專利名稱：：一種制備阿維菌素的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備阿維菌素的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
：阿維菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，具有廣譜的抗線蟲(chóng)和腸道寄生蟲(chóng)的性質(zhì)，是目前世界上最有前景的生物殺蟲(chóng)殺螨劑。阿維菌素的殺蟲(chóng)作用是通過(guò)釋放神經(jīng)傳導(dǎo)抑制劑、使害蟲(chóng)緩慢麻痹致死來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)宿主的副作用較低，在環(huán)境中無(wú)累積，對(duì)人、畜均具有安全性，所以阿維菌素在動(dòng)物保健和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面有廣泛的應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。阿維菌素是由除蟲(chóng)鏈霉菌(^Yre/^oy^ces3^r肌Y^^s)生產(chǎn)的一組由十六元大環(huán)內(nèi)酯與一個(gè)二糖(齊墩果糖)所構(gòu)成的一類(lèi)殺蟲(chóng)抗生素，共有4對(duì)8個(gè)同系物，即阿維菌素Ala/Alb、Bla/Bib、A2a/A2b、B2a/B2b。在這8個(gè)化合物中，以阿維菌素Bla活性最高。1999年，阿維菌素成為世界第21大暢銷(xiāo)農(nóng)藥，第4大暢銷(xiāo)殺蟲(chóng)劑，銷(xiāo)售額高達(dá)1.6億美元。以阿維菌素為母體，還可以開(kāi)發(fā)出一系列活性更高、選擇性更強(qiáng)、使用更加安全的衍生新品種，己商品化的品種包括伊維菌素、埃瑪菌素、道拉菌素、埃珀利諾菌素和色拉菌素等。其中的伊維菌素是目前世界上銷(xiāo)售量最大的獸藥，1981年的年銷(xiāo)售額就達(dá)到了10億美元，創(chuàng)單項(xiàng)獸藥銷(xiāo)售收入最高;埃珀利諾菌素則被美國(guó)FDA認(rèn)定為全程安全畜用驅(qū)蟲(chóng)劑。此外，近年來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)阿維菌素有抗腫瘤的功效，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗藥性也有一定的抑制作用。阿維菌素具有不易產(chǎn)生抗藥性、易降解和無(wú)殘留的特點(diǎn)，使其成為高毒農(nóng)藥的最佳替代品?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，阿維菌素在各個(gè)國(guó)家的需求不斷上升。因此，需要提高阿維菌素的生產(chǎn)效率，以供應(yīng)日益增長(zhǎng)的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株阿維鏈霉菌，該菌株能高產(chǎn)阿維菌素。本發(fā)明所提供的阿維鏈霉菌菌株為阿維鏈霉菌(5^re;^o/^ces3^/77i'^7A)ZLX6001，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2712。阿維鏈霉菌菌株ZLX6001是好氧的革蘭氏陽(yáng)性嗜溫放線菌，形成分枝狀基生菌絲和長(zhǎng)的緊密螺旋的氣生菌絲。孢子鏈由15個(gè)或以上的表面光滑的圓形或卵形孢子構(gòu)成。在燕麥培養(yǎng)基上形成灰色的氣生孢子團(tuán)，菌落背面黑褐色。在蛋白胨酵母提取物和鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色素。該菌株已于2008年10月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2712。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備阿維菌素的方法。本發(fā)明所提供的制備阿維菌素的方法，是發(fā)酵阿維鏈霉菌(5Yr印fo/^c"ave27zu'"h^)ZLX6001，得到阿維菌素。所述發(fā)酵的方法是將所述菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為25-3(TC的條件下培養(yǎng)。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由終濃度為105-195g/L的玉米淀粉、終濃度為20-36g/L的豆粕粉、終濃度為6-12g/L的酵母粉、終濃度為0.175-0.325g/L的(NH4)2S04、終濃度為0.014-0.026g/L的CoCl2、終濃度為0.015-0.028g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0016-0.003g/L的MnS04、終濃度為2800-5200U/L的淀粉酶和終濃度為0.6-1.0g/L的CaC03組成，余量為水；所述終濃度均為在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度。所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為如下培養(yǎng)基由終濃度為150g/L的玉米淀粉、終濃度為28g/L的豆粕粉、終濃度為9g/L的酵母粉、終濃度為0.25g/L的(NH4)2S(^、終濃度為0.02g/L的CoCl2、終濃度為0.022g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0023g/L的MnS(X終濃度為4000U/L的淀粉酶和終濃度為0.8g/L的CaCO.,組成。所述發(fā)酵可以在振蕩的條件下進(jìn)行，所述振蕩的轉(zhuǎn)速可以為200-250rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50ram。