專利名稱：：新型α-半乳糖苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新型a-半乳糖苷酶和使用該酶制造棉子糖的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著飲食生活、社會生活多樣化的發(fā)展，出于健康意識的提高，消費(fèi)者對食品、食品材料等的關(guān)心程度也有所提高。其中，發(fā)現(xiàn)棉子糖具有改善腸內(nèi)菌群等功能，因此作為食品、藥品、香料等或者其原料而倍受關(guān)注。最近，已發(fā)現(xiàn)棉子糖具有免疫賦活作用、對特應(yīng)性皮炎有用?，F(xiàn)今，棉子糖是作為制造甜菜糖時(shí)的副產(chǎn)物回收的，而甜菜中的棉子糖含量不過是0.1%左右，棉子糖的生產(chǎn)量與主產(chǎn)物砂糖的生產(chǎn)量有關(guān)，所以棉子糖的增產(chǎn)有限。因此，為了穩(wěn)定地以低成本向市場供給具有這樣的有用特性的棉子糖，不僅需要來自天然的提取品，還需要來自低成本原料的合成品。作為迄今嘗試的棉子糖的合成方法，可以舉出利用cx-半乳糖苷酶的催化作用的方法，并且已經(jīng)報(bào)道了以蔗糖為半乳糖受體，以蜜二糖為半乳糖供體來得到棉子糖的方法(例如參見專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。此外還報(bào)道了利用對硝基苯基-cc-D-吡喃半乳糖苷作為半乳糖供體的方法(例如，參見非專利文獻(xiàn)3)、利用肌醇半乳糖苷作為半乳糖供體的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)2)、利用半乳二糖作為半乳糖供體的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)3)等。另外，還報(bào)道了一些可以利用低成本的蔗糖和半乳糖作為原料的例子。例如，公開了使用來源于朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)的a-半乳糖苷酶得到棉子糖的方法(例如參見非專利文獻(xiàn)4)，利用來源于葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)的a-半乳糖苷酶合成棉子糖的方法(例如參見非專利文獻(xiàn)5)。專利文獻(xiàn)l:日本特許第2688854號專利文獻(xiàn)2:日本特開平10-84973專利文獻(xiàn)3:日本特公平8-24592非專利文獻(xiàn)1:Agric.BioLChem.，52(9)，2305-2311,1988非專利文獻(xiàn)2:Biosci.Biotech.Biochem.,59(4),619-623，1995非專利文獻(xiàn)3:Phytochemistry，18，35-38，1979非專利文獻(xiàn)4:NipponShokuhinKogyoGakkaishi，38(8),722-728,1991非專利文獻(xiàn)5:Carbohydr.Res.，185，139-146,1989
發(fā)明內(nèi)容由于利用ct-半乳糖苷酶生成棉子糖的效率高，所以已經(jīng)報(bào)道了利用蜜二糖、對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷、肌醇半乳糖苷、半乳二糖作為棉子糖合成原料的例子，但釆用這些方法的情況下，所使用的原料的價(jià)格高，難以在工業(yè)上制造棉子糖。另一方面，由于能夠利用低成本原料蔗糖和半乳糖，所以使用來源于朱紅密孔菌的oi-半乳糖苷酶得到棉子糖的方法或利用來源于葡酒色被孢霉的a-半乳糖苷酶合成棉子糖的方法是考慮工業(yè)性時(shí)非常有利的方法。但是，利用這些(x-半乳糖苷酶的情況下，在生成物中生成了目的棉子糖以外的雜三糖，所以需要從最終產(chǎn)品中分離出雜三糖，并且還產(chǎn)生了原料浪費(fèi)的問題。將來源于朱紅密孔菌的a-半乳糖苷酶用于棉子糖合成反應(yīng)的情況下，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低至40%;將來源于葡酒色被孢霉的(x-半乳糖苷酶用于棉子糖合成反應(yīng)的情況下，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低至60%，現(xiàn)有技術(shù)不能通過酶法選擇性地制造棉子糖?；谶@種情況，本發(fā)明的目的在于提供一種新的(x-半乳糖苷酶，其能夠使用低成本的原料選擇性地合成棉子糖，并且本發(fā)明還提供使用該酶的棉子糖的革新性制造方法。為了解決這些課題，本發(fā)明的發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種能夠選擇性合成棉子糖的新酶，并發(fā)現(xiàn)了抑制目的棉子糖以外的雜質(zhì)低聚糖的生成的棉子糖制造方法，從而完成了本發(fā)明。艮卩，本發(fā)明涉及下述的[1][20]所示的新型(X-半乳糖苷酶和棉子糖的制造方法等。一種a-半乳糖苷酶，具有下述特性(1)作用所述酶具有如下性質(zhì)在以蔗糖和半乳糖為原料的脫水縮合反應(yīng)中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為0.5%以上時(shí)，棉子糖的合成選擇率為65%以上；(2)最適pH范圍3'55.0;(3)穩(wěn)定pH范圍3.510.0;(4)分子量約80,000。如[l]所述的ct-半乳糖苷酶，其來源于屬于凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)的微生物。如[2]所述的a-半乳糖苷酶，其中，所述凝結(jié)芽孢桿菌是凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一種。一種凝結(jié)芽孢桿菌及其變異體，所述凝結(jié)芽孢桿菌屬于凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一種?！Ncc-半乳糖苷酶，其含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列O)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)序列編號2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60°/。以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。—種a-半乳糖苷酶基因，其編碼含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的a-半乳糖苷酶；(a)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)序列編號2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性?！Na-半乳糖苷酶基因，其含有下述(a)或(b)的堿基序列(a)序列編號1表示的堿基序列；(b)序列編號1表示的堿基序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)堿基的堿基序列，并且其編碼具有(x-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)?！N重組載體，其含有[6]或[7]所述的a-半乳糖苷酶基因。[9]一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有[6]或[7]所述的a-半乳糖苷酶基因或[8]所述的重組載體?！Na-半乳糖苷酶，其是培養(yǎng)[9]所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。一種酶組合物，其含有[1][3]、[5]或[10]的任一項(xiàng)所述的ct-半乳糖苷酶。如[ll]所述的酶組合物，其中，該組合物還含有選自(x-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、果膠裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一種以上的成分?！N棉子糖合成試劑，其含有[11]或[12]任一項(xiàng)所述的酶組合物。