專利名稱：改變植物生理學(xué)反應(yīng)的組合物和方法
改變植物生理學(xué)反應(yīng)的組合物和方法
背景技術(shù)：
植物激素乙烯是調(diào)節(jié)植物生命周期中的許多生理學(xué)過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，這些生理學(xué)過程包括發(fā)芽期間、花和果實(shí)發(fā)育過程中的反應(yīng)，以及植物對(duì)各種環(huán)境應(yīng)激源，例 如干旱、熱、鹽度過量以及疾病的反應(yīng)(參見例如，Chen等，2005，Annals of Botany, 95 901-915 ；Czarny 等，2006 Biotechnol. Adv. ,24 410-419)。乙烯生物合成途徑和信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)/調(diào)節(jié)途徑及網(wǎng)絡(luò)是公知的。例如，參見

圖1和2，Wang等，“乙烯生物合成和信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)”(Ethylene Biosynthesisand Signaling Networks)，《植物細(xì)胞》(The Plant Cell)，2002 (美國植物生物學(xué)家協(xié)會(huì)(American Society of Plant Biologists)編著)， 第S131-S151頁。商業(yè)上，調(diào)節(jié)包括水果、蔬菜和花卉等植物中的乙烯效應(yīng)的常規(guī)途徑涉 及將化學(xué)物質(zhì)施用于植物、水果、花卉或蔬菜，例如1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP ；農(nóng)新有限公司 (AgroFresh Inc.))。I-MCP是通常為氣體的化合物，可用作植物生長調(diào)節(jié)劑，防止乙烯與其 在植物組織中的受體的結(jié)合。其應(yīng)用增加了植物對(duì)乙烯的不敏感性。乙烯敏感性的短暫消 除可能增加植物對(duì)應(yīng)激的抵抗力或耐受、延遲成熟、枯萎或開花，以及進(jìn)行其他有商業(yè)價(jià)值 的植物生長操縱。近來，提出了用修飾的乙烯效應(yīng)受體或參與植物中乙烯效應(yīng)的其他蛋白質(zhì)遺傳 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的建議，例如參見美國專利6，294，716 ；美國專利申請(qǐng)公開2006/0200875、 2005/0066389、2005/0060772和2004/0128719等。這些系統(tǒng)介導(dǎo)乙烯途徑中的各種突變基 因的表達(dá)。這些系統(tǒng)通常采用各種建議的啟動(dòng)子來啟動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括組成型啟動(dòng)子 和組織特異性啟動(dòng)子。雖然已經(jīng)提出將化學(xué)調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)用于植物物種(M. Padidim 2003Curr. Opin Plant Biol. ,6(2) 169-77)，但許多這些系統(tǒng)僅僅是實(shí)驗(yàn)性的，或者已經(jīng)報(bào)道存在一 些缺陷。這些缺陷包括使用毒性或揮發(fā)性誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)水平低、在植物中易位/移動(dòng)差、 “關(guān)閉”基因表達(dá)的能力慢、或者對(duì)植物非毒性誘導(dǎo)劑的特異性不夠，等等。這些基因表達(dá)系 統(tǒng)未能在所有植物中普遍使用，操作性組件及其組合件的選擇常常充滿挑戰(zhàn)。在現(xiàn)有技術(shù)的例子中，乙烯途徑基因常?？偸窃谥参锏乃薪M織和部件上或者總 是在植物的特定組織上表達(dá)。然而，組織特異性啟動(dòng)子或低水平組成型啟動(dòng)子可能有漏洞 或者由不希望的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。這些常規(guī)啟動(dòng)子不能嚴(yán)格調(diào)節(jié)植物中的激素表達(dá)。乙烯途徑 基因的表達(dá)時(shí)機(jī)、表達(dá)持續(xù)時(shí)間和表達(dá)水平是正常生理學(xué)功能的關(guān)鍵。隨意誘導(dǎo)乙烯不敏 感性并且保持預(yù)定的時(shí)間范圍在現(xiàn)有技術(shù)中尚未成功實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域仍然需要能夠可控地依時(shí)序調(diào)節(jié)植物激素反應(yīng)，例如乙烯敏感性的組合物 和方法，該組合物和方法可安全用于農(nóng)作物和食物以及其他植物。附圖簡要說明圖1是質(zhì)粒pl85的示意圖，該質(zhì)粒包括用于表達(dá)乙烯效應(yīng)途徑中的突變基因 ETRl-I的基因表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建物上方是激活盒組件的標(biāo)記，即10-90p組成型啟動(dòng)子、VP16 激活域、GAL4DNA結(jié)合域、蛻皮激素受體(EcR)配體結(jié)合域和NOS終止子。構(gòu)建物上方也包 括靶標(biāo)盒組件的標(biāo)記，包括GAL4效應(yīng)元件的5個(gè)重復(fù)單元(5xG)，最小35S啟動(dòng)子(M35S)，突變etr 1-1基因的序列和35S終止子(35St)。靶標(biāo)盒之后是任選的植物選擇性標(biāo)記物PDF1，然后是rbcS終止子，可用于確定基因構(gòu)建物是否穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建物下 方是常規(guī)酶切位點(diǎn)的位置和種類。圖2是稱為pl85的質(zhì)粒的一個(gè)例子的示意圖，該質(zhì)粒同時(shí)具有基因表達(dá)系統(tǒng)的激 活盒和靶標(biāo)盒(G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etrl)，盒中各組件如圖 1 和 SEQ ID NO 1 所示，顯示突變基因etr 1-1具有G到A突變，括號(hào)中顯示切割位點(diǎn)的核酸位置。該質(zhì)粒的 盒部分在SEQ ID NO :1中有報(bào)道。序列表或附圖中未提供市售可得的質(zhì)粒主鏈，因?yàn)檫@些 主鏈可以容易地被其他質(zhì)粒主鏈代替。圖3是稱為pl87的質(zhì)粒的一個(gè)例子的示意圖，該質(zhì)粒包含激活盒和靶標(biāo)盒[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etrl]，利用GVE受體-介導(dǎo)的etr 1-1的誘導(dǎo)表達(dá)而表達(dá)etr 1-1。該質(zhì)粒的盒部分在SEQ ID NO :2中有報(bào)道。序列表或附圖中未提供市售可得的質(zhì)粒 主鏈，因?yàn)檫@些主鏈可以容易地被其他質(zhì)粒主鏈代替。

發(fā)明內(nèi)容
本文所述組合物和方法通過提供能夠以時(shí)序、定性和/或定量方式可靠而安全地 控制乙烯敏感性調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織、器官、果實(shí)或花而滿足了本領(lǐng)域的需 要。這些組合物和方法能夠嚴(yán)格調(diào)節(jié)基因表達(dá)和激素表達(dá)，可安全應(yīng)用于農(nóng)作物和食物以 及其他有商業(yè)價(jià)值的植物。在一個(gè)方面，提供了在植物細(xì)胞中可控表達(dá)乙烯效應(yīng)的基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包 括激活盒和靶標(biāo)盒，激活盒和靶標(biāo)盒可以位于一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒上。激活盒包括合適的啟動(dòng) 子、DNA-結(jié)合域(DBD)、蛻皮激素受體配體結(jié)合域(EcRLBD)和激活域(AD)。靶標(biāo)盒包括 化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包括操作性結(jié)合的效應(yīng)元件和最小啟動(dòng)子，DBD結(jié)合該效應(yīng)元 件，最小啟動(dòng)子對(duì)AD起反應(yīng)。這種化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制編碼調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的選 定蛋白質(zhì)或其片段的靶核酸序列的表達(dá)(有義或反義方向)。植物細(xì)胞中兩個(gè)盒中各組件 與誘導(dǎo)組合物的相互作用可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)并選擇性地調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的乙烯敏感性。 蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過應(yīng)用誘導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行控制。誘導(dǎo)組合 物可被植物細(xì)胞吸收和易位到植物細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)與激活域相互作用以啟動(dòng)靶標(biāo)盒的化 學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。因此，該系統(tǒng)能夠通過靶核酸序列的表達(dá)可控且選擇性地調(diào)節(jié)植物細(xì)胞 中的乙烯敏感性。在另一方面，提供了一種短暫或穩(wěn)定地表達(dá)上述基因表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞。在另一方面，提供了一種短暫或穩(wěn)定地表達(dá)上述基因表達(dá)系統(tǒng)的植物組織或器官。在另一方面，提供了一種短暫或穩(wěn)定地表達(dá)上述基因表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物。在另一方面，一種制備這種轉(zhuǎn)基因植物或其部分的方法，該方法包括用本文所述 的基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化至少一個(gè)植物細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植物細(xì)胞、組織、器官或完 整植株；和當(dāng)植物細(xì)胞、組織、器官或完整植株接觸誘導(dǎo)組合物時(shí)選擇顯示能可控調(diào)節(jié)乙烯 不敏感性的植物細(xì)胞、組織、器官或完整植株。蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過應(yīng)用誘導(dǎo)組合物 的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行控制。誘導(dǎo)組合物可以被植物細(xì)胞、組織、器官或完整植株吸 收和易位到這些植物細(xì)胞、組織、器官或完整植株內(nèi)。
在又一方面，一種控制植物中的乙烯敏感性的方法，該方法包括將有效量的誘導(dǎo)組合物應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物或其部分的細(xì)胞，所述植物包含能夠穩(wěn)定或短暫表達(dá)本文所述基 因表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞。誘導(dǎo)組合物可以被植物細(xì)胞吸收和易位到植物細(xì)胞內(nèi)。在誘導(dǎo)組合物 的存在下，在選定的時(shí)間內(nèi)植物細(xì)胞對(duì)乙烯的反應(yīng)降低；通過去除植物中的誘導(dǎo)劑，在選定 的時(shí)間后植物細(xì)胞對(duì)乙烯的反應(yīng)增加。蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過應(yīng)用誘導(dǎo)組合物的時(shí) 機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行控制。下面的發(fā)明詳述中將進(jìn)一步描述這些方法和組合物的其他方面和優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本文所述組合物和方法解決了本領(lǐng)域?qū)τ诳煽卣{(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的組合物 和方法的需要。更具體說，本文所述的組合物和方法能夠基于選定量的化學(xué)誘導(dǎo)劑的使用 有意改變表達(dá)水平。這種操控植物激素調(diào)節(jié)的能力提供了農(nóng)作物的生長和成熟的農(nóng)業(yè)優(yōu)勢 以及以下所述的其他優(yōu)點(diǎn)。I.基因表達(dá)系統(tǒng)利用基因表達(dá)或調(diào)節(jié)系統(tǒng)在植物細(xì)胞中穩(wěn)定或短暫表達(dá)。該系統(tǒng)的組件包括至少 兩個(gè)基因表達(dá)盒，每個(gè)盒能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一基因表達(dá)盒稱為激活盒，其包括可以在與其操作性結(jié) 合的合適啟動(dòng)子控制下在植物細(xì)胞中表達(dá)的多核苷酸，該多核苷酸編碼以下組件(a) DNA-結(jié)合域(DBD)，DBD識(shí)別與準(zhǔn)備調(diào)節(jié)其表達(dá)的基因，即編碼調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的選 定蛋白質(zhì)的基因相關(guān)的效應(yīng)元件；(b)配體結(jié)合域(LBD)，LBD包括蛻皮激素受體配體結(jié)合 域(EcRLBD)或其功能片段；和(c)激活或反式激活域(AD)，AD在適用于植物的誘導(dǎo)組合 物的存在下激活。在一個(gè)實(shí)施方式中，激活盒中的組件采用以下5'到3'的順序存在LBD 位于DBD下游，而DBD在AD下游。在另一實(shí)施方式中，激活盒中的組件采用以下5‘到3' 的順序存在LBD位于AD下游，而AD在DBD下游。在另一實(shí)施方式中，激活盒中的組件采 用以下5'到3'的順序存在DBD位于LBD下游，而LBD在AD下游。在另一實(shí)施方式中， 激活盒中的組件采用以下5'到3'的順序存在DBD位于AD下游，而AD在LBD下游。在 另一實(shí)施方式中，激活盒中的組件采用以下5'到3'的順序存在AD位于LBD下游，而LBD 在DBD下游。在另一實(shí)施方式中，激活盒中的組件采用以下5'到3'的順序存在AD位于 DBD下游，而DBD在LBD下游。激活盒還包括優(yōu)選位于盒3’末端的終止子。下面將描述這 些組件的具體特征。第二基因表達(dá)盒即靶標(biāo)盒，其包括編碼以下組件的多核苷酸。一個(gè)組件是化學(xué)誘 導(dǎo)的啟動(dòng)子，其包括操作性結(jié)合的效應(yīng)元件(RE)和最小啟動(dòng)子，激活盒編碼的蛋白質(zhì)的 DBD結(jié)合RE，而最小啟動(dòng)子對(duì)激活盒的AD起反應(yīng)。另一個(gè)組件是靶核酸序列，該序列編碼 調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的選定蛋白質(zhì)，或者編碼該蛋白質(zhì)的功能片段。在某些實(shí)施方式中， 核酸序列可以是有義取向。在其它實(shí)施方式中，核酸序列可以是反義取向。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 控制編碼選定蛋白質(zhì)的序列或反義序列的表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，激活盒和/或靶標(biāo)盒還包含終止子序列，例如在編碼蛋白質(zhì) 的核酸序列或其反義序列下游，以及任選的可選標(biāo)記物。這種標(biāo)記物是眾所周知的，用于在 抗生素或其他化學(xué)物質(zhì)的存在下選擇攝取基因的細(xì)胞。下面將更詳細(xì)地描述這些任選組件。植物細(xì)胞中與誘導(dǎo)組合物協(xié)同作用時(shí)，基因表達(dá)系統(tǒng)發(fā)揮作用，使得激活盒和靶標(biāo)盒的各組件能夠調(diào)節(jié)選定蛋白質(zhì)的表達(dá)。選定蛋白質(zhì)的調(diào)控或調(diào)節(jié)能夠選擇性地調(diào)節(jié)植 物細(xì)胞的乙烯敏感性。例如，一種調(diào)控方式包括提高植物細(xì)胞的乙烯敏感性。在另一實(shí)施 方式中，降低植物細(xì)胞的乙烯敏感性。通過基因表達(dá)系統(tǒng)中各組分與誘導(dǎo)組合物的相互作 用來控制植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)乙烯途徑的蛋白質(zhì)的表達(dá)。誘導(dǎo)組合物可以被植物細(xì)胞吸收和/ 或易位到植物細(xì)胞內(nèi)。在該系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式中，第一盒和第二盒位于同一個(gè)質(zhì)粒上，例如圖2和3所 示。在另一實(shí)施方式中，第一和第二盒位于單獨(dú)的質(zhì)粒上。在基因表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，第一基因表達(dá)盒可包含DBD和第一 LBD ；第 二盒可包含AD和第二不同的LBD ；第三盒可包含編碼效應(yīng)元件的多核苷酸、啟動(dòng)子和需要 調(diào)節(jié)表達(dá)的靶基因，第一多肽的DBD結(jié)合該效應(yīng)元件，第二盒的AD激活該啟動(dòng)子。