專利名稱：通過添加含二醇的物質(zhì)調(diào)節(jié)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高酶的選擇性的方法。
背景技術(shù)：
酶活性會(huì)受到其他分子的影響，例如抑制劑會(huì)降低酶活性，而激 活劑會(huì)提高酶活性。此外，分子還可提高酶的選擇性。
WO 2005/070468公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)來催化包含合 適官能團(tuán)的化合物向肽中的摻入，其中所述官能團(tuán)之后被用作進(jìn)一步 的綴合點(diǎn)。但是，主要產(chǎn)物不能以50%以上的產(chǎn)率獲得。因此需要有 改進(jìn)酶選擇性以提高反應(yīng)經(jīng)濟(jì)性的方法。 發(fā)明概述
本發(fā)明的 一 個(gè)方面提供提高酶催化反應(yīng)的選擇性和/或產(chǎn)率的方 法，所述方法包括在選自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物 (enhancing compound)存在下進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，酶催化反應(yīng)包括第一化合物和肽之間的共 價(jià)一建形成，所述方法包括使第 一化合物與肽在酶和所述增效化合物存 在下在一個(gè)或多個(gè)步驟中發(fā)生反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供可通過該方法獲得的肽。 附圖簡(jiǎn)述


圖1示出在乙二醇(EG)存在和不存在下酶反應(yīng)的反應(yīng)曲線。
圖2顯示在乙二醇存在和不存在下獲自hGH的轉(zhuǎn)氨作用的電泳圖。
圖3示出TGase Activa WM和TGase MTG P2在乙二醇存在和不 存在下的反應(yīng)曲線。
圖4示出在10-40% v/v乙二醇存在下酶反應(yīng)的反 曲線。200880005602.9
說明書第2/31頁
圖5示出在40-70% v/v乙二醇存在下酶反應(yīng)的反應(yīng)曲線。 圖6示出不同濃度的TGaseMTGP2在乙二醇存在和不存在下的 反應(yīng)曲線。
圖7示出在乙二醇、甘油、丙二醇(propyleneglycol)或1,3丙二醇 (1,3 propanediol)存在下酶反應(yīng)的反應(yīng)曲線。
圖8示出不同濃度的TGaseMTGP2在甘油存在下的反應(yīng)曲線。 發(fā)明詳述
"轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)"(E.C.2.3.2.13)也稱蛋白質(zhì)-谷氨酰胺卞谷 氨酰轉(zhuǎn)移酶，能催化以下通式反應(yīng)
q_1Lnh2 + q'—nh2 ->q~^"^j-q' + nh3
胺接納體(acceptor)可代表含谷氨酰胺的肽，胺供體(donor)則代表 第一化合物?；蛘?，胺接納體可代表第一化合物，胺供體則代表含賴 氨酸的肽。
不同的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在例如谷氨酰胺(Gln)周圍需要什么氨基酸 殘基才能使肽成為底物方面互不相同，即取決于什么氨基酸殘基鄰近 Gln殘基，不同的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶會(huì)以不同的含Gln的肽作為底物。
有用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的實(shí)例包括微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，例如來自 以下孩￡生物茂原鏈霉菌(5Vw/7tomycas 、 肉桂鏈霉菌
(5Vre; tomyc^ cz力wamowewm)和灰肉色鏈霉菌(5Vr印tow少ces gn、eocamewm)(均乂>開于US 5,156,956,該專利通過引用并入本文)， 以及薰衣草鏈霉菌CSV"/7tomyc" /avem/w/ae)(公開于US 5,252,469，該 專利通過引用并入本文)和&^ptom_ycas /a^^mwm (JP2003199569 ，該 專利通過引用并入本文)。應(yīng)注意，以前的4侖枝鏈霉菌屬 (Streptoverticillium)的各成員現(xiàn)在納入鏈霉菌屬(Streptomyces) (Kaempfer, J.Gen.Microbiol. H2, 1831-1892 (1991))。其他有用的微生物 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已從枯草芽孢桿菌(5flc"/w (公開于US
5,731,183，該專利通過引用并入本文)和/人各種私菌(myxomycetes)分離到。有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的其他實(shí)例，是WO 96/06931 (例 如來自Ba"7/ws (y&ct^的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)和WO 96/22366中公開的那些 實(shí)例，這兩個(gè)專利通過引用并入本文。有用的非微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 包括豚鼠肝臟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，和各種海洋生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶， 例如來自牙鲆(尸agmy (公開于EP 0555649，該專利通過引用并
入本文)和太平洋牡蠣(Cmsm^ea (公開于US 5,736,356,該專
利通過引用并入本文)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
本發(fā)明基于某些分子能提高酶的選擇性的這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明 的 一個(gè)方面提供提高酶催化反應(yīng)的選擇性和/或產(chǎn)率的方法，所述方法 包括在選自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下進(jìn)行反 應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，增效化合物是乙二醇。
化合物的加入有益地幫助改進(jìn)反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性。此外，增效化合物 能使反應(yīng)混合物在儲(chǔ)存過程中不易敗壞，因?yàn)樗芊乐估鋬龊统恋恚?而且它還能使純化更加容易。
在一個(gè)實(shí)施方案中，增效化合物以20-95%的濃度范圍存在。在一 個(gè)實(shí)施方案中，增效化合物以30-70%的濃度范圍存在。
應(yīng)理解，增效化合物的濃度還要取決于酶的濃度。優(yōu)化酶的量和 增效化合物的量，這都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技能范圍內(nèi)，可例如 用因子設(shè)計(jì)來進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶催化反應(yīng)包括第一化合物和肽之間的共價(jià) 鍵形成，所述方法包括使第 一化合物與肽在酶和增效化合物存在下在 一個(gè)或多個(gè)步驟中發(fā)生反應(yīng)。
在本說明書中，詞語"肽"和"蛋白質(zhì)，，可互換使用，意在表示同一 物質(zhì)。
術(shù)語"肽"意在表示具有兩個(gè)或更多個(gè)通過肽鍵連接的氨基酸殘基 的化合物。組成性氨基酸可來自由遺傳密碼編碼的氨基酸群體，且它 們可以是不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不由遺 傳密碼編碼的天然氨基酸例如是羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通過化學(xué)合成
制備的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸D-異構(gòu)體，如D-丙氨酸 和D-亮氨酸、Aib(a-氨基異丁酸)、Abu(a-氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘 氨酸)、(3-丙氨酸、3-氨基曱基苯曱酸和鄰氨基苯曱酸。
術(shù)語"肽，，還意在包括被其他肽類、糖類、脂質(zhì)類或別的有機(jī)化合 物取代的所述化合物，以及其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被化學(xué)修飾 的化合物。該術(shù)語還意在包括連接有輔基的肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶選自轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、分選酶、蛋白酶、連 接酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖合成酶(glycosynthase)、糖肽酶、糖苷酶、酪氨 酸酶、賴氨酰氧化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
肽必須是根據(jù)本發(fā)明方法的酶的底物。例如，如果酶是轉(zhuǎn)谷氨酰 胺酶，則要求肽含有Gln或Lys殘基，特別是Gln殘基。
人們認(rèn)識(shí)到，某化合物是否是指定的酶的底物，原則上取決于反 應(yīng)條件，例如時(shí)間范圍(timeframe)。若有足夠的時(shí)間，許多通常不被 認(rèn)為是底物的化合物事實(shí)上成為底物。當(dāng)上文陳述到對(duì)于指定的酶來 說一些殘基可能是底物而其他則不是底物時(shí)，意在表示在仍能達(dá)到期 望的選擇性的程度上"其他則不是"。如果一個(gè)或多個(gè)殘基是酶的底物， 但只有當(dāng)與該酶長(zhǎng)時(shí)間接觸時(shí)才是底物，且需要保持未被綴合，則可 通過在合適時(shí)間后除去或滅活該酶來實(shí)現(xiàn)選擇性。
如果指定的肽不是酶的底物，可以插入一個(gè)或多個(gè)殘基來使該肽 成為底物。例如，可將Gln或Lys殘基特別是Gln殘基加到該肽序列， 以使該肽成為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物。原則上，這些殘基可在序列的任 何位置插入，但是優(yōu)選在這樣的位置插入，即在該位置的插入不會(huì)使 該肽的生理活性如治療活性受影響至該肽不再例如在治療干預(yù)中有 用的地步。氨基酸殘基在肽中的插入可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，如翻譯后化學(xué)修飾或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
任何作為前文所述的酶的底物的肽，都可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行 綴合，例如肽可選自但不限于酶類、肽激素類、生長(zhǎng)因子類、抗體類、
10細(xì)胞因子類、受體類、淋巴因子類和疫苗抗原類，特別值得一提的是
治療性肽類，如胰島素、胰高血糖素樣肽1 (GLP-1)、胰高血糖素樣肽 2 (GLP-2)、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、三葉因子肽(TFF)、黑皮質(zhì)素受體 調(diào)節(jié)物(modifier)和VII因子化合物。
名詞術(shù)語"綴合物"意在表示經(jīng)修飾的肽，即具有與其連接以修飾 其特性的部分(moiety)的肽。動(dòng)詞術(shù)語"綴合"意在表示將某部分連接到 某肽以》務(wù)飾該肽的特性的過程。
WO2005/070468 (該專利通過引用并入本文)公開了多種特別適用 于本發(fā)明提供的方法的肽。
適用于本發(fā)明方法的其他類別的肽或蛋白質(zhì)包括酶類。有許多酶 用于各種工業(yè)用途，特別值得一提的是水解酶(蛋白酶、脂肪酶、纖維 素酶、酯酶)、氧化還原酶(漆酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化 物歧化酶、脂氧合酶)、轉(zhuǎn)移酶和異構(gòu)酶。
