸插入部分(insertion)產(chǎn)生了多肽鏈從21位至49位氨基酸的移碼和延伸。 移碼(*)點(diǎn)在該多肽鏈延伸的氨基酸#11 (F)之后發(fā)生。圖4是用野生型酶(Vip2)及其工程化的前酶(proVip2)進(jìn)行的肌動蛋白ADP-核 糖基化的時間過程。這種ADP-核糖基化反應(yīng)是如在實(shí)施例5中所說明進(jìn)行的。將等分部 分在不同時間點(diǎn)下從反應(yīng)中取出，并且通過SDS-PAGE對其進(jìn)行分辨。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，并且通過放射線照相術(shù)使ADP-核糖基化的肌動蛋白顯像。圖5是在來自轉(zhuǎn)基因proVip2植物的根提取物中ADP-核糖基化活性的顯示。根 蛋白的提取和ADP-核糖基化反應(yīng)時如在實(shí)施例7中所說明進(jìn)行的。將酶促反應(yīng)的等分部 分在不同的時點(diǎn)(1、3、5、15、60分鐘)下取出并且經(jīng)受SDS-PAGE。在印跡到PVDF膜上之 后，通過自動放射線照相術(shù)使ADP-核糖基化的肌動蛋白顯像。圖6顯示了在西方玉米根蟲中Vip2蛋白的消化結(jié)果。在進(jìn)食30分鐘 和90分鐘之后，在西方玉米根蟲全蟲(whole body)均漿中檢出的Vip2變體。泳 道1. S-tag-proVip2 (30min)、2. S-tag-proVip2 (90min)、3· proVip2(30min)、 4.proVip2 (90min),5. S-tag-Vip2(30min)、6. S-tag-Vip2(90min),7. Vip2(30min)、 8. Vip2 (90min)o實(shí)心箭頭表示與Vip2 (空心箭頭)共移動的被推定的活化型的proVip2 蛋白。圖7顯示了(A)酶測定和(B)工程化的酶前體(泳道2和4)和在進(jìn)食之后3天 從WCRW幼蟲的糞便中收集的它們的經(jīng)處理的形成物(泳道3和5)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。泳 道1· MW標(biāo)記物；2. proVip2 ；3.從蟲糞中收集的proVip2 ；4. S_tag-proVip2 ；5.從蟲糞中 收集的 S-tag-proVip2 ；6. Vip2。在序列表中序列的簡要說明SEQ ID NO 1_5是在本發(fā)明中有用的寡核苷酸引物。
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SEQIDNO6是在所述4-4-12酶原中所包含的前肽的氨基酸序列。
SEQIDNO7是核心前肽序列。
SEQIDNO8顯示了在proVip2-39T和proVip2_39A酶原中包含的前肽的氨基酸序列。
SEQIDNO9是天然的全長Vip2A ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:10是平截的Vip2 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO11是這種4-4-12酶原的氨基酸序列。
SEQIDNO:12是proVip2-39-T和proVip2_39A酶原的氨基酸序列。
SEQIDNO:13是pN0V4500的核苷酸序列。
SEQIDNO:14是pN0V4501的核苷酸序列。
SEQIDNO15-19是殺蟲性的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO20-23是非芽胞桿菌ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
定義
除非另外定義，在此所使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與屬于本發(fā)明的領(lǐng)域
之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。在此提及的全部專利、申請、已公布的申請 和其他公開文件和來自GenBank及其他數(shù)據(jù)庫的序列都通過引用以其全文進(jìn)行結(jié)合。為清 楚起見，在本說明書中所使用的某些術(shù)語被定義并呈現(xiàn)如下。在本發(fā)明的背景下，“對應(yīng)于”(corresponding to)是指在將某些蛋白的氨基酸序 列與參比氨基酸序列比對時，在該參比氨基酸序列中與某些列舉的位置比對的氨基酸(例 如但不限于，Vip2毒素(SEQ ID NO 9或SEQID NO 10)(但是那不是必須在這些相對于該 參比氨基酸序列的精確位置中彼此“對應(yīng)”。這種比對的實(shí)施例顯示在表1中。例如，該催 化殘基 Isp2a(SEQ ID NO 18)的 E423 “對應(yīng)于”Vip2 (SEQ ID NO 9)的 E428 殘基，這是在 SEQ ID NO :9用作這種參比氨基酸序列時進(jìn)行的。如在此所使用的，酶原是毒性蛋白的無活性的或基本上無活性的前肽，該前肽是 可以在靶生物或細(xì)胞中激活的。酶原總體上是較大的，盡管不必大于該毒性蛋白。酶原在 靶生物或細(xì)胞中可以被激活劑轉(zhuǎn)變成具有活性的毒素。這種激活劑(例如但沒有限制性) 可以是蛋白酶或蛋白酶的組合，它在靶生物或細(xì)胞中產(chǎn)生成熟的具有活性的毒素。因此，本 發(fā)明的酶原在非靶生物或細(xì)胞(例如，植物或植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞)中是良性的(具有很 少或無有害的作用)，并且在靶生物或細(xì)胞(例如，在昆蟲或昆蟲細(xì)胞中)中被轉(zhuǎn)變成毒性 蛋白。