一種棉子糖的制造方法，其特征在于，該制造方法使用[1][3]、[5]或[10]的任一項(xiàng)所述的(x-半乳糖苷酶；[11]或[12]所述的酶組合物；或者[13]所述的棉子糖合成試劑。—種棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物而得到的?！N棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)屬于凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一種凝結(jié)芽孢桿菌和/或其變異體而得到的?！N棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)[9]所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。如[14][17]中任一項(xiàng)所述的棉子糖的制造方法，其中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為65%以上。如[14][18]中任一項(xiàng)所述的棉子糖的制造方法，其中，該方法使用蔗糖和半乳糖作為原料。如[19]所述的棉子糖的制造方法，其中，原料中的蔗糖濃度為30%(w/v)90°/。(w/v)，原料中的半乳糖濃度為2%(w/v)45%(w/v)。通過釆用本發(fā)明，能夠選擇性地制造棉子糖。圖1給出了由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004菌體提純的(x-半乳糖苷酶的最適pH范圍(實(shí)施例2)。圖2給出了由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004菌體提純的cc-半乳糖苷酶的穩(wěn)定pH范圍(實(shí)施例2)。圖3給出了由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004菌體提純的oc-半乳糖苷酶的最適溫度范圍(實(shí)施例2)。圖4給出了由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004菌體提純的a-半乳糖苷酶的穩(wěn)定溫度范圍(實(shí)施例2)。圖5給出了由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004菌體提純的oi-半乳糖苷酶的SDS-PAGE(實(shí)施例2)的結(jié)果。圖6給出了對使用由凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株提純的(x-半乳糖苷酶的糖合成(實(shí)施例3)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。圖7給出了對使用由重組大腸桿菌JM109株得到的a-半乳糖苷酶的糖合成(實(shí)施例5)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。圖8給出了對使用培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株而得到的微生物催化劑的糖合成(實(shí)施例3)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。本發(fā)明的cx-半乳糖苷酶來源于屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物，作為該微生物，可以使用屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物中的任意微生物，并可以使用表達(dá)能夠選擇性合成棉子糖的oi-半乳糖苷酶的任意微生物。可以優(yōu)選舉出凝結(jié)芽孢桿菌AKC-003株、AKC-004株、AKC-005株、AKC-006株。另外，本發(fā)明中的微生物還可以是以屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物為母株得到的變異株。凝結(jié)芽孢桿菌AKC-003株、AKC-004株、AKC-005株、AKC-006株均在2006年(平成18年)ll月14日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)。保藏編號如下。需要說明的是，AKC-004株于2008年(平成20年)l月30日以受理編號FERM-ABP10948以及保藏編號FERM-BP10948移交到國際保藏。AKC-003株(FERMP-21091)AKC-004株(FERMP-21092;FERM-ABP10948;FERM-BP10948)AKC-005株(FERMP-21093)AKC-006株(FE腹P-21094)本發(fā)明的cx-半乳糖苷酶具有下述特性。(1)作用所述酶具有如下性質(zhì)在以蔗糖和半乳糖為原料的脫水縮合反應(yīng)中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為0.5%以上時(shí)，棉子糖的合成選擇率為65%以上；(2)最適pH范圍3'55.0;(3)穩(wěn)定pH范圍3.510.0;(4)分子量約80,000。作為本發(fā)明的酶的具體例，可以舉出在底物特異性和金屬離子的影響方面具有下述性質(zhì)的酶。底物特異性以對硝基苯基-(X-D-吡喃半乳糖苷作為底物的情況下，分解活性最高，其后依次為蜜二糖、棉子糖。另一方面，對硝基苯基-p-D-吡喃半乳糖苷、乳糖、蔗糖不發(fā)生分解。金屬離子的影響添加鉀離子、鈣離子、鎂離子、鉻離子、錳離子、鈷離子、鐵(n)離子或鐵(m)離子的各情況下，未見活性的降低。另一方面，添加鎳離子或鋅離子的各情況下，可見活性的降低，添加銅離子的情況下，活性降低最大。另外，作為本發(fā)明的酶的具體例，還可以舉出具有下述特性的酶。(5)(正反應(yīng)的)最適溫度范圍3550°C;(6)穩(wěn)定溫度范圍45'C以下穩(wěn)定。作為用于本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)方法，采用常規(guī)的通氣攪拌培養(yǎng)或者固體培養(yǎng)，并且可以采用通常進(jìn)行的微生物培養(yǎng)方法。作為培養(yǎng)基，可以舉出合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，其中含有使該微生物生育良好且順暢地生成微生物中的oc-半乳糖苷酶所必須的碳源、氮源、無機(jī)鹽、必須的營養(yǎng)源等。例如，作為碳源，可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、纖維素二糖、吡喃葡糖基蔗糖、有機(jī)酸、淀粉、橄欖油、大豆油等。作為氮源，例如可以舉出硫銨、硝銨、脲、氨基酸、胺類、氨、各種無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其他含氮化合物、蛋白胨、胰化蛋白胨、聚胨、肉湯、酵母提取液、棉籽粕、玉米槳和大豆粕等。另外，作為無機(jī)鹽類，可以舉出磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鐵、碳酸轉(zhuǎn)等。從微生物的生育性的方面考慮，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為2580°C，更優(yōu)選為4065°C，進(jìn)一步優(yōu)選為4055°C。另外，培養(yǎng)基的pH可在較寬范圍進(jìn)行選擇，但從微生物的生育性的方面考慮，優(yōu)選pH3.09.0，更優(yōu)選pH3.58.5，進(jìn)一步優(yōu)選pH4.08.0。本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的分離、提純例如可以如下實(shí)施。用上述的培養(yǎng)基培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株，通過離心分離、過濾等公知的方法將所得到的培養(yǎng)液分離成菌體和濾液。如此得到的菌體中含有a-半乳糖苷酶，通過使用溶菌酶、超聲波破碎機(jī)、弗氏壓碎器等進(jìn)行菌體破碎，得到a-半乳糖苷酶的粗提取液。