專利名稱：一種小鼠血小板的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小鼠血小板的提取方法，所提取的血小板作為抗原用于免 疫豚鼠，豚鼠免疫血清將被用于制備小鼠特發(fā)性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型。
背景技術(shù)：
特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)的發(fā)病機(jī)制與免疫有密切關(guān)系，免疫法所 致ITP模型在病理特征和愈合機(jī)理方面與人類ITP高度相似，故實(shí)驗(yàn)研究主要 采用免疫法建立動(dòng)物模型，'小鼠ITP模型對(duì)各種抗ITP藥物敏感性較高，因此 成功制備小鼠ITP模型是抗ITP藥物研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。但是，此種造模方 法的一個(gè)顯著問(wèn)題是抗原的純度不夠，即從純系小鼠全血中分離出血小板的純 度不易控制，如果血小板懸液中混有紅細(xì)胞，所得的抗血清中會(huì)含有大量的抗 紅細(xì)胞抗體，再注射給造模動(dòng)物會(huì)引起動(dòng)物死亡。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于傳統(tǒng)血小板提取方法的不足，本專利提供一種小鼠血小板的提取方法， 以解決提取的血小板濃度不夠和純度不佳的問(wèn)題。 具體實(shí)驗(yàn)方案小鼠眶靜脈取血，置于抗凝離心管中，靜置30min后離心，800rpm離心 10min，上清液即為富含血小板的血漿。吸出上清液置于干凈試管中，3500rpm 離心10min，棄去上清液，管底沉淀物為血小板。向試管中滴加50 100W質(zhì)量 濃度為1%的草酸銨溶液，以玻璃棒輕輕攪拌，再加入質(zhì)量濃度為1%草酸銨溶 液2 3ml，靜置5min，使紅細(xì)胞溶解。3500rpm離心10min，棄去上清，加入 血小板洗滌液并反復(fù)吹打，使成為血小板混懸液，3300rpm離心10min，棄去上 清，加入少量血小板洗滌液并反復(fù)吹打使之成為混懸液。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下檢 測(cè)血小板的濃度及純度，并根據(jù)結(jié)果將質(zhì)量濃度調(diào)至1 X 109 3 X 109。該方法通過(guò)3批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，此方法操作簡(jiǎn)單，所得血小板濃度和純 度高，用該血小板免疫豚鼠，制備免疫血清，給小鼠投與豚鼠免疫血清，制備 小鼠特發(fā)性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型，成模率在95% 98%之間。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例一
2007年10月10日 10月25日，80只SPF級(jí)BALB/c小鼠，應(yīng)用該方法 提取血小板，血小板純度達(dá)97°/。，濃度1X1010，使用該血小板制備免疫血清后， 制備過(guò)敏性紫癜模型，95%成模，并用該模型評(píng)價(jià)了抗過(guò)敏性紫癜中藥的療效及 作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例二
2008年4月15日 4月30日，100只SPF級(jí)BALB/c小鼠，應(yīng)用該方法 提取血小板，血小板純度達(dá)95%，濃度3X101 使用該血小板制備免疫血清后， 制備過(guò)敏性紫癜模型，96%成模，并用該模型評(píng)價(jià)了抗過(guò)敏性紫癜中藥的療效及 作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例三
2008年6月12日 6月27日，120只SPF級(jí)BALB/c小鼠，應(yīng)用該方法 提取血小板，血小板純度達(dá)98%，濃度5X101 使用該血小板制備免疫血清后， 制備過(guò)敏性紫癜模型，98%成模，并用該模型評(píng)價(jià)了抗過(guò)敏性紫癜中藥的療效及 作用機(jī)制。
權(quán)利要求
1、一種小鼠血小板的提取方法，其特征在于小鼠眶靜脈取血，置于抗凝離心管中，靜置30min后離心，800rpm離心10min，上清液即為富含血小板的血漿，吸出上清液置于干凈試管中，3500rpm離心10min，棄去上清液，管底沉淀物為血小板，向試管中滴加50～100μl質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液，以玻璃棒輕輕攪拌，再加入質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液2～3ml，靜置5min，使紅細(xì)胞溶解，3500rpm離心10min，棄去上清，加入血小板洗滌液并反復(fù)吹打，使成為血小板混懸液，3300rpm離心10min，棄去上清，加入少量血小板洗滌液并反復(fù)吹打使之成為混懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下檢測(cè)血小板的濃度及純度，并根據(jù)結(jié)果將質(zhì)量濃度調(diào)至1×109～3×109。
全文摘要
一種小鼠血小板的提取方法，小鼠眶靜脈取血，置于抗凝離心管中，靜置30min后離心，800rpm離心10min，上清液即為富含血小板的血漿。吸出上清液置于干凈試管中，3500rpm離心10min，棄去上清液，管底沉淀物為血小板。向試管中滴加50～100μl質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液，以玻璃棒輕輕攪拌，再加入質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液2～3ml，靜置5min，使紅細(xì)胞溶解。3500rpm離心10min，棄去上清，加入血小板洗滌液并反復(fù)吹打，使成為血小板混懸液，3300rpm離心10min，棄去上清，加入少量血小板洗滌液并反復(fù)吹打使之成為混懸液。該血小板將作為抗原免疫豚鼠后，取豚鼠血清給小鼠注射，制備過(guò)敏性紫癜模型。此方法操作簡(jiǎn)單，可以得到高濃度的血小板，并很好地解決血小板純度不佳的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101402940SQ20081022872
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者才麗平, 怡 曲, 曲道煒, 陽(yáng) 李, 林庶茹, 穎 范, 寧 蔣 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)