所述振蕩的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為220rpm。為了防止發(fā)酵液因過(guò)多蒸發(fā)而濃縮，造成虛假的發(fā)酵單位，保持發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境相對(duì)濕度為50-60%。所述發(fā)酵的溫度優(yōu)選為28°C。所述發(fā)酵的時(shí)間可為192-240小時(shí)，優(yōu)選為240小時(shí)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的菌株生產(chǎn)阿維菌素有效組分Bla的能力強(qiáng)，可達(dá)6000ug/ml發(fā)酵液，而且本發(fā)明菌株連續(xù)傳5代后其生產(chǎn)阿維菌素有效組分Bla的能力還保持原來(lái)水平，表明其遺傳穩(wěn)定性好。用本發(fā)明菌株來(lái)制備阿維菌素的方法，能夠提高生產(chǎn)阿維菌素的效率，而且方法簡(jiǎn)單、成本低廉。因此，本發(fā)明菌株及制備阿維菌素的方法適合于在阿維菌素的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。圖1為阿維菌素有效組分Bla標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。圖2為發(fā)酵濾液中阿維菌素有效組分Bla色譜圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、菌株的制備一、菌株的制備本實(shí)驗(yàn)中用到的高通量初篩方法如下發(fā)酵階段采用96孔深孔板，每孔中裝培養(yǎng)基0.3ml。每孔接入菌種，28°C靜置培養(yǎng)10天。所用培養(yǎng)基由終濃度為150g/L的玉米淀粉、終濃度為28g/L的豆粕粉、終濃度為9g/L的酵母粉、終濃度為0.25g/L的(NH4)2S04、終濃度為2g/L的CoCl2、終濃度為0.022g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0023g/L的MnS04、終濃度為4000U/L的淀粉酶、終濃度為0.8g/L的CaC03、和終濃度為20g/L的瓊脂組成。提取階段將每孔用1ml甲醇浸泡，搗碎，取上清。測(cè)定階段用酶標(biāo)儀測(cè)定上清在245nm下的UV吸收值。菌株的制備過(guò)程如下1、從土壤中分離菌株.取河北省的土壤，將土壤制成懸浮液，將土壤懸浮液接種于分離培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行稀釋劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)菌株；分離培養(yǎng)基由終濃度為20g/L的葡萄糖(單獨(dú)滅菌后加入)，終濃度為20g/L的瓊脂，終濃度為2g/L的酵母膏，終濃度為0.5g/L的天門(mén)冬素及終濃度為0.5g/L的K2HP04組成，余量為水；pH7.2-7.4;115度，滅菌20分鐘；初篩獲得的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)8000rpm離心5分鐘，上清液經(jīng)0.45^的微孔濾膜過(guò)濾獲得發(fā)酵濾液；HPLC分析法檢測(cè)發(fā)酵液中是否含有阿維菌素；將能產(chǎn)生阿維菌素有效組分Bla的菌株分別進(jìn)行如下系列菌種改造。2、菌種改造(1)紫外線復(fù)合鏈霉素誘變?nèi)【鷳乙?ml，加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以30W的紫外照射儀于30cm處照射。設(shè)定照射時(shí)間分別為60s、90s。分離培養(yǎng)基滅菌后，加入終濃度O.lug/ml、0.2ug/ml經(jīng)過(guò)濾除菌的鏈霉素，鋪制平皿，經(jīng)紫外線處理后的菌懸液稀釋涂布于平皿中，28i:培養(yǎng)10d。挑取單菌落按照上述方法進(jìn)行高通量篩選、搖瓶復(fù)試。獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行下一步誘變。(2)紫外線復(fù)合鏈霉素誘變(第2輪)對(duì)第一輪紫外線復(fù)合鏈霉素誘變獲得的高產(chǎn)菌株用同樣的方法再次進(jìn)行紫外線復(fù)合鏈霉素誘變。28'C培養(yǎng)10d。挑取單菌落進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試。獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行下一步誘變。(3)5-氟尿嘧啶誘變將菌株斜面接種于無(wú)有機(jī)氮源的饑餓培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)稀釋后涂布于含有不同濃度的5-氟尿嘧啶平皿中，5-氟尿嘧啶的終濃度分別為50ug/ral、100yg/ml。28"C培養(yǎng)10d。挑取單菌落進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試。獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行下一步誘變。(4)微波復(fù)合鏈霉素誘變以脈沖頻率為2450MHz的650W家用微波爐，分別對(duì)平皿中菌懸液進(jìn)行輻射處理。每次照射5s后使平皿冷卻，再進(jìn)行照射，并將照射時(shí)間累計(jì)，累計(jì)照射時(shí)間分別為60s、90s。分離培養(yǎng)基滅菌后，加入終濃度O.lug/ml、0.2ug/ml經(jīng)過(guò)濾除菌的鏈霉素，鋪制平皿。經(jīng)微波處理后的菌懸液稀釋涂布于平皿中，28"C培養(yǎng)10d。