專利名稱：流感的治療及預防的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含雙鏈區(qū)的核酸分子，編碼其的核酸構建體，它們可用于治療和/ 或預防流感。特別地，本發(fā)明涉及編碼雙鏈RNA分子的核酸構建體，它們可用于產生轉基因 動物，例如雞，從而它們至少對于禽流感感染是較不易感的。還提供了包含雙鏈區(qū)的核酸分 子，其可以作為治療劑而治療例如家禽中的禽流感。
背景技術：
已知有三種類型流感病毒，甲型、乙型和丙型，它們屬于稱為正粘病毒科的單鏈負 義有包膜RNA病毒科。病毒基因組長度大約12000-15000個核苷酸并包含8個RNA節(jié)段 (丙型中為7個)，編碼11種蛋白質。甲型流感病毒感染許多動物如人、豬、馬、海洋動物和鳥類(Nicholsonet al., 2005)。其天然貯庫(reservoir)是在水禽中，在禽類物種中大多數流感病毒感染導致溫和 的呼吸道和腸道局部感染。但是病毒在家禽中可以具有高致病作用，突然爆發(fā)，導致在感染 家禽群體中高死亡率。甲型流感病毒可以基于編碼病毒附著和細胞釋放所需的表面糖蛋白即血凝素 (HA)和神經酰胺酶(NA)的兩個基因的抗原區(qū)中的等位基因差異而分成亞型。其它主要病 毒蛋白包括核蛋白、核殼結構蛋白、基質蛋白(Ml和M2)、聚合酶(PA、PB1和PB2)及非結構 蛋白(NSl 禾口 NS2)。在甲型流感病毒中已知至少16個HA亞型(Hl至H16)和9個NA(m至N9)抗原 變體。禽類流感病毒株也可以被鑒定為低致病和高致病株。低致病株典型地在HA前體的 裂解位點的-1和_3位僅具有兩個堿性氨基酸，而高致病株具有多堿性裂解位點。亞型H5 和H7可以導致家禽中高致病性感染，某些亞型已示出穿過物種屏障至人中。高致病性H5和 H7也可以從家禽中低致病前體產生。禽流感感染癥狀從典型流感類型癥狀(發(fā)熱、咳嗽、喉 嚨痛和肌肉疼痛)到結膜炎、肺炎、急性呼吸窘迫和其它危及生命的并發(fā)癥。需要開發(fā)控制動物中如家禽中流感病毒存活和/或復制的方法，以便不僅改善家 畜業(yè)生產力和健康，也降低對人的健康威脅。發(fā)明概述本發(fā)明人鑒別了包含雙鏈區(qū)的核酸分子，其能降低流感病毒在感染的動物細胞中 的復制和/或產生。因此，本發(fā)明提供了編碼包含雙鏈區(qū)的RNA分子的核酸構建體，其中當與缺少所 述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA分子降低動物細胞中 甲型流感病毒復制和/或降低在動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生和/或降低甲 型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞中的表達。優(yōu)選地，雙鏈區(qū)包含選自如下核苷酸的序列(i)SEQ ID NO 1 的位置 2240-2341 內的核苷酸，(ii)SEQ ID NO 2 的位置 2257-2341 內的核苷酸，(iii)SEQ ID NO 3 的位置 2087—2233 內的核苷酸，
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(iv)SEQ ID NO 4 的位置 1484-1565 內的核苷酸，(v)SEQ ID NO :6_15 或 52-54 任一核苷酸序列，(vi)與(i)-(v)任一序列至少90%相同的核苷酸序列，(vii)在嚴格條件下與(i)-(v)任一序列雜交的核苷酸序列。在一個實施方案中，當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細 胞相比時，所述RNA分子降低動物細胞中甲型流感病毒復制。在另一個實施方案中，當與缺 少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA分子降低動物細 胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生。在另一個實施方案中，當與缺少所述RNA分子的等 基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流 感病毒感染的動物細胞中的表達。優(yōu)選地，甲型流感病毒是禽流感病毒。本發(fā)明的核酸構建體可編碼任何類型的包含雙鏈區(qū)的RNA分子。優(yōu)選地，所述雙 鏈區(qū)長度至少為19個堿基對。還優(yōu)選所述雙鏈區(qū)長度小于100個堿基對。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所編碼的RNA分子是短發(fā)夾RNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ ID NO 7的核苷酸 序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ IDNO 9的核苷酸 序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ IDNO 12的核苷 酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ IDNO 6的核苷酸 序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ ID NO 8的核苷酸 序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ IDNO 13的核苷 酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQ IDNO 15的核苷 酸序列。在一些情況中，希望的是核酸構建體編碼一個以上RNA分子，例如2、3、4、5或更多 個RNA分子。因此，本發(fā)明提供了編碼2個或更多個RNA分子的核酸構建體。編碼的RNA 分子可以是不同或相同的，或者其組合。另外，編碼的RNA分子可靶向相同或不同甲型流感 病毒基因，或其組合。在一個實施方案中，每個RNA分子包含相應于不同甲型流感病毒基因 的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的核酸構建體，其中每個RNA分子由與RNA聚合酶II 啟動子或RNA聚合酶III啟動子可操縱連接的核苷酸序列編碼。在一個優(yōu)選的實施方案中， 所述啟動子是RNA聚合酶III啟動子。在一些情況中，希望的是啟動子序列與來自所述核酸構建體轉染/轉化進其中的 動物和/或細胞或其后代的天然發(fā)生的啟動子序列相同。在一個實施方案中，啟動子是雞、 火雞和/或鴨啟動子。
優(yōu)選地，所述啟動子選自TO、7SK和/或Hl啟動子。在一個特別的實施方案中，TO啟動子是cU6-l、cU6-2、cU6-3和/或cU6_4。在進一步的實施方案中，啟動子包含選自SEQ ID NO :22_25任一核苷酸序列。本發(fā)明人意外地發(fā)現包含含有引起shRNA轉錄所需的最小量啟動子序列的U6啟 動子的核酸構建體與包含具有額外IOObp上游序列的U6啟動子的構建體在轉錄shRNA方 面至少等效。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，啟動子由選自SEQ ID N0s:22-25任一的 核苷酸序列組成。在另一個實施方案中，編碼RNA分子的每個核苷酸序列與不同的RNA聚合酶III 啟動子可操縱地連接。在一個實施方案中，RNA分子降低由SEQ ID NO :1_5任一序列編碼的甲型流感病 毒多肽的表達。在一個特定的實施方案中，甲型流感病毒多肽可選自？81、？82、？々、呢和/或機。 優(yōu)選地，所述多肽是禽流感多肽。在一個實施方案中，禽流感是高致病株。
優(yōu)選地，禽流感是H5W。在另一個實施方案中，構建體包含僅甲型流感病毒序列和天然發(fā)生的宿主動物序 列。例如，當構建體設計用于轉染進雞時，該核酸構建體希望地由雞序列和甲型流感病毒序 列組成。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸構建體，其中所述構建體由 雞核苷酸序列和甲型流感病毒核苷酸序列組成。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體編碼三個包含雙鏈區(qū)的RNA分子，其 中所述雙鏈區(qū)包含選自如下的核苷酸序列(i)SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :15，(ii)SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，及(iii)SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO :12。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體包含選自SEQ ID NO 16-21和61-63的 核苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQ ID NO 16-21和61-63的核苷酸序列至少95% 相同的序列。優(yōu)選地，所述片段包含從所述序列的5’和/或3’末端缺失100個核苷酸或 更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末端缺失50個核苷酸或 更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末端缺失20個核苷酸或 更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末端缺失10個核苷酸或 更少個核苷酸的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了分離的和/或外源的包含雙鏈區(qū)的核酸分子，其中所述雙鏈 區(qū)包含選自如下的核苷酸序列(i)SEQ ID NO 1 的位置 2240-2341 內的核苷酸，(ii)SEQ ID NO 2 的位置 2257-2341 內的核苷酸，(iii)SEQ ID NO 3 的位置 2087-2233 內的核苷酸，(iv) SEQ ID NO 4 的位置 1484-1565 內的核苷酸，(v) SEQ ID NO 6-15 或 52_δ4 任一核苷酸序列，(vi)與(i)-(v)任一序列至少90%相同的核苷酸序列，
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(vii)在嚴格條件下與(i)-(v)任一序列雜交的核苷酸序列。在一個實施方案中，當與缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細 胞相比時，所述分離的和/或外源的核酸分子降低動物細胞中甲型流感病毒復制。在另一 個實施方案中，當與缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所 述分離的和/或外源的核酸分子降低動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生。在另一 個實施方案中，當與缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所 述分離的和/或外源的核酸分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞 中的表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的和/或外源的核酸分子降低由SEQ ID NO 1-5任一序列編碼的甲型流感病毒多肽的表達。優(yōu)選地，分離的和/或外源的核酸分子的雙鏈區(qū)的長度至少為19個核苷酸。在一 些實施方案中，優(yōu)選所述雙鏈區(qū)長度小于100個核苷酸。在一個實施方案中，所述分離的和/或外源的核酸分子包含雙鏈RNA。優(yōu)選地，所述分離的和/或外源的核酸分子是短干擾RNA或短發(fā)夾RNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述分離的和/或外源的核酸分子包含選自SEQ ID NO 16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQID NO 16-21和61-63的 核苷酸序列至少95%相同的序列。優(yōu)選地，所述片段包含從所述序列的5’和/或3’末端 缺失100個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末 端缺失50個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末 端缺失20個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’末 端缺失10個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，核酸構建體和/或分離的和/或外源的核酸分子存 在于細胞基因組中。