專利名稱：表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芽孢表面展示技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種枯草芽孢桿菌(fe"L ^ ^/力^7/s)芽孢表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢制備方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC3. 1.1.3)能催化酯類水解、合成或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，生成長鏈脂肪酸單 酯,在醫(yī)藥、食品、制革、洗滌劑、能源等工業(yè)生產(chǎn)中具有極其廣泛的應(yīng)用價值。 尤其是利用脂肪酶生產(chǎn)生物柴油，因其對原料的選擇性低、反應(yīng)條件溫和、能耗 低、產(chǎn)物及副產(chǎn)物較易分離且無污染排放，是一種更理想的節(jié)能、環(huán)保型工藝 (Watanabe Y, et al. / Ca&丄5: ^r^/watj'c, 2007, 44 ( 324) :99 105)。
但限制生物酶法制備生物柴油規(guī)?；a(chǎn)的主要問題是脂肪酶生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定 性差、利用率低、甲醇等低碳醇對酶的失活效應(yīng)等缺陷，難以達到大規(guī)模生產(chǎn)生 物柴油的要求(鄧?yán)?，生物工程學(xué)報，2003， 19 (1):97 101)。生產(chǎn)滿足市場需 求的脂肪酶產(chǎn)品最迫切解決的問題是研制低成本、高催化活性和良好穩(wěn)定性的脂 肪酶。為了提高酶催化效率，降低生產(chǎn)成本，提高酶的使用率，通過改良生產(chǎn)工 藝已能顯著提高酶的穩(wěn)定性和催化活性，但不能從根本上降低脂肪酶的生產(chǎn)和使 用成本。另外，通過固定化酶同連續(xù)化的生物反應(yīng)器的結(jié)合，使脂肪酶具有良好 的催化活性和穩(wěn)定性，使用壽命延長，大大降低了酶制品及整個生產(chǎn)工藝的成本 (Noureddini H, et al.腸，離7"e血",2005, 96 (7) : 769 777)，但月旨肪酶在 純化和固定化過程中，活性容易受到破壞，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。全細胞生物催化 劑可克服固定化酶所存在的不足，該技術(shù)將產(chǎn)脂肪酶的細胞固定在載體上(如生 物支架顆粒，BSPs)用作全細胞生物催化劑。操作更為簡便、經(jīng)濟，省掉純化的 繁瑣工序，而且固定化過程可在批量培養(yǎng)微生物時同步完成。但脂肪酶是胞內(nèi)酶， 催化底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運受到細胞膜的屏障作用而降低反應(yīng)速度，并且細胞內(nèi)脂肪 酶的表達量受底物組成和濃度的調(diào)節(jié)，需要通過向培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的脂肪酸以 提高胞內(nèi)脂肪酶的含量、酶催化活性、穩(wěn)定性及膜的通透性來加以調(diào)控；并且全 細胞催化劑在無溶劑體系中穩(wěn)定性差，而甲醇對細胞活性、脂肪酶表達和活性均 有抑制作用([Li W， et al. / Cate7 5, j&j，a"c, 2007, 45: 122 127)。
枯草芽孢桿菌(fe"77"s卯力"7A)為環(huán)境友好菌，其芽孢具有獨特的抗逆性、容易培養(yǎng)、芽孢比重大易分離、以芽孢表面展示技術(shù)制備的重組酶，不需要 分離純化；由于酶被展示在芽孢表面，可克服全細胞生物催化劑的細胞壁和細胞 膜屏障；芽孢具有抗有機溶劑、高溫等不利因素，能顯著提高酶的催化活性和穩(wěn) 定性。基于上述優(yōu)點，以枯草芽孢桿菌芽孢為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將催 化活性的酶展示于芽孢表面，制備具有催化活性的重組芽孢成為工業(yè)化酶制劑研 究和生產(chǎn)關(guān)注的焦點(Jung HC， et al.艦脅fec力加Z 2006， 6 (23) :1-9)。本發(fā)明 以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白為分子載體，將來源于細菌或動植物細胞具有三酰 甘油脂水解功能的脂肪酶展示于枯草芽孢桿菌芽孢表面，構(gòu)建表面展示具有脂肪 酶催化活性的重組芽孢，迄今尚未見類似的報道或發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制 備方法。該方法以枯草芽孢桿菌芽孢為載體，將具有催化三酰甘油脂水解功能的 脂肪酶展示于枯草芽孢桿菌芽孢表面，制備表面展示具有脂肪酶催化活性的重組 芽孢。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
