專利名稱：高活力冬蟲夏草菌油混懸劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬蟲夏草資源的人工培育，特別涉及人工培育中具備高活 力冬蟲夏草菌油混懸劑。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cw辦ce/w 寄生于蝙蝠蛾幼蟲上形成的蟲菌結(jié)合體，為我國特有的名貴中藥。由于對 野生冬蟲夏草資源的過度采挖及其生長自然環(huán)境的破壞，致使其處于滅絕 的邊緣，我國已將冬蟲夏草列入國家二級保護(hù)物種。因此，實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草 資源的人工培育具有深遠(yuǎn)的意義。但在冬蟲夏草人工培育的各個環(huán)節(jié)中， 提高冬蟲夏草菌中國被毛孢接種侵染率己成為關(guān)鍵的限制因素，其本質(zhì)就 是缺乏高活力高侵染力的冬蟲夏草菌種制劑。目前僅有報道直接利用中國 被毛孢的子囊孢子、分生孢子或菌絲體作為侵染體侵染蝙蝠蛾幼蟲，侵染 率低(人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究，俞永信，菌物研究，2(2) :42-46， 2004年)， 無法滿足冬蟲夏草人工培育產(chǎn)業(yè)化的需要。油混懸劑以其優(yōu)良的特性成為 真菌侵染昆蟲的優(yōu)先發(fā)展劑型。目前研制的油混懸劑多以孢子為侵染體， 以孢子萌發(fā)率評價制劑質(zhì)量，而冬蟲夏草菌通過固體或液體培養(yǎng)還難以獲
得大量孢子；再者，中國被毛孢的孢子在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)時間較長、易
3染雜菌，難以觀察單個孢子的萌發(fā)，因而難以通過常規(guī)的萌發(fā)實(shí)驗來評價 冬蟲夏草菌種制劑的質(zhì)量。目前關(guān)于冬蟲夏草菌油混懸劑的報道在文獻(xiàn)(冬
蟲夏草菌種油混懸劑的研究，毛先兵等，中國生物防治，24(增刊)106-110， 2008年)中有相關(guān)組分及含量的報道，但主要是解決了提高制劑的沉降體 積比和再分散性的問題，雖然細(xì)胞活力與沉降體積比及再分散性有一定關(guān) 聯(lián)，但不同的助劑會對細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著影響，甚至可能受到所用助劑濃 度的顯著抑制，實(shí)驗表明該制劑細(xì)胞活力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種以中國被毛孢發(fā)酵菌絲體或發(fā)酵菌絲體和孢子混合 物為侵染體的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑。
該混懸劑采用下述組分進(jìn)行配制混勻制得每毫升溶劑油中加入冬蟲夏 草菌種粉0.05 0.3克，助懸劑10 90毫克，表面活性劑5 100微升；其 中所述溶劑油是選自菜籽油、大豆油、玉米油、色拉油、鄰苯二甲酸二丁 酯的一種或多種按任意比例的混合溶液；所述冬蟲夏草菌種粉是中國被毛 孢通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體或通過固體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體和分生孢子混 合物，經(jīng)干燥、粉碎制得；所述表面活性劑是指司班-80、 OP-IO、吐溫-80 中的一種；所述助懸劑是指硬脂酸鋁。
其中所述冬蟲夏草菌種粉最好是收集12 20 "C固體發(fā)酵20 35天的中 國被毛孢菌絲體和分生孢子按任意比例的混合物，經(jīng)低溫干燥，粉碎并過 120目篩制得的菌粉。其中所述表面活性劑最好是司班-80 。
其中所述溶劑油優(yōu)選菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比6 10 : l
4配制，最好按體積比7 : 3配制。
本發(fā)明最好的配比關(guān)系是菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比7 : 3配
制成溶劑油，其中每毫升溶劑油中加入0.15 g冬蟲夏草菌種粉，60mg硬脂 酸鋁，50pL司班-80。