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的核酸構建體和/或本發(fā)明的分離的和/或外源 的核酸分子的載體。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的核酸構建體、分離的和/或外源的核酸分子和 /或載體的細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述細胞是原生殖細胞，例如雞原生殖細胞。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的核酸構建體、分離的和/或外源的核酸分子、 載體和/或細胞的轉基因非人生物。所述轉基因生物可以是任何生物如動物或植物。在一個實施方案中，轉基因生物是非人動物。在另一個實施方案中，轉基因生物是禽類。在一個優(yōu)選的實施方案中，轉基因生物 是家禽。在更優(yōu)選的實施方案中，轉基因生物是雞、火雞或鴨。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因生物包含選自SEQ ID NO 16-21和61-63的 核苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQ ID NO 16-21和61-63的核苷酸序列至少95% 相同的序列，其編碼至少一個包含雙鏈區(qū)的RNA分子。與SEQ ID NO 16-21和61-63密切 相關的片段和/或序列包含在這個實施方案中，因為構建體的5’和/或3’區(qū)當整合進生 物體的基因組中時可能喪失，和/或許多世代細胞分裂過程中的微小突變可能導致與原始 構建體相比的一或幾個核苷酸差異。優(yōu)選地，所述片段包含從所述序列的5’和/或3’末端缺失100個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’ 末端缺失50個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’ 末端缺失20個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列，更優(yōu)選地從所述序列的5’和/或3’ 末端缺失10個核苷酸或更少個核苷酸的核苷酸序列。在進一步的實施方案中，轉基因生物包含兩個或更多個本發(fā)明的核酸構建體。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明核酸構建體、本發(fā)明的分離的和/或外源的核酸 分子、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的細胞和/或本發(fā)明的核酸分子的組合物。本發(fā)明的核酸構建體、分離的和/或外源的核酸分子、載體和宿主細胞可用于治 療和/或預防對象中甲型流感病毒感染。例如，所述核酸構建體、分離的和/或外源的核酸 分子、載體和宿主細胞可用于保護家禽，如但不限于雞、火雞或鴨免于禽流感。另外，在禽流 感在鳥類群體中局部爆發(fā)事件中，希望的是保護周圍區(qū)域如周圍農場的鳥類免于感染以控 制禽流感爆發(fā)。因此，本發(fā)明進一步提供了治療和/或預防對象中甲型流感病毒感染的方法，所 述方法包括給予對象本發(fā)明的核酸構建體、本發(fā)明的分離的和/或外源的核酸、本發(fā)明的 載體和/或細胞。在一個實施方案中，所述方法包括給予在飲用水或在氣溶膠中的核酸構建體、分 離的和/或外源的核酸、載體和/或細胞。在一個特別的實施方案中，甲型流感病毒是禽流感。優(yōu)選地，禽流感是高致病株。在一個最優(yōu)選的實施方案中，禽流感是H5W。優(yōu)選地，對象是禽類，更優(yōu)選地是家 禽。在一個最優(yōu)選的實施方案中，對象是雞、火雞或鴨。本發(fā)明進一步提供了降低細胞中一或多個甲型流感病毒基因表達的方法，所述方 法包括給予細胞本發(fā)明的分離的和/或外源的核酸分子。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的核酸構建體、本發(fā)明的分離的和/或外源的核酸、 本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的細胞在制備用于治療和/或預防甲型流感病毒感染的藥物中 的應用。本發(fā)明進一步提供了鑒別包含本發(fā)明的核酸構建體或本發(fā)明的分離的和/或外 源的核酸的動物的方法，所述方法包括確定得自動物的樣品中本發(fā)明的核酸構建體和/或本發(fā)明的分離的和/或外源的 核酸分子的存在或缺失。在一個實施方案中，所述方法包括擴增所述核酸構建體或其片段，或所述分離的 和/或外源的或者分子或其片段。在另一個實施方案中，所述方法包括將得自動物的樣品與探針接觸，所述探針在嚴格雜交條件下與所述核酸構建體或 所述分離的和/或外源的核酸分子雜交形成復合物，及確定復合物的存在或缺失。本發(fā)明進一步提供了育種流感抗性非人轉基因動物的方法，所述方法包括(i)將本發(fā)明核酸構建體導入非人動物細胞，(ii)選擇包含所述核酸構建體的轉基因非人動物細胞，
(iii)從所述轉基因非人動物細胞再生轉基因非人動物，(iv)育種所述轉基因非人動物以產生轉基因后代，及(ν)選擇抗流感的轉基因后代。本發(fā)明進一步提供了生產食品的方法，所述方法包括(i)將本發(fā)明核酸構建體導入動物細胞，(ii)選擇包含所述核酸構建體的轉基因細胞，(iii)從所述轉基因細胞再生轉基因動物，(iv)育種所述轉基因動物以產生轉基因后代，及(ν)從所述轉基因后代生產食品。在一個實施方案中，所述食品選自肉和蛋。本發(fā)明進一步提供了制備抗流感轉基因非人動物的方法，所述方法包括(i)將包含轉座子的第一核酸導入細胞中，其中所述核酸編碼雙鏈RNA分子，(ii)將編碼轉座酶的第二核酸導入細胞中，(ii)選擇在細胞基因組中包含第一核酸的轉基因細胞，(iii)從所述細胞再生轉基因非人動物，及(iv)育種所述轉基因非人動物。所述第一和第二核酸可以在單個核酸分子上導入細胞，或者，可以在分離的核酸 分子上導入細胞。優(yōu)選地，所述第一和第二核酸在分離的核酸分子上導入細胞。在一個實施方案中，轉座子是Tol2轉座子，轉座酶是Το12轉座酶。在另一個實施方案中，細胞是雞原生殖細胞。本發(fā)明進一步提供了抗兩個的轉基因非人動物。在一個實施方案中，所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA分子的核酸構建 體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA分 子降低動物細胞中甲型流感病毒復制。在另一個實施方案中，所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA分子的核酸構 建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA 分子降低在動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生。在另一個實施方案中，所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA分子的核酸構 建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA 分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞中的表達。在另一個實施方案中，所述轉基因非人動物是雞，流感是甲型流感。優(yōu)選地，所述轉基因非人生物包含本發(fā)明的核酸構建體、本發(fā)明的分離的和/或 外源的核酸、本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的細胞。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的非人轉基因動物或本發(fā)明的轉基因非人生物的育 種用途。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的非人轉基因動物或本發(fā)明的轉基因非人生物的生 產食品的用途。顯而易見，本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特征和特性適用于本發(fā)明的許多其它方面。在整個申請中，詞語“包含”或其變化形式應理解包括所述元件、整數或步驟或元
12件、整數或步驟的組，但是不排除任何其它元件、整數或步驟或元件、整數或步驟的組。本發(fā)明以下通過非限制實施例和附圖描述。附圖簡述

圖1. shRNA表達盒的PCR。用于產生shRNA表達載體的PCR策略的示意圖。PCR 使用與包含所有shRNA成分的反向引物配對的正向引物。所有最終PCR產物由雞TO或7SK 啟動子、shRNA有義、環(huán)、shRNA反義、終止序列和XhoI位點組成。圖2. MWH-I轉基因的構建。A，逐個轉錄單位用一步PCR法產生。PCR產物含有雞 pol III啟動子和shRNA成分(有義、環(huán)、反義和終止子序列)。B，三個轉錄單位用PCR產 物的5’和3’末端的相容的SalI和XhoI位點連接在一起。C，最終的轉基因含有3個轉錄 單位，表達3個shRNA以靶向選擇的甲型流感病毒基因。圖3. pStuffit的質粒圖(6151bp)。圖上標出雞基因組4個克隆區(qū)域并加陰影。 指出了克隆限制位點及其它相關的導入的限制位點。MWH轉基因被插入位于ME1200和 GRM5200 之間的唯一的 EcoRI 位點。TheHindl [iota] 1 enzyme sites of pIC20H 的 HindIII 位點可以用于切割包括填充片段/buffer側翼序列的完整MWH轉基因作為一個單片段插入
雞基因組。圖4.轉基因小鼠的流感攻擊。A，表達shNP-1496的小鼠相對于表達shEGFP的小 鼠的％重量變化。B，表達shNP-1496的小鼠相對于表達shEGFP的小鼠的相對病毒基因表 達。序列表關鍵點SEQ ID NO 甲型流感PB2基因的共有核苷酸序列。SEQ ID NO :2_甲型流感PBl基因的共有核苷酸序列。SEQ ID NO :3_甲型流感PA基因的共有核苷酸序列。SEQ ID NO :4_甲型流感NP基因的共有核苷酸序列。SEQ ID NO :5_甲型流感Ml基因的共有核苷酸序列。SEQ ID N0:6-15-靶向甲型流感基因和/或其編碼的mRNA的核酸分子的核苷酸 序列。SEQ ID NO :16_MWH1和填充序列的核苷酸序列。5 ‘填充序列(核苷酸 1-1748) ；cU6-3shMP-592(核苷酸 1759-2234) ；cU6-lshPA_2087 (核苷酸 2235-2622)； cU6-4shNP-1496(核苷酸 2623-2974) ；3' ±真充序列(核苷酸 2985-4745)。SEQ ID NO :17_MWH2和填充序列的核苷酸序列。5'填充序列(核苷酸1-1748)； cU6-4shPBl-2257(核苷酸 1774-2125) ；cU6-lshPB2_2240 (核苷酸 2126-2513) ；c7SK shPBl-129(核苷酸 2514-2911) ；3'填充序列(核苷酸 2936-4696)。SEQ ID NO :18_MWH3和填充序列的核苷酸序列。5'填充序列(核苷酸1-1748)； cU6-4shNP-1484(核苷酸 1774-2129) ；cU6-lshPA_2087 (核苷酸 2130-2517) ；c7SK shPBl-2257(核苷酸 2518-2917) ；3'填充序列(核苷酸 2947-4702)。SEQ ID NO :19-MWH1 的核苷酸序列。SEQ ID NO :20_MWH2 的核苷酸序列。SEQ ID NO :21_MWH3 的核苷酸序列。SEQ ID NO :22_雞U6-1啟動子(cU6_l)的核苷酸序列。
SEQIDNO :23_雞U6-3啟動子(cU6_3)的核苷酸序列。SEQIDNO 24~雞U6-4啟動子(cU6_4)的核苷酸序列。SEQIDN0:25-雞7SK啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO :26-51-寡核苷酸引物。SEQIDNO =52-54-靶向甲型流感基因和/或其編碼的mRNA的核酸分子的核苷酸 序列。SEQIDNO:55to 60-寡核苷酸引物。
SEQIDNO:61-MWH4的核苷酸序列。
SEQIDNO:62-MWH3和Tol2轉座子的核苷酉I序列。