根據(jù)培養(yǎng)條件等，有時(shí)在培養(yǎng)上清液中含有(x-半乳糖苷酶的活性，這種情況下，可以將培養(yǎng)上清液直接作為a-半乳糖苷酶的粗提取液用于下面的提純，也可以對培養(yǎng)上清液進(jìn)行濃縮等操作，然后作為(x-半乳糖苷酶的粗提取液用于下面的提純。將如此得到的粗提取液通過常規(guī)的蛋白質(zhì)提純法(例如離子交換色譜法、疏水性色譜法、凝膠過濾色譜法、羥基磷灰石色譜法、鹽析等的組合)來進(jìn)行分離，由此可以提純oc-半乳糖苷酶。無論上述操作的順序如何，各操作均可進(jìn)行1次或2次以上。另外，優(yōu)選在以各柱洗脫試樣前，通過透析等使試樣液與適當(dāng)?shù)木彌_液交換。另外，還可以在各個(gè)階段對試樣液進(jìn)行濃縮。優(yōu)選提純的各階段中，對分離的各級分中所含有的a-半乳糖苷酶活性進(jìn)行測定，將活性高的級分集中起來，供下一階段使用。對于測定a-半乳糖苷酶活性的方法，例如在含有6mM對硝基苯基陽a-D-卩比喃半乳糖苷的450pL乙酸鈉緩沖液(100mM，pH5.0)中混合150fiL酶液，在4(TC進(jìn)行530分鐘左右的反應(yīng)后，將反應(yīng)液添加到lmL碳酸鈉水溶液(1M)中，使酶失活，停止反應(yīng)。測定所得到的溶液在波長420nm的吸收(所得到的溶液的著色度)，使用以各濃度的對硝基苯酚制作的校準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度。另外，酶活性的單位如下以在上述條件下1分鐘游離出lpmol對硝基苯酚的酶量為1U。經(jīng)提純的a-半乳糖苷酶的提純度的確認(rèn)和分子量的測定可以通過電泳或凝膠過濾色譜法等進(jìn)行。另外，酶學(xué)性質(zhì)可以如下進(jìn)行研究改變反應(yīng)溫度或者反應(yīng)pH，測定酶活性；或者將各種酶抑制劑或金屬離子等添加到反應(yīng)液中，測定殘存活性。另外，通過將a-半乳糖苷酶在各種pH條件下或溫度條件下放置一定時(shí)間后再測定酶活性，由此能夠考察穩(wěn)定pH范圍和穩(wěn)定溫度范圍。另外，通過改變底物濃度來進(jìn)行反應(yīng)，能夠求出a-半乳糖苷酶對各底物的米氏常數(shù)(Km)、最大速度(VmJ。本發(fā)明的a-半乳糖苷酶基因可通過例如下述方法獲得。用上述的培養(yǎng)基培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株，通過離心分離、過濾等公知的方法將所得到的培養(yǎng)液分離成菌體和濾液。使用溶菌酶、超聲波破碎機(jī)、弗氏壓碎器等對如此得到的菌體進(jìn)行菌體破碎，分離染色體DNA。用各種限制性內(nèi)切酶對如此得到的染色體DNA進(jìn)行消化，得到DNA碎片。使用如此得到的染色體DNA碎片，通過利用鳥槍克隆法、反向PCR法等公知的手段獲得含有a-半乳糖苷酶基因的全長或一部分的DNA碎片。此處得到的含有cc-半乳糖苷酶基因的DNA碎片的堿基序列可通過利用DNA測序儀等的公知方法進(jìn)行解析，并明確其堿基序列。另外，僅知道a-半乳糖苷酶基因的部分堿基序列的情況下，可以以該堿基序列為基礎(chǔ)，再次獲得含有ct-半乳糖苷酶基因的DNA碎片。并且，通過重復(fù)該操作，能夠解明a-半乳糖苷酶基因全長的堿基序列?？梢砸匀缟辖庾x的a-半乳糖苷酶基因的堿基序列為基礎(chǔ)，通過PCR法或使用限制性內(nèi)切酶的公知方法來得到含有(x-半乳糖苷酶基因的全長的DNA碎片。如此，根據(jù)所解讀的a-半乳糖苷酶基因的堿基序列，可以確定a-半乳糖苷酶的氨基酸序列。序列編號2舉出了本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的氨基酸序列，但只要含有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有a-半乳糖苷酶活性，該氨基酸序列可以具有缺失、取代、添加至少1個(gè)氨基酸等的變異，或者可以是與該氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列。即，本發(fā)明的a-半乳糖苷酶是含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的(x-半乳糖苷酶。(a)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)序列編號2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有cc-半乳糖苷酶活性。另夕卜，根據(jù)本發(fā)明，提供一種編碼含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的cc-半乳糖苷酶的ct-半乳糖苷酶基因。(a)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)序列編號2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有oi-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。上述(b)中的"1個(gè)或幾個(gè)氨基酸"通常是指150個(gè)氨基酸，優(yōu)選為130個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為120個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選為110個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選為15個(gè)氨基酸。上述(C)中的"具有60%以上的相同性的氨基酸序列"通常是指具有60%以上(優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為卯％以上、再進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選為99°/。以上)的相同性的氨基酸序列。作為本發(fā)明的a-半乳糖苷酶基因的具體例，可以舉出含有下述(a)或(b)的堿基序列的a-半乳糖苷酶基因。(a)序列編號1表示的堿基序列；(b)序列編號1表示的堿基序列中缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)堿基的堿基序列，并且其編碼具有oc-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。上述(b)中的"1個(gè)或幾個(gè)堿基"通常是指1150個(gè)堿基，優(yōu)選l90個(gè)堿基，更優(yōu)選為160個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為130個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為120個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為115個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為lIO個(gè)堿基，特別優(yōu)選為15個(gè)堿基。本發(fā)明的a-半乳糖苷酶基因可通過公知的基因操作方法進(jìn)行不損害原本的催化反應(yīng)的性質(zhì)的肽的變異，這樣的變異基因是指通過基因工學(xué)的方法由本發(fā)明的(x-半乳糖苷酶基因制作的人工變異基因，該人工變異基因可通過使用部位特異的變異法、用人工變異DNA取代目的基因的特定DNA碎片的方法等各種基因工學(xué)方法來得到。g卩，作為使a-半乳糖苷酶中的氨基酸發(fā)生缺失、取代、添加等變異的方法，可以利用PCR法、錯(cuò)配PCR法、DNA改組法、制作融合酶的方法等公知的方法。可以將如此得到的含有完整的a-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的DNA碎片插入大腸桿菌用表達(dá)載體(例如pBluescriptIIKS(+))的多克隆位點(diǎn)并連接，構(gòu)成新的重組質(zhì)粒。對于該質(zhì)粒載體，由于導(dǎo)入有能在大腸桿菌中將作為外來基因而連接的基因有效表達(dá)的lac啟動子，所以通過培養(yǎng)在大腸桿菌中導(dǎo)入重組質(zhì)粒所得到的轉(zhuǎn)化體，能夠大量表達(dá)ct-半乳糖苷酶。