本發(fā)明用冬蟲夏草菌發(fā)酵菌絲體或發(fā)酵菌絲體和孢子混合物來配制菌 種制劑，以中國被毛孢發(fā)酵菌絲體或發(fā)酵菌絲體和孢子混合物為侵染體， 解決了冬蟲夏草菌孢子來源不足問題。這就要求制劑活力的評價方法不同 于孢子制劑。本發(fā)明在MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑， 噻唑蘭)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)通過測定活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶 (DHA)的活性來評價細(xì)胞的活力。
對MTT法的改進(jìn)之處在于常規(guī)的MTT法是將細(xì)胞與MTT溶液反應(yīng)后，經(jīng) 分離、乙酸乙酯或異丙醇提取，取上清液在分光光度計下測定吸光度并計 算活力。該冬蟲夏草菌油混懸劑是以油為載體，按常規(guī)操作分析活力的樣 品反應(yīng)前應(yīng)除去油，操作繁瑣且不徹底，對細(xì)胞活力也有很大影響。因而， 在檢測本發(fā)明時采用不除油的方式，在油混懸劑與MTT反應(yīng)前不必離心去油 等操作，經(jīng)試驗證明，油不影響反應(yīng)；反應(yīng)后，直接加入甲苯作為萃取劑， 經(jīng)超聲后，離心或靜置即可吸取上清液檢測吸光度，在萃取量和穩(wěn)定性方 面均優(yōu)于常規(guī)萃取劑，也大大簡化了操作步驟。
5本發(fā)明通過下述試驗檢測冬蟲夏草菌油混懸劑的細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶
(DHA)的活力，操作如下 1、 MTT法的操作步驟
取25mL離心管若干，每管中加冬蟲夏草菌油混懸劑400 u L，再加 入200 uL MTT溶液(5 mg/mL)。 37 。C恒溫反應(yīng)2 h后加入1 mol/L的鹽 酸2 mL終止反應(yīng)，再加入5 mL甲苯，超聲10 min，靜置萃取反應(yīng)產(chǎn)物 MTTf30min, 3000 rpm離心10 min，取上清液于560 nm下比色測定吸光
2、 MTT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
取200 uL不同濃度(0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、
1.0 mg/mL) MTT工作液于離心管中，再加入2 mL新配的濃度25%的Na2S 溶液，搖勻；置于37 "C反應(yīng)2h。其余操作同l。每個處理重復(fù)3次，取 均值。
3、 脫氫酶活力和比活力計算
脫氫酶活力大小由Kat單位數(shù)表示， 一個Kat單位&1.0i2沐at)定義為 每秒鐘使釋放出l mol的MTTf所需的酶量。比活力(Specific DHA)指每克 細(xì)胞所含有的脫氫活力單位數(shù)，單位為pKat/g。 酶活力可由式(1)計算。 Fx F xZ)x109
60x五M 式中，DHA:脫氫酶活力(pKat)Y: MTT還原反應(yīng)初速度(A/min) V: MTTf萃取液體積(mL)
D:菌種制劑的稀釋倍數(shù)(試驗之前對所取本發(fā)明產(chǎn)品進(jìn)行稀釋 的倍數(shù))
EM: MTTf摩爾吸光系數(shù)(l/mol'cm)，其中的摩爾吸光系數(shù)指單 位吸光物質(zhì)在一定波長的光透過吸收池時所產(chǎn)生的吸光度 值(用EM表示)。 MTTf的摩爾吸光系數(shù)EM可根據(jù)式(2)計算。
<formula>formula see original document page 7</formula>
式中，M: MTT分子量(414.3)A:吸光度
b:吸收池光程(cm) c: MTT濃度(g/L)
4、 MTT比色法的優(yōu)化
分光光度法測定物質(zhì)含量時，首先須確定反應(yīng)體系的最大吸收波長。 為了測定MTTf的摩爾吸光系數(shù)并計算脫氫酶活力，常用過量還原劑Na2S 將MTT還原成MTTf于最大吸收波長下測定吸收值。Na2S同琥珀酸脫氫酶一 樣可將水溶性MTT定量的還原為不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物MTTf 。
取200 iiL (1.0 mg/mL) MTT工作液于離心管中，再加入2 mL新配的 濃度為25X的Na2S溶液，搖勻，置于37。C反應(yīng)2h。其余操作同l。于400 650 nm波長下進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖l所示。可見反應(yīng)產(chǎn)物在560 nm 處有最大吸光度。而未加Na2S溶液的空白液在400 650 nm波長下基本無吸收，由此確定560 nm為測定波長。