如在此所使用的，同源的是指大于或等于25%的核酸或氨基酸序列同一性，典型 地 25%,40%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,78%, 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% ；若有必要，可以對 精確的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行限定。出于在此的目的，術(shù)語“同源”和“同一性”經(jīng)常是可互換地使用 的?？傮w上，為了確定同一性百分比，對多個序列進(jìn)行了比對，這樣就獲得了最高次序的匹 配(參見例如!Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ.，ed.，Oxford University Press，New York，1988 ；Biocomputing Jnformatics and Genome Projects，Smith，D. W.， ed.，Academic Press，New York，1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey, 1994 ；Sequence
8Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M Stockton Press, New York, 1991 ；Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48 :1073)。通過序列同一性，通過標(biāo)準(zhǔn) 比對算法程序來確定保守的氨基酸的數(shù)目，并且將其與由每個供應(yīng)商所建立的默認(rèn)缺口罰 分一起使用。基本上同源的核酸分子將典型地在中等嚴(yán)格條件或在高嚴(yán)格條件下沿著所感 興趣的核酸的長度進(jìn)行雜交。還考慮了以下核酸分子，這些核酸分子含有代替這種雜交性 的核酸分子中的密碼子的簡并密碼子。任何核苷酸或氨基酸序列的同一性或同源性可以使用已知的計算機(jī)算法(例 如，“FAST Α” 程序)來確定，使用了(例如)Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444中的默認(rèn)參數(shù)(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1) :387(1984))、BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul，S. F.，et al.，J Molec Biol 215:403(1990) ；Guide to Huge Computers,Martin J. Bishop,ed. ,Academic Press, San Diego，1994，和 Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。例如， 國家生物技術(shù)情報數(shù)據(jù)庫中心(the National Center for Biotechnology Information database)的BLAST功能可用于確定同一性。其他可商購的或公眾可獲得的程序包括 DNAStar "MegAlign，，程序(Madison、Wis.)禾口 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffG)的“Gap”程序(Madison Wis)。蛋白和/或核酸分子的同源性或同 一性百分?jǐn)?shù)可以通過以下方式來確定，例如通過使用GAP計算機(jī)程序?qū)⑿蛄行畔⑦M(jìn)行比 較(例如，Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48 :443，如由 Smith 和 Waterman 所修訂 ((1981) Adv. Appl. Math. 2 482)。簡言之，這種GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為相似的比對符號 (即，核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以在這兩種序列中較短序列的符號的總數(shù)目。用于該GAP 程序的默認(rèn)參數(shù)可以包括(1) 一元的比較矩陣(包含數(shù)值1(對于同一性)和數(shù)值0(對 于非同一性))和 Gribskov et al. (1986)Nucl. Acids Res. 14:6745 的權(quán)重比較矩陣(如 由 Schwartz and Dayhoff, eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation,pp. 353 358(1979)所說明)；(2)(罰分 3.0)對于每個 缺口(gap)，和額外的0. 10罰分(對于每個缺口中的每個符號)；和(3)沒有罰分(對于末 端缺口)。所以，如在此使用的，術(shù)語“同一性”代表在測試品與參比多肽或多核苷酸之間的 比較。如在此所使用的，例如術(shù)語至少“與90% —致的”(90%同一性)是指相對于這些 參比多肽從90%至99. 99%的同一性百分率。在90%或更高水平的同一性指示了以下事 實(shí)推定出于示范性目的，將測試品與長度為100個氨基酸的參比多核苷酸進(jìn)行比較。在這 種試驗(yàn)多肽中不超過10% (即，100個有10個)的氨基酸區(qū)別于這些參比多肽的氨基酸。 