另外，除上述以外，還可以利用各種宿主微生物、載體來大量表達(dá)a-半乳糖苷酶，例如通過培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌(Brevibacilluschoshinensis)的轉(zhuǎn)化體，能夠大量表達(dá)a-半乳糖苷酶。更詳細(xì)地說，作為導(dǎo)入本發(fā)明的(x-半乳糖苷酶基因的載體，適合的有由能夠在宿主微生物體內(nèi)自律繁殖的噬菌體或質(zhì)粒制成的用于基因重組的載體，作為噬菌體載體，例如以屬于大腸桿菌的微生物作為宿主微生物的情況下，可以使用人gt，人C、Xgf人B等。另外，作為質(zhì)粒載體，例如以大腸桿菌作為宿主微生物的情況下，可以使用質(zhì)粒pET-3a、pET-lla、pET-32a等pET載體(Novagen)或pBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pINI、BluescriptKS+;以枯草菌作為宿主的情況下，可以使用pWH1520、pUB110、pKH300PLK;以放線菌為宿主的情況下，可以使用pIJ680、pIJ702;以酵母特別是釀酒酵母作為宿主的情況下，可以使用YRp7、pYCl、YEpl3等。將這樣的載體用限制性內(nèi)切酶切斷，使生成的末端與以用于切斷本發(fā)明的a-半乳糖苷酶基因的限制性內(nèi)切酶生成的DNA末端相同，從而制成載體碎片，利用DNA連接酶依照常規(guī)方法使本發(fā)明的(x-半乳糖苷酶基因碎片和載體碎片結(jié)合，由此能夠?qū)⒕幋a本發(fā)明的a-半乳糖苷酶基因的DNA導(dǎo)入目的載體。作為導(dǎo)入質(zhì)粒的宿主微生物，只要重組DNA能夠穩(wěn)定且自律地增殖即可，例如宿主微生物是屬于大腸桿菌的微生物的情況下，可以利用大腸桿菌BL21、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌BL21trxB、大腸桿菌Rosetta(DE3)、大腸桿菌Rosetta、大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS、大腸桿菌Rosetta(DE3)pLacl、大腸桿菌RosettaBhie、大腸桿菌Rosetta畫gami、大腸桿菌Origami、大腸桿菌Origami、大腸桿菌Tuner、大腸桿菌DH1、大腸桿菌JM109、大腸桿菌W3110、大腸桿菌C600等。另外，微生物宿主是屬于芽胞桿菌屬的微生物的情況下，可以利用枯草芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌等；微生物宿主是屬于放線菌的微生物的情況下，可以利用變鉛青鏈酶菌TK24等；微生物宿主是屬于釀酒酵母的微生物的情況下，可以利用釀酒酵母INVSC1等。另外，通過轉(zhuǎn)化微生物制造本發(fā)明的(x-半乳糖苷酶時(shí)，用營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化微生物，在菌體內(nèi)或培養(yǎng)液中產(chǎn)生本發(fā)明的a-半乳糖苷酶，培養(yǎng)結(jié)束后，通過過濾或離心分離等方法由所得到的培養(yǎng)物采集菌體，接下來，用機(jī)械方法或溶菌酶等酶的方法破壞該菌體，或者根據(jù)需要添加EDTA和域適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑龋瑵饪s本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的水溶液或不進(jìn)行濃縮而直接通過硫銨分級、凝膠過濾、親和色譜法等吸附色譜法、離子交換色譜法進(jìn)行處理，由此可以得到純度好的本發(fā)明的a-半乳糖苷酶。關(guān)于轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)條件，選擇培養(yǎng)條件時(shí)考慮其營養(yǎng)生理性質(zhì)即可，通常通過液體培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，工業(yè)上進(jìn)行深部通氣攪拌培養(yǎng)是有利的。作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)源，可以廣泛地使用微生物培養(yǎng)中通常使用的營養(yǎng)源。培養(yǎng)溫度可以在微生物能夠繁殖且能生產(chǎn)本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的范圍適當(dāng)變化，以大腸桿菌為例，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為1045'C左右，進(jìn)一步優(yōu)選為203(TC左右。根據(jù)情況，培養(yǎng)條件多少有些不同，但只需預(yù)期本發(fā)明的(x-半乳糖苷酶達(dá)到最高產(chǎn)率的時(shí)期，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期結(jié)束培養(yǎng)即可，以大腸桿菌為例，通常培養(yǎng)時(shí)間為1248小時(shí)左右。培養(yǎng)基pH可以在細(xì)菌能夠繁殖且能生產(chǎn)本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的范圍適當(dāng)變化，以大腸桿菌為例，培養(yǎng)基pH優(yōu)選為pH68左右。根據(jù)本發(fā)明，使用所述酶時(shí)，只要不抑制本發(fā)明的酶的作用，對提純程度等并沒有特別限定，除了使用經(jīng)提純的本發(fā)明的酶之外，也可以使用含有該酶的混合物。根據(jù)本發(fā)明，提供了含有上述的本發(fā)明的a-半乳糖苷酶的酶組合物。上述酶組合物可以進(jìn)一步含有例如選自a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、|3-半乳糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、果膠裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一種以上的成分。根據(jù)本發(fā)明，提供了含有上述的酶組合物的棉子糖合成試劑。本發(fā)明中，作為微生物催化劑，除了凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株之外，還可以使用上述的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中，作為用于制造棉子糖的微生物催化劑，可以利用通過常規(guī)進(jìn)行的培養(yǎng)方法得到的微生物本身，而無需從微生物提純a-半乳糖苷酶。另外，有時(shí)可以利用微生物培養(yǎng)液、微生物培養(yǎng)上清液。另一方面，也可以根據(jù)需要在用水或緩沖液等對通過培養(yǎng)法得到的微生物進(jìn)行清洗后再加以利用。例如，可以使用經(jīng)培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)液；或通過離心分離、用緩沖液進(jìn)行清洗等而得到的微生物懸浮液；懸浮或溶解有微生物或微生物的處理物(例如微生物的破碎物等)的水溶液；用包埋法、交聯(lián)法或者載體結(jié)合法而固定的微生物或者微生物處理物。作為進(jìn)行固定化時(shí)的固定化載體的例子，可以舉出玻璃珠、硅膠、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜膠、藻酸等，但并不限于這些。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種棉子糖的制造方法，該方法使用上述的本發(fā)明的a-半乳糖苷酶、含有ct-半乳糖苷酶的酶組合物、棉子糖合成試劑或微生物催化劑。作為原料，例如可以使用蔗糖和半乳糖。利用蔗糖和半乳糖作為原料時(shí)，例如，從利用a-半乳糖苷酶進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的性質(zhì)方面出發(fā)，優(yōu)選原料濃度高，但半乳糖濃度過高時(shí)，半乳糖的分子間縮合抑制了蔗糖與半乳糖之間的脫水縮合反應(yīng)，蔗糖濃度優(yōu)選設(shè)定在30%(w/v)90%(w/v)，更優(yōu)選為35%(w/v)80%(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為40°/。