表面展示具有催化活性的脂肪酶(Lipase)的重組芽孢的制備方法，是以枯 草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白為分子載體，將衣殼蛋白基因與編碼具有催化三酰甘油 脂水解功能的脂肪酶基因重組后融合表達，使脂肪酶通過衣殼蛋白展示于枯草芽 孢桿菌芽孢表面，構(gòu)建表面展示具有脂肪酶催化活性的重組芽孢。
本發(fā)明優(yōu)選枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因coM、 coK和co"作為表面展 示蛋白的分子載體，選擇微生物或動植物細胞來源的具有三酰甘油脂水解和轉(zhuǎn)酯 催化功能脂肪酶基因7&ase為供體基因。
本發(fā)明涉及本發(fā)明所選擇的芽孢衣殼蛋白基因co^、c"C和co^分別與脂 肪酶基因(乃》ase)編碼序列重組后構(gòu)建的質(zhì)粒，在這些重組質(zhì)粒中分別含有芽 孢衣殼蛋白基因的啟動子、不含終止密碼子的編碼序列與h'pase的編碼序列的 重組基因，可在枯草芽孢桿菌分化形成芽孢時分別融合表達重組蛋白 CotB-Lipase、 CotC化ipase.、 CotG-Lipase。.
本發(fā)明還涉及本發(fā)明構(gòu)建的融合表達CotB-Lipase、 CotC-Lipase、 CotG-Lipase的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化s"6"h's篩選所得到的重組菌株，這些重組菌株誘導(dǎo)形成的重組芽孢，重組芽孢表面展示的脂肪酶的催化活性以水解4-硝基苯基月桂酸酯生成黃色的4-硝基苯比色法鑒定。
本發(fā)明涉及基因C0/5啟動子及不含終止密碼子的編碼序列片段擴增的引物
序列
cotB-1: GAGATCTAGAACGGATTAGGCCGTTTGTCC ， co但-2:GAGAGGTACCGGATGATTGATCATCTGAAG。 本發(fā)明涉及基因co/C啟動子及不含終止密碼子的編碼序列片段擴增的引物
序列
cotC-1: GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC cotC-2:GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT
本發(fā)明涉及基因cwG啟動子及不含終止密碼子的編碼序列片段擴增的引物
序列
cotG-l: GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC cotG-2: GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG 本發(fā)明涉及5fl"7/w 淀粉酶基因片段擴增的引物序列
呵E墨1 :CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG amyE-2: GATTGTGAATTGATCTCCATCC
與本領(lǐng)域已知的方法相比，本發(fā)明方法將不同來源的具有三酰甘油脂水解功 能的脂肪酶展示于5"d//^ 芽孢的表面，利用芽孢所具有的獨特抗逆性，
提高脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明構(gòu)建的表面展示脂肪酶的5acLL/"s s^"力's重組芽孢，可用于醫(yī)藥、食品、制革、洗滌劑、生物柴油生產(chǎn)等領(lǐng)域。


圖l融合表達CotC-LipA整合性重組質(zhì)粒pJS433結(jié)構(gòu)示意圖。a/zy^f -朋t/ 和湖yf T -e/K/分別表示淀粉酶基因編碼序列的5'端和3'端DNA片斷，通 過雙交換整合在fe"J;S/朋(吵，染色體的淀粉酶基因中；CW, 力/分別表示氯霉素抗性基因，紅霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大腸 桿菌或萬aciW^幼Z "J^ 7^9 (吵，中的篩選；cotC-h>4為在枯草桿菌芽孢中 融合表達CotC-LipA重組蛋白的基因片段，該片段含co^啟動子序列、不含co《 終止密碼子的編碼序列，以及來源于"3c/7J^ s^"h's 168 (/r,)的脂肪酶基因(力》力)的全編碼序列。or/C為大腸桿菌復(fù)制子片段。