類似的比較可以在試驗(yàn)品與參比多核苷酸之間進(jìn)行。此類差異可以被表示為隨機(jī)地分布于 氨基酸序列的全部長度內(nèi)的點(diǎn)突變、或者可以將它們簇集在一個或多個位置，這些位置具 有不同長度(高達(dá)可允許的最大值，例如100個中有10個氨基酸差異(大約90%的同一 性))。差異被稱為核酸或氨基酸的取代、或缺失。在大約85%至90%以上的同源性或同一 性的水平下，該結(jié)果應(yīng)當(dāng)不依賴與該程序和這些缺口參數(shù)設(shè)置；此類高水平的同一性可以 容易地進(jìn)行評定，經(jīng)常不需要依靠軟件。兩核酸序列基本上相同的另一指標(biāo)是這兩種分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。短語
9“特異性雜交”是指分子在嚴(yán)格條件下僅可與特定的核苷酸序列結(jié)合、雙鏈化或雜交，這是 在該序列存在于復(fù)合混合物(例如，總細(xì)胞的)DNA或RNA中時進(jìn)行的?！盎旧辖Y(jié)合”是指 在探針核酸與靶核酸之間的互補(bǔ)性雜交，并且涵蓋了少量錯配，這些錯配可以通過降低該 雜交介質(zhì)的嚴(yán)格性來適應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對這種靶核酸序列的令人希望的檢測。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)的背景下(例如，DNA及RNA雜交)“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜 交洗滌條件”是序列依賴的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列在較高的溫度 下進(jìn)行特異性地雜交。對核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2" Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier,New York?？傮w上,高嚴(yán)格條件雜交和洗滌條件 被選定為比該特異性序列(Tm)的熱解鏈點(diǎn)低大約5°C (在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。典 型地，在“嚴(yán)格條件”下，探針將會與它的靶序列進(jìn)行雜交，但不會與任何其他序列雜交。Tffl是50%的試驗(yàn)序列與完全匹配的探針進(jìn)行雜交所處的溫度(在限定離子強(qiáng)度 及PH下)?！皹O度嚴(yán)格條件”選擇為等于針對特定探針的Tm。用于互補(bǔ)核酸(它們在DNA 或RNA印跡中在濾紙上具有超過100個互補(bǔ)的殘基)的雜交的嚴(yán)格雜交條件的例子是具有 Img肝素的50%甲酰胺、在42°C、將該雜交過夜進(jìn)行。高嚴(yán)格洗滌條件的例子是0. 15M NaCl 在72°C持續(xù)大約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的例子是在65°C以0. 2xSSC洗滌達(dá)15分鐘(參 見Sambrook，以下針對SSC緩沖液的說明)。通常，高嚴(yán)格洗滌之前會先進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌， 以便除去背景探針信號。對于具有(例如)超過100個核苷酸的雙鏈體的嚴(yán)格洗滌介質(zhì)的 例子是在45°C以IxSSC持續(xù)15分鐘。對于具有(例如)超過100個核苷酸的雙鏈體的低 嚴(yán)格洗滌的例子是在40°C以4-6x SSC持續(xù)15分鐘。對于短探針(例如，大約10-50個核 苷酸)，嚴(yán)格條件典型地涉及小于約1. OM的Na離子的鹽濃度，典型地在pH 7. 0-8. 3下大約 0. 01至1. OM的Na離子濃度(或其他鹽類)，并且該溫度典型地是至少約30°C。嚴(yán)格條件 還可以用添加去穩(wěn)定劑(例如，甲酰胺)來達(dá)到?？傮w上，在這種特定的雜交測定中與針對 非相關(guān)的探針?biāo)^測到的相比，2倍(或更高)的信噪比指示了特異性雜交的測定。這些在 嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本上一致的，條件是它們所編碼的蛋白是基本上一 致的。這是(例如)在使用由該遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并時產(chǎn)生核酸拷貝時發(fā)生 的。以下是可以用來克隆同源核苷酸序列(這些序列是與本發(fā)明的參比核苷酸序列 基本上一致的)的雜交/洗滌條件的設(shè)置的例子參比核苷酸序列在以下條件下優(yōu)選地與 該參比核苷酸序列雜交在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C，并 且在2x SSC、0. 1%SDS中在50°C洗滌；更令人希望的是在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA種在50°C，并且在Ix SSC、0. 1% SDS中在50°C洗滌；仍又更加令人希望的 是在 7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA 中在 50°C，并且在 0. 5xSSC、0. 