其他適用于本發(fā)明方法的肽或蛋白質(zhì)包括ACTH、促腎上腺皮質(zhì) 激素釋放因子、血管緊張素、降鈣素、胰島素及其片段和類似物、胰 高血糖素、IGF-1、 IGF-2、腸胃泌素(enterogastrin)、胃泌素、四肽胃 泌素、五肽胃泌素、尿胃泌素(urogastrin)、表皮生長(zhǎng)因子、分泌素、 神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促曱狀腺素釋放激素、促生長(zhǎng)素抑制素、生長(zhǎng)激素釋 放激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、甲狀旁腺激素、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成 素、下丘腦釋》文因子、催乳素、曱狀腺刺激激素、內(nèi)啡肽、腦啡肽、 血管加壓素、催產(chǎn)素、阿片樣物質(zhì)(opiods)及其類似物、天冬酰胺酶、 精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶和核糖核酸酶。
本文所用的指涉多肽的術(shù)語"類似物"，是指其中該肽的一個(gè)或多 個(gè)氨基酸殘基已被其他氨基酸殘基取代的經(jīng)修飾肽，和/或其中一個(gè)或 多個(gè)氨基酸殘基已從該肽缺失的經(jīng)修飾肽，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基 酸殘基已向該肽添加的經(jīng)修飾肽。氨基酸殘基的這種添加或缺失，可 在肽的N末端和/或在肽的C末端進(jìn)行，或者在肽序列的內(nèi)部進(jìn)行。 所有沒有指明旋光異構(gòu)體的氨基酸都要理解為意指L-異構(gòu)體。來源，其中所述肽可以在它存在于自然界中這個(gè)意義上是"天然的"， 或者在它僅因?yàn)槿祟惛深A(yù)而存在這個(gè)意義上是"非天然的"。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一化合物包含一個(gè)或多個(gè)在構(gòu)成所述肽的 任何氨基酸殘基中不易接近的官能團(tuán)或者潛在官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，第一化合物由下式表示 H2N—D—R—X其中D代表鍵或氧； R代表接頭或4定；X包含一個(gè)或多個(gè)在構(gòu)成所述肽的任何氨基酸殘基中不易接近的 官能團(tuán)或者潛在官能團(tuán)。在這種實(shí)施方案中，X可選自或者可被活化成酮-、醛-、-NH-NH2、 -0-C(0)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-C(S)-NH-NH2 、 -NHC(0)-NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(S)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-C6H4-NH-NH2 、 -C(0)-NH-NH2 、 -0-NH2 、 -C(0)-0-NH2 、 -NH-C(0)-0-NH2 、 -NH-C(S)-0-NH2 、 C(0)-NH2、 Ar-NH2、炔、疊氮化物或腈-氧化物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一化合物選自4-(氨基曱基)苯乙酮、4-(2-氨基乙基)苯乙酮、N-(4-乙酰苯基)2-氨基乙酰胺、1-[4_(2-氨基乙氧基) 苯基]乙酮、l-[3-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、1，4-雙(氨基氧基)丁烷、3-氧雜戊烷-l,5-二氧基胺、1,8-二氨基氧基-3,6-二氧雜辛烷、1,3-雙(氨基 氧基)丙-2-醇、1,11-雙(氨基氧基)-3,6,9-三氧雜十一碳烷、1,3-二氨基-2-丙醇、1,2-雙(氨基氧基)乙烷和1，3-雙(氨基氧基)丙烷。在一個(gè)實(shí)施方案中，將反應(yīng)緩沖到6-9之間的pH。在一個(gè)實(shí)施方 案中，將反應(yīng)緩沖到7-8.6之間的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在15-45。C之間的溫度下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在20-37。C之 間的溫度下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括以下步驟(b) 任選活化潛在的官能團(tuán)；和(c) 使所述官能化的肽與包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的第二化合物在 一個(gè)或多個(gè)步驟中發(fā)生反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基 酸殘基中易接近的官能團(tuán)反應(yīng)，且其中所述第二化合物中的所述官能 團(tuán)能夠與所述第一化合物中的所述官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，使得所述官能化 肽和第二化合物之間形成共價(jià)鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二化合物由下式表示 Y—E—Z其中Y代表包含一個(gè)或多個(gè)能與X中存在的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán) 的基團(tuán)(radical)，且所述官能團(tuán)不會(huì)與所述肽中易接近的官能團(tuán)反應(yīng)； E代表接頭或鍵； Z是待與肽綴合的部分。X和Y中包含的官能團(tuán)之間的反應(yīng)會(huì)形成部分(moiety)。該部分 原則上可以屬任何類型，但由期望最終綴合肽有什么特性而定。在一 些情況中，可能需要有可在某后期階段例如通過某種酶促作用或通過 光分解斷裂的不穩(wěn)定鍵。在其他情況中，可能需要有穩(wěn)定的鍵以獲得 穩(wěn)定的綴合肽。特別值得一提的是通過胺衍生物和羰基基團(tuán)之間的反 應(yīng)形成的那類部分，如肝部分、腙部分、苯腙部分和半卡巴腙部分。在本說明書中，術(shù)語"肟部分"表示包含"肟鍵"的部分，即意在表 示式-C-N-O-所示的部分。在本說明書中，術(shù)語"腙部分"表示包含"腙鍵"的部分，即意在表 示式-C-N-N-所示的部分。在本說明書中，術(shù)語"苯腙部分"表示包含"苯腙鍵"的部分，即意 在表示下式所示的部分—C=N—N在本說明書中，術(shù)語"半卡巴腙部分"表示包含"半卡巴腙鍵"的部 分，即意在表示式-C-N-N-C(O)-N-所示的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，X和Y的官能團(tuán)選自羰基如酮基和趁基團(tuán)， 以及氨基衍生物。應(yīng)理解，如果X中包含的官能團(tuán)是羰基基團(tuán)，則Y中包含的官能 團(tuán)是胺衍生物，反之亦然。由于大多數(shù)肽中存在-NH2基團(tuán)，如果X 包含酮或醛官能團(tuán)(fimctionality),可獲得更好的選擇性。X和Y中存在的合適的一對(duì)官能團(tuán)的另一個(gè)實(shí)例，是疊氮化物衍 生物(-N3)和炔，它們能反應(yīng)形成三唑部分。合適的一對(duì)的又一個(gè)實(shí)例 是炔和腈-氧化物，它們能反應(yīng)形成異嚼唑烷部分。應(yīng)理解，X中包含的官能團(tuán)可在其與Y-E-Z反應(yīng)前必須進(jìn)行活化 這個(gè)意義上是潛在的。舉例說，X可包含在與合適的試劑反應(yīng)時(shí)被轉(zhuǎn) 化成醛或酮的部分。第一化合物和第二化合物都包含接頭，分別為R和E。這些相互 獨(dú)立的接頭可不存在或選自以下烷烴、烯烴或炔烴二價(jià)基團(tuán)(dimdical) 和雜烷烴、雜烯烴和雜炔烴二l介基團(tuán)，其中一個(gè)或多個(gè)任選取代的芳 族同素環(huán)狀(homocyclic)二價(jià)基團(tuán)或者雜環(huán)化合物的二價(jià)基團(tuán)如亞苯 基或哌啶二價(jià)基團(tuán)可插入到前述的二價(jià)基團(tuán)中。應(yīng)理解，這種接頭還 可包含被選自羥基、囟素、硝基、氰基、羧基、芳基、烷基和雜芳基 的基團(tuán)進(jìn)行的取代。術(shù)語"烷烴"意在表示飽和的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴。除另有指 明碳原子數(shù)目的外，該術(shù)語意在表示具有1-30 (包括l和30)個(gè)碳原子， 例如1-20 (包括1和20)個(gè)，例如1-10 (包括1和IO)個(gè)，如1-5 (包括1 和5)個(gè)；或者15-30 (包括15和30)個(gè)^友原子的烴。術(shù)語"烯烴，，意在表示包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的烴。除另有指明碳原子數(shù)目的外，該術(shù)語意在表示具有2-30 (包 括2和30)個(gè)碳原子，例如2-20 (包括2和20)個(gè)，例如2-10 (包括2 和10)個(gè)，如2-5(包括2和5)個(gè)；或者15-30 (包括15和30)個(gè)碳原子 的烴。術(shù)語"炔烴"意在表示包含至少一個(gè)碳-碳三鍵的直鏈、支鏈和/或 環(huán)狀的烴，且它可任選包含一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵。除另有指明碳原子 數(shù)目的外，該術(shù)語意在表示具有2-30 (包括2和30)個(gè)碳原子，例如 2-20 (包括2和20)個(gè)，例如2-10 (包括2和IO)個(gè)，如2-5 (包括2和 5)個(gè)；或者15-30 (包括15和30)個(gè)碳原子的烴。術(shù)語"雜烷烴"、"雜烯烴"和"雜炔烴"意在表示所述部分的結(jié)構(gòu)中 已插入一個(gè)或多個(gè)雜原子或基團(tuán)的如上定義的烷烴、烯烴和炔烴。雜 基團(tuán)和原子的實(shí)例包括-O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(0)r、 -C(O)-、 -C(S)-和 -N(R*)-，其中11*代表氫或Cl-C6-烷基。術(shù)語"同素環(huán)狀芳族化合物"(或基團(tuán))意在表示芳烴如苯和萘。術(shù)語"雜環(huán)化合物"意在表示包含5、 6或7個(gè)環(huán)原子，其中1、 2、 3或4個(gè)是選自N、 0和/或S的雜原子的環(huán)狀化合物。雜環(huán)芳族化合 物的實(shí)例包括噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、p比哇、異噻唑、異噁 唑、吡，定、吡。秦、嘧咬、。達(dá)，秦以及它們的部分或完全氫化的對(duì)等物 (equivalent),如味咬、他哇烷、p比咯烷、吡唂啉(pyroline)、咪哇烷、 咪哇啉、口底口秦和嗎啉o術(shù)語"囟素，，意在表示元素周期表第七主族的成員，例如F、 Cl、 Br和I。在本說明書中，術(shù)語"芳基"意在表示其中至少一個(gè)環(huán)是芳環(huán)的同 素環(huán)狀芳環(huán)基團(tuán)或稠合同素環(huán)狀環(huán)系基團(tuán)。典型的芳基基團(tuán)包括苯 基、聯(lián)苯基、萘基、四氫化萘基等。術(shù)語"基團(tuán)"或"二價(jià)基團(tuán)"意在表示已分別除去一個(gè)或兩個(gè)氫原子 的化合物。當(dāng)具體指明時(shí)，基團(tuán)還可表示通過從化合物正式去除大的 原子團(tuán)如羥基形成的部分。本文中單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"雜芳基"，是指具有例如5-7個(gè)環(huán) 原子的芳環(huán)基團(tuán)，或者指具有例如7-18個(gè)環(huán)原子的稠合芳族環(huán)系基 團(tuán)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳環(huán)且含有一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧或硫的雜原 子作為環(huán)原子，其中N-氧化物和一氧化硫和二氧化硫是可允許的雜芳 族取代。