挑取單菌落進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試。獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行下一步誘變。(5)NTG(亞硝基胍)復(fù)合鏈霉素誘變亞硝基胍(NTG)誘變用O.lmol/L，p服.0的磷酸鹽緩沖液制備孢子懸液，分別用終濃度為lmg/ml、2mg/ml和4mg/ml的NTG處理單孢子懸液，于28。C震蕩30min，用生理鹽水離心洗滌孢子3次，經(jīng)稀釋后涂布于含終濃度0.1ug/ml、0.2iig/ml經(jīng)過(guò)濾除菌的鏈霉素的平皿。28i:培養(yǎng)10d。挑取單菌落進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試。獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行基因工程育種。(6)aveC/aveR基因定向進(jìn)化阿維菌素的天然發(fā)酵產(chǎn)物共有8個(gè)組分Ala，Alb，A2a，A2b，Bla，Blb，B2a和B2b，其中"A"組分和"B"組分的區(qū)別在于C-5位不同，"B"組分在C5-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(AveD)的催化下在C-5位的羥基上連一個(gè)甲基即轉(zhuǎn)化為組分"A"(Ikedaetal.，1998);"a"組分和"b"組分的區(qū)別在于對(duì)支鏈脂肪酸的利用上，"a"組分在C-25位是仲丁基，其支鏈脂肪酸來(lái)源于L-異亮氨酸，而"b"組分在C-25位是異丙基，來(lái)源于L-纈氨酸；阿維菌素"l"組分和"2"組分的區(qū)別在于C-22，23位不同，"1"組分在C-22，23位為CH=CH，"2"組分為CH2-CHOH."1"組分的合成與AveC有關(guān)。我們通過(guò)對(duì)aveR和aveC基因進(jìn)行定向進(jìn)化改造，獲得有益突變，轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌，篩選獲得阿維菌素產(chǎn)量和有效組分提高的工程菌。實(shí)驗(yàn)流程aveC/aveR的易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變和突變文庫(kù)的建立易錯(cuò)PCR擴(kuò)增通過(guò)改變PCR的條件，降低一種dNTP的量(降至5%-10%)使PCR易于出錯(cuò)，達(dá)到隨機(jī)突變的目的；加入dITP來(lái)代替被減少的dNTP，使下一輪循環(huán)中出現(xiàn)更多的錯(cuò)誤；在PCR緩沖液中另加入Mn2+，有利于提高突變率。50u1反應(yīng)體系包含25ngDNA，30pmolesPCR引物(aFe/基因正向引物5，GTT/CTAGACGGTATTCCATTCGGTGTTGC3，和反向引物5'GTGA/ATTCGTGAGGCGGAAGACGAG3';ayeC基因正向引物5，GTT/CTAGACTGCTCACGCTCGCGGAC3'和反向引物5，GTGA/ATTCACCTGCCCTGAACTCAGTAAG3')，50mMKC1，10mMTris-HC1(pH8.3)，和0.01%gelatin。除了上述成分，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合液包含1.5mMMgCl2，2.5單位LApolymerase,和0.2raMdNTPs;突變反應(yīng)混合液包含3raM或6mMMgCl"0.5mM或0.8raMMnCl2，5單位LAfa。polymerase,0.2raMdATP禾卩l(xiāng)mMdGTP/dACP/dTTP。反應(yīng)條件為94°Clmin，60°Clmin，72°C3min，5個(gè)循環(huán);94。Clmin，60°Clmin(+0.5。C/循環(huán))，72°C3min，30個(gè)循環(huán)；94°Clmin，75°Clmin，72°C3min，5個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物Dpnl酶消化去除模板DNA，酚/氯仿/異戊醇純化，乙醇沉淀，然后溶于20ii110mMTris-HCl(pH8.5)。所有EP-PCR產(chǎn)物酶切；50iil酶切產(chǎn)物膠回收，30ul洗脫；30w1產(chǎn)物與pSET152連接并轉(zhuǎn)化ET12567;易錯(cuò)突變庫(kù)的建立易錯(cuò)PCR產(chǎn)物乙醇沉淀，溶于20ul10mMTris-HC1(PH8.5);所有EP-PCR產(chǎn)物酶切，酶切產(chǎn)物膠回收，與pEasyTl載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，涂于LB+Amp平板上培養(yǎng)；刮下所有生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌落，置于LB+Amp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；提取質(zhì)粒，建立易錯(cuò)片斷突變庫(kù)。易錯(cuò)突變庫(kù)質(zhì)粒EcoRI/Xbal酶切與EcoRI/Xbal酶切的載體pSET152連接，轉(zhuǎn)化E.coliET12567/(pUZ8002)。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移把易錯(cuò)基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入阿維鏈霉菌。aveC基因的定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)突變位點(diǎn)為AveC蛋白序列92位D突變?yōu)镋，133位A突變?yōu)門(mén)。