在該系 統(tǒng)中，AD和DBD操作性連接于兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)，在誘導(dǎo)組合物的存在下可激活靶基因的 表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一 LBD可以是EcR LBD，第二 LBD可以是來自類視黃醇X受體 的LBD。在另一實(shí)施方式中，第二 LBD可以是EcR LBD，而第一 LBD可以是來自類視黃醇X 受體的LBD。這種結(jié)構(gòu)在美國專利7091038或2005年12月1日公開的美國專利公開US 2005/0266457 中描述。為了理解以下組件，所用的術(shù)語“操作性連接”或“可操作地連接”表示單一核酸 片段上核酸序列的結(jié)合，使得一個(gè)核酸序列的功能受到另一個(gè)核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟 動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)時(shí)，啟動(dòng)子操作性連 接于編碼序列。編碼序列以有義或反義取向操作性連接于調(diào)控序列。本文所用術(shù)語“表達(dá)”表示源自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄 和穩(wěn)定累積。在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)表示mRNA翻譯形成蛋白質(zhì)或多肽。在另一實(shí)施方式 中，可以通過以下方式降低或下調(diào)表達(dá)反義(即，表達(dá)與mRNA “有義”序列互補(bǔ)的序列，然 后結(jié)合“有義”鏈并阻止其表達(dá))，共抑制(即，過度表達(dá)基因序列，通常是轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致同源 內(nèi)源性基因的抑制)或RNA干擾(RNAi，即將RNA引入細(xì)胞最終導(dǎo)致互補(bǔ)細(xì)胞mRNA下降并 導(dǎo)致基因活性降低的過程)。在另一實(shí)施方式中，基因表達(dá)系統(tǒng)的組件可以在植物細(xì)胞中短 暫表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，基因表達(dá)系統(tǒng)的組件可以通過整合入植物細(xì)胞的染色體內(nèi)而 穩(wěn)定表達(dá)。短暫或穩(wěn)定整合表達(dá)的選擇可以由產(chǎn)生和使用本文所述基因表達(dá)系統(tǒng)領(lǐng)域中的 技術(shù)人員進(jìn)行選擇。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”表示能夠在特定限制位點(diǎn)或者通過同源重組 插入核酸或多核苷酸的DNA區(qū)段。該DNA區(qū)段包括編碼感興趣多肽或者提供反義取向的基 因的多核苷酸，盒和限制位點(diǎn)被設(shè)計(jì)成能夠確保盒插入適當(dāng)讀碼框以任一方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和 翻譯。這些載體或質(zhì)?？扇芜x地包含編碼感興趣多肽的多核苷酸并具有除有利于特定宿主 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的多核苷酸之外的元件。在某些實(shí)施方式中，這些盒還包含使得編碼感興趣多肽 的多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)提高的元件。這些元件包括但不限于啟動(dòng)子、最小啟動(dòng)子、 增強(qiáng)劑、效應(yīng)元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列等。本文使用的所有其他術(shù)語采用本領(lǐng)域的常規(guī)涵義，除非另有說明。參見例如，美國 專利7091038中的術(shù)語定義。
Α.激活盒的啟動(dòng)子在所述系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式中，激活盒的啟動(dòng)子是能夠控制轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)DBD、LBD和AD序列的表達(dá)的核酸序列(DNA或RNA)。通常，這三種激活盒的主要組件位于 選定啟動(dòng)子序列的3'端。啟動(dòng)子序列包括稱為增強(qiáng)子的近端或較遠(yuǎn)端的上游元件?！霸鰪?qiáng) 子”是能夠刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，可以是啟動(dòng)子的先天元件或是插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子的 水平或特異性的異源元件。本文中有用的啟動(dòng)子可完全源自天然基因，或者由源自天然存 在的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，激活盒的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如導(dǎo)致基因大多時(shí)候在 大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子，使得用該盒轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不斷產(chǎn)生激活盒組件。例如， 適用于所述激活盒的某些組成型啟動(dòng)子包括但不限于示例性的G10-90啟動(dòng)子、花椰菜花 葉病毒35S啟動(dòng)子、木薯花葉病毒啟動(dòng)子、玄參花葉病毒啟動(dòng)子、桿狀DNA病毒啟動(dòng)子、紫茉 莉花葉病毒啟動(dòng)子、核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶啟動(dòng)子(Rubisco promoter)、肌動(dòng)蛋 白啟動(dòng)子或泛素啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方式中，可采用介導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子(“組 織特異性”、“細(xì)胞特異性”或“植物器官特異性啟動(dòng)子”)。理想地，這種啟動(dòng)子是植物組織和 植物細(xì)胞固有或有功能的，或者是植物組織和植物細(xì)胞固有或有功能啟動(dòng)子的突變形式。 然而，也可使用在植物細(xì)胞中起作用的諸如哺乳動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物等其他來源的其他組織 和細(xì)胞的啟動(dòng)子。其他實(shí)施方式采用在發(fā)育的不同階段表達(dá)組分的啟動(dòng)子(“發(fā)育特異性啟 動(dòng)子”或“細(xì)胞分化特異性啟動(dòng)子”)，或者響應(yīng)不同環(huán)境或生理學(xué)條件的啟動(dòng)子。組織特異 性啟動(dòng)子的詳細(xì)列表可參見Gallie，美國專利申請(qǐng)公開2005/0066389，其描述了源自以下 基因的種子特異性啟動(dòng)子來自玉米的MACI (Sheridan，1996 Genetics 142:1009-1020)； 來自玉米的 Cat3 (GenBank No. L05934, Abler 1993 Plant Mol. Biol. 22 10131-10138)； 來自擬南芥屬(Arabidopsis)的 vivparous-1 (Genbank No. U93215)；來自擬南芥屬的 atmycl(Urao,1996 Plant Mol. Biol. 32 571-576 ；Conceicao 1994 Plant 5:493-505); 來自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的 napA 禾口 BnCysPl (GenBank No. J02798, Josefsson, 1987 JBL 26 :12196_12201，Wan 等，2002 Plant J 30 :1_10)；來自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的 napin 基因家族(Sjodahl，1995 Planta 197:264-271)。果實(shí)特異性啟動(dòng)子包 括來自 CYP78A9 基因的啟動(dòng)子(Ito 和 Meyerowitz，2000 Plant Cell 12:1541-1550)。 其他組織特異性啟動(dòng)子包括 Reiser，1995 Cell 83 735-742，GenBank No. U39944 ；Ray, 1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5761_5765中描述的胚珠特異性BELl基因，以及卵和 中央細(xì)胞特異性FIEl啟動(dòng)子。萼片和花瓣特異性啟動(dòng)子包括擬南芥屬花同源異形基 因 APETALA1(API)(Gustafson Brown,1994Cell 76 131-143 ；Mandel,1992 Nature 360 273-277)，AP2 的相關(guān)啟動(dòng)子(例如參見 Drews, 1991Cell 65 :991_1002 ；Bowman, 1991 Plant Cell 3:749-758)。另一種有用的啟動(dòng)子是控制擬南芥屬的罕見花器官(ufo)基因 表達(dá)的啟動(dòng)子(Bossinger，1996Development 122:1093-1102)。其他組織特異性啟動(dòng)子 包括玉米花粉特異性啟動(dòng)子(Guerrero, 1990 Mol. Gen. Genet. 224 :161_168)；也可參見 ffakeley,1998Plant Mol. Biol. 37 :187_192 ；Ficker,1998 Mol.Gen. Genet. 257 :132_142 ； Kulikauskas, 1997 Plant Mol.Biol. 34 809-814 ；Treacy,1997 Plant Mol.Biol. 34 603-611描述的啟動(dòng)子)。有用的啟動(dòng)子包括來自FUL基因的啟動(dòng)子(Mandel和Yanofsky，1995 Plant Cell, 7 1763-1771)以及來自 SHPl 和 SHP2 基因的啟動(dòng)子(Flanagan 等，1996 Plant J 10 :343-353 ;Savidge 等，1995 Plant Cell7(6) :721_733)。啟動(dòng)子可源自 TA29 基因(Goldberg 等，1995 Philos Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :5_17)。其他合適的啟動(dòng)子包括來自以下基因的啟動(dòng)子編碼甘藍(lán)型油菜的2S儲(chǔ)存蛋白的基因(Dasgupta，1993 Gene 133 :301_302)；來自擬南芥屬的2s種子儲(chǔ)存蛋白基因家 族；編碼甘藍(lán)型油菜的油質(zhì)蛋白20kD的基因，GenBank No. M63985 ；編碼大豆油質(zhì)蛋白A 的基因，GenbankNo. U091 18，和編碼大豆油質(zhì)蛋白B的基因，Genbank No. U09119 ；編碼 擬南芥屬油質(zhì)蛋白的基因，GenbankNo. Z17657 ；編碼玉米油質(zhì)蛋白18kD的基因，GenBank No. J05212 和 Lee, 1994Plant Mol. Biol. 26 :1981_1987 ；編碼大豆低分子量富硫蛋白的 基因(Choi，1995Mol Gen，Genet. 246 :266-268)。來自番茄的組織特異性E8啟動(dòng)子和來 自 ATHB-8、AtPINl、AtP 5K1 或 TED3 基因的啟動(dòng)子(Baima 等，2001 Plant Physiol. 126 643-655，Galaweiler 等，1998 Science 282 2226-2230 ；Elge 等，2001 Plant J. 26 561-571 ；Igarashi 等，1998 Plant Mol. Biol. 36 :917_927)也是有用的。也可使用果實(shí)熟化、葉片枯萎和脫落期間以及在較低程度上花的枯萎和脫落期間 有活性的番茄啟動(dòng)子(Blume,1997 Plant J. 12 :731_746)。其他示例性的啟動(dòng)子包括編 碼雌蕊特異性堿性內(nèi)切殼多糖酶的馬鈴薯(Solanum tuberosumL.) SK2基因中的雌蕊特異 性啟動(dòng)子(Ficker, 1997 Plant Mol. Biol. 35 425-431)；轉(zhuǎn)基因苜蓿滋養(yǎng)和花柄尖的表皮 組織中有活性的豌豆阿拉斯加栽培品種(Pisum sativum cv. Alaska)的Blec4基因。可 使用在滋養(yǎng)型組織中有活性的各種啟動(dòng)子，包括控制土豆的主要儲(chǔ)存蛋白patatin的啟 動(dòng)子(例如，Kim, 1994PlantMol. Biol. 26 :603_615 ；和 Martin, 1997 Plant J. 11 :53_62) 和毛根農(nóng)桿菌的 0RF13 啟動(dòng)子(Hansen，1997 Mol. Gen. Genet. 254 :337_343)。其他有用 的滋養(yǎng)型組織特異性啟動(dòng)子包括編碼主要的芋頭(Colocasia esculenta L. Schott)球 蓮蛋白家族的球蛋白tarin的基因的tarin啟動(dòng)子(Bezerra，1995 Plant Mol. Biol. 28 137-144) ；curculin 啟動(dòng)子(de Castro, 1992 Plant Cell 4 1549-1559)和煙草根部特 異性基因TobRB7的啟動(dòng)子(Yamamoto，1991 Plant Cell 3:371-382)。葉特異性啟動(dòng)子 包括二磷酸核酮糖氫羧化酶(RBCS)啟動(dòng)子、番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因(Meier， 1997 FEBS Lett. 415 :91_95)。幾乎只在葉片和葉鞘的葉肉細(xì)胞中高水平表達(dá)的二磷酸 核酮糖羧化酶啟動(dòng)子(Matsuoka，1994 Plant J. 6 :311_319)，集光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基 因啟動(dòng)子(Shiina, 1997 Plant Physiol. 115 477-483 ；Casal, 1998 Plant Physiol. 116 1533-1538)，擬南芥myb-相關(guān)基因啟動(dòng)子(AtmybS ；Li, 1996 FEBS Lett. 379 :117_121)，禾口 Atmyb5 啟動(dòng)子(Busk, 1997 Plant J. 11 :1285_1295)都是有用的啟動(dòng)子。有用的滋養(yǎng)型組織特異性啟動(dòng)子包括分生組織(根尖和苗端)啟動(dòng)子，如 “SHOOTMERISTEMLESS” 和 “SCARECROW” 啟動(dòng)子(Di Laurenzio, 1996Cell 86 :423_433 ；和 Long, 1996Nature 379 :66_69。另一種有用的啟動(dòng)子控制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還 原酶HMG2基因的表達(dá)(例如參見Enjuto，1995Plant Cell. 7 :517_527)。有用的還有來自玉 米和其他物種的具有分生組織特異性表達(dá)的knl相關(guān)基因，例如參見Granger，1996 Plant Mol.Biol. 31 373-378 ；Kerstetter,1994 Plant Cell 6 1877-1887 ；Hake,1995 Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :45_51，例如擬南芥 KNATl 或KNAT2 啟動(dòng)子(例如參見 Lincoln,1994 Plant Cell 6:1859-1876)。