1 % SDS中在50°C洗滌；優(yōu)選在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C，并 且在0. IxSSC,0. SDS中在50°C洗滌；更優(yōu)選在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5MNaP04、 ImM EDTA 中在 50°C，并且在 0. IxSSC,0. 1% SDS 中在 65°C洗滌。兩個核酸序列或蛋白基本上是一致的(同一性)另一指示是指由該第一核酸編碼 的蛋白與由該第二核酸編碼的蛋白進(jìn)行免疫性交聯(lián)反應(yīng)或與其特異性結(jié)合。因此，蛋白典型地是與第二蛋白基本上一致的，例如其中這兩種蛋白僅區(qū)別于保守性取代。如在此使用的，引物是指寡核苷酸，該寡核苷酸包含兩種或多種脫氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸(通常上超過三種)，可以從這種寡核苷酸來起始引物延伸產(chǎn)物的合成。有助 于合成的試驗(yàn)條件包括存在著三磷酸核苷和用于聚合和延伸的試劑(例如，DNA聚合酶)、 和適當(dāng)?shù)木彌_液、溫度和PH。眾所周知，在編碼特異性氨基酸的不同密碼子中存在著大量的重復(fù)。所以，本發(fā)明 還是涉及那些包含可替換的(alternative)密碼子的DNA序列，這些密碼子對這種一致的 氨基酸的最終翻譯進(jìn)行編碼。出于本說明書的目的，帶有一個或多個取代的密碼子的序列 被定義為簡并變體。在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括了在這種DNA序列或這種已翻譯的蛋白中的突 變，該突變沒有改變這種已表達(dá)的蛋白的最終物理性質(zhì)。此類改變的例子包括脂肪族氨 基酸取代為另一脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸取代為芳香族氨基酸、酸性氨基酸取代為另 一酸性氨基酸、或堿性氨基酸取代為另一堿性氨基酸可能不會導(dǎo)致在該多肽的功能方面的 變化。而且，可以進(jìn)行更為明顯的基團(tuán)取代，條件是該殘基的功能將保持多肽溶解度，包括 電荷反轉(zhuǎn)。眾所周知，對肽進(jìn)行編碼的DNA序列可以被改變，由此對多肽進(jìn)行編碼，該多肽 具有的特性與這種天然存在的肽的那些特性不同。改變這些DNA序列的方法包括但不局限 于位點(diǎn)定向誘變。如在此所使用的，毒性活性可以被理解為是指由細(xì)胞的死亡或阻止任何細(xì)胞功能 所導(dǎo)致的任何作用，包括但不限于有絲分裂或減數(shù)分裂?！稗D(zhuǎn)化”是用于將異源核酸引入到宿主細(xì)胞或生物中的過程。特別是，“轉(zhuǎn)化”是指 將DNA分子整合進(jìn)入到感興趣的生物的基因組中?！稗D(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指宿主生物(例如，細(xì)菌或植物)，其中已經(jīng)引入了 異源的核酸分子。該核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到該宿主的基因組中，或者該核酸分子還 可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以是自主復(fù)制的。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織、 或植物可以被理解為不僅涵蓋了轉(zhuǎn)化過程的最終產(chǎn)物，還涵蓋了它的轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化 的”、“非轉(zhuǎn)基因的”、或“非重組的”宿主是指野生型生物(例如，細(xì)菌或植物)，該生物不包 含這種異源的核酸分子。核苷酸通過其堿基由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫進(jìn)行指示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶 (T)、和鳥嘌呤(G)。氨基酸由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫進(jìn)行類似地指示丙氨酸(Ala ；Α)、精氨酸(Arg ； R)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、半胱氨酸(Cys ；C)、谷氨酰胺(Gln ；Q)、谷氨酸 (Glu ；E)、甘氨酸(Gly ；G)、組氨酸(His ;H)、異亮氨酸(lie ;1)、亮氨酸(Leu ;L)、賴氨酸 (Lys ；K)、甲硫氨酸(Met ；Μ)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、絲氨酸(Ser ； S)、蘇氨酸 (Thr ；T)、色氨酸(Trp ；W)、酪氨酸(Tyr ；Y)、和纈氨酸(Val ；V)。詳細(xì)說明細(xì)菌性ADP-核糖基化毒素是由病原性細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白，它們通常被分泌到細(xì) 胞外的培養(yǎng)基中并且通過改變真核細(xì)胞的代謝作用而導(dǎo)致疾病(Rappuoli and Pizza, 1991)。這些酶催化了這種ADP-核糖基團(tuán)從NAD向具有煙酰胺釋放的靶蛋白的轉(zhuǎn)移。由于 肌動蛋白這種在真核細(xì)胞中主要的細(xì)胞骨架形成蛋白是針對Vip2 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的第 一核糖基化靶，Vip2在植物細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)也許是實(shí)際的挑戰(zhàn)。使用Vip2的早期玉米轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，所有轉(zhuǎn)基因植物在發(fā)育過程中都具有異常
