專(zhuān)利名稱：：一種嗜酸乳糖酶bgala及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：13-半乳糖苷酶(e-D半乳糖苷半乳糖水解酶，P-D-galactosido_galatohydrolase，EC3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶(Lactase)。這種酶能將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用(張樹(shù)政等，酶制劑工業(yè)，科學(xué)出版社，1984，p818819)。乳糖酶存在于植物(尤其在杏、桃、蘋(píng)果)、細(xì)菌(乳酸菌、大腸桿菌等)、真菌(米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、脆壁酵母、乳結(jié)合酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母)以及放線菌(天藍(lán)鏈霉菌)、動(dòng)物腸道(特別是乳嬰)中。乳糖則是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖約占牛奶干物質(zhì)的30%，但溶解度低，在2(TC水中溶解度僅為20%，而其甜度僅及蔗糖的16%，久貯的乳制品由于乳糖析出，呈砂樣感覺(jué)，影響風(fēng)味。此外，許多成人，特別是嬰兒(因人種而異，西歐占28%，亞洲、非洲占6090%)體內(nèi)缺乏乳糖酶，因此他們很難消化牛奶，飲用牛奶后，乳糖到了腸里，被腸道細(xì)菌分解發(fā)酵，產(chǎn)生大量二氧化碳?xì)怏w，使腸道膨脹，并興奮腸道蠕動(dòng)，使收縮加強(qiáng)，造成腸鳴和腹瀉，這種疾病稱作乳糖不耐受癥(G.G.伯奇等，酶與食品加工，輕工業(yè)出版社，1991，p93110)。乳糖酶主要用來(lái)治療乳糖不耐受癥、處理加工牛乳、乳清等，生產(chǎn)低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及減少環(huán)境污染。1.解決乳糖不耐受癥患者食用乳制品的問(wèn)題(G.G.伯奇等，酶與食品加工，輕工業(yè)出版社，1991，p93110)。由于乳糖不耐受癥患者體內(nèi)缺乏乳糖酶，他們就不能充分利用乳制品中乳糖所提供的能量，乳糖在其體內(nèi)不能被吸收，就成為腸道微生物菌系的能源，這樣就導(dǎo)致乳酸和二氧化碳的形成，它們對(duì)腸道有剌激作用，并造成機(jī)體脫水進(jìn)入結(jié)腸，最終會(huì)出現(xiàn)腹瀉，同時(shí)發(fā)生腸梗塞和脹氣等，造成腸道蠕動(dòng)加快，還會(huì)減少蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)吸收。腹瀉還會(huì)帶來(lái)衛(wèi)生學(xué)方面的問(wèn)題和造成重復(fù)感染的機(jī)會(huì)?？赏ㄟ^(guò)口服乳糖酶或?qū)⑷樘敲钢苯蛹拥饺橹破分衼?lái)解決這一問(wèn)題。在工業(yè)生產(chǎn)中可將乳糖酶加到乳制品中制成低乳糖的乳制品，一方面減輕乳糖不耐受癥的影響，另一方面可提高乳制品的營(yíng)養(yǎng)。2.改良濃縮乳和濃縮乳清的質(zhì)量。由于乳糖的溶解度低，在低溫下極易從濃縮乳和濃縮乳清中結(jié)晶析出，加入乳糖酶可防止冷凍乳及濃縮乳清中的乳糖結(jié)晶而引起乳酪蛋白的凝固。此外，乳清作為飼料的利用價(jià)值很高，但乳糖對(duì)家畜的生長(zhǎng)有一定限制，使用乳糖酶將乳糖分解為單糖既提高了消化率，同時(shí)也消除了乳糖結(jié)晶所產(chǎn)生的操作不便。3.改良冰淇淋的品質(zhì)。在冰淇淋混合物中，如有12%以上的脫脂乳固形物時(shí)，貯藏及銷(xiāo)售中會(huì)產(chǎn)生乳糖結(jié)晶，此結(jié)晶在口中呈砂樣感，降低了商品價(jià)值，如脫脂固形物為16%，用酶分解其50%的乳糖后，在冰箱中放置四個(gè)月仍穩(wěn)定，而且，增加了甜味，冰淇淋混合物中的砂糖可減少12%用量。此外，水解乳清或乳糖在三明治、軟飲料和紡織品上漿中都有很大用途，在紡織品上漿中使用水解乳清可省去使用白蛋白，降低生產(chǎn)成本。近年來(lái)，利用|3-半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖也受到重視。因此，乳糖酶在食品工業(yè)生產(chǎn)中的作用日益顯著。但目前乳糖酶并未在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，主要原因是目前乳糖酶的產(chǎn)量較低，銷(xiāo)售價(jià)格過(guò)高，添加成本昂貴；市場(chǎng)上銷(xiāo)售的乳糖酶主要來(lái)源于酵母，此種酶耐熱性差，適用范圍窄，不能滿足食品工業(yè)多方面的需要。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，尋找研制出成本低，產(chǎn)量高，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，更適合食品工業(yè)生產(chǎn)的乳糖酶，已成為研究熱點(diǎn)。