在激活盒的某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型的，例如在細(xì)胞接觸 試劑、生物分子、化學(xué)物質(zhì)、配體、光或一些其他刺激物或用這些物質(zhì)處理細(xì)胞后可引起核 酸序列的表達(dá)。這種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的非限制性列表包括PR l_a啟動(dòng)子、原核阻抑子-操 縱子系統(tǒng)和高等真核轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，例如美國專利7091038中詳述。這種啟動(dòng)子包括來自 大腸桿菌的四環(huán)素(“Tet")和乳糖(“Lac")阻抑子_操縱子系統(tǒng)。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子包括玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；馬鈴薯的寒冷、干旱和高鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，擬南芥屬枯萎 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，SAG12，以及LECl、LEC2、FUS3、AtSERKl和AGLI5的胚胎發(fā)生相關(guān)啟動(dòng)子，都 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。接觸植物激素如植物生長激素或細(xì)胞激肽類后可誘導(dǎo)的其他植 物啟動(dòng)子是也有用的，例如在美國專利申請(qǐng)公開US2005/0066389和美國專利6，294，716中所述。上在激活盒中，能夠啟動(dòng)序列DBD、LBD和AD的表達(dá)的任何啟動(dòng)子基本都是合適 的，包括但不限于病毒啟動(dòng)子、細(xì)菌啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、組織 特異性啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、光調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子；發(fā)病或疾病相關(guān)啟動(dòng) 子、花椰菜花葉病毒19S、花椰菜花葉病毒35S、CMV35S最小、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、玄 參花葉病毒、桿狀DNA病毒、紫茉莉花葉病毒、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖1，5_ 二磷酸羧 化酶、苗特異性、根特異性、殼多糖酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型、水稻東格魯桿狀病毒、植物超_啟動(dòng)子、 馬鈴薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸還原酶、醇脫氫酶、蔗糖合酶、甘露堿合酶、膽脂堿合酶、真蛸 堿合酶、泛素、玉米醇溶蛋白、肌動(dòng)蛋白和花色苷啟動(dòng)子。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng) 子選自下組花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒35S 最小啟動(dòng)子、玄參花葉病毒啟動(dòng)子、桿狀DNA病毒啟動(dòng)子、紫茉莉花葉病毒、泛素(Ubc)啟動(dòng) 子和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。B. DBD本文所用術(shù)語“DNA結(jié)合域”包括DNA結(jié)合蛋白的最小多肽序列，最長至整個(gè)DNA 結(jié)合蛋白長度，只要該DNA結(jié)合域能夠與特定效應(yīng)元件結(jié)合。在有或沒有配體的存在下， DNA結(jié)合域結(jié)合RE的DNA序列以啟動(dòng)或抑制受RE調(diào)控的下游基因的轉(zhuǎn)錄。在基因表達(dá)單 元的某些實(shí)施方式中，DBD位于激活盒中，而效應(yīng)元件位于靶標(biāo)盒中。DNA結(jié)合域可以是具有已知效應(yīng)元件的任何DNA結(jié)合域，包括合成和嵌合的DNA 結(jié)合域，或其類似物、或組合、或修飾形式。在某些實(shí)施方式中，DBD是GAL4DBD、LexA DBD、 轉(zhuǎn)錄因子DBD、H類核受體成員DBD、留體/甲狀腺激素核受體超家族成員DBD或細(xì)菌LacZ DBD0更優(yōu)選地，DBD是昆蟲蛻皮激素受體DBD，GAL4DBD (參見本文所述實(shí)施例的質(zhì)粒中所 示的序列)，或LexA DBD。這種DBD的序列公開可得，在諸如美國專利7091038或美國專利 申請(qǐng)公開2005/0266457中描述。在其它實(shí)施方式中，盒中的DBD包括但不限于由cl啟動(dòng) 子或Iac啟動(dòng)子獲得的DNA結(jié)合域，這也是公開可得的序列。C.蛻皮激素LBD和任選的第二 LBD在基因表達(dá)系統(tǒng)的某些實(shí)施方式中，蛻皮激素受體(EcR)LBD包括無脊椎動(dòng)物 蛻皮激素受體或其突變體的全部或其一部分。EcR是核留體受體超家族成員，表現(xiàn)為特 征DNA和配體結(jié)合域，以及激活域(Koelle等，1991，Cell,67 5977 ；也可參見美國專利 6245531 (Stanford)。蛻皮激素受體對(duì)許多留體化合物有響應(yīng)，例如松留酮A和莫瑞甾酮 A(muristerone A)和非甾體化合物。EcR具有5個(gè)模塊域，A/B (反式激活)，C(DNA結(jié)合，異源二聚化)，D (鉸鏈，異源二聚化)，E (配體結(jié)合，異源二聚化和反式激活)和F(反式激 活)結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域中的一些，例如A/B、C和E在與其他蛋白融合后保留功能?？梢?用作本文所述基因表達(dá)系統(tǒng)中的LBD的EcR的合適部分包括D、E和F。優(yōu)選地，EcR是鱗翅類EcR、雙翅類EcR、節(jié)肢類EcR、同翅類EcR和半翅類EcR。更 優(yōu)選地，使用的EcR是云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)EcR(〃 CfEcR")、黃粉蟲 甲(Tenebrio molitor)EcR(〃 TmEcR")、煙草天蛾(Manduca sexta)EcR(〃 MsEcR“)、綠 棉鈴蟲(Heliothies virescens)EcR(// HvEcR“)、家蠶蛾(Bombyxmori)EcR(“ BmEcR")、 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)EcR( “ DmEcR “)、埃及伊蚊(Aedes aegypti) EcR(" AaEcR “)、綠蠅(Lucilia capitata)EcR( 〃 LcEcR 〃)、地中海果蠅(Ceratitis capitata)EcR(" CcEcR“ )(Locusta migratoria)EcR( “ LmEcR “ )、 @ 蚜(Myzus persicae)EcR(// MpEcR“)、招潮蟹(Uca pugilator)EcR(“ UpEcR")、美洲 純目艮蝶(Amblyomma americanum)EcR( 〃 AmaEcR “)、銀葉粉風(fēng)(Bamecia argentifoli) EcR(" BaEcR")、或黑尾葉蟬(^photetix cinctic印s)EcR(〃 NcEcR“)等。甚至更優(yōu) 選地，LBD來自云杉卷葉蛾EcR(〃 CfEcR")或黑腹果蠅EcR(〃 DmEcR")。這種EcR的序 列公開可得，例如在美國專利7091038 ；國際專利申請(qǐng)WO 97/38117以及美國專利6333318、 6265173 和 5880333 中描述。另一種合適的突變體蛻皮激素受體包含上文引用的美國專利申請(qǐng)公開 2005/0266457描述的突變，例如包含至少一個(gè)突變的H類核受體配體結(jié)合域，所述突變的 位置等同于或類似于該公開所鑒定的某些特定氨基酸殘基。更具體說，在SEQ ID N0:9包 含T到V氨基酸突變的蛻皮激素LBD是在以下實(shí)施例中使用特別理想的EcRLBD。這種突變 體的序列也可記為本文所述SEQ ID NO :1的氨基酸990-1997。突變體EcR LBD稱為T52V， 描述了在全長CfEcR中氨基酸位置335處T到V的突變。以下實(shí)施例中使用的基因表達(dá)盒 利用這種EcRLBD的突變。本文所述基因表達(dá)系統(tǒng)中也可使用本文所述的其他EcR LBD0在 另一實(shí)施方式中，突變體蛻皮激素受體LBD是美國專利6，245，531 (Stanford)所述的LBD。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，LBD來自截短的EcR多肽。EcR多肽截短導(dǎo)致至少1、2、 3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、 120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、 215、220、225、230、235、240、245、250、255、260 或 265 個(gè)氨基酸的缺失。優(yōu)選地，EcR 多肽截 短導(dǎo)致至少一部分多肽結(jié)構(gòu)域的缺失。更優(yōu)選地，EcR多肽截短導(dǎo)致至少整個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域 的缺失。在一具體實(shí)施方式
中，EcR多肽截短導(dǎo)致至少A/B-結(jié)構(gòu)域、C-結(jié)構(gòu)域、D-結(jié)構(gòu)域、 F-結(jié)構(gòu)域、A/B/C-結(jié)構(gòu)域、A/B/1/2-C-結(jié)構(gòu)域、A/B/C/D-結(jié)構(gòu)域、A/B/C/D/F-結(jié)構(gòu)域、A/ B/F-結(jié)構(gòu)域、A/B/C/F-結(jié)構(gòu)域、部分E結(jié)構(gòu)域或部分F結(jié)構(gòu)域的缺失。也可進(jìn)行一些完整 和/或部分結(jié)構(gòu)域缺失的組合。在另一實(shí)施方式中，H類核受體配體結(jié)合域由包含導(dǎo)致以下殘基發(fā)生取代的密碼 子突變的多核苷酸編碼，這些殘基是a) SEQ ID N0:8的氨基酸殘基48、51、52、54、92、95、 96、109、110、119、120、125、128、132、219、223、234 或 238，b) SEQ ID NO 8 的氨基酸殘基 96 和119，c) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基110和128，d) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基52和110， e)SEQ ID NO :8的氨基酸殘基107、110和127，或f) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基52、107和 127。在另一實(shí)施方式中，H類核受體配體結(jié)合域由包含密碼子突變的多核苷酸編碼，所述突變可導(dǎo)致SEQ ID NO :8中氨基酸殘基107和127發(fā)生取代以及插入氨基酸259。SEQ ID NO 8如圖11所示。在另一具體實(shí)施方式
中，H類核受體配體結(jié)合域由包含導(dǎo)致以下殘基發(fā)生取代的 密碼子突變的多核苷酸編碼，所述殘基是a) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸殘基 48位置的天冬酰胺、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸或賴氨酸殘基，b) SEQ ID N0:8中等同 于或類似于氨基酸殘基51位置的甲硫氨酸、天冬酰胺或亮氨酸殘基，c) SEQ ID N0:8中等 同于或類似于氨基酸殘基52位 置的亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷 胺酰胺或谷氨酸殘基，d) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸54位置的色氨酸或蘇氨 酸，e) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸92位置的亮氨酸或谷氨酸，f) SEQ ID N0:8中 等同于或類似于氨基酸殘基95位置的組氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，g)SEQ ID N0:8中等同 于或類似于氨基酸殘基96位置的亮氨酸、絲氨酸、谷氨酸或色氨酸殘基，h)SEQ ID N0:8中 等同于或類似于氨基酸109位置的色氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺，i) SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸殘基110位置的谷氨酸、色氨酸或天冬酰胺殘基，j) SEQID NO :8中等同于或類似于氨基酸119位置的苯丙氨酸，k)SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨 基酸120位置的色氨酸或甲硫氨酸，1)SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸125位置的谷 氨酸、脯氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、纈氨酸或精 氨酸，m)SEQ ID NO 中等同于或類似于氨基酸128位置的苯丙氨酸，η) SEQ ID Ν0:8中等同 于或類似于氨基酸132位置的甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或纈氨酸，o) SEQ ID NO :8中等 同于或類似于氨基酸殘基219位置的丙氨酸、賴氨酸、色氨酸或酪氨酸殘基，ρ) SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸殘基223位置的賴氨酸、精氨酸或酪氨酸殘基，q)SEQ ID NO 8 中等同于或類似于氨基酸234位置的甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸或異亮氨酸，r)SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸238位置的脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸，s) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸119位置的苯丙氨酸殘基和SEQ ID NO :8中等同于或類 似于氨基酸96位置的蘇氨酸，t) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸110位置的脯氨酸 殘基和SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸128位置的苯丙氨酸殘基，u) SEQ ID NO 8 中等同于或類似于氨基酸52位置的纈氨酸殘基和SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸 110位置的脯氨酸殘基，ν) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸107位置的異亮氨酸殘 基，SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸127位置的谷氨酸殘基，和SEQ ID NO :8中等同 于或類似于氨基酸110位置的脯氨酸殘基，或者w) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸 107位置的異亮氨酸，SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸127位置的谷氨酸，和SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸52位置的纈氨酸。在另一實(shí)施方式中，H類核受體陪配體結(jié) 合域由包含密碼子突變的多核苷酸編碼，所述突變導(dǎo)致在SEQ ID NO :8中等同于或類似于 氨基酸107的位置取代異亮氨酸殘基，在SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸127的位 置取代谷氨酸殘基，和在SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸259的位置插入甘氨酸殘 基。在優(yōu)選實(shí)施方式中，H類核受體陪配體結(jié)合域來自蛻皮激素受體。在另一實(shí)施方式中，包含取代突變的LBD是包含取代突變的蛻皮激素受體配體結(jié) 合域，由包含導(dǎo)致選自下組的取代突變的密碼子突變的多核苷酸編碼。根據(jù)該列表，F(xiàn)48Y 表示SEQ ID NO :8的LBD中序列氨基酸位置48處的苯丙氨酸被酪氨酸取代，等等。因此， 所述組包括 SEQ ID NO 8 中 F48Y、F48W、F48L、F48N、F48R、F48K、I51M、I51N、I51L、T52M、T52V、T52L、T52E、T52P、T52R、T52W、T52G、T52Q、M54W、M54T、M92L、M92E、R95H、R95M、R95W、 V96L、V96W、V96S、V96E、F109W、F109P、F109L、F109M、F109N、A110E、AllON、AllOW、N119F、 Y120W、Y120M、M125P、M125R、M125E、M125L、M125C、M125W、M125G、M125I、M125N、M125S、 M125V、V128F、L132M、L132N、L132V、L132E、M219K、M219W、M219Y、M219A、L223K、L223R、 L223Y、L234M、L234I、L234R、L234W、W238P、W238E、W238Y、W238M、W238L、N119F/V96T、V128F/ A110P、T52V/A110P、V107I/Y127E/T52V 和 V107I/Y127E/A110P 所表示的取代突變。在另一 具體的實(shí)施方式中，包含取代突變的LBD是包含取代突變的蛻皮激素受體 配體結(jié)合域，由 包含導(dǎo)致SEQ ID N0:8中V107I/Y127E取代突變的密碼子突變的多核苷酸編碼，還包含SEQ ID NO 8 中 G259 的插入突變((V107I/Y127E/G259)。在另一實(shí)施方式中，LBD由在雜交條件下與上文鑒定的多核苷酸雜交的多核苷酸 編碼，所述雜交條件包括在小于500mM的鹽濃度和至少37°C進(jìn)行雜交步驟，以及在2 X SSPE 和至少63°C進(jìn)行洗滌步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，雜交條件包括在小于200mM的鹽濃度和至 少37°C進(jìn)行雜交步驟。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交條件包括在2 X SSPE和63°C進(jìn)行雜 交和洗滌步驟。