SEQIDNO:63-MWH4和Tol2轉座子的核苷酉I序列。發(fā)明詳述一般技術及詵擇的定義除非特別限定，則本文所用所有技術及科學術語與本領域技術人員通常理解的意 義相同(例如，在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、病毒學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生 物化學中)。除非另外指出，本發(fā)明使用的分子生物學、病毒學、細胞培養(yǎng)和免疫學技術是 本領域技術人員熟知的標準程序。這種技術在文獻資源中有描述和解釋，如J.Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley andSons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989) , T. A.Brown(editor) , EssentialMolecular Biology :A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames(editors), DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F. M.Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括直至目前的所有增訂)， Ed Harlow and David Lane (editors)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors)Current Protocols in Immunology, Johnffiley & Sons (包括直至目前的所有增訂)，并且引入本文做參考。如本文所用，術語“治療”包括給予足以降低或消除甲型流感病毒特別是禽流感病 毒感染的至少一種癥狀的治療有效量的本發(fā)明的核酸構建體、載體、細胞和/或核酸分子。術語“預防”是指保護暴露于甲型流感病毒的對象免于產生甲型流感病毒感染的 至少一種癥狀，或者降低暴露于甲型流感病毒的對象中的感染癥狀的嚴重性。如本文所用，對病毒病原體有“抗性”的動物當暴露于該病毒病原體例如當暴露于 流感病毒時顯示出與易感動物相比降低的疾病癥狀或無疾病癥狀。本文所用術語“禽類”是指分類學鳥綱生物的任何物種、亞種或品種(race)，例 如但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、鸚鵡、雀類、鷹、烏鴉和平胸類鳥包括鴕鳥、鴯鹋和 食火雞。該術語包括Gallus gallus(雞)的各種已知品系，例如White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Cornish, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partidge-coloured,以及火雞、里予雞、鵪鵓、 鴨、鴕鳥的品系以及以商業(yè)數量育種的其它家禽。
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術語“家禽”包括被保持、收獲或馴養(yǎng)用于肉用或蛋用的所用禽類，例如雞、火雞、 鴕鳥、春雞(game hen)、雛鳥、珍珠雞(guinea fowl)、野雞、鵪鶉、鴨、鵝和鴯鹋。如本文所用，“禽流感病毒”是指可感染鳥類的任何甲型流感病毒。禽流感病毒的 例子包括但不限于亞型H1-H16和m-N9的任一或多個，并包括高致病株和低致病株。在一 個實施方案中，禽流感病毒是H5亞型。在另一個實施方案中，禽流感病毒是H7亞型。在另 一個實施方案中，禽流感病毒是H5W亞型。術語“甲型流感病毒多肽”是指由甲型流感病毒基因編碼的任何蛋白質，例如 卩81，？81呼2，？82，聚合酶？六( 幻，血凝素(HA)，核殼蛋白(NP)，神經氨酸酶(NA)，基質蛋白 1 (Ml)，基質蛋白2 (M2)，非結構蛋白1 (NSl)和非結構蛋白2 (NS2)。本文所用“病毒復制”是指病毒基因組在宿主細胞中的擴增。本文所用術語“病毒顆?！笔巧婕巴暾《窘Y構，包含用蛋白質外殼或衣殼包圍的 核酸。一些病毒顆粒還包括包圍蛋白質外殼的糖蛋白包膜，在這種情況中術語病毒顆粒也 包括病毒包膜?！案腥拘圆《绢w粒”能夠進入生物體的細胞并復制?！敖档投嚯幕蚧虻谋磉_”是指宿主細胞中多肽序列的翻譯和/或核苷酸序列的轉 錄被下調或抑制。下調或抑制程度根據提供給宿主細胞的核酸構建體或核酸分子的性質和 數量、從該構建體表達的RNA分子的性質和水平以及給予后時間等而變化，但是表現為例 如靶基因蛋白質表達和/或相關靶或細胞功能的可檢測變化，或者例如病毒復制水平的降 低等；希望的是可實現與未根據本發(fā)明處理的細胞相比大于10%，33%，50%，75%，90%， 95%或99%的抑制程度。如本文所用，術語“對象”是指動物如鳥類或哺乳動物。在一個實施方案中，對象 可以是禽類，例如家禽如雞、火雞或鴨?！皹悠贰笔侵笐岩珊斜景l(fā)明的核酸構建體、核酸分子、載體和/或細胞的材料。樣 品可以直接得自來源而使用或者在至少一步(部分)純化后使用。樣品可以在不干擾本發(fā) 明方法的任何方便介質中制備。典型地，樣品是水溶液或生物學液體，如下詳述。樣品可以 源自于任何來源，如生理學液體，包括血液、血清、血漿、唾液、痰、晶狀體液、汗、糞便、尿、乳 汁、腹水、粘膜滑液、腹膜液體、透皮滲出物、咽滲出物、支氣管肺泡灌洗液、氣管吸出物、腦 脊液、精液、宮頸粘液、陰道或尿道分泌物、羊水等。在一個實施方案中，樣品是血液或其部 分。預處理可涉及例如從血液制備血漿，稀釋粘液等。處理方法可以包括過濾、蒸餾、分離、 濃縮、失活干擾成分和加入試劑。測試前生物學樣品的選擇和預處理是本領域公知的，無需 進一步描述。如本文所用，術語“轉座子”是指遺傳元件，其可以從一個位置移動(轉座)到生物 體基因組內的另一位置，移動過程不需要轉座子與插入位點之間有廣泛DNA序列同源性， 也不需要經典同源交換所需的重組酶。如本文所用，“等基因”是指生物體或細胞，其特征為基本上相同的基因組DNA，例 如基因組DNA與等基因生物體或細胞的基因組DNA至少大約92%、優(yōu)選至少大約98%、最 優(yōu)選至少大約99%相同。如本文所用，術語“導入”當其涉及核酸構建體或核酸分子時是指最廣義含義，包 括導致核酸構建體或核酸分子存在于細胞或生物體中的任何方法。例如，核酸構建體或核 酸分子可以作為裸DNA經任何合適轉染或轉化技術如電穿孔輸送到細胞?；蛘撸怂針嫿w或核酸分子可以插入基因組和/或被細胞中的轉基因表達。RNA 干擾術語“RNA干擾”、“RNAi”或“基因沉默”通常是指一個過程，其中雙鏈RNA分子降 低與所述雙鏈RNA分子功效實質上或全部同源性的核酸序列的表達。但是，最近發(fā)現RNA 干擾可以用非RNA雙鏈分子實現(參見例如US 20070004667)。本發(fā)明包括包含和/或編碼用于RNA干擾的雙鏈區(qū)的核酸分子。所述核酸分子典 型地是RNA但是看包含化學修飾的核苷酸和非核苷酸。雙鏈區(qū)應該有至少19個連續(xù)核苷酸，例如大約19-23個核苷酸，或可以更長，例如 30或50個核苷酸，或100個核苷酸或更多。相應于完整基因轉錄物的全長序列可以使用。 優(yōu)選地，它們長度為大約19至大約23個核苷酸。核酸分子雙鏈區(qū)與靶向轉錄物的相同性程度應該至少90%，更優(yōu)選95-100%。核 酸分子當然可以包含無關序列，其可以穩(wěn)定分子。術語“小干擾RNA”或“siRNA”如本文所用是指包含能抑制或下調基因表達的核 糖核苷酸的核酸分子，例如通過一序列特異性方式介導RNAi，其中雙鏈部分長度小于50個 核苷酸，優(yōu)選地長度大約19至大約23個核苷酸。例如，siRNA可以是包含自身互補有義和 反義區(qū)的核酸分子，其中反義區(qū)包含與靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序 列，有義區(qū)具有相應于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA可以從兩個單獨的寡核苷 酸組裝，其中一條鏈是有義鏈，另一鏈是反義鏈，其中反義和有義鏈是自身互補的。如本文所用，術語siRNA與用于描述能介導序列特異性RNAi的核酸分子的其 它術語是等價的，例如微RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、小干擾寡核苷酸、小干擾核酸 (siNA)、小干擾修飾寡核苷酸、化學修飾的siRNA、轉錄后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。另外， 如本文所用，術語RNAi與用于描述序列特異性RNA干擾的其它術語等價，如轉錄后基因沉 默、翻譯抑制或表觀遺傳學。例如，本發(fā)明的siRNA分子可以用于在轉錄后水平或轉錄前水 平表觀遺傳地(epigenetically)沉默基因。在非限制性例子中，本發(fā)明siRNA分子對基因 表達的外遺傳調節(jié)可以得自染色質結構的siRNA介導的修飾以改變基因表達?！?shRNA"或“短發(fā)夾RNA”是指RNA分子，其中少于大約50個核苷酸、優(yōu)選地大 約19至大約23個核苷酸與位于同一 RNA分子上的互補序列堿基配對，并且其中所述序列 和互補序列由至少大約4至大約15個核苷酸的非配對區(qū)分開，其在由兩個堿基互補區(qū)產生 的莖結構之上形成單鏈環(huán)。單鏈環(huán)序列的例子包括5' UUCAAGAGA 3'。包括的ShRNA是雙指(dual or bi-finger)和多指發(fā)夾dsRNA，其中RNA分子包括 兩個或多個由單鏈間隔區(qū)分開的這種莖環(huán)結構。設計完成后，包含雙鏈區(qū)的核酸分子可以通過本領域已知的任何方法產生，例如 通過體外轉錄、重組或合成手段產生。核苷酸修飾或類似物可以被導入以改良本發(fā)明核酸分子的性質。改良的性質包括 增加的核酸酶抗性和/或增加的透過細胞膜的能力。因此，術語“核酸分子”和“雙鏈RNA 分子”包括合成修飾的堿基，例如但不限于，肌苷，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲 基-，2-丙基-及其它烷基-腺嘌呤，5-鹵代尿嘧啶，5-鹵代胞嘧啶，6-氮胞嘧啶和6-氮 胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-thiuracil，8-鹵代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-硫代腺嘌呤(thiol adenine)，8_硫代烷基腺嘌呤(thiolalkyl adenines)，8_羥基腺嘌呤和其它8_取代的腺嘌呤，8-鹵代鳥嘌呤，8-氨基鳥嘌呤，8-硫代鳥嘌呤，8-硫代烷基鳥嘌呤，8-羥基鳥嘌呤 和其它取代的鳥嘌呤，其它氮和脫氮腺嘌呤，其它氮和脫氮鳥嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和 5-三氟胞嘧啶。鍾“分離的核酸分子”是指通常已從其天然狀態(tài)(如果其天然存在)中所結合或連接 的核苷酸序列分離開的核酸分子。優(yōu)選地，分離的核酸分子至少60%、更優(yōu)選至少75%、更 優(yōu)選至少90%不含其天然結合的其它成分。另外，術語“核酸分子”在本文中與術語“多核 苷酸”互換使用。術語“外源的”在核酸上下文中是指當核酸(包括本發(fā)明的核酸構建體)存在于 細胞或無細胞表達系統(tǒng)中時以相比于其天然狀態(tài)改變的量存在。在一個特別優(yōu)選的實施方 案中，細胞是不天然包含所述核酸或核酸構建體的細胞。術語“核酸分子”或“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。其可以 是基因組或合成來源的DNA或RNA，及與碳水化合物、脂質、蛋白質或其它進行本文定義的 特定活性的其它材料組合。核酸分子的相同性百分比是通過GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG program)確定，缺口產生罰分=5，缺口延伸罰分=0. 3。查詢序列長度至少19個核苷酸， GAP分析對比兩個序列至少19個核苷酸區(qū)域。或者，查詢序列長度至少150個核苷酸，GAP 分析對比兩個序列至少150個核苷酸區(qū)域?；蛘撸樵冃蛄虚L度至少300個核苷酸，GAP分 析對比兩個序列至少300個核苷酸區(qū)域。優(yōu)選地，兩個序列以其完整長度對比。對于限定的核酸分子，應理解高于上文提供的％相同性數字包括優(yōu)選的實施方 案。因此當適用時，對于最小的％相同性數字，優(yōu)選的是核酸分子包含與相關的SEQ ID NO 至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選 至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu) 選至少99. 