實(shí)例包括呋喃基、噻吩基(thienyl)、噻吩基(thiophenyl)、吡咯 基、咪唑基、p比峻基、三唑基、四唑基、噻唑基、嗨唑基、異嚼唑基、 噁二唑基、噻二唑基、異噻唑基、吡啶基、噠。秦基、吡嗪基、嘧啶基、 喹啉基、異喹啉基、苯并呋喃基、苯丙噻吩基、吲咮基和吲唑基等。E和R都代表鍵或接頭，在本說明書中術(shù)語"接頭"意在表示充當(dāng) 將Y與Z隔開和將X與NH2-D-隔開的手段的部分。接頭E和R的一 個(gè)功能可以是提供肽和綴合部分Z之間的連鍵的足夠柔性。E和R的 典型實(shí)例包括直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的Cwo亞烷基、CwQ亞烯基、C2-10 亞炔基、C2—u)亞雜烷基、Cw()亞雜烯基、Cw()亞雜炔基，其中可插入 一個(gè)或多個(gè)同素環(huán)狀芳族化合物二價(jià)基團(tuán)或雜環(huán)化合物二價(jià)基團(tuán)。WO 2005/070468 (該專利通過引用并入本文)公開了多種特別適 用于本發(fā)明提供的方法的鍵和接頭。Z的具體實(shí)例包括包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記如熒光標(biāo)志的基團(tuán)，如 熒光素基團(tuán)、羅丹明基團(tuán)、TexasRed⑧基團(tuán)和藻膽蛋白基團(tuán)；酶底物， 如對(duì)硝基苯酚乙酸酯(p-nitrophenol acetate)基團(tuán)；和放射性同位素，如 Cu-64、 Ga67、 Ga-68、 Zr-89、 Ru畫97、 Tc-99、 Rh-105、 Pd-109、 In畫lll、 1-123、 1-125、 1-131、 Re-186、 Re-188、 Au-198、 Pb-203、 At-211、 Pb畫212 和Bi-212;有機(jī)部分，如PEG或mPEG基團(tuán)及其氨基衍生物(包括直 鏈和支鏈PEG和mPEG基團(tuán))；直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的Cw2烷基、C"2烯基、Cw2炔基、Q.22雜烷基、C2.22雜烯基、02.22雜炔基，其中可插入一個(gè)或多個(gè)同素環(huán)狀芳族化合物二價(jià)基團(tuán)或雜環(huán)化合物二價(jià)基團(tuán)，且其中所述d-22或C2-22基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、 卣素、羧基雜芳基和芳基的取代基取代，其中所述芳基或雜芳基可任選被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、卣素和羧基的取代基取代；類固醇基團(tuán)；16脂質(zhì)基團(tuán)；多糖基團(tuán)，例如葡聚糖；聚酰胺基團(tuán)，例如聚氨基酸基團(tuán)； PVP基團(tuán)；PVA基團(tuán)；聚(l畫3-二氧雜環(huán)戊烷(dioxalane));聚(l，3,6-三 嗯烷)；乙烯/馬來酸肝聚合物；Cibacron染料，如Cibacron Blue 3GA; 指明長(zhǎng)度的聚酰胺鏈，如WO 00/12587中所公開(該專利通過引用并 入本文)；和幾烷基淀粉，如羥乙基淀粉，如WO 03/074087和WO 02/80979中所公開(該兩個(gè)專利通過引用并入本文)。術(shù)語"PEG"意在表示分子量在大約100到大約1,000,000 Da之間 的聚乙二醇，包括其類似物在內(nèi)，其中例如末端OH基團(tuán)已被烷氧基 如甲氧基、乙氧基或丙氧基替代。具體的說，其中末端OH基團(tuán)已被 曱氧基替代的PEG稱為mPEG。術(shù)語"mPEG"(或者更正確的說"mPEG基")意指以下結(jié)構(gòu)的多分散 或單分散基團(tuán)其中m為大于1的整數(shù)。因此，其中m為90的mPEG其分子量為3991 Da,即大約4kDa。 同樣，平均分子量為20kDa的mPEG其平均m值為454。由于生產(chǎn) mPEG的工藝，這些分子往往具有分子量分布。這種分布由多分散性 指數(shù)描述。本文所用的術(shù)語"多分散性指數(shù)"意指聚合物化學(xué)領(lǐng)域所知的重均 分子量與數(shù)均分子量之比(參見例如"Polymer Synthesis and Characterization", J.A. Nairn,美國猶他州大學(xué)，2003)。例如，當(dāng)提及20kDaPEG或20kDamPEG時(shí)，意在表示多分散 性指數(shù)在1.06以下、如1.05以下、如1.04以下、如1.03以下、如1.02-1.03 之間的化合物(或者事實(shí)上為各化合物的混合物)。特別值得一提的是d?！?。烷基如ds烷基和Cn烷 (尤其是直鏈 d5烷基和C17烷基)衍生物和下式的苯曱酮衍生物o特別值得一提的是包含如下所示的cibacronyl基團(tuán)的Z:SO。H SO，H與才艮據(jù)本發(fā)明的肽綴合的PEG或mPEG可以具任何分子量。具 體的說，分子量可以在500-1000,000 Da之間，如500-500,000 Da之 間，如500-100,000 Da之間,如500-60,000 Da之間，如1000-40,000 Da 之間，如5000-40,000 Da之間。具體的說，可4吏用分子量在 10，000-40,000 Da之間、如20,000 Da-40,000 Da之間、如20,000-30,000 Da之間或30,000-40，000 Da之間的PEG。特別值得一提的是分子量為 10,000、 20,000、 30,000或40,000 Da的PEG或mPEG。z可以為支鏈，使得z包含超過一個(gè)上述標(biāo)記或基團(tuán)。例如， mPEG40K通常是作為兩臂各包含mPEG20k的支鏈mPEG來得到。在一個(gè)實(shí)施方案中，Z包含一個(gè)或多個(gè)已知能結(jié)合血漿蛋白質(zhì)如 清蛋白的部分。某化合物結(jié)合清蛋白的能力可如J.Med.Chem， 41, 1986-1992 (2000)中所述進(jìn)行測(cè)定，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。在本說 明書中，某化合物如果Ru/Da在0.05以上、如0.10以上、如0.12以 上乃至0.15以上，則定義為與清蛋白結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合部分是肽，如包含不到 40個(gè)氨基酸殘基的肽。J. Biol Chem. 277(38), 35035-35043 (2002)中公 開了多種作為清蛋白結(jié)合部分的小肽，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。WO2005/070468 (該專利通過引用并入本文)公開了多種特別適用 于本發(fā)明提供的方法的式Y(jié)-E-Z化合物。反應(yīng)后，可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)將肽分離和純化。因此，在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可按本發(fā)明方法獲得的肽。肽還可轉(zhuǎn)化成 藥物可接受鹽或前體藥物，如果適當(dāng)?shù)脑?。具體的說，所述方法還包 括將所得的綴合肽配制成藥物組合物的步驟。在本說明書中，術(shù)語"藥物可接受鹽"意在表示對(duì)患者無害的鹽。 這種鹽包括藥物可接受的酸加成鹽、藥物可接受的金屬鹽、銨和烷基 化銨鹽。酸力口成鹽包括無機(jī)酸及有機(jī)酸的鹽。合適的無機(jī)酸的代表性 實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合適的有機(jī) 酸的代表性實(shí)例包括曱酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯曱 酸、肉桂酸、4科蒙酸、富馬酸、乙醇酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、丙 二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、甲磺酸、 乙磺酸、酒石酸、抗壞血酸、樸姆酸、雙亞曱基水楊酸(bismethylene salicylic acid)、乙二磺酸、葡糖酸、檸康酸、天冬氨酸、硬脂酸、椋 櫚酸、EDTA、乙醇酸、對(duì)氨基苯曱酸、谷氨酸、苯磺酸、對(duì)曱苯磺 酸等。藥物可接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸加成鹽的更多實(shí)例，包括J. Pharm. Sci. 1977,^,2(通過引用并入本文)中列舉的藥物可接受鹽。金屬鹽的 實(shí)例包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽等。銨和烷基化銨鹽的實(shí)例包括銨 鹽、曱基銨鹽、二甲基銨鹽、三曱基銨鹽、乙基銨鹽、羥乙基銨鹽、 二乙基銨鹽、丁基銨鹽、四曱基銨鹽等。本文所用的術(shù)語"前體藥物"意在表示這樣的化合物，它不一定具 有治療活性，但在給予時(shí)會(huì)被體內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)轉(zhuǎn)化成治療活性化合 物。通常，這種反應(yīng)包括水解(例如通過酯酶進(jìn)行)或氧化。前體藥物 的實(shí)例包括可生物水解的酰胺和可生物水解的酯，亦涵蓋a)其中這種 前體藥物中的可生物降解官能團(tuán)涵蓋在根據(jù)本發(fā)明的化合物中的化 合物，和b)可在指定官能團(tuán)處發(fā)生生物氧化或還原以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明 的藥物物質(zhì)的化合物。這些官能團(tuán)的實(shí)例包括1,4-二氫吡啶、N-烷基羰基-l,4-二氫吡啶、1,4-環(huán)己二烯、叔丁基等。本文所用的術(shù)語"可生物水解的酯"是藥物物質(zhì)(這里指的是根據(jù) 本發(fā)明的化合物)的酯，其a) 不會(huì)干擾母體物質(zhì)的生物活性，但給該物質(zhì)賦予有利的體內(nèi)特 性，如作用的持續(xù)時(shí)間、作用的啟動(dòng)等；或者b) 不具有生物活性，但可容易地被受治療者體內(nèi)轉(zhuǎn)化成生物活性 要素物質(zhì)(principle)。優(yōu)點(diǎn)是例如溶解性提高，或者可生物降解的酯口服后/人腸道吸收 而在血漿中轉(zhuǎn)化成根據(jù)本發(fā)明的化合物。許多這類實(shí)例是本領(lǐng)域知道 的，舉例說包括低級(jí)烷基酯(例如Cl-C4)、低級(jí)酰氧基烷基酯、低級(jí) 烷氧基酰氧基烷基酯、烷氧基酰氧基酯、烷基?；被榛ズ湍憠A 酯。本文所用的術(shù)語"可生物水解的酰胺"是藥物物質(zhì)(這里指的是根 據(jù)本發(fā)明的化合物)的酰胺，其a) 不會(huì)干擾母體物質(zhì)的生物活性，但給該物質(zhì)賦予有利的體內(nèi)特 性，如作用的持續(xù)時(shí)間、作用的啟動(dòng)等；或者b) 不具有生物活性，但可容易地被受治療者體內(nèi)轉(zhuǎn)化成生物活性 要素物質(zhì)(principle)。優(yōu)點(diǎn)是例如溶解性提高，或者可生物降解的酰胺口服后從腸道吸 收而在血漿中轉(zhuǎn)化成根據(jù)本發(fā)明的化合物。按本發(fā)明方法進(jìn)行綴合的治療性肽可在治療中使用，這也是本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的綴合肽 在診斷中的用途。胰島素被用來治療或預(yù)防糖尿病，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因 此才是供治療I型或II型糖尿病的方法，所述方法包括將治療有效量的 根據(jù)本發(fā)明的胰島素或者胰島素化合物綴合物給予有需要的受治療 者。術(shù)語"胰島素化合物，，包含具有胰島素活性的胰島素類似物和衍生 物。GLP-1可用于治療高血糖、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂異常、(3-細(xì)胞凋亡、p-細(xì)胞缺乏、炎性腸道綜合征、消化不良、認(rèn)知障礙(例如認(rèn)知增強(qiáng))、神 經(jīng)保護(hù)、動(dòng)力永粥樣^更化、冠心病和其4也心血管疾病。