在另一具體的實(shí)施方式中，配體結(jié)合域包含在等同于或類似于以下氨基酸殘基位 置的取代突變，這些氨基酸殘基是a) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基48、51、52、54、92、95、96、 109、110、119、120、125、128、132、219、223、234 或 238，b) SEQ ID NO 8 的氨基酸殘基 96 和 119，c) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基110和128，d) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基52和110， e)SEQ ID NO :8的氨基酸殘基107、110和127，或f) SEQ ID NO :8的氨基酸殘基52、107和 127。在另一實(shí)施方式中，H類核受體配體結(jié)合域包含取代突變以及SEQ ID NO :8中氨基酸 殘基259的插入突變，所述取代突變導(dǎo)致等同于或類似于SEQ IDNO 8中氨基酸殘基107和 127位置發(fā)生取代突變。優(yōu)選地，LBD包含以下殘基的取代a)SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸殘基 48位置的天冬酰胺、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸或賴氨酸殘基，b) SEQ ID N0:8中等同 于或類似于氨基酸殘基51位置的甲硫氨酸、天冬酰胺或亮氨酸殘基，c) SEQ ID N0:8中等 同于或類似于氨基酸殘基52位置的亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷 胺酰胺或谷氨酸殘基，d) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸54位置的色氨酸或蘇氨酸 殘基，e)SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸92位置的亮氨酸或谷氨酸殘基，f) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸殘基95位置的組氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，g)SEQ ID NO 8 中等同于或類似于氨基酸殘基96位置的亮氨酸、絲氨酸、谷氨酸或色氨酸殘基，h)SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸109位置的色氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺， i)SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸殘基110位置的谷氨酸、色氨酸或天冬酰胺殘基， j) SEQID NO :8中等同于或類似于氨基酸119位置的苯丙氨酸殘基，k) SEQ ID NO :8中等 同于或類似于氨基酸120位置的色氨酸或甲硫氨酸殘基，DSEQ ID NO :8中等同于或類似 于氨基酸125位置的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、天冬酰 胺、絲氨酸、纈氨酸或精氨酸殘基，m) SEQID NO:中等同于或類似于氨基酸128位置的苯丙 氨酸殘基，n) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸132位置的甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨 酸或纈氨酸殘基，o)SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸殘基219位置的丙氨酸、賴氨 酸、色氨酸或酪氨酸殘基，P) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸殘基223位置的賴氨酸、精氨酸或酪氨酸殘基，q)SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸234位置的甲硫氨酸、 精氨酸、色氨酸或異亮氨酸殘基，r) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸238位置的脯氨 酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸殘基，s) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸119 位置的苯丙氨酸殘基和SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸96位置的蘇氨酸殘基，t) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸110位置的脯氨酸殘基和SEQ ID NO :8中等同于或 類似于氨基酸128位置的苯丙氨酸殘基，u) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸52位置 的纈氨酸殘基和SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸110位置的脯氨酸殘基，ν) SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸107位置的異亮氨酸殘基，SEQ ID NO 8中等同于或類似于 氨基酸127位置的谷氨酸殘基，和SEQID NO 8中等同于或類似于氨基酸110位置的脯氨酸 殘基，或者w) SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸107位置的異亮氨酸殘基，SEQ ID NO 8中等同于或類似于氨基酸127位置的谷氨酸殘基，和SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基 酸52位置的纈氨酸殘基。在另一實(shí)施方式中，H型核受體陪配體結(jié)合域包含SEQ ID NO 8 中等同于或類似于氨基酸107位置的異亮氨酸殘基的取代，SEQ ID NO :8中等同于或類似 于氨基酸127位置的谷氨酸殘基的取代以及SEQ ID NO :8中等同于或類似于氨基酸259位 置的甘氨酸殘基的插入。在某些實(shí)施方式中，基因表達(dá)系統(tǒng)采用第二 LBD。第二 LBD不是蛻皮激素受體多肽，但可以是第二核受體的配體結(jié)合域。這種第二結(jié)合域包括但不限于脊椎動(dòng)物類視黃 醇X受體配體結(jié)合域、無脊椎動(dòng)物類視黃醇X受體配體結(jié)合域、超氣門蛋白(ultraspiracle protein)配體結(jié)合域，以及包含兩個(gè)多肽片段的嵌合配體結(jié)合域，其中第一多肽片段來自 脊椎動(dòng)物類視黃醇X受體配體結(jié)合域、無脊椎動(dòng)物類視黃醇X受體配體結(jié)合域或超氣門 蛋白配體結(jié)合域，第二多肽片段來自不同的脊椎動(dòng)物類視黃醇X受體配體結(jié)合域、無脊椎 動(dòng)物類視黃醇X受體配體結(jié)合域或超氣門蛋白配體結(jié)合域。例如參見美國專利申請(qǐng)公開 US2005/0266457中描述的結(jié)合域。這種LBD是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且已在文獻(xiàn)中詳細(xì) 記載。D.激活域可用于基因表達(dá)系統(tǒng)的激活或反式激活域(縮寫為“AD”)可以是任何H類核受 體成員AD、留體/甲狀腺激素核受體AD、合成或嵌合AD、聚谷胺酰胺AD、堿性或酸性氨基 酸 AD、VP 16 AD、GAL4 AD、NF- κ B AD、BP64 AD、B42 酸性激活域(B42AD)、p65 反式激活域 (P65AD)、糖皮質(zhì)激素激活域或其類似物、組合或修飾形式。在具體實(shí)施方式
中，AD是合成或 嵌合AD，或者由EcR、糖皮質(zhì)激素受體、VP16、GAL4、NF- κ B或Β42酸性激活域AD獲得。優(yōu) 選地，AD是EcRAD、VP 16AD、B42AD或p65AD。這種激活域的序列在諸如美國專利7，091, 038 或本文所述的其他文獻(xiàn)中公開可得。示例性的VP16AD在本文實(shí)施例所述的質(zhì)粒中描述。這 些結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且已在文獻(xiàn)中詳細(xì)記載。E.靶標(biāo)盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些實(shí)施方式中，靶標(biāo)盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是多組件啟動(dòng)子序列。其包括與對(duì)應(yīng) 于激活盒中的DNA結(jié)合域的一個(gè)或多個(gè)拷貝的效應(yīng)元件操作性結(jié)合的最小啟動(dòng)子。如本文 所述，最小啟動(dòng)子包括核心啟動(dòng)子(即，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的序列)和5'非翻譯區(qū)(5' UTR) 而沒有增強(qiáng)子序列。因此，在基因表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)施方式中，最小啟動(dòng)子可以是源自部分A 所述激活盒中使用的任何啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)子。在靶標(biāo)盒的某些實(shí)施方式中，理想的最小啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒35S最小啟動(dòng)子；合成的Elb最小啟動(dòng)子(SEQ ID NO 10 ；參見美國專利7091038)和合成的TATA最小啟動(dòng)子(TATATA ；參見美國專利申請(qǐng)公開 US2005/0228016)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地從文獻(xiàn)中詳述的各種啟動(dòng)子選擇本文所述 基因表達(dá)系統(tǒng)中使用的最小啟動(dòng)子。35S最小啟動(dòng)子的序列在以下實(shí)施例所述的質(zhì)粒中描 述。靶標(biāo)盒中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其他部分包括位于最小啟動(dòng)子5'或3'位置的效應(yīng) 元件(“RE")。一個(gè)RE的兩側(cè)可具有兩種不同或者相同的最小啟動(dòng)子以表達(dá)兩種不同的 蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，RE操作性連接于最小啟動(dòng)子。效應(yīng)元件是一種或多種順 式作 用的DNA元件，它能夠賦予啟動(dòng)子以通過與激活盒的DNA-結(jié)合域相互作用介導(dǎo)的反應(yīng)性。 這種DNA元件可以是回文序列(完美或不完美)或者由可變數(shù)量的核苷酸分隔的序列基序 或半位點(diǎn)(half sites)組成。半位點(diǎn)可以類似或者相同，并排列成正向或反轉(zhuǎn)重復(fù)序列或 者形成單個(gè)半位點(diǎn)或相鄰半位點(diǎn)串聯(lián)形成的多聚體。天然蛻皮激素受體的效應(yīng)元件的DNA 序列的例子在 Cherbas L.等，1991 Genes Dev. 5,120 131 ；D' Avino PP.等，1995 Mol. Cell. Endocrinol，113 :19 和 Antoniewski C.等，1994 Mol. Cell Biol. 14，4465-4474 以 及其他出版物中描述。RE可以是對(duì)應(yīng)于激活盒中的DNA結(jié)合域的任何效應(yīng)元件，或其類似 物、組合或修飾形式。靶標(biāo)盒中可采用單個(gè)RE或多個(gè)RE，多個(gè)RE可以是相同RE的多個(gè)拷 貝或是兩種或更多種不同的RE。RE可以被針對(duì)其他DNA結(jié)合蛋白域，例如酵母的GAL-4蛋 白(參見Sadowski等，1988Nature, 335 563564)或大腸桿菌的LexA蛋白(參見Brent禾口 Ptashne 1985，Cell,43 =729736)的效應(yīng)元件修飾或取代，或?qū)Ω鶕?jù)特異性相互作用設(shè)計(jì)、 修飾和選擇的蛋白質(zhì)的靶向相互作用特異的合成效應(yīng)元件(例如參見Kim等，1997 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，94 =3616-3620)以適合嵌合受體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，RE是GAL4 的RE(〃 GAL4RE")，優(yōu)選兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。以下實(shí)施例顯示采用5個(gè)拷貝的GAL4RE(Le， 5XGAL4)。然而，其他合適的RE包括但不限于LexA、H類核受體RE、留體/甲狀腺激素核 受體RE、或識(shí)別合成DNA結(jié)構(gòu)域的合成RE。在其它實(shí)施方式中，RE是蛻皮激素效應(yīng)元件 (EcRE)、或包含多核苷酸序列的LexA RE(操縱子，丨‘op")。所有這些RE已在文獻(xiàn)中詳 細(xì)記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地根據(jù)本說明書內(nèi)容進(jìn)行選擇。在靶標(biāo)盒中，“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”操作性連接，控制調(diào)節(jié)乙烯敏感性的核酸序列或基 因的表達(dá)，如下所述。靶標(biāo)盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子由化學(xué)誘導(dǎo)組合物或者誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，當(dāng)所述化 學(xué)誘導(dǎo)組合物或者誘導(dǎo)劑接觸激活盒的配體結(jié)合域時(shí)激活最小啟動(dòng)子的效應(yīng)元件。F.編碼選定蛋白的核酸序列該系統(tǒng)中使用的核酸序列編碼能夠調(diào)節(jié)植物乙烯敏感性或乙烯產(chǎn)生的選定蛋白。 在某些實(shí)施方式中，這種核酸序列包括乙烯生物合成基因、ACC合酶(ACS)、ACC氧化酶 (ACO)和ACC脫氨酶(ACD)。其他合適的乙烯受體基因是編碼ETR1、ETR2、ERSU ERS2和 EIN4蛋白的野生型基因。其他乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因編碼蛋白，如RTE1、CTR1、EIN2、EIN3、 EIN3-樣(EIL1-5)、EIN5、EIN6和EEN可用于在本文所述方法以及植物、植物器官和組織中 使用的基因表達(dá)系統(tǒng)。形成基因表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)施方式的其他核酸序列包括乙烯反應(yīng)因子、 ERFU EDFU EDF2、EDF3和EDF4、EIN3結(jié)合F-盒蛋白、EBFl和EBF2。其他乙烯調(diào)節(jié)靴點(diǎn) 也可參見 Czamy 等，2006 Biotech. Advances, 24 410-419 ；Chen φ, 2005 Annals Bot. 95 901-915 ；和 Ciardi 和 Klee, 2001, Annals Bot, 88 :813_822。