1%、更優(yōu)選至少99. 2%、更優(yōu)選至少99. 3%、更優(yōu)選至少99. 4%、更優(yōu)選至少 99. 5%,更優(yōu)選至少99. 6%、更優(yōu)選至少99. 7%、更優(yōu)選至少99. 8%、更優(yōu)選至少99. 9%相 同的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸分子可選擇性與編碼甲型流感病毒多肽的多核苷酸在嚴格條件下 雜交。如本文所用，在嚴格條件下是⑴采用低離子濃度和高溫度洗滌的條件，例如0. 015M NaCl/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1% NaDodS04, 50°C ； (2)在雜交過程中采用變性劑如甲酰胺的 條件，例如50% (vol/vol)甲酰胺與0. 牛血清白蛋白，0. 1% Ficoll,0. 聚乙烯吡咯 烷酮，含有750mMNaCl的50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，75mM檸檬酸鈉，42°C ；或者(3)采用 50% 甲酰胺，5x SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 檸檬酸鈉)，50mM 磷酸鈉(pH6. 8)，0. 1 %焦磷酸 鈉，5x Denhardt' s溶液，超聲化鮭精DNA(50g/ml)，0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，42°C于 0. 2x SSC 和 0. SDS 中。當與天然發(fā)生的分子相比時，本發(fā)明的核酸分子可以具有這樣的區(qū)域(例如天然 發(fā)生的啟動子)，其具有一或多個是核苷酸殘基的缺失、插入或取代的突變。突變體可以是 天然發(fā)生的(即從天然來源分離)或者合成的(例如，通過在上述核酸上進行定點誘變)。 因此很明顯本發(fā)明的多核苷酸可以是天然發(fā)生的或者重組的。通常，核酸單體通過磷酸二酯鍵或其類似物連接而形成寡核苷酸，大小范圍從相
17對較短的單體單位，例如12-18，至幾百個單體單位。磷酸二酯鍵類似物包括硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phosphoranilidate， 氨基磷酸酯。核酸構津體如本文所用，“核酸構建體”是指編碼本文定義的雙鏈RNA分子的任何核酸分子，并 包括在載體中的所述核酸分子，以染色體外核酸分子存在于細胞中的所述核酸分子，以及 整合進染色體中的核酸分子。典型地，核酸構建體是雙鏈DNA或雙鏈RNA或其組合。另外， 核酸構建體典型地包含與編碼所述雙鏈RNA的開放讀框可操縱連接的合適的啟動子。核酸 構建體可包含編碼雙鏈RNA分子的第一單鏈的第一開放讀框，互補(第二)鏈由不同的或 優(yōu)選相同的核酸構建體第二開放讀框編碼。核酸構建體可以是線性片段或環(huán)狀分子，其可 以或不能復制。本領域技術人員理解本發(fā)明的核酸構建體可以包括合適載體中。將核酸構 建體轉染或轉化進受體細胞使得細胞表達由所述核酸構建體編碼的RNA分子。本發(fā)明的核酸構建體可表達多個拷貝的相同和/或一或多個(例如1、2、3、4、5或 更多個)包括多個不同的含雙鏈區(qū)的RNA分子，例如短發(fā)夾RNA。被認為彼此“相同”的RNA 分子是僅包含相同雙鏈序列的那些，被認為彼此“不同”的RNA分子包含不同的雙鏈序列， 而無論被每種不同雙鏈序列靶向的序列是否在同一或不同基因中，或者兩個不同基因的序 列。核酸構建體還可以含有額外的遺傳元件。可包括在構建體中的元件類型沒有顯著 并可由本領域技術人員選擇。在一些實施方案中，核酸構建體作為轉基因插入到宿主細胞 中。在這種情況中，希望的是在構建體中包括“填充”片段，它們被設計用于保護編碼RNA 分子的序列免于轉基因插入過程，并且降低外部轉錄連讀的風險。填充片段也可以包括在 構建體中以增加例如啟動子與編碼序列和/或終止子元件之間的距離。填充片段可以是從 5-5000或更多個核苷酸的任意長度。啟動子之間可以有一或多個填充片段。在多個填充片 段情況中，它們可以是相同或不同長度。填充DNA片段優(yōu)選地是不同序列。優(yōu)選地，填充序 列包含與其所插入的細胞或其后代中發(fā)現的序列相同的序列。在另一個實施方案中，核酸 構建體包含位于編碼雙鏈RNA的開放讀框側翼的填充區(qū)域?；蛘撸怂針嫿w可以包括可轉座元件，例如轉座子，特征在于位于編碼雙鏈RNA 的開放讀框側翼的末端反向重復序列。合適的轉座子的例子包括Tol2，mini-Tol，Sloping Beauty, Mariner 禾口 Galluhop0可被包括在核酸構建體中的額外的遺傳元件的例子包括報道基因，如編碼以下物 質的一或多個基因熒光標記蛋白如GFP或RFP ；容易測定的酶如β -半乳糖苷酶、螢光素 酶、β-普糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶或分泌型胚胎堿性磷酸酶；或者可以容易利用 免疫測定的蛋白質如激素或細胞因子。用于本發(fā)明實施方案中的其它遺傳元件包括編碼賦 予細胞選擇性生長優(yōu)勢的的那些，如腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉移酶(aminoglycodicpho sphotransferase)，二氫葉酸還原酶、潮霉素B-磷酸轉移酶，或藥物抗性。當核酸構建體被轉染進動物時，希望的是啟動子和任意的遺傳元件由動物基因組 中天然發(fā)生的核苷酸序列組成。進一步希望的是編碼RNA分子的序列有甲型流感病毒序列 組成。啟動子
如本文所用，“啟動子”是指能指導可操縱連接的核酸分子的轉錄的核酸序列，包 括例如RNA聚合酶II和RNA聚合酶III啟動子。這一定義還包括轉錄調節(jié)元件(例如增 強子)，其足以賦予細胞類型特異性、組織特異性或時間特異性方式可控的啟動子依賴性基 因表達，或者可由外部試劑或信號誘導。當包含啟動子的核酸構建體被轉染進宿主動物中時，希望的是該啟動子是該動物 基因組中天然存在的啟動子。例如，當轉基因動物是雞時，啟動子優(yōu)選是雞啟動子；其中轉 基因動物是火雞時，啟動子優(yōu)選是火雞啟動子；其中轉基因動物是鴨時，啟動子優(yōu)選是鴨啟 動子。本文所用“可操縱連接”是指兩個或多個核酸(例如DNA)節(jié)段之間的功能關系。 典型地，其是指轉錄調節(jié)元件與被轉錄序列的功能關系。例如，如果啟動子刺激或調節(jié)編碼 序列在合適細胞中的轉錄，則該啟動子與編碼序列如編碼本文定義的雙鏈RNA分子的開放 讀框可操縱連接。通常，與被轉錄序列可操縱連接的啟動子轉錄調節(jié)元件是與被轉錄序列 物理相鄰的，即他們是順式作用的。但是，一些轉錄調節(jié)元件如增強子無需與其增強轉錄的 編碼序列物理相鄰或緊密接近?！癛NA聚合酶III啟動子”或“RNA pol III啟動子”或“聚合酶III啟動子”或“pol III啟動子”是指任何無脊椎動物、脊椎動物或哺乳動物啟動子，例如雞、人、鼠、豬、牛、靈長 類、猿等的啟動子，其在細胞中天然環(huán)境下與RNA聚合酶III結合或相互作用以轉錄其可操 縱連接的基因，或者其任何變體，天然的或工程化的，它們在選擇的宿主細胞中與RNA聚合 酶III相互作用而轉錄可操縱連接的核酸序列。TO啟動子(例如雞TO、人TO、鼠TO)、H1啟 動子或7SK啟動子是指任何無脊椎動物、脊椎動物或哺乳動物啟動子或多態(tài)性變體或突變 體，其在自然界發(fā)現與RNA聚合酶III相互作用而分別轉錄其關聯(lián)RNA產物，即U6 RNA,Hl RNA 或 7SKRNAο 合適的啟動子的例子包括 cU6_l (SEQ ID NO 22)，cU6_3 (SEQ IDNO 23)， cU6-4(SEQ ID NO 24)和 c7SK(SEQ ID NO :25)。在一些應用中優(yōu)選的是III型RNA pol III啟動子包括TO、H1和7SK，它們存在于 5’側翼區(qū)，包括TATA盒，并缺少內部啟動子序列。內部啟動子針對pol III 5S rRNA, tRNA 或VA RNA基因而發(fā)生。7SK RNA pol III基因含有若內部啟動子和在轉錄所需基因的5’ 側翼區(qū)的序列。應用特定應用如表達雙鏈RNA分子如發(fā)夾RNA抗禽類或人類病毒的核酸構 建體中的polIII啟動子可有利地被選擇用于由宿主細胞RNA聚合酶III的最佳結合和轉 錄，例如包括禽類pol III啟動子在表達構建體中，以設計轉錄多個發(fā)夾dsRNA以在禽類宿 主細胞中抗禽類病毒如禽流感病毒(H5N1)?！安煌摹本酆厦竼幼邮侵溉魏蝺蓚€RNA聚合酶啟動子，如RNA聚合酶II或RNA 聚合酶III啟動子，包括變體如多態(tài)性和突變體，其在特定物種中驅動不同關聯(lián)轉錄物的 轉錄，例如人7SK啟動子，人TO啟動子和人Hl啟動子，它們被認為是三種“不同的”聚合酶 啟動子?！安煌摹本酆厦竼幼舆€指一個啟動子家族的各個成員，例如雞U6啟動子家族， 其中cU6-l，cU6-2, cU6-3和啟動子被認為是“不同的”啟動子。不同的聚合酶啟動 子在本發(fā)明構建體中的應用會降低分子內和/或分子間重組事件如重排或缺失的可能性。在一些方面中，多拷貝的“相同”RNA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動子可以包括 在本發(fā)明核酸構建體中。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體可含有多拷貝的相同聚 合酶啟動子而沒有“不同的”聚合酶啟動子，例如3個、4個、5個或更多個TO啟動子，每個均可操縱連接編碼RNA分子如shRNA的序列。任選地，在一些實施方案中，除了兩個或多個 聚合酶啟動子之外，還可包括其它啟動子，例如一或多個聚合酶I啟動子，一或多個線粒體 啟動子等。在一個方面，包含多個聚合酶啟動子(2、3、4、5或更多個)的表達構建體被工程 化以表達多個dsRNA發(fā)夾或shRNA，其中可以使用相同聚合酶啟動子的2、3、4、5或更多個拷 貝，而無論是否還包括“不同的” RNA聚合酶啟動子。在一些情況中，還希望的是核酸構建體包含組織特異性或細胞特異性啟動子。術 語“組織特異性”當用于啟動子時是指能指導感興趣核苷酸序列在特異類型組織(例如肺) 中選擇性表達的啟動子，而相同的感興趣核苷酸序列在不同組織類型(例如腦)中不表 達。這種組織特異性啟動子包括啟動子如Ick，myogenin或thyl。術語“細胞特異性”當 用于啟動子時是指能指導感興趣核苷酸序列在特異類型細胞中選擇性表達的啟動子，而相 同感興趣核苷酸序列在相同組織的不同類型細胞中不表達(參見例如Higashibatietal. (2004) ；Hoggatt, et al. (2002) ；Sohal, et al, (2001) ；and Zhang, et al.，(2004))。術 語“細胞特異性”當用于啟動子時還指能促進感興趣核苷酸序列在單個組織的一個區(qū)域中 選擇性表達的啟動子。或者，啟動子可以是組成型或可調節(jié)的。另外，啟動子可以被修飾以 具有不同特異性。核酶擴增“聚合酶鏈反應”(“PCR”)是一種反應，其中用由“上游”和“下游”引物組成的 “引物對”或“引物組”和聚合催化劑如DNA聚合酶、典型地熱穩(wěn)定聚合酶制備靶多核苷酸的 復制拷貝。PCR方法是本領域已知的，并且在例如“PCR”中有教導(Ed. MJ. McPherson and S. G Moller (2000) BIOSScientific Publishers Ltd, Oxford) PCR 可以在得自逆轉錄分 離自生物學樣品的mRNA的cDNA上進行。引物通常是寡核苷酸，通常大約20個核苷酸長，最低大約15個核苷酸，其能夠以 序列特異性方式與靶序列雜交并在PCR過程中被延伸。較長的核酸分子例如至少50或100 或更多個核苷酸長的核酸分子也可以用作引物。擴增子或PCR產物或PCR片段或擴增產物 是延伸產物，其包含引物和新合成拷貝的靶序列。多重PCR系統(tǒng)含有多個引物組，導致同時 產生一個以上擴增子。引物可以與靶序列完全匹配或者它們可以含有內部錯配堿基，導致 在特異靶序列中導入限制酶或催化核酸識別/裂解位點。引物還可以含有額外的序列和/ 或修飾的或標記的核苷酸以促進擴增子捕獲或檢測。DNA熱變性、引物與它們的互補序列退 火及退火引物用聚合酶延伸的重復循環(huán)導致靶序列指數擴增。術語靶或靶序列或模板是指 被擴增的核酸序列。另一種核酸擴增技術是逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。首先，互補DNA(cDNA)用 逆轉錄酶從RNA模板制備，然后在所得cDNA上進行PCR。另一種擴增方法是連接酶鏈反應(“LCR”)，如EP 0320308披露。