本文所用的名詞和動(dòng)詞"治療"意指為抗擊某種狀況如疾病(disease)或病恙(disorder)的目的對(duì)患者進(jìn)行的管理和照料。該術(shù)語意 在包括對(duì)患者所患特定病癥(condition)的全套治療，如給予活性化合物 以減輕癥狀或并發(fā)癥，延遲疾病、病恙或病癥的進(jìn)展，減輕或緩解癥 狀和并發(fā)癥，和/或治愈或消除疾病、病恙或病癥。待治療的患者可以 是哺乳動(dòng)物，特別是人，但也可包括動(dòng)物，如狗、貓、牛、綿羊和豬。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供治療所述疾病的方法，該方 法包括將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的GLP-1或GLP-1化合物綴合物給 予有需要的受治療者。術(shù)語"GLP-1化合物，，包含具有GLP-1活性的 GLP-1類似物和衍生物。GLP-2可用于治療導(dǎo)致營養(yǎng)物吸收不良的腸衰竭，具體的說， GLP-2可用于治療小腸綜合征、炎性腸道綜合征、節(jié)段性回腸炎、大 腸炎(包括膠原大腸炎、放射性大腸炎)、放射后萎縮(post radiation atrophy)、非熱帶(麩質(zhì)不耐受)和熱帶性口炎性腹瀉、血管阻塞或創(chuàng)傷 后的組織損傷、旅行者腹瀉(tourist diarrhoea)、脫水、菌血癥、膿血癥、 神經(jīng)性食欲缺乏、化療后的組織損傷、早產(chǎn)兒、硬皮病、胃炎(包括萎 縮性胃炎、竇切除術(shù)后萎縮性胃炎和幽門螺旋桿菌胃炎)、潰瘍、腸炎、 盲腸(cul-de-sac)、淋巴管阻塞、血管病和移植物抗宿主病、手術(shù)后痊 愈、放射后萎縮和化療以及骨質(zhì)疏松癥。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供治療上述疾病的方法，該方法包 括將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的GLP-2或GLP-2化合物綴合物給予有 需要的受治療者。術(shù)語"GLP-2化合物"包含具有GLP-2活性的GLP-2 類似物和書f生物。生長(zhǎng)激素可用于治療生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD); Turner綜合征；21Prader-Willi綜合征(PWS); Noonan綜合征；Down綜合征；慢性腎??； 青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；嚢性纖維變性；接受HAART治療的兒童的 HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡短小兒童(short children born short for gestational age)(SGA);除SGA外身材短小伴極低出生體重 (VLBW)兒重(short stature in children born with very low birth weight (VLBW) but SGA);骨骼發(fā)育異常；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全； 特發(fā)性身材矮小(ISS);成人GHD;長(zhǎng)骨如脛骨、腓骨、大腿骨、肱 骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨(matacarpea)、跖骨(matatarsea)和指趾的 骨折；松質(zhì)骨如頭骨、手基部(baseofhand)和腳基部(baseoffood)的骨 折；在例如手、膝或肩中進(jìn)行腱或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行了或正進(jìn) 行手術(shù)骨分離成骨的患者；進(jìn)行了髖或盤(discus)置換、半月板修復(fù)、 脊柱融合或假體固定的患者，例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中；體 內(nèi)固定了骨合成材料如釘子、螺絲和板的患者；骨折不能愈合或愈合 不佳的患者；骨切開術(shù)后的患者，例如從脛骨或大腳趾切開；移植物 植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝蓋關(guān)節(jié)軟骨變性；Turner綜合 征患者中的骨質(zhì)疏松癥；男人中的骨質(zhì)疏松癥；長(zhǎng)期透析的成人患者 (APCD); APCD中的營養(yǎng)不良相關(guān)心血管疾?。籄PCD中惡病質(zhì)的逆 轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD中的慢性阻塞性肺疾病(abstractive pulmonal disease); APCD中的HIV; APCD老年患者(elderly with APCD); APCD中的慢性肝??；APCD中的疲勞綜合征；節(jié)段性回腸 炎；肝功能受損；HIV感染的雄性；短腸綜合征；中心性肥胖；HIV 相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS);雄性不育癥；重大選擇性外科手術(shù) (major elective surgery)、酒精/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；衰老； 體弱老人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷損害的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛； 記憶障礙；抑郁；創(chuàng)傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下腔出血；極低出生體重； 代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素肌?。换蛘邇和刑瞧べ|(zhì)激素治療所致的身 材矮小。生長(zhǎng)激素還已用于加速肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口的痊愈；加速或改善向受損組織的血液流動(dòng)；或者降低受損組織中的感染率；或者 降低受損組織中的感染率；所述方法包括將治療有效量的本文所定義 治療性肽給予有需要的患者。本發(fā)明因此提供治療這些病恙、疾病或狀態(tài)的方法，該方法包括 將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素化合物綴合物給 予有需要的患者。術(shù)語"生長(zhǎng)激素化合物"包含具有生長(zhǎng)激素活性的生 長(zhǎng)激素類似物和衍生物。細(xì)胞因子與許多涉及免疫系統(tǒng)的疾病的病因有關(guān)。尤其提到的 是，IL-20可能涉及牛皮癬及其治療，IL-21涉及癌癥而可構(gòu)成對(duì)癌癥 的治療。本發(fā)明因此提供治療這些病恙、疾病或狀態(tài)的方法，該方法包括 給予治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-20或IL-20化合物綴合物。術(shù)語 "IL-20化合物"包含具有IL-20活性的IL-20類似物和衍生物。TTF肽可用來提高受治療者中黏液層的粘度，用來減少唾液的分 泌，例如當(dāng)唾液分泌增加是由輻射療法、抗膽堿能藥物治療或Sj6gren 綜合征引起時(shí)，用來治療過敏性鼻炎、創(chuàng)傷繼發(fā)的應(yīng)激誘導(dǎo)胃潰瘍、 休克、大手術(shù)、腎病或肝病、用NSAID(如阿司匹林)、類固醇或酒精 進(jìn)行的治療。TTF肽還可用來治療節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、角 膜結(jié)膜炎、慢性膀胱感染、腸膀胱炎(intestinalcystitis)、乳頭狀瘤和膀 胱癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供治療上述疾病或狀態(tài)的方 法，該方法包括將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的TTF綴合物或TTF化 合物綴合物給予有需要的受治療患者。術(shù)語"TTF化合物"包含具有 TTF活性的TTF類似物和書f生物。黑皮質(zhì)素受體調(diào)節(jié)物特別是黑皮質(zhì)素4受體激動(dòng)劑已被用于治療 和預(yù)防肥胖癥和相關(guān)疾病。黑皮質(zhì)素4受體激動(dòng)劑還已被用于治療選 自以下的疾病動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、II型糖尿病、葡萄 糖耐量降低(IGT)、血脂異常、冠心病、膽嚢病、膽石、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥、性功能障礙和過早死亡風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供治療上述疾病或狀態(tài)的方 法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明黑皮質(zhì)素4受體激動(dòng)劑綴合物 或黑皮質(zhì)素4受體激動(dòng)劑化合物綴合物給予有需要的受治療者。術(shù)語"黑皮質(zhì)素4受體"包含具有黑皮質(zhì)素4受體活性的黑皮質(zhì)素4受體類 似物和書f生物。VII因子化合物已被用于治療與凝血有關(guān)的疾病，特別是生物活 性VII因子化合物已被用于治療血友病患者、體內(nèi)有VIII因子和IX 因子的抑制劑的血友病患者、血小板減少癥患者、血小板病如 Glanzmann血小板機(jī)能不全血小板釋放缺陷和貯庫缺陷(storage pool defect)的患者、vonWillebrand病患者、有肝病和與創(chuàng)傷或手術(shù)相關(guān)的 出血問題的患者。生物活性VII因子化合物已被用于治療處于高凝狀 態(tài)(hypercoagluablestate)的患者，例如有膿血癥、深靜脈血^全的患者， 處于心肌感染或血栓性中風(fēng)、肺栓塞的危險(xiǎn)中的患者，急性冠狀動(dòng)脈 綜合征患者，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈強(qiáng)心治療、防止接受血管成形術(shù)后出現(xiàn)心 臟事件和再狹窄的患者，外周血管疾病和急性呼吸窘迫綜合征患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供治療上述疾病或狀態(tài)的方 法，該方法包括將治療有效量的4艮據(jù)本發(fā)明的VII因子綴合物或VII 因子化合物綴合物給予有需要的受治療者。術(shù)語"VII因子化合物"包 含具有VII因子活性的VII因子類似物和衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如上所述的按本發(fā)明方法綴合的 治療性肽在制造用于治療上述疾病或狀態(tài)的藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含如上所述的按本發(fā)明方法綴合的治 療性肽、用于治療如上所述的疾病、病恙或病癥的藥物組合物。許多疾病是在治療中用超過一種的同時(shí)給予或依序給予的藥物 進(jìn)行治療。因此，將本發(fā)明的各種肽綴合物互相組合在治療方法中用 來治療上述疾病之一，或者作為其他通常用于治療所述疾病的確立療 法的補(bǔ)充，或者與這些確立療法聯(lián)用，這都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。以的治療活性化合物進(jìn)行組合，用于制造所述疾病的藥物，這也落入本 發(fā)明的范圍內(nèi)。另 一個(gè)目的是提供包含本發(fā)明的綴合肽如綴合生長(zhǎng)激素(GH)的 藥物組合物，所述綴合肽以10-15 mg/ml-200mg/ml、如10-10 mg/ml-5 mg/ml的濃度存在，其中所述組合物的pH為2.0-10.0。該組合物還可 包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、張度劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是含水組合物，即包含 水的組合物。