除了使用野生型或天然來源的植物基因外，基因表達(dá)系統(tǒng)也可采用某些核酸序列，在這些基因序列和編碼蛋白中包含有用的突變。這種突變體etrl-Ι受體序列的例子鑒 定為SEQ ID NO :1中的核苷酸2557至4767。文獻(xiàn)中描述了許多已知的突變乙烯受體蛋白 以及產(chǎn)生這種突變的方法。參見例如，美國專利申請(qǐng)公開US2004/0128719中描述的突變受 體，以及段落0033-0041中描述的突變；和美國專利公開US 2005/0066389中描述的ACC氧 化酶序列；和美國專利申請(qǐng)公開US 2006/0200875中描述的ETR序列等等。在本文所述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的基因表達(dá)系統(tǒng)中以及方法中使 用特定植物的野生型基因來控制或調(diào)節(jié)植物乙烯敏感性。在另一實(shí)施方式中，采用介導(dǎo)植 物細(xì)胞乙烯敏感性或乙烯產(chǎn)生的野生型蛋白的突變體。在又一些實(shí)施方式中，將調(diào)節(jié)一種 植物細(xì)胞的乙烯敏感性或乙烯產(chǎn)生的蛋白的編碼基因突變體的野生型用于另一種植物細(xì) 胞中，需要這樣使用來消除潛在的RNA沉默。除了使用編碼能夠用于調(diào)節(jié)乙烯敏感性的蛋白序列的核酸序列，本文使用的某些 基因表達(dá)系統(tǒng)的另一組件還包括序列與本文所述編碼序列互補(bǔ)的多核苷酸。例如，基因表 達(dá)系統(tǒng)可以在植物細(xì)胞中表達(dá)許多上文鑒定的野生型序列的反義序列。這種反義序列的轉(zhuǎn) 錄通過結(jié)合植物固有序列并使該序列失活而調(diào)節(jié)乙烯敏感性。G.任選的組件基因表達(dá)系統(tǒng)各個(gè)盒中的任選組件包括終止控制區(qū)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式 中，激活盒或靶標(biāo)盒中可使用這種終止子或聚腺苷酸化序列。該區(qū)域源自優(yōu)選宿主天然具 有的各種基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，終止控制區(qū)包括或源自合成的聚腺苷酸化信 號(hào)、膽脂堿合酶(nos)、花椰菜花葉病毒(CaMV)、真蛸堿合酶(ocs)、土壤桿菌、病毒和植物 終止子序列等。選擇性標(biāo)記物包括能夠基于其作用進(jìn)行選擇的抗生素或化學(xué)抗性基因，即抗生 素耐藥性、除草劑抗性、比色標(biāo)記物、酶、熒光標(biāo)記物等。本領(lǐng)域已知并使用的可選擇的標(biāo) 記基因的例子包括提供氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、放線酰胺素 (PDF1基因)、雙丙氨磷除草劑、草甘磷除草劑、磺酰胺、甘露糖等抗性的基因；和可用作表 型標(biāo)記物的基因，即花色素苷調(diào)節(jié)基因、異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因、GUS和熒光素酶。根據(jù)本文所述的某些實(shí)施方式轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)的盒或包含盒的質(zhì)粒中可以存 在其他調(diào)控序列，例如在質(zhì)粒中用作間隔序列的核苷酸序列，以及其他小調(diào)控序列、酶切位 點(diǎn)等。根據(jù)本文內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地從公知并且已在文獻(xiàn)中詳細(xì)記載的各 種序列中選擇合適的終止序列、選擇性標(biāo)記物和其他常規(guī)質(zhì)粒調(diào)控序列。H.用于基因表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)組合物/誘導(dǎo)劑當(dāng)基因表達(dá)系統(tǒng)在植物中表達(dá)時(shí)，使用誘導(dǎo)組合物可以控制選定蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) 以及植物細(xì)胞中乙烯敏感性的選擇性調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方式中，誘導(dǎo)組合物是與植物細(xì)胞 相接觸的化學(xué)物質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，誘導(dǎo)組合物是被植物細(xì)胞吸收的化學(xué)物質(zhì)。在又 一實(shí)施方式中，誘導(dǎo)組合物是易位到植物細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)。誘導(dǎo)組合物也可以是對(duì)激活 盒的EcR LBD高度特異的配體。誘導(dǎo)組合物或配體與激活盒的LBD的結(jié)合可誘導(dǎo)靶標(biāo)盒的 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及編碼選定蛋白的核酸序列的表達(dá)。因此，該系統(tǒng)可調(diào)節(jié)植物的乙烯敏感 性。誘導(dǎo)組合物還表現(xiàn)為對(duì)植物細(xì)胞、組織或器官的毒性低。誘導(dǎo)組合物還能夠從植物快速去除以“關(guān)閉”乙烯敏感性的調(diào)節(jié)，并有效控制這種調(diào)節(jié)，如下文更詳細(xì)所述。其中，有效的誘導(dǎo)組合物是優(yōu)先結(jié)合蛻皮激素配體結(jié)合域的配體。在某些實(shí) 施方式中，這些配體包括二乙酰胼化合物，包括市售蟲酰胼(陶氏農(nóng)用科技公司(Dow AgroSciences)),甲氧蟲酰胼(陶氏農(nóng)用科技公司)、氯蟲酰胼(陶氏農(nóng)用科技公司)和環(huán) 蟲酰胼(日本化藥株式會(huì)社(Nippon Kayaku))(參見國際專利公開WO 96/027673和美國專 利號(hào)5，530，028)。其他有用的誘導(dǎo)劑是非留體配體，包括美國專利6，258603所述的二苯甲 酰胼衍生物。其他有用的誘導(dǎo)劑是美國專利申請(qǐng)公開US 2005/0228016中詳細(xì)描述的4-四 氫喹啉衍生物。許多其他合適 的化合物如1-芳?；鵢4-(芳基氨基)-1，2，3，4_四氫喹啉 (THQ)在 Kumar 等，J. Biol. Chem. · 2004,279(26) 2721 1-8 ；Hormann 等，J. Comput Aided Mol. Res 200317(2-4) 135-53 ;Tice 等，Bioorg Med Chem Lett 2003，13(11 :1883_6 ；和 Tice 等，2003 Bioorg Med Chem Lett. 2003 13(3) :475_8 中列出。因此，基因表達(dá)系統(tǒng)由化學(xué)誘導(dǎo)組合物誘導(dǎo)或“打開”，當(dāng)誘導(dǎo)組合物接觸激活盒 的配體結(jié)合域時(shí)可激活最小啟動(dòng)子的效應(yīng)元件，從而打開調(diào)節(jié)乙烯敏感性的核酸序列或基 因的表達(dá)。該基因表達(dá)系統(tǒng)提供了對(duì)包含基因表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞的乙烯敏感性的外部可 控的調(diào)節(jié)。II.轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或器官如上所述，基因表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)成能夠整合到植物、植物細(xì)胞或植物的其他組織或 器官內(nèi)。任選地，這種整合可以是短暫的。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，希望穩(wěn)定整 合到植物染色體內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞設(shè)計(jì)成能夠表達(dá)上述基因表達(dá)系統(tǒng)，暫時(shí)且 可逆地控制乙烯敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種植物細(xì)胞是用基因表達(dá)系統(tǒng)的激活盒和 靶標(biāo)盒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，激活盒和靶標(biāo)盒位于相同質(zhì)粒上，并將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，激活盒和靶標(biāo)盒位于不同質(zhì)粒上，兩質(zhì)粒單 獨(dú)或一起轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化入相同的植物細(xì)胞?；蛘撸瑑蓚€(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化入相同植 物的不同細(xì)胞中。在又一個(gè)實(shí)施方式中，兩個(gè)質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化入不同植物，具有單一質(zhì) 粒的各植物有性雜交形成含有兩種質(zhì)粒的雜交體，從而提供功能誘導(dǎo)性系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染包括將外源或異源RNA或DNA引入細(xì)胞內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)表型改變。轉(zhuǎn)化表示將核 酸片段轉(zhuǎn)移和整合到植物細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)，得到遺傳穩(wěn)定的遺傳特性。因此，包含轉(zhuǎn)化 的核酸片段的植物細(xì)胞稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物體。因此，初始轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 的植物細(xì)胞的后代也具有短暫或穩(wěn)定整合入其染色體的盒。1.轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包括產(chǎn)生僅包含激活盒、僅包含靶標(biāo)盒或包含兩種盒的留體或質(zhì) 粒。例如，參見圖2-3。合適的載體和植物組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白的，可參見例 如Maliga等，1994《植物分子生物學(xué)方法實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Methods in Plant Molecular Biology :A Laboratory Manual),(ColdSpring Harbor，NY)。 例如，合適的“載體”是用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的任何部件。載 體可以是連接另一DNA區(qū)段的復(fù)制子，以實(shí)現(xiàn)所連接區(qū)段的復(fù)制?！皬?fù)制子”是用作DNA自主 復(fù)制單位的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)，即能夠在其自身控制 下進(jìn)行復(fù)制。適合用基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體包括將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒載體?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的大量載體來操縱核酸，將效應(yīng)元件和啟動(dòng)子引入基因等。合適 的載體包括例如質(zhì)粒和修飾的植物病毒，包括例如噬菌體如λ衍生物，或質(zhì)粒如pBR322 或pUC質(zhì)粒衍生物，或Bluescript載體。將合適的DNA片段連接到具有互補(bǔ)粘性末端的選 定載體內(nèi)或通過將核苷酸序列(接頭)連接到DNA末端內(nèi)以便對(duì)合適的插入位點(diǎn)進(jìn)行酶促 修飾的常規(guī)方式是已知的。可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任何病毒或非病毒載體都是有用的。非 病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑(cytofectin))、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和 生物聚合物。除了基因表達(dá)系統(tǒng)的盒之外，載體還可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)，和/或用于選 擇、測量和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移到哪個(gè)組織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間等)的選擇性標(biāo)記物。術(shù)語“質(zhì)?！北硎就ǔ榄h(huán)狀雙鏈DNA分子形式的額外染色體元件。這些元件可以是自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，源自任何來源的線性、環(huán)狀或 超螺旋的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中大量核苷酸序列已連接或重組入能夠?qū)?dòng)子片段 和選定基因產(chǎn)物的DNA序列與合適的3’未翻譯序列引入細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。載體或質(zhì)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方式引入所需的植物細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、 顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE右旋糖苷、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、利用基 因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)子(參見例如，Wu等，1992，J. Biol. Chem. 267 =963967 ；Wu和Wu， 1988, J. Biol. Chem. 263 14621 14624 ；和 Hartmut 等，美國專利 5354844)。或者，利用陽離 子脂質(zhì)有利于負(fù)電荷核酸的包封，也有利于與負(fù)電荷細(xì)胞膜的融合(Feigner和Ringold， 1989Science337 387 388)。用于轉(zhuǎn)移核酸的尤其有用的脂質(zhì)化合物和組合物如美國專 利6172048、6107286和5459127所述。也可利用其他分子促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡 肽或陽離子聚合物(例如，美國專利5856435)，或源自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如，美國專 利6200956)。也可將載體以裸DNA質(zhì)粒的形式引入(參見美國專利5693622、5589466 和5580859)。也可利用受體-介導(dǎo)的DNA遞送方法來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞。 植物轉(zhuǎn)化例如可以利用Horsch等，1988《葉盤轉(zhuǎn)化植物分子生物學(xué)手冊(cè)》(Leaf Disc Transformation =Plant MolecularBiology Manual)所述的土壤桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法或 本領(lǐng)域已知的其他方法來實(shí)現(xiàn)。2.繁殖與篩選因此，用上述基因表達(dá)系統(tǒng)(在單一質(zhì)粒中，或者作為多個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，各自包含不 同的盒)轉(zhuǎn)化植物中的至少一個(gè)細(xì)胞之后，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物組織或植物器官的方法 還包括在選定植物的典型條件下由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物繁殖植物、或如上所述的植物雜 交體。然后，篩選植物以選擇包含或顯示轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞表型性狀的植物(細(xì)胞、組織、器 官)。例如，隨后進(jìn)行所得植物或其細(xì)胞、組織和器官的篩選以確定所述植物是否包含所需 的基因表達(dá)盒的整合核酸序列，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，利用質(zhì)粒中的一種或 多種報(bào)道基因或標(biāo)記物來選擇將引入的DNA穩(wěn)定整合到其染色體中的細(xì)胞。在下面的實(shí)施 例中，采用了卡那霉素、放線酰胺素、雙丙氨磷或熒光素酶。成功整合表達(dá)系統(tǒng)的植物(組織或器官)在接觸上述誘導(dǎo)組合物時(shí)，快速出現(xiàn)乙 烯不敏感性。任何植物(包括植物細(xì)胞、組織或器官)易于進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化，因而可通過常 規(guī)方式培育重組植物。尤其適合用基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、因而易于調(diào)節(jié)其乙烯敏感性的 植物包括雙子葉植物、單子葉植物、裝飾性植物、開花植物以及用于人或動(dòng)物消費(fèi)的植物。 非限制性地，這種植物包括水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、栗米、牧草、燕麥、番茄、馬鈴薯、香蕉、獼猴桃、鱷梨、甜瓜、芒果、甘蔗、甜菜、煙草、木瓜、桃、草莓、懸鉤子、黑莓、藍(lán)莓、萵苣、 卷心菜、花椰菜、洋蔥、椰菜、抱子甘藍(lán)、棉花、蕓苔、葡萄、大豆、油菜、蘆筍、豆類、胡蘿卜、黃 瓜、黃瓜、甜瓜、秋葵、防風(fēng)草、花生、胡椒、菠蘿、南瓜、甜馬鈴薯、黑麥、香瓜、豌豆、西葫蘆、 向曰葵、菠菜、蘋果、櫻桃、酸果蔓、葡萄柚、檸檬、酸橙、油桃、橙、桃、梨、蜜柑與柚子雜交品 (tangelos)、橘子、百合、康乃馨、菊、矮牽?；ā⒚倒?、天竺葵、紫羅蘭、劍蘭、蘭花、紫丁香、 山楂、楓香樹(sweetgum)、槭樹、猩猩木、刺槐、岑樹、菩提樹和擬南芥。植物組織和器官包括但不限于營養(yǎng)組織，例如根、莖或葉，或生殖組織，例如果 實(shí)、胚珠、胚、胚乳、珠被、種子、種皮、花粉、花瓣、萼片、雌蕊、花、花藥或任何其他胚胎組織。. III.控制乙烯敏感性的方法可以對(duì)這種轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞、組織、花、種子或器官應(yīng)用控制乙烯敏感性的方法，該方法包括使用有效量的誘導(dǎo)組合物。誘導(dǎo)組合物可以與轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物組織 或植物器官的細(xì)胞相接觸、被其吸收和/或易位到這些細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)用技術(shù)包括但不限于用 誘導(dǎo)劑浸漬、噴霧、灑粉、灌透、滴加或灌溉植物或者與植物相接觸的土壤或介質(zhì)。在誘導(dǎo)組合物的存在下，可以根據(jù)選定蛋白的種類調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對(duì)乙烯的反應(yīng)。 在下面的實(shí)施例中，選定蛋白是顯性負(fù)相突變體etrl-Ι，應(yīng)用誘導(dǎo)劑可提高etrl-Ι的表達(dá) 并降低植物對(duì)乙烯的敏感性。這種敏感性的降低持續(xù)一段時(shí)間，該持續(xù)時(shí)間包括誘導(dǎo)劑施 加于植物(細(xì)胞、組織或器官)以及停止主動(dòng)施加后植物繼續(xù)代謝剩余的誘導(dǎo)劑的時(shí)間。