在LCR中，兩個 互補探針對被制備，在靶序列存在下，每個探針對結合靶的相反互補鏈，從而它們鄰接。在 連接酶存在下，兩個探針對連接形成一個單位。通過溫度循環(huán)，如在PCR中一樣，結合的連 接單位從靶解離，然后作為“靶序列”用于連接過量探針對。U. S. Pat. No. 4，883，750描述了 類似于LCR的方法，用于將探針對與靶序列結合。擴增核酸分子的其它方法是本領域技術人員已知的，包括等溫擴增方法和基于轉 錄的擴增系統(tǒng)。用于擴增核酸構建體或其片段或者分離的或外源的核酸分子或其片段的任何合適方法可以用于本發(fā)明方法中。載體及宿主細胞在一些情況中，希望的是將本發(fā)明的核酸構建體和/或核酸分子插入載體中。載 體可以是例如質粒、病毒或人工染色體，源自例如噬菌體、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病 毒、痘病毒或皰疹病毒。這種載體包括染色體的、附加型的和病毒衍生的載體，例如源自細 菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件和病毒的載體，源自上述組合的載體，如源自 質粒和噬菌體遺傳元件的那些，粘粒和噬菌粒。因此，一種舉例的載體是雙鏈DNA噬菌體載 體。另一舉例載體是雙鏈DNA病毒載體。被插入核酸構建體的載體還看包括可轉座元件，例如特征在于位于編碼雙鏈 RNA的開放讀框側翼的末端反向重復序列的轉座子。合適的轉座子的例子包括Tol2， Mini-Tol2, Sleeping Beauty, Mariner 和 GalIuhop0 本文所稱的 Tol2 轉座子包括源自 Το12的轉座子，如Mini-Tol2。本發(fā)明還提供了宿主細胞，其中已導入本發(fā)明的核酸構建體、核酸分子和/或載 體。本發(fā)明的宿主細胞可以用作例如生產系統(tǒng)以生產或表達dsRNA分子。對于體外生產， 可以使用真核細胞或原核細胞。有用的真核宿主細胞可以是動物、植物或真菌細胞。作為動物細胞，可以使用哺乳 動物細胞如CHO，COS, 3T3，DFl, CEF, MDCK骨髓瘤，幼倉鼠腎(BHK)，HeLa或Vero細胞，兩棲 類細胞如非洲爪蟾卵母細胞，或昆蟲細胞如Sf9，Sf21或Tn5細胞。缺少DHFR基因的CHO 細胞(dhfr-CHO)或CHO K-I也可以使用。載體可以通過例如磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖方法、 陰離子脂質體DOTAP (Boehringer Mannheim)方法、電穿孔、脂轉染等導入宿主細胞中。有用的原核細胞包括細菌細胞如大腸桿菌，例如JM109，DH5a和HBlOl，或枯草芽 孢桿菌。培養(yǎng)基如DMEM，MEM, RPMl 1640或IMDM可以用于動物細胞。培養(yǎng)基可以含有或不 含血清補劑如胎牛血清(FCS)而使用。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選在大約6到8之間。細胞典型地 在30-40°C培養(yǎng)大約15-200小時，培養(yǎng)基可以更換、通氣或攪拌，如果需要。轉基因非人動物“轉基因非人動物”是指除了人之外的動物，其含有在同一物種或品種的野生型動 物中未發(fā)現的核酸構建體(“轉基因”)。本文所稱“轉基因”具有生物技術領域正常意義 并包括已通過重組DNA或RNA及時產生或改變以及已導入動物優(yōu)選禽類的細胞中的遺傳序 列。轉基因可包括源自動物細胞的遺傳序列。典型地，轉基因已通過人工操作例如轉化導 入動物中，但是可以使用本領域技術人員已知的任何方法。轉基因包括導入染色體中以及 染色體外的遺傳序列。產生轉基因動物的技術是本領域熟知的。這一主題的有用教科書是Houdebine， Transgenic animals-Generation and Use(Harwood Academic，1997)0雜合DNA可以被導入例如受精卵中。例如，全能或多能肝細胞可以通過顯微注射、 磷酸鈣介導的沉淀、脂質體融合、逆轉錄病毒感染或其它方法轉化，轉化的細胞然后導入胚 胎中，胚胎然后發(fā)育成轉基因動物。在一種方法中，發(fā)育胚胎用含有希望的DNA的逆轉錄病 毒感染，轉基因動物從感染的胚胎產生。然而在另一種方法中，合適的DNA被共注射進優(yōu)選 在單細胞階段的胚胎的原核或細胞質中，胚胎發(fā)育成成熟轉基因動物。
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有用產生轉基因動物的另一種方法涉及將核酸經標準方法顯微注射進原核階段 卵(pro-nuclear stage eggs)中。注射的卵然后培養(yǎng)，之后轉移到假孕受體的輸卵管中。轉基因動物還可以通過核轉移技術產生。使用這個方法，來自供體動物的成纖維 細胞用質粒穩(wěn)定轉染，所述質粒摻入了在調節(jié)序列控制下的感興趣的結合結構域或結合配 偶體的編碼序列。穩(wěn)定的轉染子然后與去核卵母細胞融合，培養(yǎng)，轉移進雌性受體。精子介導的基因轉移(SMGT)是可用于產生轉基因動物的另一種方法。這個方法 首先由 Lavitrano et al. (1989)描述。產生轉基因動物的另一種方法是基于接頭的精子介導的基因轉移技術 (LB-SMGT)。這一程序在美國專利7067308中描述。簡而言之，新鮮收集的精子被洗滌并與 鼠單克隆抗體mAbC (由ATCC登錄號PTA-6723的雜交瘤分泌)保溫，然后與構建體DNA保 溫。單克隆抗體幫助DNA結合精子。精子/DNA復合物然后人工受精到雌性中。種系轉基因雞可以通過將復制缺陷逆轉錄病毒注射進新下的蛋中的雞囊胚層的 胚下腔中而產生(U. S. Pat. No. 5，162，215 ;Bosselman et al. , 1989 ；Thoraval et al.， 1995)。攜帶外來基因的逆轉錄病毒核酸隨機插入胚細胞的染色體中，產生轉基因動物，其 中一些在其種系中攜帶轉基因。使用插入在融合基因構建體的5’或3’去的絕緣體元件以 克服插入位點的位置效應已經描述(Chim et al.，1993)。產生種系轉基因動物的另一種方法是用轉座子例如Tol2轉座子以整合本發(fā)明的 核酸構建體進入動物基因組中。Το12轉座子首先從鏘魚Oryziaslatipe中分離，屬于轉座 子 hAT 家族，描述于 Koga et al. (1996) and Kawakamiet al. (2000)。Mini_Tol2 是 Tol2 變體，描述于Balciunas et al. (2006)。Tol2和Mini_Tol2轉座子當與Tol2轉座酶共作 用時促進轉基因整合進生物體基因組中。通過在單獨的不復制質粒上輸送Το12轉座酶，僅 Το12或Mini-Tol2轉座子和轉基因被整合進基因組，含有Tol2轉座酶的質粒在有限數目 細胞分裂后喪失。因此，整合的Το12或Mini-Tol2轉座子不再具有經歷后續(xù)轉座事件的能 力。另外，由于Tol2已知不是天然發(fā)生的禽類轉座子，禽類細胞如雞細胞中無導致進一步 轉座事件的內源轉座酶活性。任何其它合適的轉座子系統(tǒng)可以用于本發(fā)明方法中。例如，轉座子系統(tǒng)可以是 Sleeping Beauty, Frog Prince 或 Mosl 轉座子系統(tǒng),或者屬于 cl/mariner 或 hAT 轉座子 家族的任何轉座子均可以使用。US 7，145，057描述了將禽類胚胎干細胞注射進受體胚胎以產生嵌合鳥類。育種所 得嵌合體產生轉基因鳥類，其基因組由外源DNA組成。從禽類原生殖細胞(PGC)的長期培養(yǎng)物獲得轉基因雞的方法如美國專利申請 20060206952所述。當通過已知程序與宿主禽類胚胎組合時，那些ixush的PGC通過種系傳 遞以產生轉基因后代?；谌魏魏线m病毒的病毒輸送系統(tǒng)可以用于輸送本發(fā)明的核酸構建體至細胞。另 外，可以使用雜合病毒系統(tǒng)。病毒輸送系統(tǒng)的選擇取決于各種參數，如輸送進感興趣的細 胞、組織或器官的效率，系統(tǒng)的轉導效率，致病性，免疫學和毒性考慮，等等。清楚的是不存 在適合所有應用的單一病毒系統(tǒng)。當選擇用于本發(fā)明的病毒輸送系統(tǒng)時，重要的是選擇這 樣的系統(tǒng)，其中含有核酸構建體的病毒顆粒優(yōu)選地1)能重復和穩(wěn)定繁殖；2)能被純化至 高效價；和3)能夠介導靶向輸送(將核酸表達構建體輸送至感興趣的細胞、組織或器官，無需廣泛傳播)。組合物和施用在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物是包含合適載體的藥物組合物。合適的藥 物載體、賦形劑和/或稀釋劑包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉粉末、滑石粉、alkonoic acids 的纖維素酯、硬脂酸鎂、氧化鎂、結晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、明膠、甘油、藻酸 鈉、抗細菌劑、抗真菌劑、阿拉伯膠、阿拉伯樹膠、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、聚乙烯吡咯烷 酮和/或聚乙烯醇、鹽水和水。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體和/或核酸分子與一或多種陰離子脂質 或陰離子兩親分子復合，如US 4, 897, 355 ；US 5，264，618 ；或US5，459，127中公開的組合 物。在其它實施方案中，它們與包括陰離子脂質和任何地包括其它成分如中性脂質的脂質 體/脂質體組合物復合(參見例如US5, 279，833 ；US 5，283，185 ；and US 5，932，241)。在 其它實施方案中，它們與US5，837，533 ；6, 127，170 ；和6，379，965的多功能分子復合物復 合，或者希望地與WO 03/093449的多功能分子復合物或油/水陰離子兩親分子乳液復合。 后一申請教導了一種組合物，其包括核酸、包括膽固醇或脂肪酸的溶內體(endosomolytic) 精胺，以及包括細胞表面分子配體的靶向精胺。組合物的正負電荷之比在0. 1-2.0，優(yōu)選 地0. 5-1. 5，包括端值；所述溶內體精胺組成了組合物中至少20%的含精胺分子；靶向精胺 組成了組合物中至少10%的含精胺分子。希望地，正負電荷之比在0.8-1.2，包括端值，如 0. 8-0. 9，包括端值。核酸構建體、核酸分子和/或組合物的給予可以方便地通過注射進禽類卵中實 現，通常注射進氣囊中。盡管氣囊是卵給予的優(yōu)選途徑，但是其它區(qū)域如卵黃囊或絨毛膜尿 囊液也可以經注射接種。當氣囊不是給予靶時孵化率可能略有下降，但是不是必須在商業(yè) 上不能接受水平。注射機理不是本發(fā)明實施關鍵的，盡管優(yōu)選的是針不導致卵或發(fā)育胚胎 的組織和器官或者圍繞胚胎的胚胎外膜的過度損害。通常，配有大約22號針的皮下注射器適于禽的卵給予。本發(fā)明方法特別適于自動 化注射系統(tǒng)，如 US 4，903，635，US 5，056，464，US 5，136，979 和 US20060075973 所述的那些。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體、核酸分子和/或組合物經肺輸送給 予，如通過吸入氣溶膠或噴霧干燥的配制品。例如，氣溶膠可以通過吸入裝置或噴霧器給予 (參見例如US 4，501，729)，提供了核酸分子快速局部攝入相關肺組織。含有微粉化核酸組 合物的可呼吸干燥顆粒的固體顆粒組合物可以如下制備研磨干燥或凍干的核酸組合物， 然后將微粉化組合物通過例如400目篩以粉碎或分離出大聚集體。包含本發(fā)明的核酸組合 物的固體顆粒組合物可以任選地含有促進氣溶膠的配制的分散劑以及其它治療化合物。合 適的分散劑是乳糖，其可以與核酸化合物以任何合適比例混合，如1 1重量比。噴霧器是可商購裝置，其通過將壓縮氣體典型地為空氣或氧加速通過文氏管孔或 通過超聲攪拌而將活性成分的溶液或懸浮液轉化為治療性氣溶膠霧。用于噴霧器中的合適 配制品包含在液體載體中的活性成分，其量為至多40% w/w配制品，優(yōu)選小于20% w/w配 制品。載體典型是水或稀水性醇溶液，優(yōu)選通過加入例如氯化鈉或其它合適鹽制成與體液 等滲。任選的添加劑包括防腐劑，如果配制品不是無菌制備，例如，羥基苯甲酸甲酯，抗氧化 劑，調味劑，揮發(fā)油，緩沖劑和乳化劑及其它配制表面活性劑。含有活性組合物和表面活性
23劑的固體顆粒的氣溶膠可以類似地用任何固體顆粒氣溶膠產生器生產。用于將固體顆粒治 療劑給予對象的氣溶膠產生器產生可呼吸的顆粒，如上所述，并產生含有以合適人類給藥 的速率預定計量劑量的治療組合物的氣溶膠體積。本發(fā)明的核酸構建體、核酸分子和/或組合物也可以加入到動物飼料或飲用水 中?？梢苑奖愕嘏渲骑暳虾惋嬘盟M合物，從而動物與其飲食一起攝取治療合適數量。還 可以方便地將組合物作為預混合料加入飼料或飲用水中。