設(shè)置反應(yīng)時間梯度10 min、 20 min、 40 min、 60 min、 90 min、 120 min、 150 min、 180 min、 240 min、 300 min。其余操作同1。反應(yīng)時間對 中國被毛孢脫氫酶活力的影響見圖2。由圖2可見在240 min內(nèi)，脫氫酶 活力隨著反應(yīng)時間的延長而增加，240 min后開始進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)；其反應(yīng) 速率在150 min內(nèi)基本不變，由此確定反應(yīng)時間為120 min。這樣既保證 所測得的反應(yīng)速度為酶促反應(yīng)初速度，又能使萃取液達(dá)到一定的吸光度， 以減少試驗誤差。
設(shè)置反應(yīng)溫度梯度7 。C、 17 。C、 27 。C、 37 。C、 47 。C、 57 。C。其 余操作同l。不同溫度對中國被毛孢脫氫酶活力的影響見圖3。由圖3可見在 7 57t:范圍內(nèi)，脫氫酶活力先升高后又下降，在37"C時達(dá)到最高值。因 此，檢測脫氫酶活力的溫度選定為37'C。
5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
為了測定MTTf的摩爾吸光系數(shù)并計算脫氫酶活力，常用過量還原劑 Na2S將MTT完全還原為MTTf于最大吸收波長下測定吸收值，繪制吸收 曲線。取200(iL不同濃度(20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100pg/mL) 的MTT工作液于離心管中，再加入2 mL新配的濃度為25%的Na2S溶液， 搖勻。置于37"C反應(yīng)2h。其余操作同l。
繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4?？梢奙TT濃度在20 100 |ag/mL范圍內(nèi)吸光 度與產(chǎn)物MTTf濃度線性關(guān)系良好，依標(biāo)準(zhǔn)曲線和式(2)計算得MTTf的
8摩爾吸光系數(shù)EM為3794.2 (L/mol'cm)。將EM代入式(1)中，便可計算 脫氫酶的活力。
也考察了添加滅活細(xì)胞對脫氫酶活力測定的影響，結(jié)果顯示滅活細(xì)胞 對脫氫酶活力測定沒有影響，活細(xì)胞量與酶活力仍遵循上述線性關(guān)系。因 而采用MTT比色法檢測冬蟲夏草菌油混懸劑活力，既能對冬蟲夏草菌種制 劑活力做出科學(xué)的評價，又能通過制劑菌種活力的變化情況考察貯藏及使 用的最佳時期。
6、 細(xì)胞量與細(xì)胞活力的換算關(guān)系
分別精確稱取試驗冬蟲夏草菌種粉25、 50、 75、 100、 125、 150 mg于 20mL刻度試管中，配制10mL油混懸劑，取所配制劑400 ^用于測定細(xì)胞 活力。其余操作同l。結(jié)果見圖5，可得到細(xì)胞量(x)與吸光度(y)間呈良好 的線性關(guān)系。
由式(l)、 (2)及反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)EM值，依據(jù)數(shù)學(xué)關(guān)系可得細(xì) 胞量(x)與細(xì)胞活力(DHA)的關(guān)系式，見式(3)。
<formula>formula see original document page 9</formula>(3)
7、 本發(fā)明的冬蟲夏草菌油混懸劑的活力測定及穩(wěn)定性實(shí)驗 該制劑在4'C (貯藏溫度)和17'C (生長溫度)下的酶活力和沉降體
積比的變化情況，以便有效的貯存和使用，結(jié)果見圖6。
從圖6中可知，冬蟲夏草菌油混懸劑在4i:下， 一個月內(nèi)活力僅略為下
降，活力仍保持在90%以上；17。c下活力的變化趨勢與4r;的相似，下降幅度也不大。沉降體積比為混懸劑沉降前后混懸液的高度之比。從圖中可