目前，商品化的乳糖酶主要來(lái)源于微生物(相尺孝亮等著，酶應(yīng)用手冊(cè)，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1989，407414)。以大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergill體iger)、乳糖發(fā)酵酵母(Kluyveromyceslactis)及臭曲霉(A.foetidus)的變異株為適宜。在研究蛋白質(zhì)合成及遺傳因子抑制的關(guān)系中，廣泛應(yīng)用的大腸桿菌P-半乳糖苷酶是第一個(gè)被結(jié)晶的乳糖酶，分子量為850，000Da。從大腸桿菌(E.coli)ML309所產(chǎn)生的乳糖酶，推測(cè)其分子量為518，OOODa。大腸桿菌的酶最適pH為7.0，但在Na+存在下最適pH變?yōu)?.6。在乳品及其他食品工業(yè)中獲得有效應(yīng)用的乳糖酶主要是由克魯維斯氏酵母(Kluyveromyceslactis)禾口黑曲毒(Aspergillusniger)中f尋至lj的?？唆斁S其j氏酵母是從牛乳中分離到的，其產(chǎn)生的乳糖酶最適PH與新鮮牛乳的天然pH(6.66.8)相近，主要適用于分解牛乳及脫脂奶粉中的乳糖。該酶在P朋.27.0穩(wěn)定，6.27.0以上或以下酶活迅速下降。最適溫度為3540°C。分子量為135000Da。40。C處理lhr，pH在6.58.5之間穩(wěn)定，即使處理3hr也同樣穩(wěn)定，處理24hrpH78穩(wěn)定。40°C以上就急劇失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢復(fù)Ca2+對(duì)酶的抑制，K+單獨(dú)存在就可以大大提高酶的熱穩(wěn)定性(謝毅等，復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1999，Vol.38，No.5:523-528)。以O(shè)NPG(鄰硝基苯酚-e-D半乳糖苷)為底物，40。C反應(yīng)3min，Km為2.78mmol/L，最大反應(yīng)速度為0.lumol/min，酶的水解產(chǎn)物半乳糖對(duì)酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也極為強(qiáng)烈，但其機(jī)理尚不清楚(沈?yàn)槿旱?，生物工程學(xué)報(bào)，1993,9(4):348354;DicksonRCetal.，JournalofBacteriology，1980，142(3):777785)。從黑曲霉所得的乳糖酶pH較低，而且在高溫下有活性。分子量為106000Da，最適溫度60°C，最適pH在3.54.0。精制酶在pH48穩(wěn)定，粗酶在pH2.28穩(wěn)定，以O(shè)NPG和乳糖為底物，Km分別為7.2X10—4M，1.8X10—2M，最大反應(yīng)速度分別為86.7umol/min/mg和121.9umol/min/mg(LEEet.al.，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1970，138:264271;AKASAKIM，etal.，J.Biochem，1976,80:11951200)。酶的穩(wěn)定與激活均不需要金屬離子。Mg2+能抑制活性。螯合劑使酶鈍化，對(duì)微量的重金屬離子也不顯示敏感。硝基酚疏基半乳糖苷(半乳糖酸內(nèi)酯)(TANAKA，etal.，J.Biochem,1975,77:241-247)及半乳糖是強(qiáng)抑制劑。從霉菌來(lái)的乳糖酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性高，最適PH值低，這樣在食品工業(yè)上就不容易受到微生物的污染，更具有應(yīng)用價(jià)值。目前，被克隆的乳糖酶基因有多種，用于工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)菌、酵母以及真菌的乳糖酶基因均已被克隆(HaijimeSHIBUYAetal.，Biotech.Biochem.，1995,59(7):1345-1348;IrmaF.DenHerder,etal.，MolGenGenet，1992，238:404-410;HuoKeke.SCIENCEINCHINA(SeriesB)，1995，38(11):1332-1340)。這些乳糖酶基因雖然來(lái)源不同，但它們之間卻具有較高的同源性。乳糖酶基因的高效表達(dá)主要集中在來(lái)源于曲霉的乳糖酶基因上，因?yàn)榍沟娜樘敲笩岱€(wěn)定性好，PH低，更適合食品加工的需要。食物進(jìn)入人的消化道后，在消化過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)不同的pH過(guò)程，從pHl.8-5.5的大范圍變化，在胃里還要忍受胃蛋白酶的降解作用。因此，為了能夠在消化道中更加有效的水解奶制品中的乳糖，理想中的乳糖酶應(yīng)具有耐酸、抗蛋白酶的特性，還要在生理溫度和低pH具有高活性。