圖2菌株DRJS433重組芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法測定。DRJS426 為不含重組脂肪酶的重組芽孢；DRJS433為表面展示脂肪酶(LipA)的重組芽孢
圖3融合表達CotB-LipA整合性重組質(zhì)粒pJS549結(jié)構(gòu)示意圖。a/z /^f -e/ d 和朋yf <T -e/^/分別表示淀粉酶基因編碼序列的5'端和3'端DNA片斷，通 過雙交換整合在萬aci〃w w6"7A (吵，染色體的淀粉酶基因中；C#， ^￥， 分別表示氯霉素抗性基因，紅霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大腸桿菌 或few77w w6"7A (吵-)中的篩選；coM-7ip力為在枯草桿菌芽孢中融合表達 CotB-LipA重組蛋白的基因片段，該片段含c"5啟動子序列、不含"M終止密 碼子的CotB編碼序列，以及來源于fe""M s"6""s 168 (吵')的脂肪酶基因 的全編碼序列。or/C為大腸桿菌復(fù)制子片段。
圖4菌株DRJS549重組芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法測定。DRJS426為不 含重組脂肪酶的重組芽孢；DRJS549為表面展示脂肪酶(LipA)的重組芽孢。
圖5融合表達CotG-LipA整合性重組質(zhì)粒pJS551結(jié)構(gòu)示意圖。a^^f -e/^ 和-朋J分別表示淀粉酶基因編碼序列的5'端和3'端DNA片斷，通 過雙交換整合在ifecy77^ w力"7A7份(吵-)染色體的淀粉酶基因中；
^/分別表示氯霉素抗性基因，紅霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大腸 桿菌或泡c/L/ws s"力"7/s 168 (吵〕中的篩選；coK-7i/^為在枯草桿菌芽孢中 融合表達CotG-LipA重組蛋白的基因片段，該片段含co^啟動子序列、不含 終止密碼子的CotG編碼序列，以及來源于》ac^7"s sM07ys 168 (//^)的脂肪 酶基因(h';^)全編碼序列。為大腸桿菌復(fù)制子片段。
圖6菌株DRJS551重組芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法測定。DRJS426 為不含重組脂肪酶的重組芽孢；DRJS551為表面展示脂肪酶(LipA)的重組芽孢。
具體實施方式
實施例1
以CotC為載體蛋白表面展示枯草芽孢桿菌脂肪酶(LipA)的重組芽孢的制備
1.分子生物學(xué)操作
1. 1枯草芽孢桿菌染色體的提取
離心收集10mL5"ci〃歸w歸s 168(吵，(Bacillus Genetic Stock Center,
6Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210， USA)培養(yǎng)物，力B 0.5ml TE懸浮沉淀。每個微量離心 管加入30pl溶菌酶(100mg/ml)，于37。C反應(yīng)1小時；加入50mJ SDS(10。/。)與20^1 蛋白酶K(20mg/ml)，震蕩均勻，于37'C反應(yīng)2小時，加入等體積的苯酚/氯仿 抽提后取上清，加入2倍體積的乙醇，室溫下使DNA沉淀超過2小時12,000g 離心10分鐘，棄上清液后以75%乙醇50(^1洗DNA沉淀物，以去除無機鹽離子。 待DNA沉淀物干燥后，加入30 50pl TE或ddH20溶解DNA，于-2(TC下保存
備用o
1. 2分子生物學(xué)技術(shù)
所有質(zhì)粒的構(gòu)建采用Sambrook等人(《分子克隆試驗手冊》第二版，冷泉 港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進行，用于本發(fā)明 的所有回收DNA片段均采用上海生工生物工程有限公司凝膠回收試劑盒分離純 化。所有PCR產(chǎn)物克隆片段均經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序。
1. 3 PCR擴增
用于基因擴增的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，為便于擴增產(chǎn)物的 克隆部分引物5'端添加限制性內(nèi)切酶識別位點，PCR反應(yīng)體系中含10 mmol/L Tris'Cl(pH 8.3)， 50 mmol/L MgCI2，上下游引物各100 pmol， 200 ^unol/LdNTPs， 50ng模板DNA， 2.5 U DNA聚合酶(72^/尸>=1/1， U/U)。 PCR反應(yīng)程序根據(jù) 不同引物特征設(shè)置。