(w/v)70%(w/v)。半乳糖濃度優(yōu)選設(shè)定為2%(w/v)45%(w/v)，更優(yōu)選為5%(w/v)35%(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為7%(w/v)30°/。(w/v)。另外，優(yōu)選制備成原料中的蔗糖和半乳糖均可溶的濃度。使用本發(fā)明的ot-半乳糖苷酶、含有ct-半乳糖苷酶的酶組合物、含有酶組合物的棉子糖合成試劑或微生物催化劑制造棉子糖時(shí)，從反應(yīng)速度、酶的穩(wěn)定性的方面考慮，反應(yīng)溫度優(yōu)選為1090°C，更優(yōu)選為2070°C，進(jìn)一步優(yōu)選為3060°C。反應(yīng)pH可在較寬范圍進(jìn)行調(diào)整，從酶的穩(wěn)定性的方面考慮，優(yōu)選pH2.010.0，更優(yōu)選pH3.07.5，進(jìn)一步優(yōu)選為3.56.0。反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的用量而有所不同，考慮到工業(yè)上的利用時(shí)，通常優(yōu)選為為20分鐘200小時(shí)，更優(yōu)選為6小時(shí)80小時(shí)。但是，本發(fā)明并不限于以上的反應(yīng)條件和反應(yīng)形態(tài)，可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。本發(fā)明中，在使用oc-半乳糖苷醇、含有ot-半乳糖苷酵的酶組合物或含有酶組合物的棉子糖合成試劑的棉子糖合成反應(yīng)中，棉子糖在反應(yīng)溶液中累積0.5%以上時(shí)，生成的低聚糖中的棉子糖含有率可以提高到65%以上，在更優(yōu)選的條件下，可以提高到80%以上。在反應(yīng)溶液中累積棉子糖達(dá)到0.75%以上、進(jìn)而1.0%以上時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中生成的低聚糖中的棉子糖高含有率。另外，使用微生物本身的棉子糖合成反應(yīng)中，通常由于雜酶的影響，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低，而使用本發(fā)明的微生物催化劑的棉子糖合成反應(yīng)中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率高。本發(fā)明得到的生成的低聚糖中的棉子糖含有率可通過下述方法測定。棉子糖合成反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液稀釋25倍，在99"保持10分鐘，由此停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后，通過離心分離除去微生物，用高速液相色譜法(HPLC)對所得到的反應(yīng)溶液進(jìn)行定量。測定使用Thermoelectron社制造的Hypercarb柱，檢測器使用RI。生成的低聚糖中的棉子糖含有率根據(jù)在HPLC分析譜圖中檢測到的各個(gè)峰的面積比通過(棉子糖的峰面積)/(生成的低聚糖的峰面積)x100來計(jì)算。作為對通過本發(fā)明的方法制造的棉子糖進(jìn)行提純、分離的方法，可以利用通常采用的提純處理方法。即，例如可通過離心分離、利用MF(微濾)膜或UF(超濾)膜等的膜處理、壓濾機(jī)等除去微生物催化劑；通過陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法等色譜處理或透析等脫鹽處理來除去由緩沖液、培養(yǎng)基等帶入的鹽類等；以及通過陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法、高速液相色譜法、活性炭色譜法等色譜處理或利用溶解度差等的結(jié)晶化處理、其他常規(guī)方法進(jìn)行oc-低聚半乳糖的分離、提純。色譜處理可以單獨(dú)使用這些方法，也可以組合使用這些方法，并可以適當(dāng)利用移動床方式、模擬移動床方式、多成分分離模擬移動床方式、多成分分離循環(huán)方式等。這些棉子糖的提純、分離處理方法可以分批式進(jìn)行，也可以利用柱等連續(xù)進(jìn)行。下面通過實(shí)施例具體進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。實(shí)施例實(shí)施例1將凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株(保藏編號FERMP-21092(移交為FERM-ABP10948);保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ)，TryptoseBloodAgarBase)培養(yǎng)板(Difco)在55"C培養(yǎng)l天，形成菌落。將30rnL調(diào)整到pH7.2的表1所示的培養(yǎng)基裝入150mL的三角燒瓶中，用接種環(huán)從上述培養(yǎng)板接種菌落，在50。C、180rpm進(jìn)行25小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，以此作為罐培養(yǎng)種子。培養(yǎng)基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>接著，將6L調(diào)整到pH7.2的表1所示的培養(yǎng)基放入10L的發(fā)酵罐，移植15mL上述的罐培養(yǎng)種子，以50。C、200rpm、0.2vvm的條件通氣攪拌培養(yǎng)48小時(shí)。接著，將該培養(yǎng)液在4"C進(jìn)行10，000gx30分鐘的離心分離，除去上清液，回收菌體。測定所得到的菌體的a-半乳糖苷酶的活性，該活性為261U。將該菌體用含有50mMTris-HCl、20mMEDTA、50mM葡萄糖的Lysis緩沖液(pH8.0)懸浮，并定量到150mL。將該懸浮液在4匸進(jìn)行10,000gx30分鐘的離心分離，除去上清液，回收菌體。將用Lysis緩沖液清洗后的菌體再次懸浮在上述Lysis緩沖液中，定量為150mL。在其中添加0.02n/。的溶菌酶(Sigma社制造，來自蛋白)，以37°C、120rpm的條件振蕩13小時(shí)，進(jìn)行菌體破碎。將菌體破碎后的溶液在4'C進(jìn)行10，000gx30分鐘的離心分離，除去菌體殘?jiān)?，回收上清液。在該上清液中加入硫酸銨，并達(dá)到37.5%飽和，在4'C放置一夜，生成沉淀。在4。C進(jìn)行10，000gx30分鐘的離心分離，除去該沉淀，回收上清液。在該上清液中加入硫酸銨，并達(dá)到54.5%飽和，在4。C放置一夜，生成沉淀。在4'C進(jìn)行10,000gx30分鐘的離心分離，回收該沉淀，并將其溶解到pH7.0的20mM磷酸緩沖液中，在4i:對與上述相同的磷酸緩沖液進(jìn)行一夜透析。使通過透析得到的上清吸附在用與上述相同的磷酸緩沖液平衡化后的"DEAESepharoseFF"(GEHealthcareBio-Sciences株式會社)上后，通過含有00.4M氯化鈉的pH7.0的20mM磷酸緩沖液的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫出的活性級分，使用平均分級分子量10,000的超濾膜進(jìn)行濃縮，使其吸附在用含有2M氯化鈉的pH7.0的20mM磷酸緩沖液平衡化后的"HiTrapPhenylFF(highsub)"(GEHealthcareBio-Sciences株式會社)后，通過含有2，00M氯化鈉的pH7.0的20mM磷酸緩沖液的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫出的活性級分，使用平均分級分子量10,000的超濾膜進(jìn)行濃縮，使其吸附在用pH7.0的20mM磷酸緩沖液平衡化后的"MonoQ5/50GL"(GEHealthcareBio-Sciences株式會社)后'通過含有00.4M氯化鈉的pH7.0的20mM磷酸緩沖液的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫出的活性級分，使用平均分級分子量10,000的超濾膜進(jìn)行濃縮，使其填充在用pH7.0的20mM磷酸緩沖平衡化后的"HiLoad16/60Superdex200"(GEHealthcareBio-Sciences株式會社)中后，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。