另外，大多數(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)的乳糖酶其最適pH為2.5-5.5，它們都是作為片劑或膠囊的形式，使其在腸道中發(fā)揮作用的。這些商品化的酶制劑大都腸衣包被，它們不適于在整個(gè)消化道尤其是胃中作用。腸衣包被的方式會(huì)增加產(chǎn)品的處理過(guò)程和成本。因此，篩選具有更加特異優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的新型乳糖酶，使其適應(yīng)整個(gè)消化道的環(huán)境，作為直接添加的酶制劑，具有更好的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的嗜酸乳糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述嗜酸乳糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述嗜酸乳糖酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述嗜酸乳糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種嗜酸乳糖酶BGALA，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明提供了編碼上述嗜酸乳糖酶基因bgalA。具體地，該基因的基因組序列如SEQIDNO.2所示。其cDNA序列如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明還提供了一種制備嗜酸乳糖酶BGALA的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳糖酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的乳糖酶BGALA。本發(fā)明還提供了上述嗜酸乳糖酶BGALA的應(yīng)用。本發(fā)明獲得一種嗜酸乳糖酶BGALA，其最適pH值為1.5，同時(shí)在酸性的范圍內(nèi)均具有高的酶活穩(wěn)定性。該酶具有較好蛋白酶抗性。在模擬人工消化道中保持穩(wěn)定并具有較高的乳糖水解率。這些性質(zhì)符合人和動(dòng)物消化生理特點(diǎn)、pH適應(yīng)范圍，可直接應(yīng)用于乳制品加工或作為口服制品用于治療乳糖不耐受癥。圖1在畢赤酵母菌中表達(dá)的重組乳糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1:低分子量蛋白質(zhì)Marker;2:純化的重組乳糖酶。3:脫糖基化的重組乳糖酶。圖2重組乳糖酶BGALA的最適pH。圖3重組乳糖酶BGALA的pH穩(wěn)定性。圖4重組乳糖酶BGALA的最適溫度。圖5重組乳糖酶BGALA的熱穩(wěn)定性。圖6重組乳糖酶BGALA的蛋白酶抗性。圖7重組乳糖酶BGALA在人工胃液中的穩(wěn)定性。圖8重組乳糖酶BGALA在模擬消化道環(huán)境對(duì)乳糖的水解。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)條件1、菌株及載體嗜酸真菌Bisporasp.MEY_1，于2008年5月19日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2500。2、酶類(lèi)及其他生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公司。底物購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑。3.培養(yǎng)基Bisporasp.MEY-1培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基1000mL馬鈴薯汁，lOg葡萄糖，25g瓊脂，pH2.5。乳糖酶活性誘導(dǎo)培養(yǎng)基5g戶硫酸銨，lg"磷酸二氫鉀，0.5g"七水合硫酸鎂，O.2gl-1氯化鈣，O.Olgl—1七水合硫酸亞鐵，3g1—1麥麩，and3gl-1豆粕，1.5%瓊脂糖，pH2.5.本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來(lái)進(jìn)行，包括Sambrook等人MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3片反.2001);Kriegler，GeneTransferandExpression:ALaboratoryMaruml(1990);禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人編，1994)。實(shí)施例1嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1及其產(chǎn)酶特性將來(lái)源于江西某礦的鈾礦廢水樣品經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板上，3(TC培養(yǎng)56d，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板可見(jiàn)透明圈產(chǎn)生。