實施例實施例1.詵擇包括在轉基因中的shRNA序列選擇甲型流感的最高度保守的基因PB1、PB2、PA、NP和Ml用于RNAi靶向。發(fā)明 人使用SiVirus (基于網絡的抗病毒SiRNA設計軟件，用于高度趨異的病毒序列，Naito et al.，2006)鑒別選擇的基因內的高保守區(qū)，并且預測能夠篩選用于選擇shRNA的siRNA序 列。該軟件高亮指出了分析的甲型流感病毒基因組節(jié)段內的一些區(qū)域，它們對于shRNA設 計是特別感興趣的，即PB1，PB2，PA和NP的3’區(qū)域。更具體地，這些是節(jié)段1 (PB2基因)核 苷酸2240-2341 ；節(jié)段2 (PBl基因)核苷酸2257-2341 ；節(jié)段3 (PA基因)核苷酸2087-2233 ； 節(jié)段5 (NP基因)核苷酸1484-1565。發(fā)明人選擇了 29個從siVirus預測的siRNA序列以篩選選擇shRNA(表1)。有若 干算法可用于選擇針對特異靶基因的潛在siRNA。但是已經顯示許多這些預測的siRNA當 從表達的shRNA加工時不能有效起作用。Taxmanet al. (2006)具體設計了一種算法以預測 有效的shRNA分子，本發(fā)明人對該算法進行了修改以改善shDNTA預測。本發(fā)明人對29個 siVirus選擇的siRNA應用了修飾的Taxman算法以選擇序列用于作為shRNA測試對甲型流 感病毒復制的特異性抑制。表1靶向甲型流感病毒基因的shRNA序列的算法選擇 使用Taxman算法對于shRNA選擇有4個標準。3個標準被評分最多4分。這些標 準是1)序列5’末端的C或G= 1分，5’末端A或T = -I分；2)序列3’末端的A或T = 1分，3’末端C或G = -I分；3)7個3’堿基中有5個或更多個A或T = 2分，7個3’堿基 中有4個A或T = 1分。優(yōu)選具有最高評分的shRNA序列。第四個標準是基于計算對于19 個核苷酸序列的shRNA序列的6個中心堿基(與反義鏈的堿基9-14雜交的有義鏈的堿基 6-11)的自由能。優(yōu)選具有中心雙螺旋AG > -12. 9kcal/mol的shRNA。本發(fā)明人對Taxman 算法的修改是使用不同的自由能參數預測RNA雙螺旋穩(wěn)定性，如Freier et al. (1986)所 公開的?；谠撍惴ǎl(fā)明人選擇了 13個siVirus siRNA序列用于潛在有效的shRNA中以 測試它們抑制甲型流感病毒復制的能力。選擇的序列在表1中黑體示出，它們的5’ -3’序 列示于表2。這13個序列用于構建ddRNAi質粒以表達10個shRNA。表2.選擇用于病毒抑制測定的shRNA的序列 實施例2.雞啟動子序列已知當設計轉基因構建體時，希望的是包括這樣的啟動子，其包括上游序列以使 得聚合酶有效附著到啟動子序列。盡管如此，雞U6啟動子被設計及測試以含有引起shRNA 轉錄所需的最低量的啟動子序列，因此使得降低轉基因構建體的整體大小。測試了兩個版本的構建體，pcU6-4shNP-1496和 pcU6_4 (+100) shNP-1496,經 RNAse保護測定測試shRNA表達，或測試病毒沉默。第一個質粒含有表達shNP-1496短發(fā) 夾RNA所需的最小的雞U6-4序列。第二個質粒含有IOObp額外的啟動子上游序列。 預期含有IOObp額外上游序列的第二個構建體將提供更好的shRNA表達。表3提供了測量由來自兩個質粒的shRNA表達誘導的對病毒產生的抑制的血凝 測定(HA測定)實驗結果。為進行這個測定，MDCK細胞生長至對數期，然后使用Amaxa Nucleofector用所述shRNA質粒電穿孔。轉染的細胞然后8小時后用低致病Hmi A/ PR/8/34(PR8)甲型流感病毒以一系列感染復數(moi)感染。病毒效價(HA單位)在感染 后48小時用HA測定測量。測定在V底96孔板中進行。系列2倍稀釋的病毒樣品與等體 積的雞紅細胞的0. 5%懸液(vol/vol)混合，在冰上保溫1小時。含有粘附的均質層的紅細 胞的孔被記錄為陽性。在HA測定實驗中，含有最小啟動子序列的pcTO-4shNP-1496在所有測試的MOI在 沉默病毒方面均比含有額外上游啟動子序列的pcU6-4(+100) shNP-1496及模擬質粒更有效。表3.血凝測定(HA測定)結果 實施例3.用于表達選擇的shRNA的ddRNAi質粒的構建雞聚合酶III 啟動子 cU6-l (GenBank 登錄號 DQ531567)，cU6_3 (DQ531569)， cU6-4 (DQ531570)和c7SK(EF488955)用作模板以經一步PCR構建用于選擇的shRNA的 ddRNAi表達質粒(圖1)。構建質粒的PCR使用引物TD135與TD218或TD275配對，用于 cU6-l 啟動子；TD 175 與 TD216、TD274 或 TD302 配對用于 cU6_4 啟動子；TD176 與 TD217 配 對用于cTO-3啟動子；TD269與TD307或TD316配對用于c7SK啟動子(引物序列及擴增的
27特異shRNA的細節(jié)參見表4)。每個PCR中的反向引物被設計包含每個啟動子序列的最后 20個核苷酸、shRNA有義、環(huán)和shRNA反應序列，并被HPLC純化。全長擴增的表達盒產物連 接進pGEM-T Easy，然后測序。在選擇的13個shRNA中，對于7個序列成功構建了表達質粒。用于病毒抑 制測定中的最終shRNA表達質粒被命名為pcU6-l-shPB2-2240, pcU6-l-shPA_2087， pcU6-3-shMP-592, pcU6-4-shNP_1496， pcU6-4-shNP_1484， pc7SK_shPB卜129， pcU6-4-shPBl-2257和pc7SK-shPBl_2257。還構建了 cU6_l無關對照質粒，用于在病毒抑 制測定中進行模擬比較(見下述)。對于這一模擬質粒，正向引物TD135與包含chTO-1啟 動子的最后20個核苷酸和所有其它無關shRNA (shirr)成分的反向引物TD155配對。PCR 產物連接進pGEM-T Easy并測序。每個ddRNAi質粒被構建以便每個shRNA序列在天然U6或7SKsnRNA轉錄物的 +1位。Xhol限制酶位點被工程化在終止信號下游以使得篩選插入pGEM-T Easy中的全 長shRNA產物。所有最終shRNA表達載體由全長雞U6或7SK啟動子之一、shRNA有義序 列、環(huán)序列、shRNA反義序列、終止序列和Xhol位點組成。所有shRNA中使用的環(huán)序列是 5' UUCAAGAGA 3'。實施例4.測試詵擇shRNA的病毒抑制表5總結了血凝測定(HA測定)實驗測量由shRNA表達質粒誘導的病毒產生的 抑制的結果。為進行這些測定，MDCK細胞生長至對數期，然后用Amaxa Nucleofector 用 shRNA質粒電穿孔。轉染細胞8小時后用甲型流感病毒低致病性HmiA/PR/8/34(PR8)或高 致病性H5mA/chicken/Vietnam/008/2004(H5Nl)以一系列感染復數(moi)感染。病毒效 價(HA單位)在感染后48小時通過HA測定測量。測定在V底96孔板中進行。系列2倍 稀釋的病毒樣品與等體積的雞紅細胞的0. 5%懸液(vol/vol)混合，在冰上保溫1小時。含 有粘附的均質層的紅細胞的孔被記錄為陽性。表4.序列及所用引物細節(jié)
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〔0260〕琳媧 55ff雒浮筇澍 HA 簦沛將餿書，^;iishpBl-2257,shNP-1484^shNP-1496sM li<lIT滿莛錘酋盞tsMTTT碑澍饞薛咨垂PR8菩S，湔娜浮1阱。琳shPBl-2257普shNP-1484情況中，它們在許多實驗中均能完全抑制兩種病毒的復制，證實它們的有效性。表達 shPA-2087和shMP-592的質粒也能有效抑制病毒的產生，但是不像shPBl-2257、shNP_1484 和shNP-1496那樣有效。shPBl-129分子抑制低致病性PR8毒株的產生但不抑制高致病性 H5N1毒株。最后，盡管被鑒別為潛在的靶shRNA序列，但是shPB2-2240不能抑制每種測試 病毒的復制。 表5shRNA對MDCK細胞中流感病毒產生的作用。括號中數字是感染復數(moi)值 已經確定從-
(MWH)轉基因的構建 -個轉基因表達多個shRNA以進-
j步降低病毒靶序列變異對RNAi策略的風險有顯著益處。這些“多彈頭”(MWH)轉基因由多個轉錄單位組成，每個具有不同的 雞pol III啟動子(cU6-l，cU6-3，cU6-4和c7SK)表達各個shRNA分子靶向上述不同甲型 流感病毒基因的保守序列。啟動子序列對于雞是天然的，小的21bp shRNA已經存在于AI 感染的或接種的鳥類中。RNAi靶是絕對特異于甲型流感病毒的，因此這種特異的轉基因不 會由脫靶效應(off target effects)。從選擇的shRNA如下構建了 4種MWH轉基因a. MWHl-cU6-3shMP-592 ；cU6-lshPA_2087 ；cU6-4shNP_1496每個MWH轉基因含有3個轉錄單位，它們從雞pol III啟動子獨立地表達單個 shRNA分子。3個轉錄單位用一步PCR擴增，所得片段然后連接在一起以產生MWH轉基因(圖 2)。MWH然后從單個轉基因表達3個shRNA。MWH 1的3個轉錄單位是cTO-4shNP_1496 ； cU6-3shMP-592 和 cU6_l shPA_2087。cU6-4shNP_1496 轉錄單位用正向引物 TD233 和反 向引物TD216擴增，cU6-3shMP-592轉錄單位用正向引物TD234和反向引物TD217擴增， cU6-lshPA-2087轉錄單位用正向引物TD232和反向引物TD218擴增(引物如表4所述)。 每個PCR產物克隆進pGEM-T Easy，各自含有5' Sail限制位點和3' Xhol限制位點。這 些限制位點具有相容的突出端，使得各個轉錄單位依次連接在一起，以產生最終的MWH轉 基因(圖2)。b. MWH 2-cU6-4shPBl-2257 ;cU6-lshPB2-2240 ;c7SKshPBl-129MWH 2 的 3 個轉錄單位是cU6_4shPB 1-2257 ；cU6-lshPB2_2240 和 c7SK shPBl-129。cU6-4shPBl-2257轉錄單位用正向引物TD233和反向引物TD274擴增， cU6-lshPB2-2240轉錄單位用正向引物TD232和反向引物TD275擴增，c7SK shPBl-129轉 錄單位用正向引物TD306和反向引物TD307擴增(引物如表4所述)。每個PCR產物克隆 進pGEM-T Easy,如上所述和如圖2所述各個轉錄單位依次連接在一起，以構建最終的MWH 轉基因。c. MWH3-cU6-4shNP-1484 ；cU6-lshPA_2087 ；c7SKshPBl_2257MWH 3 的 3 個轉錄單位是cU6-4shNP_1484 ；cU6-lshPA_2087 和 c7SKshPBl_2257。 cU6-4shNP-1484轉錄單位用正向引物TD233和反向引物TD302擴增，cU6-lshPA_2087轉 錄單位用正向引物TD232和反向引物TD218擴增，c7SK shPBl_2257轉錄單位用正向引物 TD306和反向引物TD316擴增(引物如表4所述)。每個PCR產物克隆進pGEM_T Easy，如 上所述和如圖2所述依次連接在一起，以構建最終的MWH轉基因。d. MWH4-cU6-4shPBl-2257 ；cU6-3shNP_1484 ；cU6-lshPA_2087MWH 3 的 3 個轉錄單位是cU6-4shPBl_2257 ；cU6-3shNP_1484 和 cU6-lshPA-2087。cU6_4shPBl_2257轉錄單位用正向引物TD233和反向引物TD274擴增， cU6-3shNP-1484轉錄單位用正向引物TD234和反向引物TD343擴增，cU6-lshPA-2087轉錄 單位用正向引物TD232和反向引物TD218擴增(引物如表4所述)。每個PCR產物同樣克 隆進pGEM-T Easy,如上所述和如圖2所述依次連接在一起，以構建最終的MWH轉基因。在HA測定中使用H5W甲型流感病毒還測試了 4個最終MWH轉基因的抑制病毒產 生的能力(表4，實驗8)。MWH 3和MWH 4是最有效的轉基因。MWH 1也有效抑制H5W病 毒產生，而MWH 2不如MWH 1有效。實施例6. MWH轉基因克隆進pStuffit載體