為了便于篩選突變體，在引入相應(yīng)的突變時(shí)引入aveC基因序列中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，這樣只有突變體有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，可以從非突變體中篩選出突變基因。以質(zhì)粒pBJC為模板，定點(diǎn)突變引物PCR擴(kuò)增aveC基因，DpnI酶切消化擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化pEasyTl，挑克隆，DdeI/PvuII酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證突變基因。EcoRI/Xbal酶切回收突變片斷，EcoRI/Xbal酶切的載體pSetl52連接，轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌和產(chǎn)生菌。結(jié)果aveR和aveC基因通過(guò)易錯(cuò)PCR引入突變。通過(guò)pBJOT3測(cè)序后DNA序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列的比對(duì)，AveC蛋白序列92位D突變?yōu)镋，133位A突變?yōu)門(mén)。將經(jīng)過(guò)定向進(jìn)化的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入阿維鏈霉菌產(chǎn)生菌。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試，從中篩選得到阿維菌素有效組分Bla產(chǎn)量提高的菌株。(7)阿維鏈霉菌寡核苷酸表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄水平分析高產(chǎn)和低產(chǎn)菌株在轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上的差異，通過(guò)RT-PCR的方法驗(yàn)證芯片雜交結(jié)果中的差異表達(dá)基因幻^4與阿維菌素生物合成基因的關(guān)系，找到與產(chǎn)量密切相關(guān)的關(guān)鍵基因點(diǎn)。針對(duì)該基因構(gòu)建了易錯(cuò)PCR片段的質(zhì)粒庫(kù)，并將其轉(zhuǎn)入阿維菌素高產(chǎn)菌株中。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行高通量初篩、搖瓶復(fù)試，從中篩選得到阿維菌素有效組分Bla產(chǎn)量提高的菌株。經(jīng)過(guò)上述系列方法，最終獲得了阿維菌素高產(chǎn)菌株ZLX6001。二、菌株的鑒定本發(fā)明菌株ZLX6001是好氧的革蘭氏陽(yáng)性嗜溫放線菌，形成分枝狀基生菌絲和長(zhǎng)的緊密螺旋的氣生菌絲。孢子鏈由15個(gè)或以上的表面光滑的圓形或卵形孢子構(gòu)成。在燕麥培養(yǎng)基上形成灰色的氣生孢子團(tuán)，菌落背面黑褐色。在蛋白胨酵母提取物和鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色素。具體見(jiàn)表l。表1、本發(fā)明菌株ZLX6001生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對(duì)該菌株ZLX6001進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)定，序列如序列表中序列1所示。生理生化特征與序列特征表明，本發(fā)明菌株ZLX6001屬于阿維鏈霉菌(5Yre;^o/^c"s^i7wYih's)，將其命名為ZLX6001，該菌株已于2008年10月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2712。實(shí)施例2、發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX6001生產(chǎn)阿維菌素應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化高產(chǎn)菌株ZLX6001發(fā)酵培養(yǎng)條件。牛肉浸提物購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基有限公司；玉米淀粉購(gòu)自黑龍江龍鳳玉米開(kāi)發(fā)有限公司，豆粕粉購(gòu)自秦皇島市匯禾源實(shí)業(yè)有限公司，花生餅粉購(gòu)自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限公司，酵母粉購(gòu)自0X0ID，淀粉酶購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。斜面培養(yǎng)基組成由終濃度為15g/L的葡萄糖、終濃度為3g/L的牛肉浸提物、終濃度為0.5g/L的天門(mén)冬酰胺、終濃度為0.5g/L的KH2P04和終濃度為18g/L的瓊脂組成，余量為水，所述終濃度均為各物質(zhì)在斜面培養(yǎng)基中的濃度；斜面培養(yǎng)基的pH值為7.2-7.5。種子培養(yǎng)基組成由終濃度為30g/L的玉米淀粉、終濃度為8g/L的豆粕粉、終濃度為10g/L的花生餅粉、終濃度為4g/L的酵母粉和終濃度為3g/L的CoCl2組成，余量為水，所述終濃度均為在種子培養(yǎng)基中的濃度；種子培養(yǎng)基的pH值為6.8-6.9。121°C，滅菌25min。發(fā)酵培養(yǎng)基I組成由終濃度為150g/L的玉米淀粉、終濃度為28g/L的豆粕粉、終濃度為9g/L的酵母粉、終濃度為0.25g/L的(MU2S04、終濃度為0.02g/L的CoCl2、終濃度為0.022g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0023g/L的MnS04、終濃度為4000U/L的淀粉酶、終濃度為0.8g/L的CaC03組成，余量為水，所述終濃度均為在發(fā)酵培養(yǎng)基I中的濃度；發(fā)酵培養(yǎng)基I的pH值為7.4。