2. 質(zhì)粒的構(gòu)建
2. l基本質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)5ad/to sw6"fc 168染色體上的脂肪酶基因/!》J (Gene BanK序列號 AAZ07988)序列合成引物
lipA隱1 :GAGAGGAGCTCTCGGTCGTGTCGGCC ATCC lipA-2:GAGAGGAATTCTTAACTCGGTCTCAGTGCCAG 為便于克隆，上游引物lipA-l添加了 ^ "/位點，下游引物lipA-2添加了 ￡coi / 位點，以lipA-l和lipA-2:為引物，以Saci/ZwsSM&ito 168(Wf)染色體為模板，PCR 擴增/(pJ基因編碼序列片段，PCR反應(yīng)程序為94'C變性5min; 94°C 1 min， 56。Clmin， 72。C 1 min， 30個循環(huán):72。C延伸5min。 PCR產(chǎn)物大小為709bp， 分別以限制性內(nèi)切酶S"c/和五c^R/消化酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后插入pUC18 (《分子克隆試驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989) 相應(yīng)的克隆位點，克隆片段測序確定序列正確后命名為pJS422。
以Bam/Z/酶切由發(fā)明人保存的質(zhì)粒pRL598 (Black, T. A.， and C. P. Wolk. 1994. J. Bacteriol. 176:2282-2292.)，回收含氯霉素(CW) —紅霉素抗性(i:w7) 基因片段(約1.9kb)，以7V)A^聚合酶處理后，與S"Z/酶切、7VDiV^聚合酶補 平的pJS422連接，分別以Sam///和X; "/酶切鑒定后重組質(zhì)粒命名為pJS424。
根據(jù)5flc"/www6"to 168染色體上的淀粉酶基因flw;^(Gene BanK序列號 NP—388186)序列，設(shè)計并合成引物
amyE-1 :CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG
呵E-2: GATTGTGAATTGATCTCCATCC
以amy-l和amy-2為引物，5a"7/ws sw6"fc 168O;0染色體為模板PCR擴增 "ff^五基因部分編碼序列片段。PCR反應(yīng)程序為94。C變性5min; 94°C 1 min， 6(TClmin, 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72。C延伸5min。 PCR產(chǎn)物大小約lkb，抽 提沉淀后以7W)A^聚合酶處理后與Pv"/7酶切pUC18大片段連接，連接產(chǎn)物傳 化￡.co/z'DH5a，鑒定后的重組質(zhì)粒為整合平臺質(zhì)粒pJS225。
以尸vm//酶切質(zhì)粒pJS424，回收Cm^&^-Zz:^(大小約2.6kb)重組DNA片段 插入整合平臺質(zhì)粒pJS225中的Sma/位點，鑒定后的重組質(zhì)粒命名為pJS426， 該質(zhì)粒為不含5""7/^ /&/&復(fù)制位點的整合型質(zhì)粒，可通過質(zhì)粒中的被插入失 活的flwy五基因片段與Ba"7/m168(&; -)染色體上的同源片段重組而整合 與染色體上，并使重組基因得以穩(wěn)定遺傳。 2. 2融合表達CotC-LipA重組蛋白整合型重組質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)5fl"7/^犯6"fc 168染色體上的cWC (Gene BanK序列號NP—389653) 序列，設(shè)計并合成以下引物
cotC-l: GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC cotC-2: GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT 為便于克隆，上游引物cotC-l添加了力a/位點，下游引物cotC-2添加了 /Qw/位點。以cotC-l和cotC-2為引物，3^"7/^; ^^7!; 168(>70染色體為模板， 擴增含co,C基因的啟動子和不含終止密碼子的編碼序列，PCR反應(yīng)程序為94°C 變性5min; 94°C 1 min， 52°C 1 min， 72°C 1 min, 30個循環(huán);72。C延伸5min。