11表現(xiàn)型和問題。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物其生長在非常早的發(fā)育階段就停止下來。此外，設(shè)計為將Vip2 蛋白靶向進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)外空間(非原質(zhì)體)的實(shí)驗(yàn)沒有顯著性地改進(jìn)植物病理學(xué)的癥狀。所 以，需要其他方法，從而保護(hù)植物、非靶有機(jī)體免于Vip2毒性活性同時又在靶有機(jī)體或細(xì) 胞(例如，昆蟲中)保持這種毒性活性。在此顯示的是有可能設(shè)計出毒性蛋白的新酶原，這些酶原在非靶生物或細(xì)胞中是 良性的，并且僅當(dāng)在靶生物或細(xì)胞中被激活劑作用時成為有毒的。在此還教導(dǎo)的是再次工 程化的蛋白可以包括改變天毒性蛋白的C端或N端而不必是這種毒性蛋白無活性?；?這些教導(dǎo)內(nèi)容，目前可能的是將特定的酶原設(shè)計成僅在靶有機(jī)體或細(xì)胞中是有活性的，同 時仍保留著發(fā)揮適當(dāng)?shù)纳锘钚缘哪芰?。在一?shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了毒性蛋白的工程化的酶原，該酶原具有多肽鏈延 伸，該部分融合至該毒性蛋白的C端或N端上，其中該酶原在非靶生物或細(xì)胞中是良性的， 并且其中當(dāng)該酶原靶生物在靶生物或細(xì)胞中時該酶原被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘鞍?。在另一?shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了毒性蛋白的工程化的酶原，該酶原的氨基酸序 列與該毒性蛋白的氨基酸序列通過以下變化而有所不同，這些變化包括(a)從這種毒性蛋 白的天然羧基端或氨基端延伸的一條多肽鏈的添加、和(b)在該酶原中新的羧基端或氨基 端的引入，該酶原能夠在靶有機(jī)體或者細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成毒性蛋白。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該毒性蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移 酶。典型地，該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶將肌動蛋白核糖基化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶包括氨基酸序 列，該氨基酸序列具有與SEQ ID NO :9至少69%、或78%、或85%、或93%、或95%的序列 同一性，并且其中這種ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有催化殘基(該殘基對應(yīng)于SEQ ID N0:9的 E428)、和多個NAD結(jié)合殘基(這些殘基對應(yīng)于SEQ ID NO 9的Y307、R349、E355、F397、和 R400)。在這一實(shí)施方案的一方面，該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是殺蟲性的。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是Vip2毒 素。在這一實(shí)施方案的一方面，該Vip2毒素選自下組SEQ ID NO :9、10、15、16、17、18、和 19。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該多肽延伸包括氨基酸序列，該氨 基酸序列長度為至少21個殘基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)殘基。在這 一實(shí)施方案的一方面，該多肽延伸包括SEQID NO :6。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該多肽延伸包括SEQ IDNO :8。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋了 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的酶原，其中該多肽鏈延伸被融合到該 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的C端上。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，其中該非靶生物或細(xì)胞是植物、植物細(xì) 胞、或酵母細(xì)胞。在這一實(shí)施方案的一方面中，該植物或植物細(xì)胞選自下組高梁、小麥、番 茄、甘藍(lán)類作物、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜、和玉米。在這個實(shí)施方 案的其他方面，該酵母細(xì)胞是釀酒酵母。