收集上述洗脫出的活性級分，使用平均分級分子量IO，OOO的超濾膜進(jìn)行濃縮，制成提純(x-半乳糖苷酶?；钚允章蕿?5%，活性為270U/mL。使用實(shí)施例1得到的提純a-半乳糖苷酶，進(jìn)行關(guān)于其作用的實(shí)驗(yàn)。(l)最適pH范圍在150|iL溶解有6mM對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的各pH的lOOmM緩沖液中混合50pL經(jīng)100倍稀釋的本發(fā)明的提純酶液，在40°C反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，通過對游離的對硝基苯酚進(jìn)行定量來測定活性，求出設(shè)最大活性為100時(shí)的相對活性。其結(jié)果見圖1。需要說明的是，所使用的緩沖液是甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.53.5)、乙酸鈉緩沖液(pH3.56.0)、磷酸鈉緩沖液(pH6.08.5)、甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.510.0)。(2)穩(wěn)定pH范圍使用pH4.010.0的范圍的10mM緩沖液，在各pH于45。C進(jìn)行140分鐘加熱處理，測定其殘存活性，與上述同樣地求出設(shè)最大活性為100時(shí)的相對活性。其結(jié)果見圖2。需要說明的是，所使用的各pH的緩沖液的種類與上述相同。(3)最適溫度范圍在l卯pL溶解有4.7mM對硝基苯基-(x-D-吡喃半乳糖苷的pH4.5的乙酸鈉緩沖液中混合1OjliL經(jīng)20倍稀釋的本發(fā)明的提純酶液，在2060。C的范圍反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，對游離的對硝基苯酚進(jìn)行定量，由此測定活性，求出設(shè)最大活性為IOO時(shí)的相對活性。其結(jié)果見圖3。(4)穩(wěn)定溫度范圍使用pH4.5的100mM乙酸鈉緩沖液，在3055。C的各溫度進(jìn)行20分鐘的加熱處理，測定其殘存活性，與上述同樣地求出設(shè)最大活性為100時(shí)的相對活性。其結(jié)果見圖4。C5)分子量使用分離凝膠濃度為10%的"k亍V—f/PJ"(日本Bio-RadLaboratories株式會社)，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出分子量。其結(jié)果見圖5。分子量約為80,000，這與由氨基酸序列推定的分子量83,122大致一致。(7)底物特異性在150pL含有10mM各種底物的pH4.5的100mM乙酸鈉緩沖液中混合50^iL經(jīng)100倍稀釋的本發(fā)明的提純酶液，在4(TC進(jìn)行20分鐘反應(yīng)。但是，對于使用對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷作為底物的反應(yīng)，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為5分鐘。反應(yīng)后，對游離的對硝基苯酚定量、或者使用"ShodexSUGAR"(昭和電工株式會社)柱通過高速液相色譜法進(jìn)行分析，對分解的底物進(jìn)行定量，求出設(shè)最大活性為100時(shí)對各底物的相對活性。該結(jié)果見表2。另外，對于其中能夠作為底物的物質(zhì)，測定反應(yīng)速度，其結(jié)果見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>cc-半乳糖苷酶的反應(yīng)速度常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(8)抑制因子在溶解有6mM對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的pH4.5的乙酸鈉緩沖液中添加各種金屬離子，使最終濃度為lmM，并定量到150pL，混合50pL經(jīng)100倍稀釋的本發(fā)明的提純酶液，在40'C反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)后，對游離的對硝基苯酚進(jìn)行定量，由此測定活性，求出設(shè)最大活性為100時(shí)的相對活性。該結(jié)果見表4。[表4:金屬對a-半乳糖苷酶的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例3取0.5U實(shí)施例1所述的提純a-半乳糖苷酶，將其添加到裝在1.5mL聚丙烯制管中的200pL糖液(pH5.0的100mM乙酸鈉緩沖液中含有73%蔗糖、12%半乳糖)中并混合，在6(TC、1，200rpm進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)開始45小時(shí)后，采集反應(yīng)液之中的20^L，用480pL蒸餾水進(jìn)行稀釋后，在99'C處理10分鐘，由此使酶熱失活。將熱失活后的稀釋糖液降溫到常溫，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析。其結(jié)果見圖6。生成的低聚糖中的棉子糖含有率為82%，反應(yīng)液中的棉子糖濃度為1.67重量％。實(shí)施例4(1)染色體DNA的制備通過常規(guī)方法制備凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株的染色體DNA。對60mL以實(shí)施例1所述的方法取得的凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，回收菌體。將所得到的菌體懸浮在Lysis緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、50mM葡萄糖)中，充分清洗。進(jìn)行離心分離，回收菌體后，再次懸浮于Lysis緩沖液中，在其中加入溶菌酶，在37。C培養(yǎng)45分鐘。接著，添加SDS和RNase，在37。C培養(yǎng)45分鐘。其后，添加蛋白酶K，在5(TC緩慢振蕩60分鐘。將此處得到的溶液用苯酚-氯仿和氯仿處理后，用乙醇沉淀，將析出的核酸纏在玻璃移液管上，進(jìn)行回收。該核酸用70%乙醇清洗后，進(jìn)行干燥，并再次溶解在TE中。通過該操作，制備出約lmg的染色體DNA。(2)a-半乳糖苷酶基因的分離根據(jù)上述(l)制備的染色體DNA設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增a-半乳糖苷酶基因碎片的PCR引物并進(jìn)行合成?？梢曰谠醋怨膸追N微生物的a-半乳糖苷酶基因的序列分析結(jié)果來進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，作為上游引物合成具有5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'(序列編號3)序列的低聚DNA，作為下游引物合成具有5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3'(序列編號4)序列的低聚DNA。需要說明的是，序列中，I表示肌苷，Y表示C或T，R表示A或G。使用此處得到的PCR引物，以上述(l)中制備的染色體DNA為模板，通過PCR法進(jìn)行a-半乳糖苷酶基因碎片的擴(kuò)增，得到含有380個(gè)堿基對的a-半乳糖苷酶基因碎片。使用DNA測序儀，對此處得到的基因碎片的堿基序列進(jìn)行解析。為了基于解析得到的a-半乳糖苷酶基因碎片的堿基序列獲得含有a-半乳糖苷酶基因全長的DNA碎片，設(shè)計(jì)并合成了反向PCR用PCR引物。作為上游弓i物合成具有5'-TGATCAACAACTGGGAAAGCGACCT-3'(序列編號5)序列的低聚DNA，作為下游引物合成具有5'-GAACTGGTCCTGCTGCACAATTCC-3'(序列編號6)序列的低聚DNA。接著，制備用于反向PCR的模板。