這種組合物通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí) 施方案中，藥物組合物是含水溶液。術(shù)語"含水組合物"定義為包含至 少50 % w/w的水的組合物。同樣，術(shù)語"含水溶液"定義為包含至少 50 % w/w的水的溶液，術(shù)語"含水懸浮液"定義為包含至少50 % w/w 的水的懸浮液。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是冷凍干燥組合物，醫(yī)生或患者 在臨用前向其中加入溶劑和/或稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是不用先溶解就可使用的干燥組 合物(例如冷凍干燥或噴霧干燥)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含肽綴合物如GH綴合物和緩 沖劑的含水溶液的藥物組合物，其中所述肽綴合物如GH綴合物以 0.1-100 mg/ml或以上的濃度存在，且其中所述組合物的pH為約2.0 至約10.0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的pH選自以下pH值2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2,6、2.7、2.8、 2.9、 3.0、 3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、 4.3、 4.4、 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5,4、5.5、5.6、 5.7、 5.8、 5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、 7.1、 7.2、 7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8,2、8.3、8.4、 8.5、 8.6、 8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7,,9,8、 9,9和10.0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬 酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫 鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)氨基曱烷、二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、三(羥曱基)曱基甘氨酸(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、 富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或者它們的混合物。這些具體的緩沖劑的 每一個(gè)都構(gòu)成本發(fā)明的可供選4奪的實(shí)施方案。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含藥物可接受的防腐 劑。防腐劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見， 參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥 科學(xué)與實(shí)踐)，第20版，2000。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含等滲劑。等滲劑在藥 物組合物中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)與實(shí)踐)，第 20版，2000。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含螯合劑。螯合劑在藥 物組合物中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓:制藥科學(xué)與實(shí)踐)，第 20版，2000。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥 物組合物中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓:制藥科學(xué)與實(shí)踐)，第 20版，2000。更具體的說，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其治 療活性成分包括在液體藥物組合物中保存過程中可能會(huì)顯示聚集體 形成(aggregate formation)的蛋白質(zhì)。所謂"聚集體形成"意指蛋白質(zhì)分從溶液中沉淀出來的大的可見聚集體。所謂"保存過程中"意指液體藥 物組合物或組合物一旦制備出來，并不立即給予受治療者。相反，在制備后以液體形式、冷凍狀態(tài)或干燥形式包裝進(jìn)行保存，干燥形式是 供以后復(fù)溶成適合給予受治療者的液體形式或其他形式。術(shù)語"穩(wěn)定化的組合物"是指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高或 者物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的組合物。 一般來說，在有效期到期前，組 合物必須在使用和保存過程中穩(wěn)定(遵循推薦的使用和保存條件)。本文所用的蛋白質(zhì)組合物的"物理穩(wěn)定性"這個(gè)術(shù)語，是指蛋白質(zhì) 因?yàn)楸┞队跓?機(jī)械脅迫和/或與去穩(wěn)定性界面和表面如疏水表面和界 面發(fā)生相互作用，而形成蛋白質(zhì)的生物失活和/或不可溶的聚集體的傾 向。本文所用的蛋白質(zhì)組合物的"化學(xué)穩(wěn)定性"這個(gè)術(shù)語，是指蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)中的會(huì)導(dǎo)致形成化學(xué)降解產(chǎn)物的化學(xué)共價(jià)變化，這些化學(xué)降解產(chǎn) 物與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比，具有潛在減低的生物效價(jià)和/或潛在增加的 免疫原性特性。取決于天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)及蛋白質(zhì)所暴露的環(huán) 境，可形成各種不同的化學(xué)降解產(chǎn)物。所謂"干燥形式"是指液體藥物組合物或組合物是通過冷凍干燥(即凍干法，參見例如Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. M:48-59)、噴霧干燥(參見Masters (1991), Spray-Drying Hand-book (第 5版,Longman Scientific and Technical, Essez， U.K.),第491-676頁； Broadhead W a/. (1992) Drug Deve.Ind. Pharm. Jl:l 169-1206;和 Mumenthaler a o/. (1994) Pharm. Res. 11:12-20)或者空氣干燥 (Carpenter和Crowe (1988) Cryobiology 21:459-470;和Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)進(jìn)行干燥的。蛋白質(zhì)在液體藥物組合物的保存過程中的聚集體形成，會(huì)不利地 影響該蛋白質(zhì)的生物活性，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效的損失。此外， 聚集體形成還可《1起其他問題，例如當(dāng)用輸注系統(tǒng)給予含蛋白質(zhì)的藥 物組合物時(shí)管子、膜或泵的堵塞。本發(fā)明的藥物組合物還可進(jìn)一步包含一定量的足以降低蛋白質(zhì) 在組合物保存過程中的聚集體形成的氨基酸堿(amino acidbase)。所謂"氨基酸堿"意指某種氨基酸或者幾種氨基酸的組合，其中任何給定氨 基酸以其游離堿形式或以其鹽形式存在。在使用幾種氨基酸的組合的 情況中，所有的氨基酸都可以它們的游離堿形式存在，所有的都可以 它們的鹽形式存在，或者有一些可以它們的游離^5威形式存在，而其他 的則以它們的鹽形式存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明組合 物的氨基酸是具有帶電荷側(cè)鏈的那些氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、天 冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、 異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸和它們的混合物)的任何立體異 構(gòu)體(即L或D異構(gòu)體或者它們的混合物)，或者這些立體異構(gòu)體的組 合，或者甘氨酸，或者有機(jī)堿如但不限于咪唑，可在本發(fā)明的藥物組 合物中存在，只要該特定氨基酸或有機(jī)堿以其游離堿形式或其鹽形式 存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用氨基酸的L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物還可用這些氨基酸的類似物配制。所謂"氨基酸類似物，，是指天然氨基酸的能帶來如下期望效果的衍生物降低蛋白質(zhì)在本發(fā)明液體藥物組合物保存過程中的聚集體形成。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、烏氨酸和N-—乙基L-精氨酸，合適的曱硫氨酸 類似物包括乙硫氨酸(ethionine)和丁疏氨酸(buthionine)，合適的半胱氨 酸類似物包括S-曱基-L半胱氨酸。如同其他氨基酸一樣，氨基酸類似 物也是以它們的游離堿形式或它們的鹽形式摻入到組合物中。在本發(fā) 明的又一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸或氨基酸類似物以足以防止或延遲蛋 白質(zhì)的聚集的濃度使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)作為治療劑的蛋白質(zhì)是包含至少 一個(gè)易于發(fā)生曱疏氨酸殘基向曱硫氨酸亞砜的氧化的曱硫氨酸殘基 的蛋白質(zhì)時(shí)，可加入甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸類似物)來 抑制這一氧化。所謂"抑制"意指隨時(shí)間的推移使曱硫氨酸氧化種類的 積累最小。抑制曱硫氨酸氧化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)更多地保持其正確分子形 式。可使用曱硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(L或D異構(gòu)體)或者它們的任 何組合。要加入的量應(yīng)是這樣的量，它足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化，28使得曱硫氨酸亞砜的量為監(jiān)管機(jī)構(gòu)所接受。通常，這意味著組合物含有不超過約10%至約30%甲硫氨酸亞砜。 一般來說，這可這樣獲得 加入甲硫氨酸，使得所加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基之比在約1:1 至約1000:1、如10:1至約100:1的范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含選自高分子聚合物或 低分子化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑選自 聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/ 羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、 HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、環(huán) 糊精、含硫物質(zhì)如一硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇和不同 的鹽(例如氯化鈉)。