一 段時(shí)間后，由于植物清除了誘導(dǎo)劑，植物細(xì)胞對(duì)乙烯的反應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在這種情況下反應(yīng)提 尚ο“控制”、“調(diào)節(jié)”或“調(diào)控”影響植物細(xì)胞乙烯敏感性或乙烯產(chǎn)生的蛋白表達(dá)可以多 種方式實(shí)現(xiàn)。在一種實(shí)施方式的方法中，通過誘導(dǎo)組合物應(yīng)用于植物的時(shí)機(jī)選擇來控制蛋 白表達(dá)的調(diào)節(jié)(包括該表達(dá)的量化大小)。在另一實(shí)施方式中，利用應(yīng)用于植物的誘導(dǎo)組合 物的濃度來控制蛋白表達(dá)(包括該表達(dá)量化大小)，因而控制乙烯敏感性。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，通過誘導(dǎo)組合物應(yīng)用于植物的持續(xù)時(shí)間來控制蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(包括該表達(dá)的 量化大小)。植物生長期間可以改變施加誘導(dǎo)組合物的這三種參數(shù)中的任一種、兩種或全部 三種參數(shù)以獲得所需結(jié)果。作為一個(gè)通過時(shí)機(jī)選擇進(jìn)行控制的例子，可以在植物生長周期的選定時(shí)間施加誘 導(dǎo)組合物以誘導(dǎo)乙烯敏感性，例如在植物發(fā)芽、果實(shí)熟化或開花中的一個(gè)階段之前或之后 或者根據(jù)環(huán)境條件(例如在植物接觸應(yīng)激因子如病原體或干旱之前或之后)施加。在另一 實(shí)施方式中，在植物生長周期過程中多次應(yīng)用誘導(dǎo)組合物。在其它實(shí)施方式中，在選定時(shí)間 停止應(yīng)用誘導(dǎo)組合物以控制乙烯敏感性。理想的施加時(shí)間可根據(jù)需處理植物的類型、誘導(dǎo) 組合物的效能、及其對(duì)植物可能產(chǎn)生的植物毒性作用進(jìn)行選擇和改變。作為通過誘導(dǎo)組合物的濃度進(jìn)行控制的一個(gè)例子，將濃度0. 01-20 μ M的誘導(dǎo)組 合物應(yīng)用于植物。在另一實(shí)施方式中，濃度為10 μ Μ。在另一實(shí)施方式中，濃度為至少0.01、 0. 10、0· 20,0. 30,0. 40,0. 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、1· 0、2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、 10. 0,11. 0,12. 0,13. 0,14. 0,15. 0,16. 0,17. 0,18. 0,19. 0 和至少 20. 0 μ Μ，包括各濃度之 間的小數(shù)濃度。在又一實(shí)施方式中，濃度為20 μ Μ。在其它實(shí)施方式中，采用濃度大于20 μ M 的誘導(dǎo)組合物。在另一實(shí)施方式中，采用大于30μΜ的濃度。在另一實(shí)施方式中，采用大于 40 μ M的濃度。在又一實(shí)施方式中，本文所述方法中采用大于50 μ M的濃度。例如，如實(shí)施例9所述，該實(shí)施例顯示了誘導(dǎo)劑的濃度如何調(diào)節(jié)植物所具有的乙烯敏感性的程度。類似于通過施加時(shí)機(jī)進(jìn)行的控制，誘導(dǎo)組合物的濃度可用于響應(yīng)植物在不同生長階段變化的需 求或者響應(yīng)變化的環(huán)境條件。第三種控制介導(dǎo)植物乙烯敏感性或乙烯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)方法包括改變施加 誘導(dǎo)組合物的持續(xù)時(shí)間。例如，將誘導(dǎo)組合物應(yīng)用于植物的持續(xù)時(shí)間為至少10分鐘、至少 30分鐘的施加時(shí)間，從至少1到約24小時(shí)，或者更長時(shí)間，取決于所需的作用、誘導(dǎo)劑的效 能以及不良植物毒性作用的可能性。如果需要，誘導(dǎo)組合物的施加時(shí)間可以達(dá)到幾天。施 加持續(xù)時(shí)間通常由有經(jīng)驗(yàn)的培育員進(jìn)行選擇。通常，從停止施加誘導(dǎo)劑到植物對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)逆轉(zhuǎn)之間的時(shí)間約為2天或更 長，取決于植物大小、施加方法和誘導(dǎo)劑的用量?；蛘?，當(dāng)靶標(biāo)盒誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的核酸序列是野生型基因的互補(bǔ)序列或其 反義序列時(shí)，施加合適的誘導(dǎo)劑可提高植物對(duì)乙烯的敏感性。例如，增加乙烯受體(ETR1、 ETR2、ERS1、ERS2或EIN4)的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生更多乙烯受體而乙烯敏感性降低。與CTRl的 N-末端激酶結(jié)構(gòu)域融合的截短ETRl的過度表達(dá)導(dǎo)致野生型擬南芥產(chǎn)生輕微的乙醚不敏感 性。增加植物中EBF1、EBF2的表達(dá)，和/或降低EIN3的表達(dá)可使植物對(duì)乙烯的敏感性降 低。降低ACO、ACS、EIN2、EDF或EEN和EIN6的表達(dá)可導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生減少和/或乙烯反應(yīng) 降低。增加ACD的表達(dá)可導(dǎo)致乙烯減少且乙烯反應(yīng)降低。一段時(shí)間后由于植物中誘導(dǎo)劑的 消除，植物細(xì)胞對(duì)乙烯的反應(yīng)被逆轉(zhuǎn)、在這種情況下增加。這就使得植物能夠在去除誘導(dǎo)劑 后繼續(xù)正常發(fā)育、成熟、熟化。將誘導(dǎo)劑應(yīng)用于用本文所述的基因表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物能夠控制對(duì)乙烯敏 感的一種或多種植物生長特性，例如枯萎、果實(shí)熟化、發(fā)芽、病原體抗性、葉片脫落、花蕾脫 落、芽脫落、莢殼脫落、果實(shí)脫落和開花，以及植物對(duì)應(yīng)激，例如干旱、熱、群體密度和鹽度等 條件導(dǎo)致的應(yīng)激的反應(yīng)。更具體說，本文所述方法也可用作提高植物對(duì)疾病的抗性和/或耐受性的方法， 該方法包括提高植物對(duì)乙烯的不敏感性。或者，該方法可通過提高植物對(duì)乙烯的不敏感性 延遲植物、組織或器官的熟化或開花，例如用于儲(chǔ)存或運(yùn)輸?shù)哪康?。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 采用本文所述轉(zhuǎn)化植物與在適當(dāng)時(shí)機(jī)施加誘導(dǎo)組合物的方法能夠處理處于不良生長條件， 例如干旱或過熱條件的植物，該方法包括施加誘導(dǎo)組合物以降低乙烯敏感性并使植物更易 于忍受環(huán)境條件?；诒菊f明書的內(nèi)容，植物繁殖與生長領(lǐng)域的技術(shù)人員可能容易地選擇 轉(zhuǎn)化植物和誘導(dǎo)上述核酸序列表達(dá)的方法能夠提供效益的情況。因此，利用本文所述方法，在植物生長期間可以改變施加誘導(dǎo)劑的時(shí)機(jī)、持續(xù)時(shí)間 或濃度以控制乙烯敏感性，因而以相當(dāng)準(zhǔn)確地控制植物的生長特性。.IV.實(shí)施例下面的實(shí)施例表明使用上述基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括激活盒，激活盒包括在與 其操作性結(jié)合的組成型G10-90啟動(dòng)子控制下的(a)GAL 4 DBD，該DBD識(shí)別由5個(gè)拷貝的 GAL4效應(yīng)元件組成的效應(yīng)元件；(b)突變體蛻皮激素受體LBD，其包括結(jié)構(gòu)域D、E和F，在全 長Cf EcR的氨基酸335處具有蘇氨酸到纈氨酸突變；和(C)VP16 AD，該AD在誘導(dǎo)組合物 的存在下被激活。靶標(biāo)盒包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括操作性結(jié)合的位于對(duì)VP16 AD激活起反應(yīng)的最小35S啟動(dòng)子上游的5個(gè)拷貝的GAL 4效應(yīng)元件，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制(e)編碼突變體ETRl蛋白的核酸序列的表達(dá)。根據(jù)該實(shí)施方式，在植物細(xì)胞中，激活盒和靶標(biāo)盒各組件可調(diào)節(jié)突變體ETRl蛋白的表達(dá)并選擇性地降低植物細(xì)胞的乙烯敏感性。這種 蛋白表達(dá)受到誘導(dǎo)組合物相互作用的控制，誘導(dǎo)組合物調(diào)節(jié)選定蛋白的表達(dá)并選擇性地調(diào) 節(jié)植物細(xì)胞的乙烯敏感性。蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過施加誘導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù) 時(shí)間進(jìn)行控制。更具體說，示例性的基因表達(dá)系統(tǒng)包含位于單一質(zhì)粒pl85上的激活盒和靶標(biāo)盒。 該質(zhì)粒示意性地如圖2所示。另一種示例性的質(zhì)粒如圖3所示。圖2-3所示質(zhì)粒各自的基 因表達(dá)盒組件的核酸序列進(jìn)一步如SEQ ID NO :1-2所示。實(shí)施例中討論的其他質(zhì)粒的基因 表達(dá)盒組件的核苷酸序列在SEQ ID NO 3中示出。下面的實(shí)施例闡述了上述組合物和方法的某些實(shí)施方式。這些實(shí)施例并不限制權(quán) 利要求書和說明書的范圍。實(shí)施例1 質(zhì)?；蚝薪M件包括激活盒，激活盒包括G10_90組成性啟動(dòng)子(SEQ ID NO=I的核苷 酸 1-243)，VP16 激活域(SEQ ID NO 1 的核苷酸 249-529)，GAL4DNA 結(jié)合域(SEQ ID NO 1 的核苷酸534-983)，與NOS終止子序列(SEQ ID NO 1的核苷酸2070-2364)結(jié)合的T52V突 變型蛻皮激素受體配體結(jié)合域(SEQ ID NO :1的核苷酸990-1997)，對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)克隆。類 似地，單獨(dú)克隆靶標(biāo)盒組件，靶標(biāo)盒包括由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO=I的核 苷酸2391-2492)和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO 1的核苷酸2499-2554)構(gòu)成的誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子、以及突變型etrl-Ι基因(SEQ ID NO 1的核苷酸2557-4764)和35S終止子序列(SEQ ID NO 1 的核苷酸 4791-5001)。SEQ ID NO :1 如圖 4 所示。這些組件在SK_質(zhì)粒(司查塔基公司(Stratagene))中單獨(dú)組裝形成表達(dá)盒，然 后合并到各種質(zhì)粒中盒(1):G10-90 啟動(dòng)子一VP16 :GAL4 =EcRDEF T52V-N0S 終止子盒(2):G10-90 啟動(dòng)子一GAL4 :VP16 =EcRDEF T52V-N0S 終止子盒(3):G10-90 啟動(dòng)子一etrl_l_35S 終止子盒(4):G10-90 啟動(dòng)子一PDFl-E9 終止子盒(5) :G10_90啟動(dòng)子一螢光素酶-35S終止子盒(6) :5xG_M35S誘導(dǎo)型啟動(dòng)子一etrl_l_35S終止子盒(7) :5xG_M35S誘導(dǎo)型啟動(dòng)子一螢光素酶-35S終止子在組裝激活盒的過程中，以下組件以兩種不同順序融合形成兩種不同的激活盒VP16AD 到 GAL4LBD 到 T52V DBD 的 EcR (DEF)(縮寫為 “VGE” )禾口GAL4LBD 到 VP16AD 到 T52V DBD 的 EcR(DEF)(縮寫為 GVE)也提供誘導(dǎo)型螢光素酶控制子作為陽性對(duì)照。隨后，用pBlueScript II SIT主鏈(司查塔基公司(Stratagene))制備質(zhì)粒DNA。 SIT多克隆位點(diǎn)區(qū)域被包含8bp切割酶的識(shí)別位點(diǎn)的新多克隆位點(diǎn)取代。這種酶切位點(diǎn)中 的一些在示例性質(zhì)粒的圖2-3中示出。制備了六個(gè)示例性的大腸桿菌質(zhì)粒并測序以驗(yàn)證核苷酸序列。這些質(zhì)粒包含獨(dú)特 的酶切位點(diǎn)，用于添加/刪除/交換各個(gè)組件，如圖2-3所示。因此，每個(gè)完整的構(gòu)建物可 轉(zhuǎn)移至包括植物轉(zhuǎn)化二元載體在內(nèi)的所選擇的任何其他載體中。
然后，將SK_質(zhì)粒中的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移至二元質(zhì)粒pBIN19(美國典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)37327)。由于pBIN19已經(jīng)具有新霉素植物選擇性標(biāo)記基因、LB、RB和nptll選擇性標(biāo) 記物，所以附圖和/或序列表未示出主鏈序列，而是僅僅顯示了感興趣的基因表達(dá)序列，即 基因表達(dá)系統(tǒng)的主要組件，例如克隆到左右邊界之間的Ec受體和誘導(dǎo)型etrl-Ι或螢光素 酶。選擇以下五種土壤桿菌(Agrobacterium) 二元質(zhì)粒用于制備實(shí)施例2的轉(zhuǎn)基因植 株和進(jìn)行實(shí)施例3的原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)pl84[G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-LUC]用于獲得包含 G10-90 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 VGE受體和誘導(dǎo)型螢光素酶的轉(zhuǎn)基因植株。pl84的表達(dá)盒組件如SEQ ID NO :3所示，即 G10-90組成型啟動(dòng)子(SEQ ID NO 3的核苷酸1-243)、VP16激活域(SEQ ID NO 3的核苷 酸249-529)、GAL4DNA結(jié)合域(SEQ ID NO 3的核苷酸534-983)、和與NOS終止子序列(SEQ ID NO :3的核苷酸2070-2364)結(jié)合的T52V突變型蛻皮激素受體配體結(jié)合域(SEQ ID NO: 1的核苷酸990-1997)，由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO 3的核苷酸2391-2492) 和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO 3的核苷酸2499-2554)組成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、螢光素酶 標(biāo)記基因(SEQ ID NO 3的核苷酸2557-4209)和35S終止子序列(SEQID NO 3的核苷酸 4217-4427)。pl85[G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etrl]是包含與靶標(biāo)盒融合的激活盒的示 例性質(zhì)粒，用于制備包含G10-90啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VGE受體和誘導(dǎo)型etrl-Ι的轉(zhuǎn)基因植株。例 如參見圖2和SEQ ID NO 1,以及上述組件。pl86[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-LUC]質(zhì)粒用于獲得包含 G10-90 啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的GVE受體和誘導(dǎo)型螢光素酶的轉(zhuǎn)基因植株。pl86的表達(dá)盒組件如SEQ ID NO :4所示，即 G10-90組成型啟動(dòng)子(SEQ ID NO 4的核苷酸1-243)、GAL4DNA結(jié)合域(SEQ ID NO 4的核 苷酸276-716)、VP16激活域(SEQ ID NO 4的核苷酸717-793)、和與NOS終止子序列(SEQ ID NO 4的核苷酸2064-2258)結(jié)合的T52V突變型蛻皮激素受體配體結(jié)合域(SEQ ID NO 4的核苷酸994-1991)，由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO 4的核苷酸2385-2486) 和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO 4的核苷酸2493-2548)組成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，螢光素酶 標(biāo)記基因(SEQ ID NO 4的核苷酸2551-4203)和35S終止子序列(SEQID NO 4的核苷酸 4211-4421)。pl87[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etrl]質(zhì)粒用于獲得包含 G10-90 啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的GVE受體和誘導(dǎo)型etrl-Ι的轉(zhuǎn)基因植株。參見圖3和SEQ ID NO :2。