見，4 "C下制劑沉降體積比在早期略有下降，隨后保持穩(wěn)定；17'C的變化 態(tài)勢與4 "C的相近。結(jié)果表明，油混懸劑能有效地維持細(xì)胞活力和沉降體 積比的穩(wěn)定性，且在低溫下儲藏時制劑穩(wěn)定性更好，從而保證了冬蟲夏草 菌油混懸劑在生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是采用了中國被毛孢發(fā)酵菌絲體或發(fā)酵菌絲體和孢 子混合物來配制菌種制劑，一方面解決了冬蟲夏草菌孢子來源不足的問題， 另一方面由菌絲體或菌絲體和孢子混合物制成的油混懸劑活力得到較大的 提高，從而提高了侵染成功率，適宜作為人工培育冬蟲夏草的菌種，能滿 足大規(guī)模培育冬蟲夏草的接種需求。


圖l反應(yīng)產(chǎn)物MTTf掃描圖
圖2反應(yīng)時間對脫氫酶活力的影響
圖3反應(yīng)溫度對脫氫酶活力的影響
圖4 MTT反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖5細(xì)胞量對吸光度的影響
圖6冬蟲夏草油混懸劑的穩(wěn)定性實(shí)驗 具體實(shí)施例(共10例，其中對比實(shí)施例4例) 實(shí)施例l
按下述組分及含量進(jìn)行配制，經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升溶劑油，加入冬蟲夏草菌種粉5克，硬脂酸鋁1000毫克，表面活性劑(司班-SO) 500 微升；其中溶劑油是菜籽油、大豆油按任意比例的混合溶液；冬蟲夏草菌 種粉是中國被毛孢通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體經(jīng)低溫干燥、粉碎制得。 實(shí)施例2
按下述組分及含量進(jìn)行配制,經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升菜籽油即 為溶劑油，加入冬蟲夏草菌種粉30克，助懸劑(硬脂酸鋁)9000毫克，表
面活性劑(OP-10) 10毫升；冬蟲夏草菌種粉是中國被毛孢通過固體發(fā)酵 生產(chǎn)的菌絲體和分生孢子的混合物。
實(shí)施例3
按下述組分及含量進(jìn)行配制，經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升溶劑油，
加入冬蟲夏草菌種粉10克，助懸劑(硬脂酸鋁)3000毫克，表面活性劑(吐 溫-80)2000微升；其中溶劑油是菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比10 : 4配制的混合溶液；冬蟲夏草菌種粉是收集15 18'C固體發(fā)酵30天的中國 被毛孢菌絲體和分生孢子按任意比例的混合物，經(jīng)低溫干燥，粉碎并過120 目篩制得的菌粉。 實(shí)施例4
按下述組分及含量進(jìn)行配制，經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升溶劑油，
加入冬蟲夏草菌種粉20克，助懸劑(硬脂酸鋁)5000毫克,表面活性劑 (OP-10) 6000微升；其中溶劑油是菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比
6 : 1配制的混合溶液；冬蟲夏草菌種粉是中國被毛孢通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的
11菌絲體經(jīng)干燥、粉碎制得。
實(shí)施例5
按下述組分及含量進(jìn)行配制，經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升溶劑油， 加入冬蟲夏草菌種粉25克，助懸劑(硬脂酸鋁)7000毫克,表面活性劑(司 班-SO) 8000微升；其中溶劑油是菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比8 : 2配制混合溶液；冬蟲夏草菌種粉是中國被毛孢通過固體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲 體和分生孢子混合物，經(jīng)干燥、粉碎制得。 實(shí)施例6
按下述組分及含量進(jìn)行配制,經(jīng)攪拌混勻制得量取100毫升溶劑油， 加入冬蟲夏草菌種粉15克，助懸劑(硬脂酸鋁)6000毫克，表面活性劑(司 班-SO) 5000微升；其中溶劑油是其中所述溶劑油是菜籽油與鄰苯二甲酸二
丁酯按體積比7 :3配制混合溶液；冬蟲夏草菌種粉是收集17 t:固體發(fā)酵
25天的中國被毛孢菌絲體和分生孢子按任意比例的混合物，經(jīng)低溫干燥， 粉碎并過120目篩制得的菌粉。
以上6例所得的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，4"C儲存1個月后通過前 面所述的方法測定脫氫酶比活力均在6000pKat/g以上，其中最優(yōu)選的實(shí)施 例6其脫氫酶比活力達(dá)到7500pKat/g。 對比實(shí)施例1