這些具體的穩(wěn)定劑的每一個(gè)都構(gòu)成本發(fā)明的可供 選擇的實(shí)施方案。藥物組合物還可包含能進(jìn)一步提高其中的治療活性蛋白質(zhì)的穩(wěn) 定性的另外穩(wěn)定劑。對(duì)本發(fā)明特別有意義的穩(wěn)定劑，包括但不限于能 保護(hù)蛋白質(zhì)免于發(fā)生曱硫氨酸氧化的曱硫氨酸和EDTA,和能保護(hù)蛋 白質(zhì)免于發(fā)生冷凍-解凍或機(jī)械剪切所致的聚集的非離子型表面活性 劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含表面活性劑。表面活 性劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥牙牛學(xué)與 實(shí)踐)，第20版，2000。有可能其他成分也可存在于本發(fā)明的藥物組合物中。這種額外成 分可包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、增量劑(bulking agent)、張度調(diào) 節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、含油介質(zhì)、蛋白質(zhì)(例如人血清清蛋白、明 膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘 氨酸、賴氨酸和組氨酸)。這些額外成分當(dāng)然不應(yīng)不利影響本發(fā)明藥物 組合物的總體穩(wěn)定性。含有根據(jù)本發(fā)明的肽綴合物如GH綴合物的藥物組合物，可在幾 個(gè)部位給予需要這種治療的患者，例如在局部部位，如皮膚和黏膜部位；在省略吸收的部位，如在動(dòng)脈中、在靜脈中、在心臟中給予；和在涉及吸收的部位，如在皮膚中、在皮膚下、在肌肉中或在腹部給予。 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給予可通過幾個(gè)給予途徑來進(jìn)行，例 如口服、直腸、鼻內(nèi)、肺部、局部(包括口腔和舌下)、透皮、池內(nèi)(intracistemal)、腹膜內(nèi)、陰道和胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、靜 脈內(nèi)和真皮內(nèi))途徑。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，優(yōu)選的途徑要取決于待治療的受治療 者的一般狀況和年齡，待治療的病癥的性質(zhì)和所選擇的活性成分。本發(fā)明的組合物可以以幾種劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、 乳劑、微乳劑、潤(rùn)濕劑、泡沫劑、油膏劑、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、 片劑、包衣片劑、洗劑、膠嚢劑(例如硬明膠膠嚢和軟明膠膠嚢)、栓 劑、直腸膠嚢、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣溶膠劑、吸入劑、 滴眼劑、眼用軟膏劑、眼用洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏劑、 注射溶液、原位轉(zhuǎn)化溶液(例如原位膠凝、原位固化、原位沉淀、原位 結(jié)晶化)、輸注溶液和植入物來給予。本發(fā)明的組合物還可混合在或連接到(例如通過共^介、疏水和靜電 相互作用)藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和先進(jìn)(advanced)藥物遞送系統(tǒng)， 以進(jìn)一步提高GH綴合物的穩(wěn)定性，提高生物利用度，提高溶解度， 降低不良反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的時(shí)間療法(chronotherapy), 提高患者依從性或者前述各項(xiàng)的任何組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和先 進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于聚合物，例如纖維素和^f汙生物、 多糖如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚乙烯醇、丙烯酸和曱基丙 烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及它們的嵌段共聚物、聚乙二醇；載 體蛋白，例如清蛋白；凝膠，例如熱膠凝系統(tǒng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的嵌段共聚系統(tǒng)；膠束；脂質(zhì)體；微球體；納米顆粒；液晶及其分 散體；L2相及其*體，脂質(zhì)-水系統(tǒng)中的相行為領(lǐng)域的技術(shù)人員公 知；聚合膠束；復(fù)合乳劑；自乳化；自微乳化；環(huán)糊精及其衍生物； 和樹狀聚體。本發(fā)明的組合物適用于固體、半固體、粉末和溶液的組合物，用來例如使用計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器和噴霧器進(jìn)行肽綴合物如 GH綴合物的肺部給予，所述各種器具的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的組合物特別適用于控制釋放、持續(xù)釋放、延長(zhǎng)釋放、延 遲釋放和緩慢釋放藥物遞送系統(tǒng)的組合物。更具體的說但不局限于此 的是，組合物適用于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的胃腸外控制釋放和持續(xù)釋 放系統(tǒng)的組合物(這兩個(gè)系統(tǒng)都能導(dǎo)致給予次數(shù)減少許多倍)，為本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知。甚至更優(yōu)選的是皮下給予的控制釋放和持續(xù)釋放系 統(tǒng)。有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的實(shí)例有水凝膠、含油凝膠、液晶、 聚合膠束、微球體、納米顆粒，舉出這些實(shí)例并不意在限制本發(fā)明的 范圍。制造適用于本發(fā)明組合物的控制釋放系統(tǒng)的方法，包括但不限于 結(jié)晶、縮合、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓均質(zhì)化、包 嚢、噴霧干燥、微包嚢、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球體、擠出和超臨界流體過程。 一般參考Handbook of Pharmaceutical ControlledRelease (Wise, D丄.(編輯).Marcel Dekker, New York, 2000)和Drug andthe Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Composition and Delivery(MacNally， E丄(編輯).Marcel Dekker, New York, 2000)。胃腸外給予可憑借注射器(任選為筆式注射器)通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來進(jìn)行。或者，胃腸外給予可憑借輸注泵進(jìn)行。 又一個(gè)選項(xiàng)是這樣的組合物，其可為溶液劑或混懸劑，供以鼻腔或肺部噴霧劑的形式給予肽綴合物如GH綴合物。作為還又一個(gè)選項(xiàng)，含 有本發(fā)明肽綴合物如GH綴合物的藥物組合物，也可適用于透皮給予， 例如通過無針注射給予或者從貼劑(任選離子電滲貼劑)給予，或者透 黏膜給予例如口腔給予。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含綴合物的藥物組合物能穩(wěn)定使 用超過6個(gè)星期和穩(wěn)定儲(chǔ)存超過三年。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含綴合物的藥物組合物能穩(wěn)定使 用超過4個(gè)星期和穩(wěn)定儲(chǔ)存超過三年。31在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含綴合物的藥物組合物能穩(wěn)定使 用超過6個(gè)星期和穩(wěn)定儲(chǔ)存超過兩年。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含綴合物的藥物組合物能穩(wěn)定使 用超過兩個(gè)星期和穩(wěn)定儲(chǔ)存超過兩年。綴合肽或其組合物通常要以能達(dá)到預(yù)定結(jié)果的有效量使用，例如 以能有效治療或預(yù)防所治療的特定疾病的量使用?；衔锟蛇M(jìn)行治療 給予，以實(shí)現(xiàn)治療益處。所謂治療益處是指所治療的潛在病恙的根除 或改善，和/或一個(gè)或多個(gè)與潛在病恙有關(guān)的系統(tǒng)的根除或改善。治療 益處還包括停止或減慢疾病的進(jìn)展，不管是否實(shí)現(xiàn)了改善。精確劑量要取決于給藥的頻率和方式，所治療的受治療者的性 別、年齡、體重和一般狀況，所治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及要 治療的任何伴隨疾病和本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他因素。應(yīng)認(rèn)識(shí) 到，適當(dāng)劑量的確定可采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，通過構(gòu)造數(shù)值矩陣并測(cè)試該矩 陣中的不同點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)，這完全在訓(xùn)練有素的醫(yī)生或獸醫(yī)的普通技能范圍內(nèi)。當(dāng)將綴合肽或其藥物可接受鹽、溶劑合物或前體藥物，與對(duì)同一 疾病狀態(tài)有活性的第二治療劑進(jìn)行組合使用時(shí)，每種化合物的劑量可 與其單獨(dú)使用時(shí)不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易確知適當(dāng)?shù)膭┝?。所有本文引述的參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利在內(nèi)， 都通過引用整體并入本文，如同每個(gè)參考文獻(xiàn)被單獨(dú)和具體指出通過 引用并入本文和在本文中完整呈現(xiàn)(至法律允許的最大程度)。所有標(biāo)題和副標(biāo)題在本文中是為了方便起見使用，不應(yīng)被解釋為 以任何方式限制本發(fā)明。本文提供的任何和全部實(shí)例或者示例性語言(例如"如")的使用， 僅意在更好地闡述本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，除非另有 聲明。本說明書中的任何語言都不應(yīng)被解釋為指出任何非要求保護(hù)的 要素對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施是必要的。任何對(duì)這些專利文獻(xiàn)的有效性、可專利性和/或可實(shí)施性的觀點(diǎn)。本發(fā)明包括可適用的法律允許的所附權(quán)利要求書中述及的主題 的所有^^改方案和等同方案。 實(shí)施例將參考以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì) 明白，可不偏離本發(fā)明的范圍，對(duì)材料和方法兩者實(shí)施許多修改方案。 縮寫TGase:(a) TGase Activa WM，日本味之素公司，60 mg/ml于20mM磷酸 鹽緩沖液pH 8.5中。茂原輪鏈絲菌(5Vre/ toveWd〃Zwm mo6arae似e)的 Activa WM酶在麥芽糊精中以干燥形式配制，含有1% w/w蛋白質(zhì))(6.7或者(b) 用大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)以可溶形式表達(dá)的茂原輪鏈絲菌(&^ptover"7/ww woZ^raewe)的TGase MTG P2，在20 mM磷酸鈉緩沖液，pH 6.0中與2 mM DTT和5 w/v。