8為便于克隆，擴增各基因的上游引物添加了力"/位點，下游引物添加了 ATp"/ 位點。擴增產(chǎn)物大小為650bp，抽提沉淀后以乃"/和A:/7w/酶切，插入質(zhì)粒pJS426 中的JH^/和i^w/位點，得到的重組質(zhì)粒測序確定克隆基因正確后命名pJS433。 整合型重組質(zhì)粒pjS433中含重組基因cwC-/!i^，該質(zhì)粒的物理圖譜見本發(fā)明附 圖1。
3.融合表達重組蛋白的5ac,7/附菌株的篩選鑒定
分別將整合型重組質(zhì)粒pJS431和pJS433轉(zhuǎn)化5ad//^ w&rifo 168(/r//)，以 含0.4 u g/mL紅霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，從平板上挑單菌落接種在3mL含相 同抗生素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按以下兩種方法鑒定轉(zhuǎn)化子(l)淀粉 平板碘液染色法。1%淀粉平板的制備固體LB培養(yǎng)基中加可溶性淀粉至終濃 度為1%，高壓滅菌后制備平板.
碘液的配制碘化鉀2g;蒸餾水300ml;碘lg，先將碘化鉀溶于少量蒸餾 水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至300mL，保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。
取5 u L于含紅霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液涂在淀粉平板上，37'C培養(yǎng)16 小時，取2mL碘液噴于淀粉平板上，菌落及周圍顏色為白色表明重組基因插入 萬^7/^幼6礎(chǔ)"68(吵-)染色體上的淀粉酶基因flwj^中，菌落及周圍顏色變藍 表明重組基因沒有插入淀粉酶基因flm》必中。鑒定后的重組菌株分別命名為 DRJS426和DRJS433,其中DRJS426為對照重組菌株。
4.表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定 以DSM培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組菌株DRJS431和DRJS433形成芽孢。 DSM培養(yǎng)基的配制0.8%肉湯營養(yǎng)液(Difco)， 0.1% KC1， 0.025% MgS04 7H20， 1.0 mM Ca(N03)2,10 n M MnCl2， 1.0 P M FeS04。
分別取重組菌株DRJS431和DRJS433單菌落接種于3mLDSM培養(yǎng)基中， 37。C震蕩培養(yǎng)過夜，按h 100接種于200mLLB液體培養(yǎng)基中，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心 IO分鐘收集芽孢，重懸于2mL無菌水中。以終濃度為10mg/mL溶菌酶37"C處理30 分鐘破壞營養(yǎng)細胞，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀芽孢，力QlmL50mM磷酸鈉緩 沖液(pH7.0)重懸芽孢，以LB平板計數(shù)芽孢后，調(diào)整芽孢的濃度，使終濃度約 為2X10^個/mL。重組芽孢脂肪酶活性利用4-硝基苯基月桂酸酯顯色法鑒定。脂 肪酶活性通過脂肪酶水解4-硝基苯基月桂酸酯生成的黃色產(chǎn)物4-硝基苯，4-硝基苯對405 nm可見光有最大吸收值，利用分光光度計測定405 nm的光吸收值，確定 重組芽孢脂肪酶活性。
重組芽孢脂肪酶活性測定方法。
反應(yīng)液的配制lmM4-硝基苯基月桂酸酯，5%(v/v)異丙醇，0.6%(v/v) Triton X-IOO， 50 mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。
重組芽孢脂肪酶水解反應(yīng)在50mL具塞錐形瓶中，加入1X10^個重懸的 DRJS433重組芽孢，加反應(yīng)液至20mL，于37'C搖床中，200轉(zhuǎn)/分鐘，每間隔40 分鐘取2mL反應(yīng)混和物。
陰性對照脂肪酶水解反應(yīng)在50mL具塞錐形瓶中，加入1X10^個重懸的 DRJS431重組芽孢，加反應(yīng)液至20mL,于37'C搖床中，200轉(zhuǎn)/分鐘，每間隔40 分鐘取2mL反應(yīng)混和物。
芽孢脂肪酶活性測定 一定時間間隔取出的2mL反應(yīng)混和物8000轉(zhuǎn)/分鐘離 心5分鐘，沉淀芽孢，取2mL上清液于比色皿中，同時取2mL反應(yīng)液于另一比色 皿中作空白對照；以分光光度計測定405nm的光吸收值。菌株DRJS433重組芽孢 及對照菌株DRJS426重組芽孢脂肪酶活性測定結(jié)果見本發(fā)明