12rC，滅菌25rain。發(fā)酵培養(yǎng)基II組成由終濃度為105g/L的玉米淀粉、終濃度為20g/L的豆粕粉、終濃度為6g/L的酵母粉、終濃度為O.175g/L的(NH4)2S(X、終濃度為0.014g/L的CoCl2、終濃度為0.015g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0016g/L的MnS04、終濃度為2800U/L的淀粉酶、終濃度為0.6g/L的CaC03組成，余量為水，所述終濃度均為在發(fā)酵培養(yǎng)基II中的濃度；發(fā)酵培養(yǎng)基II的pH值為7.3。12rC，滅菌25min。發(fā)酵培養(yǎng)基III組成由終濃度為195g/L的玉米淀粉、終濃度為36g/L的豆粕粉、終濃度為12g/L的酵母粉、終濃度為0.325g/L的(NH4)2S04、終濃度為0.026g/L的CoCl2、終濃度為0.028g/L的Na2Mo04、終濃度為0.003g/L的MnS04、終濃度為5200U/L的淀粉酶、終濃度為1.Og/L的CaC03組成，余量為水，所述終濃度均為在發(fā)酵培養(yǎng)基m中的濃度；發(fā)酵培養(yǎng)基III的pH值為7.5。121°C，滅菌25min。一、利用發(fā)酵培養(yǎng)基I發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX6001制備阿維菌素(一)發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX60011、斜面培養(yǎng)將阿維鏈霉菌ZLX6001接種到斜面培養(yǎng)基上，在28。C、環(huán)境相對(duì)濕度為50-60%條件下培養(yǎng)10-12天。2、種子培養(yǎng)挖取步驟1中得到的斜面菌苔lcra2，將其接入裝有40ml滅過(guò)菌的種子培養(yǎng)基的種子瓶，在如下條件下培養(yǎng)44-48小時(shí)溫度為28°C、環(huán)境相對(duì)濕度為50-60%、轉(zhuǎn)速為200-250rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為50mm，得到種子培養(yǎng)液。3、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)方法取上述種子培養(yǎng)液按5%(V/V)的接種量接種于裝有30ml滅過(guò)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基I的瓶中，在如下條件下發(fā)酵培養(yǎng)240小時(shí)溫度為28t:、濕度為55%、轉(zhuǎn)速為220rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為50ram，得到發(fā)酵液。(二)提取阿維菌素及產(chǎn)量檢測(cè)1、提取方法如下(1)取lml發(fā)酵液，以8000rpm的速度離心5min，棄上清，加入10ml90%(體積百分含量)甲醇溶液，以200rpm的速度(旋轉(zhuǎn)半徑為50mm)振搖6小時(shí)，以8000rpm的速度離心5min，取上清溶液，共得到10ml上清。(2)取lml上清，用0.45nm的微孔濾膜過(guò)濾，獲得lml發(fā)酵濾液。2、HPLC分析采用LC-9101型循環(huán)制備HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱。用U反相柱，柱溫3(TC，取步驟l的發(fā)酵濾液，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量IOul;以甲醇水(體積比為9:1)為流動(dòng)相進(jìn)行分離，流速為lml/min，利用UV檢測(cè)器在波長(zhǎng)245nm處檢測(cè)并自動(dòng)形成分離圖譜；在此色譜條件下，阿維菌素Bla標(biāo)準(zhǔn)品(DR,Germany)的色譜圖如圖1所示，阿維菌素Bla標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為6分鐘左右。計(jì)算發(fā)酵濾液中保留時(shí)間為6分鐘左右處的洗脫峰面積，計(jì)算阿維菌素Bla的量。發(fā)酵濾液中阿維菌素Bla色譜圖如圖2所示。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，10yl發(fā)酵濾液中獲得6ug阿維菌素Bla，本發(fā)明菌株生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力為6000ug/ml發(fā)酵液。二、利用發(fā)酵培養(yǎng)基II發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX6001制備阿維菌素(一)發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX60011、斜面培養(yǎng)方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。2、種子培養(yǎng)方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。3、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)方法取上述種子培養(yǎng)液按3%(V/V)的接種量接種于裝有30ml滅過(guò)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基II的瓶中，在如下條件下發(fā)酵培養(yǎng)192小時(shí)溫度為25i:、環(huán)境相對(duì)濕度為50%、轉(zhuǎn)速為200rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為50mm，得到發(fā)酵液。