pl87的表達(dá)盒 組件是G10-90組成型啟動(dòng)子(SEQ ID NO 2的核苷酸1-243)、GAL4DNA結(jié)合域(SEQ ID NO 2的核苷酸276-716)、VP16激活域(SEQ ID NO 2的核苷酸717-793)、和與NOS終止 子序列(SEQ ID NO :2的核苷酸2064-2258)結(jié)合的T52V突變型蛻皮激素受體配體結(jié)合域 (SEQ ID NO 2)的核苷酸994-1991)，由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO :2的核苷酸 2385-2486)和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO 2的核苷酸2493-2548)組成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， etrl基因(SEQ ID NO 2的核苷酸2551-4761)和35S終止子序列(SEQ ID NO 2的核苷酸 4785-4995)。pl002 [G10-90p-VGE-NosT-5xGAL-M35S-etrl 和 MMVp-def-rbcS_E9t]及其組件如 SEQ ID NO 5所示，即G10-90組成型啟動(dòng)子(SEQ ID NO 5的核苷酸1-243)、VP16激活域(SEQ ID NO 5 的核苷酸 249-529)，GAL4DNA 結(jié)合域(SEQ ID NO 5 的核苷酸 534-983)，和與 NOS終止子序列(SEQ ID NO 5的核苷酸2070-2364)結(jié)合的T52V突變型蛻皮激素受體配 體結(jié)合域(SEQ ID NO 5的核苷酸990-1997)，由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO 5 的核苷酸2391-2492)和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO 5的核苷酸2499-2554)組成的誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子，etrl基因(SEQ ID NO :5的核苷酸2557-4764)，35S終止子序列(SEQ IDNO :5的 核苷酸 4791-5001)，MMV 啟動(dòng)子(SEQ ID NO :5 的核苷酸 7228-6592)，P-DEF 標(biāo)記基因(SEQ ID NO 5 的核苷酸 6533-5712)和 rbcS_E9 終止子(SEQ IDNO 5 的核苷酸 5682-5038)。pl003 [G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-etrl 和 MMVp-def-rbcS_E9t]及其組件如SEQ ID NO 6所示，即G10-90組成型啟動(dòng)子(SEQ ID NO 6的核苷酸1-243)，GAL4DNA結(jié)合 域(SEQ ID NO :6的核苷酸276-716)，VP16激活域(SEQ ID NO :6的核苷酸717-973)，和與 NOS終止子序列(SEQ ID NO 6的核苷酸2064-2258)結(jié)合的T52V突變型蛻皮激素受體配 體結(jié)合域(SEQ ID NO 6的核苷酸984-1991)，由5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件(SEQ ID NO 6 的核苷酸2385-2486)和最小35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO :6的核苷酸2493-2548)組成的誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子，etrl基因(SEQ ID NO :6的核苷酸2551-4761)，35S終止子序列(SEQ IDNO :6的 核苷酸 4785-4995)，MMV 啟動(dòng)子(SEQ ID NO :6 的核苷酸 7222-6586)，P-DEF 標(biāo)記基因(SEQ ID NO 6 的核苷酸 6527-5706)和 rbcS_E9 終止子(SEQ IDNO 6 的核苷酸 5676-5032)。實(shí)施例2 制備轉(zhuǎn)基因煙草植株用實(shí)施例1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草植株，通過Fisher和Guiltinan 1995的《植物分子生 物學(xué)報(bào)道》(Plant Molecular Biology R印orter) 13 :278_289所述的標(biāo)準(zhǔn)土壤桿菌介導(dǎo)的 葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行制備。植株在包含卡那霉素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖，然后通過PCR驗(yàn)證 基因表達(dá)系統(tǒng)的引入和遺傳，如下所述。收集維持在品紅盒子中的每株植物的一個(gè)葉片放入液氮快速冷凍并在-80°C凍 存。然后將葉片(50-100mg)轉(zhuǎn)移至KONTES管并采用鉆孔機(jī)用KONTES—次性研磨棒研磨 約1分鐘，加入裂解緩沖液后再研磨幾秒鐘。用DNEASY小抽試劑盒(凱杰公司(Qiagen)) 方案純化DNA。DNA最終洗脫在100 μ 1中。設(shè)計(jì)特定的PCR引物以擴(kuò)增529bp的VGE、495bp的GVE、463bp的標(biāo)記物基因螢光 素酶LUC或441bp的突變etr-Ι基因。采用3微升植物DNA、10皮摩爾的各種引物和25微 升AMPLITAQ GOLD PCR(ABI)，在50微升反應(yīng)液中循環(huán)35次擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因。在瓊脂糖凝 膠上分離25微升PCR反應(yīng)液，通過兩種不同轉(zhuǎn)基因的擴(kuò)增鑒定陽性植株。需極其小心以避免由于污染和非特異擴(kuò)增引起的假陽性。合成了不結(jié)合煙草基因 組的高嚴(yán)謹(jǐn)引物。研磨和DNA制備期間對(duì)葉材料應(yīng)極其小心以盡可能減少污染。與各批DNA 制備一起制備非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓闐NA。每次PCR擴(kuò)增包括無DNA PCR對(duì)照。其他注意事項(xiàng) 包括耐氣溶膠吸管端和一次性操作臺(tái)表面擦布，并且頻繁更換手套。采用熱啟動(dòng)PCR以盡 可能減少引物的非特異結(jié)合。用預(yù)計(jì)不會(huì)產(chǎn)生帶的引物進(jìn)行PCR，在一些DNA中也檢查交叉 污染。PCR結(jié)果如下對(duì)于pl84(VP16AD到GAL4LBD到T52V DBD的EcR(DEF)加上誘導(dǎo)型螢光素酶；縮 寫為“VGE”)篩選10個(gè)植株，其中8個(gè)植株VGE和LUC陽性(pl84_2、3、4、5、7、8、9和10)。 兩個(gè)植株VGE或LUC陰性(ρ 184-1和6)。
對(duì)于包含激活盒和靶標(biāo)盒用于表達(dá)突變型etrl-Ι基因的示例性質(zhì)粒pl85，篩選16個(gè)植株，其中13個(gè)植株VGE和etr-Ι陽性(質(zhì)粒分別是pl85_l、2、3、4、5、8、10、11、12、 13、14、15 和 16)。兩個(gè)植株 VGE 或 etr-Ι 陰性(pl85_6、7 和 9)。對(duì)于pl86(GAL4LBD 到 VP16AD 到 T52V 的 EcR(DEF)；縮寫為“GVE” + 誘導(dǎo)型 LUC)， 篩選 25 個(gè)植株，其中 23 個(gè)植株 GVE 和 LUC 陽性(pl86_2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24 和 25)，2 個(gè)植株 GVE 或 LUC 陰性(pl86_l 和 14)。對(duì)于pl87(GVE+誘導(dǎo)型etr-Ι)篩選34個(gè)植株，其中33個(gè)植株GVE和etr_l陽 性(pl87-l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33 和 34)，1 個(gè)植株 GVE 和 etr-Ι 陰性(ρ 187-14)。實(shí)施例3 調(diào)節(jié)乙烯敏感性對(duì)煙草植株生長的影響進(jìn)行根據(jù)Guzman和 Ecker 1990The Plant Cell，2 :513_523 改良的三重反應(yīng)分析 以確定實(shí)施例2轉(zhuǎn)化的煙草植株中調(diào)節(jié)乙烯敏感性的作用。從標(biāo)為185-1、184-3、185-8、 185-11、187-7、187-13、187-17和187-21的各種轉(zhuǎn)化植株獲取兩個(gè)葉片并切成小塊。將這 些小塊接種在包含100納克/升卡那霉素的MSS板上，其中包含或不含10 μ M誘導(dǎo)劑，即 3，5 二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N，-(3S-羥甲基-5-甲基-2，3-二 氫-苯并[1，4] 二氧雜環(huán)己烯-6-羰基)胼。使用沒有抗生素或誘導(dǎo)劑的MSS板作為對(duì)照。這些種板植物組織在25°C中培育，生長室中有光以誘導(dǎo)發(fā)芽。將芽轉(zhuǎn)移至新鮮板 培育約2周，在25°C繼續(xù)生長。然后將各個(gè)愈傷塊轉(zhuǎn)移至含有或不含誘導(dǎo)劑的新的培養(yǎng)皿 中。將各個(gè)開始發(fā)芽的愈傷塊分到幾個(gè)板中，每塊板含有大約相等的愈傷塊。然后，將板分組，進(jìn)行持續(xù)18天的以下處理過程。(a)誘導(dǎo)、避光、無乙烯(空氣對(duì)照)(b)無誘導(dǎo)劑、避光、無乙烯(空氣對(duì)照)(c)誘導(dǎo)、避光、濃度約IOppm的乙烯(d)無誘導(dǎo)劑、避光、乙烯(濃度約IOppm)測定芽長度，表1顯示了基于上述處理過程(a)到(d)得到的芽長度的原始數(shù)據(jù) 對(duì)根據(jù)實(shí)施例制備的轉(zhuǎn)基因植株的功效進(jìn)行相對(duì)評(píng)價(jià)的結(jié)果。通常，避光暴露于乙烯的野 生型芽顯示生長變矮。在這些條件下，乙烯不敏感性植株應(yīng)顯示生長變長?；谠谙嗤h(huán) 境下相對(duì)于未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株芽長度增加，在用于表達(dá)突變型etrl-Ι的誘導(dǎo)劑的存在下， 包含用于表達(dá)etrl-Ι的激活盒和靶標(biāo)盒的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯不敏感性。具光生長條件 下的芽產(chǎn)生的數(shù)據(jù)無法解釋。表1 誘導(dǎo)煙草的乙烯不敏感性 該實(shí)施例的結(jié)果表明，用基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其有反應(yīng)的選定誘導(dǎo)組合物處理時(shí)，基 因表達(dá)系統(tǒng)和用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植株能夠成功調(diào)節(jié)乙烯敏感性。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植株的制備采用標(biāo)準(zhǔn)花浸漬方法，用實(shí)施例1的土壤桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥屬植株。收獲種子 并接種到含卡那霉素的培養(yǎng)基上。選擇轉(zhuǎn)化植株能夠在卡那霉素上生長的能力并通過PCR 篩選以驗(yàn)證etrl-Ι基因的存在。對(duì)攜帶螢光素酶構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化體采用螢光素酶試驗(yàn)。陽性 轉(zhuǎn)化體自交產(chǎn)生Tl種子。種子在含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長以鑒定轉(zhuǎn)基因純合品系。采 用純合植株進(jìn)行誘導(dǎo)乙烯不敏感性的試驗(yàn)。實(shí)施例5 調(diào)節(jié)乙烯敏感性對(duì)擬南芥屬植株生長的影響進(jìn)行三重反應(yīng)分析(根據(jù)上文引用的Guzman和Ecker，1990進(jìn)行如下所述的改 良)以確定實(shí)施例4轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植株中乙烯敏感性的調(diào)節(jié)。對(duì)擬南芥種子表面除菌 并浸泡在20 μ M誘導(dǎo)劑中，4°C保持避光4天。將種子接種到含1 %蔗糖和20 μ M誘導(dǎo)劑的 0. 5Χ MS上，突變型受體用IOppm乙烯處理，或者野生型受體用Ippm乙烯處理，21°C避光培 育4-8天。在最后一天記錄對(duì)乙烯的反應(yīng)。基于在相同環(huán)境下相對(duì)于未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株芽 長度增加和/或根生長改變，在用于表達(dá)突變型etrl-Ι的誘導(dǎo)劑的存在下，包含用于表達(dá)etrl-1的激活盒和靶標(biāo)盒的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯不敏感性。該實(shí)施例的結(jié)果進(jìn)一步表明， 用基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其有反應(yīng)的選定誘導(dǎo)組合物處理時(shí)，基因表達(dá)系統(tǒng)和用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植 株能夠成功調(diào)節(jié)乙烯敏感性。采用三重反應(yīng)試驗(yàn)測定野生型、ein2-5(乙烯不敏感突變體對(duì)照)和pl002擬南芥屬轉(zhuǎn)化體幼苗的乙烯不敏感性(Guzman和Ecker，1990，同上，改良如下)，其中種子在0. 5x MS培養(yǎng)基上、IOppm乙烯的存在下避光培育11天使其發(fā)芽。乙烯敏感型幼苗的根和下胚軸 生長受到乙烯抑制，但乙烯不敏感性幼苗不受抑制。表II 擬南芥屬中乙烯不敏感性的誘導(dǎo) 所有樣品在0. 5x MS+1%蔗糖上用IOppm乙烯室溫避光處理11天如上所示，在沒有誘導(dǎo)劑的存在下，pl002轉(zhuǎn)化體幼苗的根和下胚軸生長與野生型 幼苗相比并無顯著差別。然而，在誘導(dǎo)劑的存在下，相對(duì)于野生型幼苗P1002轉(zhuǎn)化體顯示根 顯著更長，雖然沒有像ein2突變體那樣長。下胚軸中沒有觀察到這種結(jié)果。在也可導(dǎo)致乙烯不敏感性的銀和誘導(dǎo)劑的存在下，如預(yù)期的那樣，大多數(shù)P1002擬南芥屬轉(zhuǎn)化體幼苗的 根并不顯著長于野生型或ein2突變體幼苗。因此，基于在相同環(huán)境下相對(duì)于未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 植株根長度增加，在用于表達(dá)突變型etrl-Ι的誘導(dǎo)劑的存在下，包含用于表達(dá)etrl-1的激 活盒和靶標(biāo)盒的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯不敏感性。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因番茄植株的制備采用標(biāo)準(zhǔn)方法，用實(shí)施例1的土壤桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化番茄子葉片。用卡那霉素或放線酰胺素選擇推定的轉(zhuǎn)化體并用PCR試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。陽性轉(zhuǎn)化體自交兩次，獲得轉(zhuǎn)基因純合 品系。使用純合植物進(jìn)行測定，以類似于實(shí)施例5的方式誘導(dǎo)乙烯敏感性。采用三重反應(yīng)試驗(yàn)(Guzman和Ecker，1990，同上，如下所述進(jìn)行改良)來確定轉(zhuǎn) 化的番茄植株中乙烯敏感性的調(diào)節(jié)。對(duì)番茄種子進(jìn)行表面除菌并浸泡在20μΜ誘導(dǎo)劑中， 4°C保持避光4天。將種子接種到含1 %蔗糖和20 μ M誘導(dǎo)劑的0. 5Χ MS上，突變型受體用 IOppm乙烯處理，或者野生型受體用Ippm乙烯處理，21°C避光培育4-8天。在最后一天記 錄對(duì)乙烯的反應(yīng)?；谠谙嗤h(huán)境下相對(duì)于未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株芽長度增加和/或根生長改 變，在用于表達(dá)突變型etrl-Ι的誘導(dǎo)劑的存在下，包含用于表達(dá)etrl-1的激活盒和靶標(biāo)盒 的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯不敏感性。該實(shí)施例的結(jié)果進(jìn)一步表明，用基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其有反 應(yīng)的選定誘導(dǎo)組合物處理時(shí)，基因表達(dá)系統(tǒng)和用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植株能夠成功調(diào)節(jié)乙烯敏感 性。來自三種純合的獨(dú)立？1002和？1003品系的種子在含2(^11 ACC(乙烯前體)的 0. 5x MS培養(yǎng)基+1%蔗糖上避光發(fā)芽。在ACC上發(fā)芽抑制番茄幼苗生長。來自相同品系的 種子在20 μ M ACC加上20 μ M誘導(dǎo)劑的存在下發(fā)芽。結(jié)果列于表III。表III 番茄中乙烯不敏感性的誘導(dǎo)