將每個MWH克隆進pSuffit質粒(圖3)。這一質粒促進MWH轉基因插入雞基 因組DNA的填充/緩沖片段之間以潛在保護MWH序列免于轉基因插入過程和外部轉錄連 讀。從雞基因組的大內含子序列(即基因組desert)選擇ME1和GRM5填充片段，其不 含可能干擾MWH轉基因表達的轉錄元件。GenBank中描述的具體區(qū)域為ME11500 (chr3) gb|AADN02002420. 130995_32489bp ；ME1200(chr3)gb|AADN02002420. 15079_5276bp ； 禾口 GRM51500(chrl)gb|AADN02004814.113141-13113，13078-12911，12848-11638bp ； GRM5200(chrl)gb|AADN02004814. 110126_9927bp。質粒 DStuffit 構建通過將雞基因組的4個區(qū)域以應用限制酶位點限定的特異順序克隆進PIC20H克 隆載體而構建質粒pStuff it (圖3)。表6所列片段首先用表7所列引物進行PCR擴增，然 后逐個克隆進pGEM-T Easy(Invitrogen)并測序。這些片段然后從pGEM-T Easy切下并用 表5所列限制酶位點依次克隆。首先，GRM5 200克隆進pC20H，隨后是ME1 200,GRM5 1500 和ME1 1500。在每個克隆階段，所得質粒用限制酶消化和DNA測序檢查。最終組裝的質粒 命名為pStuffit。表6. pStuffit構建。克隆片段名稱和其擴增中使用的引物 表7pStuffit構建。PCR引物名稱和序列。限制酶位點下劃線示出 MWH 轉基因插入 DStuff itpStuffit載體具有位于GRM5 200和ME1 200序列之間的唯一 EcoRI限制位點 以允許插入每個MWH轉基因。每個MWH轉基因通過連接進這個EcoRI限制位點而插入 pStuffit。還包括PacI和Swal以允許切下具有不同量側翼序列的構建體(圖3)。pIC20H 載體的Hindlll限制酶位點可以用于切下完整的克隆序列。因此，含有每種MWH插入序列 的最終的pStuffit質粒用Hindlll限制酶消化以釋放最終插入序列，以純化并用于精子介 導的基因轉移(SMGT)方法。實施例7.基于接頭的精子介導的基因轉移將構建體輸送進受精的雞卵的方法可以通過基于接頭的精子介導的基因轉移實 現。這一方法如US 7，067，308所述進行。簡而言之，洗滌新鮮采集的雞精子，并與鼠單克 隆抗體mAbC (由ATCC登錄號PTA-6723的雜交瘤分泌)保溫，然后與構建體DNA保溫。加 入的單克隆抗體有助于DNA與精子的結合。精子/DNA復合物然后人工受精母雞。這一方 法重復4次，受精間隔72小時。首次受精后2天開始每天收集雞蛋，直至最后一次受精后 3天。實施例8. MWH轉基因插入Tol2并輸送至雞中MWH 3(SEQ ID NO 21)和 MWH 4(SEQ ID NO 61)轉基因被克隆進 Tol2 轉座子載 體 pminiTol2/MCS((SEQ ID NO 64) ；Balciunas et al. ,2006) 兩個轉基因通過用 Sail 和Xhol雙酶切從pGEM-T Easy載體取出。這一片段然后連接進位于Tol2轉座子載體的多 克隆位點內的唯一的XhoI位點中。輸送MWH 3Tol2 構建體(SEQ ID NO 62)禾P MWH 4Tol2 構建體(SEQID NO 63) 進入雞胚的方法可以用原生殖細胞(PGC)實現。簡而言之，PGC從供體雞胚收集，當胚胎 是2日齡時從血中收集或者從5. 5日齡胚胎的性腺中收集。用Magnetic Antibody Cell Separation (MACS)從血液或性腺組織中純化PGC。用Amaxa Nucleofector將純化的PGC 然后用Tol2構建體和編碼Tol2轉座酶的單獨質粒(pCMV-Tol2 ；SEQ ID NO 65 ；Balciunas
35et al.，2006)電穿孔。這些細胞然后注射回到2. 5日齡的受體胚胎中。轉換的PGC遷移以 建立發(fā)育胚胎的性腺。輸送Tol2構建體進入雞胚的方法也可以通過直接電穿孔新下的蛋的囊胚層而實 現。簡而言之，打開新下的受精卵以暴露囊胚層。用顯微毛細管將Tol2構建體DNA與編碼 Tol2轉座酶的質粒一起注射進囊胚層。然后用BTX ECM830 Electro Square Porator卵內 電穿孔所述囊胚層。PGC位于囊胚層中心，如果這些細胞在電穿孔后用構建體轉化，它們會 變成在發(fā)育的胚胎的性腺中的生殖細胞。實施例9.篩詵轉基因的GO后代從1周齡GO后代的翼靜脈或羽尖取少量血。用QIAmp DNA Blood Minikit(Qiagen)從翼靜脈血制備基因組DNA。來自羽尖血的DNA用QuickExtract (TM)DNA Extraction Solution (Epicentre Biotechnologies)制備。在這些樣品上進行兩項測試以 證實構建體的存在。Southern 印跡用表8列出的正向和反向引物在基因組樣品上進行PCR。PCR混合物然后在瓊脂 糖凝膠上電泳，轉移至膜上兵與放射性標記的鎖核酸探針(表8)雜交。在雜交并用高嚴格 溶液洗滌后，膜在X光膠片上曝光。由在所得放射自顯影上檢測到正確大小的條帶指示陽 性。表8.用于Southern印跡PCR分析的寡核苷酸。下劃線為鎖核酸堿基。 實時定量PCR用表9列出的引物在基因組樣品上進行實時PCR。該測定用SYBRGreen試劑與雙 鏈DNA結合，隨后用熔融曲線分析確定陽性樣品。表9.實時PCR分析中使用的引物 實施例10.測試轉基因鳥類LB-SMGT在GO群中鑒別為轉基因的鳥將被保留并圈養(yǎng)直至性成熟。一旦性成熟，將該鳥 用于交配實驗以產生G1轉基因后代，其在每個細胞中均具有構建體的拷貝。再次使用 Southern印跡和實時PCR以顯示G1后代的轉基因性質。在這些鳥上進行關于插入位點和構建體拷貝數的更詳細的分析，使用基因組 Southern 印跡和 PCR。飼養(yǎng)鑒別為具有相關構建體插入的G1鳥直至性成熟。來自這些鳥的一些G2后代 用于動物試驗中以驗證它們對各種禽流感毒株抗性。其它G2鳥被分析構建體在各種組織 和各個年齡的表達。Tol2 轉座子接受Tol2轉化的PGC或已經用Tol2構建體電穿孔的GO胚胎被孵化。僅GO雄性 雞被保持并飼養(yǎng)直至性成熟。從所述雄性雞收集精子并進行PCR以證實任何任何一個雞含 有相關構建體。PCR陽性的雞用于交配實驗以產生G1轉基因后代，其在每個細胞中均具有 構建體拷貝。使用Southern印跡和實時PCR以顯示G1后代的轉基因性質t施徹丨11. 1草型系統(tǒng)-甲型、流感杭件轉某因小鼠本發(fā)明人構建了兩個shRNA轉基因盒以用于產生轉基因小鼠。每個盒含有小鼠 U6啟動子用于表達shNP-1496或shEGFP。兩個轉基因然后用于實驗慢病毒技術產生轉基 因小鼠。簡而言之，shNP-1496和shEGFP shRNA轉基因盒被克隆進慢病毒基因轉移載體 (AusGen^Bentleigh，Australia)。轉基因病毒構建體然后包裝成慢病毒顆粒。確定慢病 毒效價并將慢病毒顆粒注射進早期小鼠胚胎的卵周隙。胚胎重植入假孕雌性小鼠中，通過 southern印跡分析篩選所得后代。獲得了轉基因建立者小鼠，其具有每個轉基因的穩(wěn)定整 合。建立者然后與野生型小鼠交配以產生F1后代。轉基因F1小鼠然后在攻擊實驗中測試 對甲型流感感染的抗性。 攻擊實驗包括3組，每組含有5只小鼠。組1和組2各含有5只具有shEGFP shRNA 的小鼠。組2和組3接受5x102TCID50的低致病性H1N1A/PR/8/34(PR8)甲型流感病毒的 鼻內攻擊。組1用不含病毒的磷酸鹽緩沖鹽水攻擊。攻擊后每天監(jiān)測體重10天，在實驗結 束時小鼠安樂死，取肺樣品進行病毒RNA的qPCR測量。如圖4所示，具有shNP-1496轉基因的轉基因小鼠與具有無關shEGFP轉基因的小 鼠相比具有優(yōu)異的抗感染水平。shNP-1496小鼠在實驗期間與PBS對照組相比不喪失體重。 相比之下，shEGFP小鼠顯示統(tǒng)計學顯著的體重降低，表明流感病毒的活性感染。當測量來自 組2和組3小鼠的肺樣品的病毒RNA時，具有shNP-1496轉基因的小鼠與含有無關shEGFP 轉基因的小鼠相比具有大于90 %的病毒RNA降低。整體上這些結果表明含有特異地靶向甲 型流感病毒的shRNA分子如shNP-1496的轉基因小鼠對于用H1N1A/PR/8/34(PR8)甲型流 感病毒的實驗攻擊是高度抗性的。本領域技術人員明白可以對特異實施方案示出的本發(fā)明進行各種改變和/或修改而不偏離本發(fā)明的精神或范圍。本發(fā)明實施方案因此被認為是示意性和非限制性的。本文討論和/或參考的所有出版物以其全文引入本文。本申請要求US 60/938,315和AU 2007902616的優(yōu)先權，其全部內容引入本文作參考。包括在本說明書中的任何文件、活動、材料、裝置、文章等的任何討論僅僅是提供 本發(fā)明的背景。不應理解為承認本發(fā)明的這些內容的任何或全部構成現有技術的一部分或 是在本發(fā)明優(yōu)先權日之前存在的本發(fā)明所屬技術領域中的常識。參考文獻Balciunas et al. (2006)PLoS Genet. 10 :el69.Bosselman et al. (1989)Science，243 :533_534.Chim et al. (1993) Cell，74 :504_514.Fire, et al. (1998)Nature,391 :806_811.Freier, et al. (1986)Proc Natl Acad Sci USA, 83 :9373-7.Higashibata, et al. (2004)J Bone Miner Res, 19 :78_88.Hoggatt, et al. (2002)Circ Res,91 :1151_59.Kawakami, et al. (2000)Proc Natl Acad Sci USA, 97 11403-11408.Ketting, et al. (1999)Cell,99 :133_141.Koga, et al. (1996) Nature, 383 :30.Lavitrano, et al. (1989)Cell, 57 :717_723.Love et al. (1994)Bio/Technology, 12 :60-63.Naito et al. (2006)Nucleic Acids Res, Jul 34(WebServerlssue) :W448_50.Needleman, S.B. and ffunsch,CD. (1970)J Mol Biol，48 443-453.Nicholson, et al. (2005)Lancet,362 :1733—1745.Ratcliff, et al. (1999)Plant Cell,11 :1207_1216.Tabara, et al, (1999)Cell,99 :123_132.Taxman, et al. (2006)BMC Biotechnol, Jan 24，6 -J.Thoraval et al. (1995) Transgenic Research 4:369-36.Zamore, et al, (2000)Cell，101 :25_33.Zhang, et al. (2004)Genome Res 14:79-89
權利要求
編碼包含雙鏈區(qū)的RNA分子的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述RNA分子降低動物細胞中甲型流感病毒復制和/或降低在動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生和/或降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞中的表達。
2.權利要求1的核酸構建體，其中所述雙鏈區(qū)包含選自如下核苷酸的序列(i)SEQID NO 1的位置2240-2341內的核苷酸，(ii)SEQID NO 2的位置2257-2341內的核苷酸，(iii)SEQID NO 3的位置2087-2233內的核苷酸，(iv)SEQ ID NO 4的位置1484-1565內的核苷酸，(ν) SEQ ID NO 6-15 或 52-54 任一核苷酸序列，(vi)與(i)-(v)任一序列至少90%相同的核苷酸序列，(vii)在嚴格條件下與(i)-(v)任一序列雜交的核苷酸序列。
3.權利要求2的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染 的動物細胞相比時，所述RNA分子降低動物細胞中甲型流感病毒復制。
4.權利要求2的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染 的動物細胞相比時，所述RNA分子降低動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生。
5.權利要求2的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染 的動物細胞相比時，所述RNA分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞 中的表達。
6.權利要求1-5任一項的核酸構建體，其中所述雙鏈區(qū)的長度至少為19個堿基對。
7.權利要求1-6任一項的核酸構建體，其中所述雙鏈區(qū)的長度小于100個堿基對。