(二)提取阿維菌素及產(chǎn)量檢測(cè)1、提取方法如下方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。用lml發(fā)酵液提取得到10ml上清。取lml上清，用0.45pm的微孔濾膜過(guò)濾，獲得lml發(fā)酵濾液。2、HPLC分析方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，10ul發(fā)酵濾液中獲得5yg阿維菌素Bla，本發(fā)明菌株生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力為5000ug/ml發(fā)酵液。三、利用發(fā)酵培養(yǎng)基III發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX6001制備阿維菌素(一)發(fā)酵阿維鏈霉菌ZLX60011、斜面培養(yǎng)-方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。2、種子培養(yǎng)方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。3、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)方法取上述種子培養(yǎng)液按5%(V/V)的接種量接種于裝有30ral滅過(guò)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基m的瓶中，在如下條件下發(fā)酵培養(yǎng)240小時(shí)溫度為3(TC、環(huán)境相對(duì)濕度為60%、轉(zhuǎn)速為250rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為50mm，得到發(fā)酵液。(二)提取阿維菌素及產(chǎn)量檢測(cè)1、提取方法如下方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。用lml發(fā)酵液提取得到10ml上清。取lml上清，用0.45,的微孔濾膜過(guò)濾，獲得lral發(fā)酵濾液。2、HPLC分析方法同實(shí)驗(yàn)一中所述一致。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，10ul發(fā)酵濾液中獲得5.5ug阿維菌素Bla，本發(fā)明菌株生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力為5500yg/ral發(fā)酵液。實(shí)施例3、本發(fā)明菌株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)將本發(fā)明菌株ZLX6001進(jìn)行斜面?zhèn)鞔矀?代，每代菌的培養(yǎng)方法均如實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)一所述一致，每代培養(yǎng)得到的菌均按照實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)一中所述方法進(jìn)行發(fā)酵和提取，并計(jì)算菌株生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明本發(fā)明菌株ZLX6001在5次傳代后，生產(chǎn)能力還能保持原來(lái)水平，表明本發(fā)明菌株ZLX6001的遺傳穩(wěn)定性好。<160〉1〈210>1〈211〉1448〈212〉DNA<213〉鏈霉菌屬阿維鏈霉菌序列表〈400〉1gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgasgcccttcggggtgg60attagtggcgascgggtgsgtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccc120tggaaacggggtctsst3ccctcgcaggcstctgtgsgggttaaaagctc180cggcggtgcaggstgsgcccgcggcctatcagcttgttggtgsggtsgtggctcaccasg240gcg3cg^cgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggccc300sgsctcctscgggsggcagcsgtggggaat3ttgC3C33tgggcgasagcctgatgcagc360gacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggsagasgcg420aaagtgacggtacctgcsgsagaagcgccggct3sctacgtgccagcagccgcggtaata480cgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcctgtca540cgtcgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgstscgggctagctaga600gtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtsgcggtg33atgcgcagatatcaggagga660acaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggg720gagcgsacsgcctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttg780gtgacattccscgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttcccggcctggggagtac840ggccgcsaggCt3333CtC3aaggaattgacgggggcccgcscaagcagcggagcatgtg900gctt3tttcgacgcaacgcgccasggcttgacatacaccggassgcatta960gagatagtgccccccttgtggtcggtgtscaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgt1020cgtgagatgttgggttaisgtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcstg1080cccttcggggtgatggggsctcacsggagaccgccggggtcaactcggaggssggtgggg1140gtcatcatgcccctt3tgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccgat1200scs3tg3gctgcgataccgceisggtggsgcaagtcggtctcagttcggst1260tggggtctgcaactcgaccccatgaagttggsgttgctagtaatcgcagatcagcattgc132〇tgcggtgsatscgttcccgggccttgtacacsccgcccgtcscgtcacg31380cacccgaagccggtggcccssccccttgtgggagggsgctgtcgasggtgggactggcga1440ttgggacg1448權(quán)利要求1、阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)ZLX6001，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2712。2、一種制備阿維菌素的方法，是發(fā)酵阿維鏈霉菌(5Yre/^o,cess^ry^'fW^s)ZLX6001CGMCCNo.2712，得到阿維菌素。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的方法是將所述菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為25-3(TC的條件下培養(yǎng)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由終濃度為105-195g/L的玉米淀粉、終濃度為20-36g/L的豆粕粉、終濃度為6-12g/L的酵母粉、終濃度為0.175-0.325g/L的(NH4)2S04、終濃度為0.014-0.026g/L的CoCl2、終濃度為0.015-0.028g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0016-0.003g/L的MnS04、終濃度為2800-5200U/L的淀粉酶和終濃度為0.6-1.0g/L的CaC03組成，余量為水；所述終濃度均為在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵在振蕩的條件下進(jìn)行，所述振蕩的轉(zhuǎn)速為200-250rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵的環(huán)境相對(duì)濕度為50-60%。7、根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述溫度為28r。8、根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時(shí)間為192-240小時(shí)，優(yōu)選為240小時(shí)。9、根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述振蕩的轉(zhuǎn)速為220rpm。10、根據(jù)權(quán)利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由終濃度為150g/L的玉米淀粉、終濃度為28g/L的豆粕粉、終濃度為9g/L的酵母粉、終濃度為0.25g/L的(NH4)2S04、終濃度為0.02g/L的CoCl2、終濃度為0.022g/L的Na2Mo04、終濃度為0.0023g/L的MnS04、終濃度為4000U/L的淀粉酶和終濃度為0.8g/L的CaC03組成，余量為水；所述終濃度均為在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種制備阿維菌素的方法及其專用菌株。本發(fā)明菌株為阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)ZLX6001，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2712。本發(fā)明的制備阿維菌素的方法，是發(fā)酵阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)ZLX6001，得到阿維菌素。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的菌株生產(chǎn)阿維菌素有效組分B1a的能力強(qiáng)，可達(dá)6000μg/ml發(fā)酵液，而且本發(fā)明菌株連續(xù)傳5代后其生產(chǎn)阿維菌素有效組分B1a的能力還保持原來(lái)水平，表明其遺傳穩(wěn)定性好。用本發(fā)明菌株來(lái)制備阿維菌素的方法，能夠提高生產(chǎn)阿維菌素的效率，而且方法簡(jiǎn)單、成本低廉。因此，本發(fā)明菌株及制備阿維菌素的方法適合于在阿維菌素的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。文檔編號(hào)C12R1/465GK101407775SQ200810227639公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者梅劉,劉金濤,英卓,周賢龍,張立新,兵徐,陳滌非,弘高申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所