實(shí)施條件與實(shí)施例6不同之處在于將表面活性劑換成十二垸基硫酸 鈉，所得冬蟲夏草菌油混懸劑，4"C儲存1個月后按同樣的方法測定脫氫酶比活力僅有85 pKat/g。 對比實(shí)施例2
實(shí)施條件與實(shí)施例6不同之處在于將表面活性劑換成脂肪醇聚氧乙烯 醚，所得冬蟲夏草菌油混懸劑，測定其細(xì)胞沉降體積比較高83.8%，但是4 "C儲存1個月后按同樣的方法測定脫氫酶比活力僅有160 pKat/g。由此看 出細(xì)胞沉降體積比與細(xì)胞活力并非正相關(guān)。 對比實(shí)施例3
在本發(fā)明中，所述表面活性劑的含量是每毫升溶劑油中含5 100微 升，如果含量過高所得制劑會抑制細(xì)胞活力。因此在此實(shí)施例中，選取最 好的表面活性劑司班-80，按每毫升溶劑油中加入200微升，在其他條件不 變的情況下，測定脫氫酶比活力僅有約4000pKat/g，相比每毫升溶劑油中 加入50微升司班-80，細(xì)胞活力下降超過30%。 對比實(shí)施例4
與實(shí)施1 6所不同的是在助懸劑的選擇上，分別選擇羥丙基纖維素、氣 相二氧化硅、羧甲基纖維素，測定結(jié)果顯示所得制劑沉降體積比都較高 (73%以上)，但是都對細(xì)胞活力均有很大程度的抑制，脫氫酶比活力僅僅 是選擇硬脂酸鋁的50%，甚至不到50%。
1權(quán)利要求
1、一種高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是按下述組分及含量進(jìn)行配制，經(jīng)混勻制得每毫升溶劑油中加入冬蟲夏草菌種粉0.05～0.3克，助懸劑10～90毫克，表面活性劑5～100微升；其中所述溶劑油是選自菜籽油、大豆油、玉米油、色拉油、鄰苯二甲酸二丁酯的一種或多種按任意比例的混合溶液；所述冬蟲夏草菌種粉是中國被毛孢通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體或通過固體發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體和分生孢子混合物，經(jīng)干燥、粉碎制得；所述表面活性劑是指司班-80、OP-10、吐溫-80中的一種；所述助懸劑是指硬脂酸鋁。
2、 如權(quán)利要求1所述的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是冬蟲 夏草菌種粉是收集12~20 "C固體發(fā)酵20 35天的中國被毛孢菌絲體和分生 孢子按任意比例的混合物，經(jīng)干燥，粉碎并過120目篩制得的菌粉。
3、 如權(quán)利要求1所述的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是表面 活性劑是司班-80。
4、 如權(quán)利要求1所述的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是溶劑 油由菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比6 10 : 1 4配制。
5、 如權(quán)利要求4所述的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是溶劑 油由菜籽油與鄰苯二甲酸二丁酯按體積比7 : 3配制。
6、 如權(quán)利要求5所述的高活力冬蟲夏草菌油混懸劑，其特征是每毫 升溶劑油中含有0.15g冬蟲夏草菌種粉，60mg硬脂酸鋁，50pL司班-80。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活力冬蟲夏草菌油混懸劑。該混懸劑由冬蟲夏草菌種粉、溶劑油、表面活性劑、助懸劑組成。每毫升溶劑油中含冬蟲夏草菌種粉0.05～0.3克，表面活性劑5～100微升，助懸劑10～90毫克。本發(fā)明采用中國被毛孢發(fā)酵菌絲體或發(fā)酵菌絲體和孢子混合物來配制油混懸劑，菌種活力高、穩(wěn)定性好，提高了侵染率。適宜作為人工培育冬蟲夏草的菌種，能滿足大規(guī)模培育冬蟲夏草的接種需求。
文檔編號C12N1/14GK101423802SQ200810237149
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者劉洪波, 朱華李, 毛先兵, 鐘國躍, 陳仕江, 馬開森 申請人:重慶市中藥研究院