8.權利要求1-7任一項的核酸構建體，其中所述RNA分子是短發(fā)夾RNA。
9.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID NO: 7的核苷酸序列。
10.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID NO: 9的核苷酸序列。
11.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID NO: 12的核苷酸序列。
12.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID NO: 6的核苷酸序列。
13.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID NO: 8的核苷酸序列。
14.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID N0 13的核苷酸序列。
15.權利要求1-8任一項的核酸構建體，其中由RNA分子編碼的雙鏈區(qū)包含SEQID N0 15的核苷酸序列。
16.前述任一項權利要求的核酸構建體，其中所述構建體編碼兩個或多個RNA分子。
17.權利要求16的核酸構建體，其中每個RNA分子包含相應于不同甲型流感病毒基因 的核苷酸序列。
18.權利要求16或17的核酸構建體，其中每個RNA分子由與RNA聚合酶II啟動子或 RNA聚合酶III啟動子可操縱連接的核苷酸序列編碼。
19.權利要求18的核酸構建體，其中所述啟動子是RNA聚合酶III啟動子。
20.權利要求18或19的核酸構建體，其中啟動子是雞、火雞和/或鴨啟動子。
21.權利要求19或20的核酸構建體，其中啟動子選自TO、7SK和/或Hl啟動子。
22.權利要求2的核酸構建體，其中U6啟動子是cU6-l、cU6_2、cU6-3和/或cU6_4。
23.權利要求19-22任一項的核酸構建體，其中編碼RNA分子的每個核苷酸序列與不同 的RNA聚合酶III啟動子可操縱連接。
24.權利要求1-23任一項的核酸構建體，其中甲型流感病毒多肽選自PB1、PB2、PA、NP 和/或Ml。
25.權利要求1-24任一項的核酸構建體，其中甲型流感病毒多肽由SEQID N0:l_5任一序列編碼。
26.權利要求1-25任一項的核酸構建體，其中所述多肽是禽流感多肽。
27.權利要求26的核酸構建體，其中禽流感是H5W。
28.權利要求1-27任一項的核酸構建體，其中所述構建體由雞和甲型流感病毒核苷酸 序列組成。
29.權利要求1-28任一項的核酸構建體，其編碼3個包含雙鏈區(qū)的RNA分子，其中所述 雙鏈區(qū)包含選自如下的核苷酸序列(i)SEQID NO 9, SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO :15，(ii)SEQID NO :6, SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID N0:8，及(iii)SEQID NO -J, SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO :12。
30.權利要求1-28任一項的核酸構建體，其包含核酸構建體包含選自SEQID N0 16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQID NO 16-21和61-63的核苷 酸序列至少95 %相同的序列。
31.分離的和/或外源的包含雙鏈區(qū)的核酸分子，其中所述雙鏈區(qū)包含選自如下的核 苷酸序列(i)SEQID NO 1的位置2240-2341內的核苷酸，(ii)SEQID NO 2的位置2257-2341內的核苷酸，(iii)SEQID NO 3的位置2087-2233內的核苷酸，(iv)SEQ ID NO 4的位置1484-1565內的核苷酸，(v)SEQID NO 6-15 或 52-54 任一核苷酸序列，(vi)與(i)-(v)任一序列至少90%相同的核苷酸序列，(vii)在嚴格條件下與(i)-(v)任一序列雜交的核苷酸序列。
32.權利要求31的分離的和/或外源的核酸分子，其中當與缺少所述核酸分子的等 基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述核酸分子降低動物細胞中甲型流感病毒復 制。
33.權利要求31或32的分離的和/或外源的核酸分子，其中當與缺少所述核酸分子的 等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述核酸分子降低動物細胞中感染性甲型流 感病毒顆粒的產生。
34.權利要求31-33任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其中當與缺少所述核酸分 子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相比時，所述核酸分子降低甲型流感病毒多肽在 甲型流感病毒感染的動物細胞中的表達。
35.權利要求34的分離的和/或外源的核酸分子，其中所述核酸分子降低由SEQID NO 1-5任一序列編碼的甲型流感病毒多肽的表達。
36.權利要求31-35任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其中所述雙鏈區(qū)長度至少 為19個核苷酸。
37.權利要求31-36任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其中所述雙鏈區(qū)長度小于 100個核苷酸。
38.權利要求31-37任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其中所述分子包含雙鏈RNA。
39.權利要求31-38任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其是小干擾RNA或短發(fā)夾RNA。
40.權利要求31-39任一項的分離的和/或外源的核酸分子，其包含選自SEQID NO: 16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQID NO 16-21和61-63的核苷 酸序列至少95 %相同的序列。
41.一種載體，其包含權利要求1-30任一項的核酸構建體和/或權利要求31-40任一 項的分離的和/或外源的核酸分子。
42.一種細胞，其包含權利要求1-30任一項的核酸構建體，權利要求31-40任一項的分 離的和/或外源的核酸和/或權利要求41的載體。
43.權利要求42的細胞，其是雞原生殖細胞。
44.一種轉基因非人生物，其包含權利要求1-30任一項的核酸構建體，權利要求31-40 任一項的分離的和/或外源的核酸，權利要求41的載體和/或權利要求42或43的細胞。
45.權利要求44的轉基因生物，其是非人動物。
46.權利要求45的轉基因生物，其是禽類。
47.權利要求46的轉基因生物，其是家禽。
48.權利要求47的轉基因生物，其是雞、火雞或鴨。
49.權利要求44-48任一項的轉基因生物，其包含選自SEQIDNO 16-21和61-63的核 苷酸序列或其片段，或者包含與選自SEQ ID NO 16-21和61-63的核苷酸序列至少95%相 同的序列，編碼至少一種含雙鏈區(qū)的RNA分子。
50.一種組合物，其包含權利要求1-30任一項的核酸構建體，權利要求31-40任一項的 分離的和/或外源的核酸分子，權利要求41的載體和/或權利要求42或43的細胞。
51.一種治療和/或預防對象中甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括給予對象權 利要求1-30任一項的核酸構建體，權利要求31-40任一項的分離的和/或外源的核酸，權 利要求41的載體和/或權利要求42或43的細胞。
52.權利要求51的方法，其中所述方法包括給予在飲用水或在氣溶膠中的所述核酸構 建體，所述分離的和/或外源的核酸，所述載體和/或所述細胞。
53.權利要求51或52的方法，其中所述甲型流感病毒是禽流感。
54.權利要求51-53任一項的方法，其中所述對象是禽類。
55.權利要求54的方法，其中所述對象是家禽。
56.權利要求55的方法，其中所述對象是雞、火雞或鴨。
57.降低細胞中一或多種甲型流感病毒基因表達的方法，包括給予細胞權利要求 31-40任一項的分離的和/或外源的核酸分子。
58.權利要求1-30任一項的核酸構建體，權利要求31-40任一項的分離的和/或外源 的核酸分子，權利要求41的載體和/或權利要求42或43的細胞在制備用于治療和/或預 防甲型流感病毒感染的藥物中的應用。
59.一種鑒別包含權利要求1-30任一項的核酸構建體或權利要求31-40任一項的分離 的和/或外源的核酸分子的動物的方法，所述方法包括確定得自所述動物的樣品中權利 要求1-30任一項的核酸構建體和/或權利要求31-40任一項的分離的和/或外源的核酸 分子的存在或缺失。
60.權利要求59的方法，其中所述方法包括擴增所述核酸構建體或其片段，或者所述 分離的和/或外源的核酸分子或其片段。
61.權利要求59或60的方法，其中所述方法包括將得自所述動物的樣品與探針接 觸，所述探針在嚴格條件下與所述核酸構建體和/或所述分離的和/或外源的核酸分子雜 交形成復合物，以及確定所述復合物的存在或缺失。
62.育種抗流感的非人轉基因動物的方法，所述方法包括(i)將權利要求1-30任一項的核酸構建體導入非人動物細胞， ( )選擇包含所述核酸構建體的轉基因非人動物細胞，(iii)從所述轉基因非人動物細胞再生轉基因非人動物，(iv)育種所述轉基因非人動物以產生轉基因后代，及 (ν)選擇抗流感的轉基因后代。
63.生產食品的方法，所述方法包括(i)將權利要求1-30任一項的核酸構建體導入動物細胞， ( )選擇包含所述核酸構建體的轉基因細胞，(iii)從所述轉基因細胞再生轉基因動物，(iv)育種所述轉基因動物以產生轉基因后代，及 (ν)從所述轉基因后代生產食品。
64.制備轉基因非人動物的方法，所述方法包括(i)將包含轉座子的第一核酸導入細胞中，其中所述核酸編碼雙鏈RNA分子，( )將編碼轉座酶的第二核酸導入細胞中，( )選擇在細胞基因組中包含第一核酸的轉基因細胞，(iii)從所述細胞再生轉基因非人動物，及(iv)育種所述轉基因非人動物。
65.權利要求64的方法，其中所述轉座子是Tol2轉座子，所述轉座酶是Το12轉座酶。
66.權利要求65的方法，其中所述細胞是雞原生殖細胞。
67.抗流感轉基因非人動物。
68.權利要求67的轉基因非人動物，其中所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA 分子的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相5比時，所述RNA分子降低動物細胞中甲型流感病毒復制。
69.權利要求67的轉基因非人動物，其中所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA 分子的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相 比時，所述RNA分子降低在動物細胞中感染性甲型流感病毒顆粒的產生。
70.權利要求67的轉基因非人動物，其中所述轉基因動物包含編碼包含雙鏈區(qū)的RNA 分子的核酸構建體，其中當與缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的動物細胞相 比時，所述RNA分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的動物細胞中的表達。
71.權利要求67-70任一項的轉基因非人動物，其中所述轉基因非人動物是雞，流感是 甲型流感。
72.權利要求44-49任一項的非人轉基因生物或權利要求67-71任一項的轉基因非人 動物用于育種的用途。
73.權利要求44-49任一項的非人轉基因生物或權利要求67-71任一項的轉基因非人 動物用于食品生產的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含雙鏈區(qū)的核酸分子，及編碼其的核酸構建體，它們可用于治療和/或預防流感。特別地，本發(fā)明涉及編碼雙鏈RNA分子的核酸構建體，其可以用于產生轉基因家禽，例如雞，從而它們至少對禽流感感染的易感性更低。還提供了包含雙鏈區(qū)的核酸分子，其可以用作治療劑治療和/或預防例如家禽中的禽流感。
文檔編號C12N15/113GK101918558SQ200880024796
公開日2010年12月15日 申請日期2008年5月16日 優(yōu)先權日2007年5月16日
發(fā)明者J·C·麥凱, J·W·洛溫塔爾, R·J·莫爾, S·G·蒂亞克, T·J·多蘭 申請人:Mat馬耳他先進技術有限公司;聯(lián)邦科學技術研究組織