/。麥芽糊精配制。酶濃度在0.7和4.5 mg/ml之間。分析方法毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳(CE)用Agilent Technologies 3D-CE系統(tǒng)(Agilent Technologies)進(jìn)行。數(shù)據(jù)采集和信號(hào)處理用Agilent Technologies 3DCE ChemStation進(jìn)行。毛細(xì)管為Agilent的64.5cm (56.0 cm有效長(zhǎng)度) 50pm內(nèi)徑"加長(zhǎng)光徑毛細(xì)管(Extended Light Path Capillary)"。紫外檢測(cè) 在200nm(16nmBw，參比380 nm和50 nm Bw)處進(jìn)行。運(yùn)行電解質(zhì) 為磷酸鹽緩沖液50mMpH7.0。毛細(xì)管用0.1MNaOH調(diào)節(jié)3分鐘，然 后用Milli-Q水調(diào)節(jié)2分鐘和用電解質(zhì)調(diào)節(jié)3分鐘。每次運(yùn)行后，將毛細(xì)管用Milli-Q水沖洗2分鐘，然后用磷酸沖 洗2分鐘，接著用Milli-Q水沖洗2分鐘。流體動(dòng)力學(xué)注射在50mbar 下進(jìn)行4.0秒。電壓為+25kV。毛細(xì)管溫度為30C，運(yùn)行時(shí)間為10.5分鐘。hGH綴合的示例性方案按以下方案合成Nsl41-[2-(4-(4-(40KDa mPEG基)丁?；?-氨基-丁 氧基亞氨基)-乙基]hGH:<formula>formula see original document page 34</formula>TGase催化步驟的方法向1,3-二氨基-1-丙醇于三乙醇胺20mM pH8.6緩沖液(14^U)中的 1M溶液，加入三乙醇胺20mMpH8.6緩沖液(20.6|^1)、乙二醇(53.6pl) (40% w/v))和人生長(zhǎng)激素(50mg/ml)于三乙醇胺20mM pH8.6緩沖液 (40pl)中的溶液。加入TGase MTG P2溶液(0.35mg/ml， 5.8|^1)啟動(dòng)反應(yīng)。 反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下溫育，接著進(jìn)行毛細(xì)管電泳。 實(shí)施例lhGH在乙二醇存在和不存在下的轉(zhuǎn)氨作用反應(yīng)是用以下濃度，按與上述方法類似的方式進(jìn)行。-[hGH]=0.67mM(14.9mg/ml終濃度)畫[1，3-二氨基2-丙醇]:300mM-緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6-+/-乙二醇40%(v/v)-[TGase MTG P2]= 0.39岸總體積134^1環(huán)境溫度圖1所示的結(jié)果證明，在11小時(shí)后獲得期望的pos.l41-hGH的 75%最大產(chǎn)率。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，在4小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后獲得期望產(chǎn)物的 53%最大產(chǎn)率。電泳圖是在期望產(chǎn)物處在其最大產(chǎn)率時(shí)的反應(yīng)時(shí)間從反應(yīng)混合物獲得，即對(duì)于無乙二醇的反應(yīng)混合物為4小時(shí)，對(duì)于含有40。/。v/v 乙二醇的反應(yīng)混合物為11小時(shí)。結(jié)果在圖2中顯示。
實(shí)施例2
用TGase Activa WM或TGase MTG P2比專交乙二醇的作用 反應(yīng)是用以下濃度，按與上述方法類似的方式進(jìn)行。 -[hGH]-0.67mM(14.9mg/ml終濃度) - [1,3-二氨基2-丙醇]-300mM -緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6 -+/-乙二醇40%^ )
-[TGase MTG P2]= 0.39 或[TGase Activa WM]= 1 .95jiM
環(huán)境溫度
圖3顯示的結(jié)果證明，兩種酶的反應(yīng)曲線非常相似。 實(shí)施例3
hGH在10-40。/。 v/v乙二醇存在下的轉(zhuǎn)氨作用
反應(yīng)是用以下濃度，按與上述方法類似的方式進(jìn)行。
-[hGH]-0.67mM(14.9mg/ml終濃度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6
隱+/-乙二醇10-40% (v/v)
-[TGase MTG P2]= 0.39 juM
總體積134jul
在環(huán)境溫度溫育
圖4所示的結(jié)果揭示，當(dāng)增加乙二醇的濃度時(shí)，獲得的pos.141 TA-hGH產(chǎn)率提高。 實(shí)施例4
hGH在40-70。/。 v/v乙二醇存在下的轉(zhuǎn)氨作用
反應(yīng)是按與上述方法相似的方式進(jìn)行，例外的是在5小時(shí)反應(yīng)時(shí)
35間后加入更多的酶。反應(yīng)^f吏用到以下濃度
-[hGH]-0.67mM(14,9mg/ml終濃度) -[1，3-二氨基2-丙醇]-300mM -緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6 -+/隱乙二@享40-70% (v/v)
-[TGase MTG P2]= 0.39 |LtM,然后在5小時(shí)時(shí)為0.78 jiM
總體積134^1
環(huán)境溫度
結(jié)果在圖5中顯示。 實(shí)施例5
用不同濃度的TGase MTG P2比4交乙二醇的作用
反應(yīng)是用以下濃度，按與上述方法類似的方式進(jìn)行。
畫[hGH]=0.67mM(14.9 mg/ml終濃度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
陽緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6
-+/-乙二醇40%^ )
-[TGase MTG P2]= 0.39 pM或0.16
環(huán)境溫度
圖6顯示的結(jié)果證明，0.39 MTG P2酶和40%乙二醇得出最 高的產(chǎn)物產(chǎn)率。 實(shí)施例6
比較相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物的作用
反應(yīng)是用乙二醇、甘油、丙二醇和1,3丙二醇，用以下濃度，按 與上述方法類似的方式進(jìn)行。
-[hGH]=0,67mM(14.9mg/ml終濃度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6
-十A增效化合物7.18M-[TGase MTG P2]= 0.39 pM 總體積134^1 環(huán)境溫度
圖7顯示的結(jié)果證明，乙二醇得出最高產(chǎn)率。丙二醇的最高產(chǎn)率 其次。發(fā)現(xiàn)甘油減少了所形成的副產(chǎn)物(pos.40-TA-hGH和二轉(zhuǎn)氨的 hGH)的量，因此甘油也改進(jìn)了反應(yīng)的選擇性。
1,3丙二醇完全抑制反應(yīng)。
實(shí)施例7
用不同濃度的TGase MTG P2比較甘油的作用
反應(yīng)是用甘油按與上述方法相似的方式進(jìn)行，例外的是在5小時(shí) 反應(yīng)時(shí)間后加入更多的酶。反應(yīng)使用以下濃度
-[hGH]=0.67mM(14.9 mg/ml終濃度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6
-甘油7.18M
-[TGaseMTGP2]=0.39|uM,然后在5小時(shí)時(shí)1.17 pM
總體積134^1
環(huán)境溫度
圖8顯示的結(jié)果證明，當(dāng)向反應(yīng)混合物中加入更多的酶時(shí)，可提 高用甘油獲得的產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種提高酶催化反應(yīng)的選擇性和/或產(chǎn)率的方法，所述方法包括在選自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下進(jìn)行反應(yīng)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述增效化合物是乙二醇。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述酶催化反應(yīng)包括第 一化合物和肽之間的共價(jià)鍵形成，所述方法包括使第 一化合物與肽在 酶和增效化合物存在下在一個(gè)或多個(gè)步驟中發(fā)生反應(yīng)。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述第一化合物由下式表示 H2N—D—R—X其中D代表鍵或氧； R代表接頭或鍵；X選自或者可活化成酮-、醛-、-NH-NH2、 -0-C(0)-NH-NH2、 陽麗畫C(0)-NH畫麗2 、 -NH-C(S)-NH-NH2 、-NHC(0)-NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(S)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-C6H4-NH-NH2 、 -C(0)-NH-NH2 、 -0-NH2、 -C(0)-0-NH2、 -NH-C(0)-0-NH2、 -NH-C(S)-0-NH2、 C(0)-NH2、 Ar-NH2、炔、疊氮化物或腈-氧化物。
6. 權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的方法，其中第一化合物包含一個(gè)或 多個(gè)在構(gòu)成所述肽的任何氨基酸殘基中不易接近的官能團(tuán)或者潛在 官能團(tuán)，所述方法另外包括以下步驟(b) 任選活化潛在的官能團(tuán)；和(c) 使所述官能化的肽與包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的第二化合物在 一個(gè)或多個(gè)步驟中發(fā)生反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基 酸殘基中易接近的官能團(tuán)反應(yīng)，且其中所述第二化合物中的所述官能 團(tuán)能夠與所述第一化合物中的所述官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，使得所述官能化 肽和第二化合物之間形成共價(jià)鍵。
7. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一化合物選自4-(氨 基曱基)苯乙酮、4-(2-氨基乙基)苯乙酮、N-(4-乙酰苯基)2-氨基乙酰胺、 1一[4_(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、l-[3-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、1,4-雙(氨基氧基)丁烷、3-氧雜戊烷-l,5-二氧基胺、1,8-二氨基氧基-3,6-二 氧雜辛烷、1,3-雙(氨基氧基)丙-2-醇、1,11-雙(氨基氧基)-3，6,9-三氧雜 十一碳烷、1，3-二氨基-2-丙醇、1，2-雙(氨基氧基)乙烷和1,3-雙(氨基氧 基)丙烷。
8. 權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述肽選自胰島素、胰高 血糖素樣肽1 (GLP-1)、胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)、催乳素、生長(zhǎng)激 素、白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、抗體、TFF、黑皮質(zhì)素受體調(diào)節(jié)物、凝 血因子和VII因子化合物。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述肽是生長(zhǎng)激素，例如人生長(zhǎng)激素。