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了酶原，該酶原包括SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :12ο在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了分離的核酸分子，該核酸分子包括核苷酸序列(該序列編碼了本發(fā)明的酶原)；包括該核酸分子的重組載體；和包括該重組載體的酵母 細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了包括本發(fā)明的酶原的轉(zhuǎn)基因植物。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了制造毒性蛋白的酶原的方法，該方法包括以 下步驟(a)設(shè)計從該毒性蛋白的一端延伸的多肽鏈；(b)形成具有表達(dá)質(zhì)粒的庫，這些表 達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn)入到遺傳系統(tǒng)時將表達(dá)包括該多肽鏈的前體；(C)在天然地易受該毒性蛋 白影響的遺傳系統(tǒng)中表達(dá)這些前體；(d)回收在步驟(C)中存活的遺傳系統(tǒng)的多個生物或 細(xì)胞；(e)將這些前體從步驟(d)的這些生物或細(xì)胞中分離；(f)測試這些前體對抗靶生物 或細(xì)胞的生物活性；并且(g)識別作為酶原的這些具有生物學(xué)活性的前體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了遺傳系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許有效識別毒性蛋白的酶 原前體，其中在該前體中該毒性蛋白是無活性的或基本上無活性的，并且其中該酶原在非 靶宿主生物或細(xì)胞中是良性的，并且在該酶原是在靶生物或細(xì)胞中時被轉(zhuǎn)變成毒性蛋白。
在又另一實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的這些新酶原的藥用組合物是由本發(fā)明所涵蓋 的。此類藥用組合物作為(例如)抗癌劑應(yīng)當(dāng)是有效的。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，披露了方法，從而創(chuàng)造Vip2 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的酶 原用于在植物中表達(dá)時降低植物毒性。作為在自然中大多數(shù)保守的蛋白之一的Vip2核 糖基轉(zhuǎn)移酶，有理由推定這種毒素對于要求肌動蛋白用于其生存的細(xì)胞而言將可能是有毒 的。在其天然形式中，在植物中Vip2蛋白的表達(dá)是致命的，并且因此不能被用于轉(zhuǎn)基因目 的。然而，工程化的酶原應(yīng)當(dāng)需要被靶害蟲的消化蛋白酶激活從而發(fā)揮其致命的功能。來 自Vip2 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的一端的一條多肽鏈的適當(dāng)延伸可以但非限制性地通過四個機(jī) 制來干擾其酶促功能1)對該活性位點(diǎn)進(jìn)行空間阻斷，2)干擾NAD-結(jié)合位點(diǎn)，3)在酶構(gòu)象 方面給予變化，或者4)在總體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面引入降低。由于Vip2的C端與其N端相 比是更接近這種蛋白的功能位點(diǎn)的(圖1)，考慮了在該蛋白的C端部分上加入多肽鏈延伸 也許是更好的掩蔽Vip2酶活性的機(jī)會。為了發(fā)現(xiàn)有功能的前肽序列，必須設(shè)計出對于具有 抑制酶性功能的Vip2酶原前體應(yīng)當(dāng)進(jìn)行有效選擇的遺傳系統(tǒng)。在此披露了體內(nèi)遺傳系統(tǒng)，用于在酵母中選擇存在缺陷的Vip2變體。在這種蛋白 的C端使用隨機(jī)延伸誘變并且在酵母中進(jìn)行選擇，鑒定出具有顯著降低的酶活性的Vip2前 酶，這種前酶對于玉米植物是良性的，由此在溫室條件下沒有引起發(fā)育的病理學(xué)。此外，這 種工程化的酶原仍然是足夠有力的以便致使根蟲死亡，這是由于在這種玉米根蟲的消化系 統(tǒng)中通過蛋白酶激活成野生型酶形式)。使用本披露，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地將該遺傳系統(tǒng)用于快速篩選以確 定在任何ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(特別是肌動蛋白ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶)中氨基酸殘基的潛在 功能的重要性，并且用于對這些關(guān)鍵性殘基進(jìn)行鑒定。Vip2與其他殺蟲性的和非殺蟲性的 毒素的酶組分(分別對應(yīng)地包括在以下表1和表2中所列的那些)共有顯著的序列相似 性。這些Vip2-樣ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有幾種涉及其功能的常見的結(jié)構(gòu)特征。在Vip2-樣 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的生物活性中十分重要的這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征包括對應(yīng)于Vip2(SEQ ID NO 9)的 E428 的催化殘基、對應(yīng)于 Vip2(SEQ ID NO 9)的 Y307、R349、E355、F397、和 R400 的NAD結(jié)合殘基、對應(yīng)于Vip2 (SEQID NO 9)的殘基386-388的“STS基序”(它使這種NAD 結(jié)合袋穩(wěn)定)、和由對應(yīng)于Vip2 (SEQ ID NO 9)的E426和E428的殘基形成的NAD結(jié)合袋。