_ 取20 μ M ACC存在下培養(yǎng)的14日齡幼苗進(jìn)行測量。在誘導(dǎo)劑的存在下在ACC上生長導(dǎo)致乙烯不敏感性，因?yàn)檎T導(dǎo)的幼苗顯示變長的 下胚軸而沒有尖鉤(apical hook)。在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，含pl002的品系無乙烯不敏感 性，P1003構(gòu)建物僅產(chǎn)生很少乙烯不敏感性。該結(jié)果進(jìn)一步表明，完全狀態(tài)的乙烯不敏感性 是需要誘導(dǎo)的。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因玉米植株的制備及乙烯敏感性的調(diào)節(jié)對(duì)玉米植株生長的影響采用實(shí)施例1的質(zhì)粒通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米植株。用卡那霉素或雙丙氨磷選擇推 定的轉(zhuǎn)化體并用PCR試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。陽性轉(zhuǎn)化體與近交B73回交以增加活力。測定如上所 述制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株中乙烯敏感性的調(diào)節(jié)。通過使植株暴露于乙烯并測定乙烯誘導(dǎo)型基因的誘導(dǎo)變化，在分子水平測定乙烯敏感性的調(diào)節(jié)?；谝蚁┱T導(dǎo)型基因表達(dá)的減少，在 用于表達(dá)突變型etrl-Ι的誘導(dǎo)化合物的存在下，包含用于表達(dá)etrl-1的激活盒和靶標(biāo)盒 的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯不敏感性。測定如上所述制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株中乙烯敏感性的調(diào)節(jié)。通過使植株暴露于 ACC(乙烯前體)并測定乙烯誘導(dǎo)型基因的誘導(dǎo)變化，在分子水平測定乙烯敏感性的調(diào)節(jié)。 從在溫室中培育的轉(zhuǎn)基因TO玉米植株切割莖鞘組織用于體外生物試驗(yàn)。切割 的組織用水 或20 μ M誘導(dǎo)劑處理2天以誘導(dǎo)乙烯不敏感etrl-Ι轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。2天誘導(dǎo)后，組織用0、 1或10 μ M ACC處理以1天產(chǎn)生乙烯，然后收獲。收獲的組織立即置于RNAlater中(安碧 公司(Ambion))。使用MagMAX-96總RNA分離試劑盒(安碧公司(Ambion))，由組織制備總 RNA。在應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems) 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(ABI)上，通過定 量PCR測定乙烯誘導(dǎo)型基因(ACC氧化酶)的誘導(dǎo)。采用生產(chǎn)商推薦的方案，用TaqMan分 析試劑盒(ABT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和PCR。使用玉米18s作為內(nèi)標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)化各樣品的表 達(dá)。引物和探針序列如下18s正向引物CGTCCCTGC CCTTTGTACAC SEQ ID NO 11反向引物ACACTTC ACCGGACCATTCAA SEQ ID NO: 12探針CCGCCCGTCGCTCCTACCGSEQ ID NO: 13ACC 氧化酶(aco):正向引物GTTGTAGAAGGACGCGATGGA SEQ ID NO 14反向引物CAGGT ACAAGAGCGTCATGCA SEQ ID NO 15探針TCCTGTTCCCGCTGGGCTGCSEQ ID NO: 16為了測定基因表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)化各個(gè)玉米品系中0 μ M誘導(dǎo)劑加上0 μ M ACC對(duì)照處理 的ACC氧化酶的表達(dá)。各玉米品系的相對(duì)表達(dá)以及每種處理的平均表達(dá)如表IV所示。表IV 誘導(dǎo)的玉米中ACC氧化酶的表達(dá) 如預(yù)期的那樣，在誘導(dǎo)劑加上ACC(乙烯前體)的存在下，轉(zhuǎn)基因玉米品系中ACC 氧化酶的平均表達(dá)受到抑制。基于乙烯誘導(dǎo)型基因表達(dá)的減少，在用于表達(dá)突變型etrl-1 的誘導(dǎo)化合物的存在下，包含用于表達(dá)etrl-Ι的激活盒和靶標(biāo)盒的轉(zhuǎn)基因植株顯示乙烯 不敏感性。實(shí)施例8 =ACC濃度對(duì)乙烯不敏感性的影響來自一種pl002品系和一種pl003品系的純合番茄種子在包含20 μ M誘導(dǎo)劑和各 種水平的乙烯前體ACC(即1.0-μ Μ)的培養(yǎng)基上發(fā)芽。如表V所示，在測定的ACC濃度下 能夠誘導(dǎo)乙烯不敏感性。較高的ACC濃度實(shí)現(xiàn)的不敏感性水平有一些降低，表現(xiàn)為下胚軸 和根延長較少，然而，相對(duì)于野生型對(duì)照數(shù)值仍然顯著提高。表V 以一系列ACC濃度誘導(dǎo)乙烯不敏感性 取在誘導(dǎo)劑的存在培養(yǎng)的14日齡幼苗進(jìn)行測量。實(shí)施例9 植物中乙烯不敏感性的程度與誘導(dǎo)劑濃度的關(guān)系來自一種含pl002品系和一種含pl003品系的純合番茄種子在包含20 μ MACC和 各種水平的誘導(dǎo)劑(即0.5-20μΜ)的培養(yǎng)基上發(fā)芽。如表VI所示，誘導(dǎo)劑的濃度與每種 品系獲得的乙烯不敏感性水平正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，植物中不同水平的乙烯不敏感性可 以簡單地通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)水平而實(shí)現(xiàn)。表VI 施加的誘導(dǎo)劑水平調(diào)節(jié)乙烯不敏感性水平 對(duì)10日齡幼苗進(jìn)行測量。實(shí)施例10 植物中乙烯不敏感性的短暫誘導(dǎo)為了驗(yàn)證當(dāng)不再提供誘導(dǎo)劑的情況下誘導(dǎo)的乙烯不敏感性植物恢復(fù)到乙烯敏感， 來自一種P1002品系的純合番茄種子在包含20 μ M ACC和10 μ M誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上發(fā)芽2、 4、6、8或14天。避光培育14天后，測定下胚軸和根以評(píng)價(jià)乙烯不敏感性。預(yù)計(jì)乙烯不敏感 幼苗將具有較長的下胚軸和根。沒有誘導(dǎo)劑的存在下，幼苗將變得乙烯敏感并在避光條件 下生長變矮。因此，逆轉(zhuǎn)幼苗(reversed seedling)的根和下胚軸生長是敏感和不敏感幼 苗間的中間狀態(tài)。如表VII所示，幼苗誘導(dǎo)2或4天后分別去除誘導(dǎo)劑培育10或6天，結(jié) 果表明與未誘導(dǎo)對(duì)照幼苗相比，其恢復(fù)到乙烯敏感狀態(tài)。在包含P1002的番茄品系中，6天 足以誘導(dǎo)完全狀態(tài)的乙烯不敏感性。表VII 去除誘導(dǎo)劑導(dǎo)致恢復(fù)乙烯敏感性 取在20 μ M ACC上避光培養(yǎng)的14日齡幼苗進(jìn)行測量。雖然上述實(shí)施例顯示使用了 etrl-Ι的核苷酸序列，但本說明書清楚地向本領(lǐng)域 技術(shù)人員提供了以相同方式調(diào)節(jié)乙烯生物合成途徑和其他植物途徑中許多其他基因表達(dá) 的能力。上述實(shí)施方式的各種改良和變化包括在本說明書中，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而 易見的。據(jù)信這種對(duì)本文所述組合物和方法的改良和改變包括在本文所附權(quán)利要求書的范 圍內(nèi)。上文列出或引用的所有文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)和出版物以及非專利出版物以 及附圖和/或序列表的全部內(nèi)容都包括在此作為參考，只要它們與本說明書的明確涵義不 發(fā)生矛盾。然而，任何參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)構(gòu)成本申請(qǐng)的“現(xiàn)有技 術(shù)”。
權(quán)利要求
一種在植物細(xì)胞中可控表達(dá)乙烯效應(yīng)的基因表達(dá)系統(tǒng)，其包括激活盒，激活盒包括在與其操作性結(jié)合的合適啟動(dòng)子控制下的以下組件(a)識(shí)別選定效應(yīng)元件的DNA-結(jié)合域(DBD)；(b)蛻皮激素受體配體結(jié)合域(EcRLBD)；和(c)在誘導(dǎo)組合物存在下激活的激活域(AD)；和靶標(biāo)盒，其包括(d)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包含操作性結(jié)合的效應(yīng)元件和最小啟動(dòng)子，(a)的DBD結(jié)合所述效應(yīng)元件，最小啟動(dòng)子對(duì)(c)的AD起反應(yīng)，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制(e)編碼能夠調(diào)節(jié)乙烯敏感性的選定蛋白的核酸序列在植物中的表達(dá)；在植物細(xì)胞中，所述激活盒和靶標(biāo)盒各組件與誘導(dǎo)組合物之間的相互作用可調(diào)節(jié)所述選定蛋白的表達(dá)和選擇性地調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的乙烯敏感性，蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)可受施加誘導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間的控制。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述激活盒和靶標(biāo)盒位于同一質(zhì)粒上。
3.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述激活盒和靶標(biāo)盒位于單獨(dú)的質(zhì)粒上。
4.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述激活盒的啟動(dòng)子選自下組組成型啟動(dòng) 子、植物細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、植物組織特異性啟動(dòng)子、植物器官特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子和細(xì)胞分化特異性啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述DBD選自GAL4DBD,LexA DBD、轉(zhuǎn)錄因 子DBD、H類核受體成員DBD、留體/甲狀腺激素核受體超家族成員DBD、細(xì)菌LacZ DBD,EcR DBD, cl 啟動(dòng)子 DBD。
7.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述蛻皮激素受體LBD包括無脊椎動(dòng)物蛻皮 激素受體或其突變體的全部或其一部分。
8.
9.如權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述蛻皮激素LBD包含全長CfEcR中氨基酸 位置335處蘇氨酸到纈氨酸的突變。
10.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述激活域選自VP16、糖皮質(zhì)激素激活 域、Gal4激活域。
11.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含操作性結(jié)合的最小 啟動(dòng)子序列以及一個(gè)或多個(gè)拷貝的對(duì)應(yīng)于激活盒中DNA結(jié)合域的效應(yīng)元件。
12.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，編碼所述選定蛋白的核酸序列選自下組 乙烯生物合成基因ACS或ACO、ACC脫氨酶、乙烯受體基因、ETRl、ETR2、ERSl、ERS2或EIN4、 乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因、RTEl、CTRl、EIN2、EIN3或EIN3-樣(EIL1-5)、乙烯反應(yīng)因子、ERF1、 EDF1、EDF2、EDF3或EDF4，或EIN3結(jié)合F-盒蛋白、EBFl或EBF2以及它們的突變體。
13.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其包括激活盒，包括在與其操作性結(jié)合的組成型G10-90啟動(dòng)子控制下的以下組件(a)識(shí)別 包含5個(gè)拷貝的GAL4效應(yīng)元件的效應(yīng)元件的GAL 4 DBD ； (b)蛻皮激素受體LBD ；和(c)在誘導(dǎo)組合物的存在下激活的VP16 AD ；和靶標(biāo)盒，其包括(d)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包含操作性結(jié)合的5個(gè)拷貝的GAL 4效應(yīng) 元件和對(duì)VP16 AD激活起反應(yīng)的最小35S啟動(dòng)子，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制(e)編碼突變體 ETRl蛋白的核酸序列的表達(dá)；在植物細(xì)胞中，所述激活盒和靶標(biāo)盒各組件與誘導(dǎo)組合物之間的相互作用可調(diào)節(jié)突變體ETRl蛋白的表達(dá)和選擇性地降低植物細(xì)胞的乙烯敏感性，蛋白表達(dá)的降低受到施加誘 導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間的控制。
14.一種組合物，其包含能夠穩(wěn)定表達(dá)權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物 細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物是轉(zhuǎn)基因植物組織或器官。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物是轉(zhuǎn)基因植物。
17.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(a)用權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物的至少一個(gè)細(xì)胞；(b)由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞形成植物；和(c)選擇包含轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物，當(dāng)所述植物接觸誘導(dǎo)組合物時(shí)能夠選擇性地調(diào) 節(jié)乙烯不敏感性，所述調(diào)節(jié)受施加所述誘導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間的控制。
18.—種調(diào)節(jié)植物乙烯敏感性的方法，該方法包括將有效量的誘導(dǎo)組合物施加于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述植物包含能夠穩(wěn)定表達(dá)權(quán)利要求 1-13中任一項(xiàng)所述的基因表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，在所述誘導(dǎo)組合物的存在下所述植物細(xì)胞對(duì)乙烯的敏感性降低，而在沒有所述誘導(dǎo)組 合物的情況下所述植物細(xì)胞對(duì)乙烯的敏感性提高；和所述乙烯敏感性的調(diào)節(jié)受到施加所述誘導(dǎo)組合物的時(shí)機(jī)、濃度和持續(xù)時(shí)間的控制。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)組合物是二酰胼化合物。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述受控的乙烯敏感性選自下組枯萎、 果實(shí)熟化、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)芽、病原體抗性、葉片脫落、花蕾脫落、芽脫落、莢殼脫落、果實(shí)脫落、 開花以及對(duì)干旱、熱、群體密度和鹽度的反應(yīng)。
全文摘要
一種在植物細(xì)胞中可控表達(dá)乙烯效應(yīng)的基因表達(dá)系統(tǒng)，其包括激活盒和靶標(biāo)盒，激活盒包括識(shí)別效應(yīng)元件的DNA-結(jié)合域、蛻皮激素受體配體結(jié)合域和激活域(AD)；靶標(biāo)盒誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含操作性結(jié)合的效應(yīng)元件和對(duì)激活域起反應(yīng)的最小啟動(dòng)子。該基因表達(dá)系統(tǒng)在控制乙烯敏感性的誘導(dǎo)組合物的存在下，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的乙烯敏感性?？煽刂七@種轉(zhuǎn)基因植物和組織的乙烯敏感性以操縱熟化、開花、枯萎及植物的其他乙烯敏感性功能。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101848990SQ200880107634
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者D·R·加里, J·L·羅西尚 申請(qǐng)人:羅門哈斯公司