10. 權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)緩沖到6-9之間 的pH。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述反應(yīng)緩沖到7-8.6之間的pH。
12. 權(quán)利要求3-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)在15-45。C之 間的溫度下進(jìn)行。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述反應(yīng)在20-37。C之間的溫度下 進(jìn)行。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述增效化合物以 20-95%之間的濃度范圍存在。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述增效化合物以30-70%之間的 濃度范圍存在。
16. 可通過權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法獲得的肽。
17. 包含權(quán)利要求16中所定義的肽的藥物組合物。
18. —種治療以下病癥或患者的方法生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD); Turner綜合征；Prader-Willi綜合征(PWS); Noonan綜合征；Down綜 合征；慢性腎病；青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；嚢性纖維變性；接受HAART治療的兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡短小兒童(SGA); 除SGA外身材短小伴極低出生體重(VLBW)兒童；骨骼發(fā)育異常；軟 骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小(ISS);成人GHD;長(zhǎng) 骨如脛骨、腓骨、大腿骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、恥骨和 指趾的骨折；松質(zhì)骨如頭骨、手基部和腳基部的骨折；在例如手、膝 或肩中進(jìn)行腱或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行了或正進(jìn)行手術(shù)骨分離成骨 的患者；進(jìn)行了髖或盤置換、半月板修復(fù)、脊柱融合或假體固定的患 者，例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中；體內(nèi)固定了骨合成材料如釘 子、螺絲和板的患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者；骨切開術(shù)后 的患者，例如從脛骨或大腳趾切開；移植物植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān) 節(jié)炎引起的膝蓋關(guān)節(jié)軟骨變性；Turner綜合征患者中的骨質(zhì)疏松癥； 男人中的骨質(zhì)疏+>癥；長(zhǎng)期透析的成人患者(APCD); APCD中的營養(yǎng) 不良相關(guān)心血管疾??；APCD中惡病質(zhì)的逆轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD 中的慢性阻塞性肺疾病；APCD中的HIV; APCD老年患者；APCD 中的慢性肝??；APCD中的疲勞綜合征；節(jié),殳性回腸炎；肝功能受損； HIV感染的雄性；短腸綜合征；中心性肥胖；HIV相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良 綜合征(HALS);雄性不育癥；重大選擇性外科手術(shù)、酒精/藥物解毒 或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；衰老；體弱老人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷損害的軟骨； 勃起功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；創(chuàng)傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜 下腔出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素肌病；或者兒童 中糖皮質(zhì)激素治療所致的身材矮小，生長(zhǎng)激素還已用于加速肌肉組 織、神經(jīng)組織或傷口的痊愈；加速或改善向受損組織的血液流動(dòng)；或 者降低受損組織中的感染率；所迷方法包括將治療有效量的權(quán)利要求 16中所定義的化合物給予有需要的患者。
19.權(quán)利要求16中定義的化合物在制造用于治療以下病癥或患 者的藥物中的用途生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD); Turner綜合征； Prader-Willi綜合征(PWS); Noonan綜合征；Down綜合征；慢性腎病； 青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；嚢性纖維變性；接受HAART治療的兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡短小兒童(SGA);除SGA外身 材短小伴極低出生體重(VLBW)兒童；骨骼發(fā)育異常；軟骨發(fā)育不良； 軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小(ISS);成人GHD;長(zhǎng)骨如脛骨、腓 骨、大腿骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、跖骨和指趾的骨折； 松質(zhì)骨如頭骨、手基部和腳基部的骨折；在例如手、膝或肩中進(jìn)行腱 或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行了或正進(jìn)行手術(shù)骨分離成骨的患者；進(jìn)行 了髖或盤置換、半月板修復(fù)、脊柱融合或4艮體固定的患者，例如在膝、 髖、肩、肘、腕或顎中；體內(nèi)固定了骨合成材料如釘子、螺絲和板的 患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者；骨切開術(shù)后的患者，例如從 脛骨或大腳趾切開；移植物植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝蓋 關(guān)節(jié)軟骨變性；Turner綜合征患者中的骨質(zhì)疏松癥；男人中的骨質(zhì)疏 松癥；長(zhǎng)期透析的成人患者(APCD); APCD中的營養(yǎng)不良相關(guān)心血管 疾?。籄PCD中惡病質(zhì)的逆轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD中的慢性阻 塞性肺疾??；APCD中的HIV; APCD老年患者；APCD中的慢性肝 病；APCD中的疲勞綜合征；節(jié)段性回腸炎；肝功能受損；HIV感染 的雄性；短腸綜合征；中心性肥胖；HIV相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良綜合征 (HALS);雄性不育癥；重大選擇性外科手術(shù)、酒精/藥物解毒或神經(jīng) 創(chuàng)傷后的患者；衰老；體弱老人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷損害的軟骨；勃起 功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；創(chuàng)傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下腔 出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素肌病；或者兒童中糖 皮質(zhì)激素治療所致的身材矮小，生長(zhǎng)激素還已用于加速肌肉組織、神 經(jīng)組織或傷口的疾愈；加速或改善向受損組織的血液流動(dòng)；或者降低 受損組織中的感染率。
20.用于治療以下病癥或患者的權(quán)利要求16的肽生長(zhǎng)激素缺乏 癥(GHD); Turner綜合征；Prader-Willi綜合征(PWS); Noonan綜合征； Down綜合征；慢性腎??；青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；嚢性纖維變性； 接受HAART治療的兒童的HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡短 小兒童(SGA);除SGA外身材短小伴極低出生體重(VLBW)兒童；骨骼發(fā)育異常；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小(ISS); 成人GHD;長(zhǎng)骨如脛骨、腓骨、大腿骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、 掌骨、跖骨和指趾的骨折；松質(zhì)骨如頭骨、手基部和腳基部的骨折； 在例如手、膝或肩中進(jìn)行腱或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行了或正進(jìn)行手 術(shù)骨分離成骨的患者；進(jìn)行了髖或盤置換、半月板修復(fù)、脊柱融合或 假體固定的患者，例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中；體內(nèi)固定了骨 合成材料如釘子、螺絲和板的患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者； 骨切開術(shù)后的患者，例如從脛骨或大腳趾切開；移植物植入后的患者； 創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝蓋關(guān)節(jié)軟骨變性；Turner綜合征患者中的骨質(zhì) 疏松癥；男人中的骨質(zhì)疏松癥；長(zhǎng)期透析的成人患者(APCD); APCD 中的營養(yǎng)不良相關(guān)心血管疾病；APCD中惡病質(zhì)的逆轉(zhuǎn)；APCD中的 癌癥；APCD中的慢性阻塞性肺疾??；APCD中的HIV; APCD老年 患者；APCD中的慢性肝??；APCD中的疲勞綜合征；節(jié)段性回腸炎； 肝功能受損；HIV感染的雄性；短腸綜合征；中心性肥胖；HIV相關(guān) 脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS);雄性不育癥；重大選擇性外科手術(shù)、酒 精/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；衰老；體弱老人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷 損害的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；創(chuàng)傷性腦 損傷；蛛網(wǎng)膜下腔出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素肌 ??；或者兒童中糖皮質(zhì)激素治療所致的身材矮小，生長(zhǎng)激素還已用于 加速肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口的痊愈；加速或改善向受損組織的血 液流動(dòng)；或者降^f氐受損組織中的感染率。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高酶的選擇性的方法，所述方法包括在選自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下進(jìn)行反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101617053SQ200880005602
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月22日
發(fā)明者J·巴查特, M·曾德爾, N·L·約翰森 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司