13所以，酶原可以被設(shè)計成用于任何ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶原具有與Vip2相似的結(jié)構(gòu)/功 能關(guān)系，由此該酶原在非靶生物或細(xì)胞中是良性的而在靶生物或細(xì)胞中是具有活性的。表1 顯示了殺蟲性的毒素的比對，這些毒素具有與Vip2的同源性。表2顯示了非殺蟲性的毒素 的比對，這些毒素具有與Vip2的同源性。這些ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(表1中的SEQ ID NOs 15-19和表2中的SEQ ID NOs 20-23)中每一種均具有催化殘基、NAD結(jié)合殘基、STS基序、 和NAD結(jié)合袋殘基(對應(yīng)于Vip2(SEQ ID NO 9)的那些殘基)。表1.同源的ADP-核糖基化毒素。Vip2中的催化殘基Glu 428在這些序列之上用 標(biāo)記。參與NAD結(jié)合的殘基用丨指示。STS基序加下劃線。
權(quán)利要求
毒性蛋白的工程化的酶原，該酶原具有融合至該毒性蛋白的C端或N端上的多肽鏈延伸，其中該酶原在非靶生物或細(xì)胞中是良性的，并且其中當(dāng)該酶原在靶生物或細(xì)胞中時該酶原被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘鞍住?br> 2.如權(quán)利要求1所述的酶原，其中該毒性蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。
3.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶將肌動蛋白核糖基化。
4.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶包括氨基酸序列，該氨基酸序 列與SEQ ID NO :9具有至少69%的序列同一性，并且其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有催化 殘基和NAD結(jié)合殘基，該催化殘基對應(yīng)于SEQ ID NO 9的E428 ；所述NAD結(jié)合殘基對應(yīng)于 SEQ ID NO :9 的 Y307、R349、E355、F397 和 R400。
5.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是殺蟲性的。
6.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是Vip2毒素。
7.如權(quán)利要求6所述的酶原，其中該Vip2毒素選自下組SEQIDNO :9、10、15、16、17、 18 和 19。
8.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該多肽延伸包括長度為至少21個殘基的氨基酸序 列，并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)。
9.如權(quán)利要求8所述的酶原，其中該多肽延伸包括SEQID NO :6。
10.如權(quán)利要求2所述的酶原，其中該多肽延伸包括SEQID NO :8。
11.如權(quán)利要求8、9或10所述的酶原，其中該多肽鏈延伸融合至該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶 的C端。
12.如權(quán)利要求1所述的酶原，其中該非靶生物或細(xì)胞是植物、植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的酶原，其中該植物或植物細(xì)胞選自下組高粱、小麥、番茄、甘 藍(lán)類作物、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜和玉米。
14.如權(quán)利要求13所述的酶原，其中該植物或植物細(xì)胞是玉米。
15.如權(quán)利要求12所述的酶原，其中該酵母細(xì)胞是釀酒酵母。
16.如權(quán)利要求1所述的酶原，其中該酶原包括SEQID N0:11或SEQID N0:12。
17.分離的核酸分子，包括編碼權(quán)利要求1-16所述的酶原的核苷酸序列。
18.重組載體，包括如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子。
19.轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，包括如權(quán)利要求17所述的核酸分子。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物是玉米植物或玉米植物細(xì)胞。
21.酵母細(xì)胞，包括如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子。
22.如權(quán)利要求21所述的酵母細(xì)胞，其中該酵母是釀酒酵母。