和附圖2。
實施例2
以CotB為載體蛋白表面展示枯草芽孢桿菌脂肪酶LipA的重組芽孢的制備
1. 分子生物學(xué)操作
fecj77〃s w6"乃's 168 (trp-)染色體的提取，分子生物學(xué)技術(shù)，PCR擴增操 作同本發(fā)明實施例1中分子生物學(xué)操作
2. 質(zhì)粒的構(gòu)建
2. 1基本質(zhì)粒構(gòu)建操作方法同本發(fā)明實施例1中2.1基本質(zhì)粒的構(gòu)建。 2. 2融合表達CotB-LipA重組蛋白整合型重組質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)萬ac^wjw^'fe 168染色體上的co詔(Gene BanK序列號NP_391486) 序列，設(shè)計并合成以下引物
cotB-l: GAGATCTAGAACGGATTAGGCCGTTTGTCC ，
cotB-2:GAGAGGTACCGGATGATTGATCATCTGAAG。
為便于克隆，上游引物co但-l添加了 X&a/位點，下游引物cotB-2添加了
10《;w/位點。以cotB-1和cotB-2為引物，Sac"/MS s"6"fo 168(^p—)染色體為模板，擴增含coW基因的啟動子和不含終止密碼子的編碼序列，PCR反應(yīng)程序為94°C變性5min; 94。Clmin， 52°C 1 min, 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72。C延伸5min。為便于克隆，擴增各基因的上游引物添加了 J^fl/位點，下游引物添加了位點。擴增產(chǎn)物大小為1,088bp，抽提沉淀后以乃fl/和《;w/酶切，酶切產(chǎn)物插入質(zhì)粒pJS426中的力"/和A:jw/位點，得到的重組質(zhì)粒中克隆基因coW測序正證明正確后命名為pJS549。整合型重組質(zhì)粒pJS549中含重組基因co詔-/^4，該質(zhì)粒的物理圖譜見本發(fā)明說明書及附圖3。
3.融合表達重組蛋白的5ac"/附s"6說fc菌株DRJS549的篩選鑒定
融合表達重組蛋白的5ac/Z/附犯^/to 1680p—)菌株的篩選鑒定操作方法同本發(fā)明實施例1中3.融合表達重組蛋白的5fl"7/^ w^/fc菌株的篩選鑒定。鑒定后的重組菌株命名為DRJS549。
4.表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定
表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定的操作方法同本發(fā)明實施例1中4.表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定，鑒定結(jié)果見本發(fā)明

及附圖4。
實施例3
以CotG為載體蛋白表面展示枯草芽孢桿菌脂肪酶LipA的重組芽孢的制備
1. 分子生物學(xué)操作
Bacillus subtilis染色體的提取，分子生物學(xué)技術(shù)，PCR擴增操作同本發(fā)明實施例1中分子生物學(xué)操作
2. 質(zhì)粒的構(gòu)建
2. 1基本質(zhì)粒構(gòu)建操作方法同本發(fā)明實施例1中2.1質(zhì)粒的構(gòu)建。2. 2融合表達CotB-LipA重組蛋白整合型重組質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)5ac!7/iw w6rifc 168染色體上的cofG (Gene BanK序列號NP—391486)序列，設(shè)計并合成以下引物
cotG-1: GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC
cotG-2GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG
為便于克隆，上游引物cotG-l添加了 ^&fl/位點，下游引物cotG-2添加了尺; "/位點。以cotG-1和cotG-2為引物，fiacz7/ws s"6"fc 168(rrp-)染色體為模板，擴增含a^G基因的啟動子和不含終止密碼子的編碼序列,PCR反應(yīng)程序為:94'C變性5min; 94。Clmin， 52°C 1 min， 72°C 1 min, 30個循環(huán)；72。C延伸5min。為便于克隆，擴增各基因的上游引物添加了力a/位點，下游引物添加了 Xp"/位點。擴增產(chǎn)物大小為971bp，抽提沉淀后以力a/和Kp"/酶切，插入質(zhì)粒pJS426中的JHw/和A:pw/位點，得到的重組質(zhì)粒測序確定克隆基因正確后命名pJS551。整合型重組質(zhì)粒pJS551中含重組基因corG-/(pJ，該質(zhì)粒的物理圖譜見本發(fā)明說明書及附圖5。