將上述(l)中制備的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII消化后，將所得到的DNA碎片用T4DNALigase進(jìn)行自身環(huán)化，制成反向PCR的模板。對于該模板，使用如上合成的反向PCR用引物，通過PCR法進(jìn)行含有a-半乳糖苷酶基因的DNA碎片的擴(kuò)增，得到含有a-半乳糖苷酶基因的全序列的由4500個(gè)堿基對構(gòu)成的PCR產(chǎn)物。(3)堿基序列的解析使用DNA測序儀，由(2)中得到的PCR產(chǎn)物確定a-半乳糖苷酶基因的堿基序列。結(jié)果解讀到具有從序列編號1所示的5'末端開始的DNA堿基序列的2190個(gè)堿基對的a-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因。該序列是迄今未被發(fā)現(xiàn)的新型基因。另外，由該DNA堿基序列類推的凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株生產(chǎn)的oc-半乳糖苷酶含有730個(gè)氨基酸，具有序列編號2所示那樣的從N末端開始的氨基酸序列。數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果如下該氨基酸序列與來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)的a-半乳糖苷酶(AgaN)具有.57%的相同性，與來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的a-半乳糖苷酶(AgaA)具有56°/。的相同性，與來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的a-半乳糖苷酶(AgaB)具有56%的相同性，與來源于棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)的a-半乳糖苷酶具有56%的相同性，表明其編碼新型oc-半乳糖苷酶。(4)a-半乳糖苷酶基因的表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化基于(3)中得到的a-半乳糖苷酶基因的序列，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增含有a-半乳糖苷酶基因的SD序列、結(jié)構(gòu)基因、終止密碼子的區(qū)域的PCR引物?；?2)中得到的含有4500個(gè)堿基對的PCR產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行PCR引物的設(shè)計(jì)，作為上游引物合成具有5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3'(序列編號7)序列的低聚DNA，作為下游引物合成具有5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3'(序歹U編號8)序列的低聚DNA。以(2)中得到的含有4500個(gè)堿基對的PCR產(chǎn)物作為模板，使用合成的PCR引物，通過PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有2325個(gè)堿基對的PCR產(chǎn)物。對此處得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑化、磷酸化。用限制性內(nèi)切酶EcoRV對pBluescriptIIKS(+)載體進(jìn)行消化并進(jìn)行脫磷酸化，在該載體上連接上述得到的經(jīng)末端平滑化、磷酸化的PCR產(chǎn)物，制成新的質(zhì)粒載體pBlue/agaA。該質(zhì)粒載體中導(dǎo)入有能夠在大腸桿菌中有效表達(dá)作為外來基因而連接的基因的lac啟動子，能夠有效地表達(dá)、制造a-半乳糖苷酶。通過熱激，將所得到的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到利用氯化鈣法制備的大腸桿菌JM109株感受態(tài)細(xì)胞中，制作重組微生物。(5)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和a-半乳糖苷酶的表達(dá)將(4)中制作的重組大腸桿菌JM109-pBlue/agaA用含有100mg/L氨芐青霉素的30mLLB培養(yǎng)基在37'C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，進(jìn)行離心分離來回收重組大腸桿菌。菌體用10OmM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)清洗后，再次懸浮于同樣的緩沖液中，用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行破碎。通過上述方法測定該破碎液的a-半乳糖苷酶活性，結(jié)果為19.9U/培養(yǎng)液(mL)。實(shí)施例5取l.OU實(shí)施例4所述的通過培養(yǎng)重組體所得到的a-半乳糖苷酶，將其添加到裝在1.5mL聚丙烯制管中的200|aL糖液(pH5.0的100mM乙酸鈉緩沖液含有73%蔗糖、12%半乳糖)中并混合，在6(TC、1，200rpm進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)開始16小時(shí)后，采集反應(yīng)液之中的20(iL，用480pL蒸餾水進(jìn)行稀釋后，在99'C進(jìn)行10分鐘處理，由此使酶熱失活。將熱失活后的稀釋糖液降溫到常溫后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析。其結(jié)果見圖7。生成的低聚糖中的棉子糖含有率為82%，反應(yīng)液中的棉子糖濃度為1.20重量％。實(shí)施例6將凝結(jié)芽孢桿菌AKC-004株(保藏編號FERMP-21092(移交為FERM-ABP10948);保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL表1所述的培養(yǎng)基中，在55"C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以lOOOOrpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始16h后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99。C對酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析，其結(jié)果見圖8。生成的低聚糖中的棉子糖含有率為80%(反應(yīng)液中的棉子糖濃度為0.70重量％)。將凝結(jié)芽孢桿菌AKC-003株(保藏編號FERMP-21091;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL表1所述的培養(yǎng)基中，在55。C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將lOmL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300|iL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始38h后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960(iL蒸餾水充分混合，在99'C對酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析，此時(shí)，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為80°/。(反應(yīng)液中的棉子糖濃度為0.76重量％)。實(shí)施例8將凝結(jié)芽孢桿菌AKC-005株(保藏編號FERMP-21093;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL表1所述的培養(yǎng)基中，在55'C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300(iL糖液(含62.5°/。