23.制造毒性蛋白的酶原的方法，該方法包括以下步驟(a)設(shè)計從該毒性蛋白的一端延伸的多肽鏈；(b)制備表達(dá)質(zhì)粒的文庫，所述表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化入遺傳系統(tǒng)時將表達(dá)包括該多肽鏈的 前體；(c)在天然地對毒性蛋白易感的遺傳系統(tǒng)中表達(dá)所述前體；(d)回收在步驟(c)中存活的遺傳系統(tǒng)的生物或細(xì)胞；(e)從步驟(d)的生物或細(xì)胞中分離所述前體；(f)測試前體針對靶生物或細(xì)胞的生物活性；并且(g)將所述具有生物學(xué)活性的前體鑒定為酶原。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該毒性蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶將肌動蛋白核糖化。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是殺蟲性的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶是Vip2毒素。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該Vip2毒素選自下組SEQIDNO :9、10、15、16、 17,18 和 19。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該文庫包括隨機(jī)的氨基酸序列，序列具有至少 21個殘基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)殘基。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該遺傳系統(tǒng)是真核生物或細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中該遺傳系統(tǒng)是酵母。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中酵母是釀酒酵母。
33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該靶生物或細(xì)胞是真核的或原核的。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該靶生物或細(xì)胞是昆蟲或昆蟲細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該昆蟲或昆蟲細(xì)胞是根螢葉甲屬中的。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中該昆蟲生物或細(xì)胞是玉米根螢葉甲(西方玉米 根蟲)、長角根螢葉甲(北方根蟲)、或D. virgifera zeae (墨西哥玉米根蟲)。
37.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該酶原在該靶細(xì)胞中是具有生物學(xué)活性的。
38.遺傳系統(tǒng)，該遺傳系統(tǒng)允許有效鑒定毒性蛋白的工程化的酶原，其中該酶原在非 靶生物或細(xì)胞中是良性的，并且其中當(dāng)該酶原在靶生物或細(xì)胞中時該酶原被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘?白。
39.如權(quán)利要求37所述的遺傳系統(tǒng)，其中該工程化的酶原包括從該毒性蛋白的C端或 N端延伸的多肽鏈。
40.如權(quán)利要求37所述的遺傳系統(tǒng)，該遺傳系統(tǒng)是酵母。
41.如權(quán)利要求37所述的遺傳系統(tǒng)，其中該酵母是釀酒酵母。
42.如權(quán)利要求37所述的遺傳系統(tǒng)，其中該靶生物或細(xì)胞是病原性細(xì)胞或生物。
43.如權(quán)利要求37所述的遺傳系統(tǒng)，其中該毒性蛋白是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。
44.如權(quán)利要求42(43)所述的遺傳系統(tǒng)，其中該ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶將肌動蛋白核糖
全文摘要
ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Vip2)通過修飾肌動蛋白并且防止肌動蛋白聚合而在昆蟲體內(nèi)發(fā)揮它的細(xì)胞內(nèi)毒性。由于這種毒素的特性，Vip2在植物中的表達(dá)對該植物是致命的。在此所說明的是制造毒性蛋白的酶原的方法，這些酶原在非靶生物中是良性的并且在靶生物中被激活。在此披露的是在毒性蛋白的末端對隨機(jī)的前肽庫進(jìn)行工程化、并且對酵母中功能失常的變體進(jìn)行選擇的方法。使用這種方法，所選擇的前酶與野生型Vip2蛋白相比具有降低的酶活性，但仍保持著對于玉米根蟲幼蟲的有效毒性。玉米根蟲消化蛋白酶可以對這種Vip2酶原進(jìn)行蛋白質(zhì)分解性地激活。
文檔編號C12N9/10GK101970647SQ200880126346
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日
發(fā)明者弗雷德里克·S·沃爾特斯, 米蘭·朱科維克, 納倫達(dá)·V·帕勒卡, 陳政雄 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司