3.融合表達重組蛋白的fiadZ/us 菌株DRJS551的篩選鑒定
融合表達重組蛋白的^7d//^ W6"fc菌株的篩選鑒定操作方法同本發(fā)明實
施例1中3.融合表達重組蛋白的5a"7/^ w6"fc菌株的篩選鑒定。鑒定后的重組菌株命名為DRJS551。
4.表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定
表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定的操作方法同本發(fā)明實施例1中4.表面展示LipA重組芽孢的誘導(dǎo)及其鑒定，鑒定結(jié)果見本發(fā)明見本發(fā)明說明書及附圖6。
1權(quán)利要求
1、一種表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制備方法，其特征在于，利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與具有三酰甘油脂水解和轉(zhuǎn)酯功能的脂肪酶基因重組后，構(gòu)建融合表達的整合性重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示脂肪酶的重組芽孢。
2、 如權(quán)利要求1所述的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制備 方法，其特征在于，所說的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為co^、cotC和c"6"， 脂肪酶基因為來源于微生物、動植物細胞，其編碼產(chǎn)物具有三酰甘油脂水解和轉(zhuǎn) 酯催化功能。
3、 如權(quán)利要求2所述的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制備 方法，其特征在于，所說的融合表達的整合性重組質(zhì)粒是將枯草芽孢衣殼蛋白基 因與脂肪酶基因重組構(gòu)建的質(zhì)粒，在這些重組質(zhì)粒中含有整合基因a/zy《片段、 適用于大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的抗性選擇標(biāo)記基因、芽孢衣殼蛋白基因的啟動 子和不含終止密碼子的編碼序列與脂肪酶基因的編碼序列重組后的DNA片段。
4、 如權(quán)利要求3所述的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制備 方法，其特征在于，所說的枯草芽孢桿菌重組菌株是整合性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽 孢桿菌的所得菌株，該菌株染色體上含有適用于枯草芽孢桿菌的抗性選擇標(biāo)記基 因、以及芽孢衣殼蛋白基因的啟動子和不含終止密碼子的編碼序列與脂肪酶基因 的編碼序列，這些基因插入淀粉酶基因中并導(dǎo)致淀粉酶失活。
5、 如權(quán)利要求4所述的的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢的制 備方法，其特征在于，重組芽孢是枯草芽孢桿菌重組菌株誘導(dǎo)形成的枯草芽孢桿 菌芽孢，其表面展示脂肪酶，該重組芽孢具有三酰甘油脂水解和轉(zhuǎn)酯催化功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌芽孢表面展示具有催化活性的脂肪酶的重組芽孢制備方法。該方法是利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與具有三酰甘油脂水解和轉(zhuǎn)酯功能的脂肪酶基因重組后，構(gòu)建融合表達的整合性重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示脂肪酶的重組芽孢。與本領(lǐng)域已知的方法相比，本發(fā)明方法將不同來源的具有三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于Bacillus subtilis芽孢的表面，利用芽孢所具有的獨特抗逆性，能提高脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/62GK101475954SQ20081024364
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者寧德剛, 許小紅, 聞崇煒 申請人:江蘇大學(xué)