蔗糖、12.5%半乳糖的lOOmM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度6CTC、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始38h后，回收40jiL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99'C對酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，使用"Hypercarb"CThermodectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析，此時(shí)，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為91%(反應(yīng)液中的棉子糖濃度為0.32重量％)。實(shí)施例9將凝結(jié)芽孢桿菌AKC-006株(保藏編號FERMP-21094;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55'C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL表1所述的培養(yǎng)基中，在55'C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的lOOmM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的lOOmM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°c、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始38h后，回收40(iL反應(yīng)液，將其與960mL蒸餾水充分混合，在99'c對酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通過高速液相色譜法進(jìn)行分析，此時(shí)，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為76%(反應(yīng)液中的棉子糖濃度為0.86重量％)。產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過使用本發(fā)明，能夠提供使用低成本的原料選擇性制造棉子糖的方法。權(quán)利要求1、一種α-半乳糖苷酶，其具有下述特性(1)作用所述酶具有如下性質(zhì)在以蔗糖和半乳糖為原料的脫水縮合反應(yīng)中，在生成的低聚糖中的棉子糖含有率為0.5％以上時(shí)，棉子糖的合成選擇率為65％以上；(2)最適pH范圍3.5～5.0；(3)穩(wěn)定pH范圍3.5～10.0；(4)分子量約80,000。2、如權(quán)利要求1所述的(x-半乳糖苷酶，其來源于屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物。3、如權(quán)利要求2所述的a-半乳糖苷酶，其中，所述凝結(jié)芽孢桿菌是凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一種。4、一種凝結(jié)芽孢桿菌及其變異體，所述凝結(jié)芽孢桿菌屬于凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一種。5、一種(X-半乳糖苷酶，其含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列(a)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)在序列編號2表示的氨基酸序列中，缺失、取代和/或添加了l個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。6、一種a-半乳糖苷酶基因，其編碼含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的a-半乳糖苷酶(a)序列編號2表示的氨基酸序列；(b)在序列編號2表示的氨基酸序列中，缺失、取代和/或添加了l個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)與序列編號2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。7、一種a-半乳糖苷酶基因，其含有下述(a)或(b)的堿基序列(a)序列編號1表示的堿基序列；(b)在序列編號1表示的堿基序列中，缺失、取代和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)堿基的堿基序列，并且其編碼具有a-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。8、一種重組載體，其含有權(quán)利要求6或7所述的(x-半乳糖苷酶基因。9、一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有權(quán)利要求6或7所述的a-半乳糖苷酶基因或權(quán)利要求8所述的重組載體。10、一種cc-半乳糖苷酶，其是培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。11、一種酶組合物，其含有權(quán)利要求13、5或10的任一項(xiàng)所述的a-半乳糖苷酶。12、如權(quán)利要求ll所述的酶組合物，其中，該組合物還含有選自a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、p-半乳糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、果膠裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一種以上的成分。13、一種棉子糖合成試劑，其含有權(quán)利要求11或12任一項(xiàng)所述的酶組合物。14、一種棉子糖的制造方法，其特征在于，該制造方法使用權(quán)利要求13、5或10的任一項(xiàng)所述的a-半乳糖苷酶；權(quán)利要求11或12所述的酶組合物；或者權(quán)利要求13所述的棉子糖合成試劑。15、一種棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)屬于凝結(jié)芽孢桿菌的微生物而得到的。16、一種棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)屬于凝結(jié)芽孢桿菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一種凝結(jié)芽孢桿菌和/或其變異體而得到的。17、一種棉子糖的制造方法，其特征在于，該方法利用微生物催化劑，所述微生物催化劑是培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。18、如權(quán)利要求1417中任一項(xiàng)所述的棉子糖的制造方法，其中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為65%以上。19、如權(quán)利要求1418中任一項(xiàng)所述的棉子糖的制造方法，其中，該方法使用蔗糖和半乳糖作為原料。20、如權(quán)利要求19所述的棉子糖的制造方法，其中，原料中的蔗糖濃度為30%(w/v)90%(w/v)，原料中的半乳糖濃度為2%(w/v)45%(w/v)。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種能夠選擇性合成棉子糖的新型α-半乳糖苷酶。通過本發(fā)明，提供具有如下性質(zhì)的α-半乳糖苷酶在以蔗糖和半乳糖為原料的脫水縮合反應(yīng)中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率為0.5％以上時(shí)，棉子糖的合成選擇率為65％以上。文檔編號C12P19/18GK101657544SQ20088000539公開日2010年2月24日申請日期2008年2月19日優(yōu)先權(quán)日2007年2月19日發(fā)明者今津晉一,小西一誠申請人:旭化成化學(xué)株式會社