證明其具有乳糖酶活性。嗜酸真菌Bisporasp.MEY-l，于2008年5月19日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2500。實(shí)施例2嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1乳糖酶編碼基因bgalA的克隆提取嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1基因組DNA:將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無(wú)菌濾紙過(guò)濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65。C水浴鍋裂解20min，每隔10min混勻一次，在4t:下10000rpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4t:下10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-2(TC備用。根據(jù)乳糖酶基因的保守序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物BgalAPl:5'-TWYGGNGGNACNAAYTGGGG-3，和BgalAP2:5'-TCNCCNCCNAGRTTNCCNGT-3，，W，Y，N及R分別代表A/T，C/T，A/C/T/G和A/G。以嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C變性3min;然后94。C變性30sec，46。C退火30sec，72。C延伸lmin，32個(gè)循環(huán)后72。C保溫10min。得到一約1494bp片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒(méi)有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度一般2230nt，退火溫度在6065°C。并將它們分別命名為uspl，usp2，usp3(上游特異性引物)，dspl，dsp2，dsp3(下游特異性引物)見(jiàn)表l。表1.乳糖酶編碼基因bgalATAIL-PCR特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過(guò)TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果獲得全長(zhǎng)3181bp的基因組序列。實(shí)施例3乳糖酶基因的RT-PCR分析提取Bisporasp.MEY-1的總RNA，總RNA的提取方法如下將在麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)54hr的菌體離心，取濕重100mg，用lmmol/L的磷酸緩沖液(K17.0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入冰預(yù)冷的600iiL變性液(26mM醋酸鈉，pH4.0、0.5%十二烷基肌氨酸、0.125M|3-巰基乙醇、4M硫氰酸胍)中，然后依次加入60iiL2mol/L醋酸鈉(K14.0)，混勻，加入600iiL酚-氯仿-異戊醇(125:24:1，PH4.7)，劇烈振蕩，在冰上放置15min，4。C下10000g離心20min，將上清吸出，加入等體積的異丙醇，-20。C放置30min，4。C下10000g離心10min，棄去上清，沉淀加入lmL冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌后，沉淀RNA自然干燥，用Nuclease-free水溶解后備用。利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)囊?P-BgalF:5'-GTCTACGTAATGTTGTTGTCACGCTCTTTCGCGGCCGGT-3'，P-BgalR:5'-CGAGCGGCCGCTCAATACGCCCCAGGCCGTGGGCTATAC-3')擴(kuò)增cDNA，獲得編碼乳糖酶的cDNA序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后測(cè)序。通過(guò)比較乳糖酶bgalA的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因有3個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)3009bp，編碼1002氨基酸。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，其與Aspergillusphoenicis來(lái)源的乳糖酶的序列相似性最高。氨基酸最高相似性為55.5%。證明從Bisporasp.MEY-1中分離克隆得到的編碼乳糖酶的基因?yàn)樾禄颉?shí)施例4重組乳糖酶的制備將表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切(EcoRI+NotI)，同時(shí)將編碼乳糖酶的基因bgalA雙酶切(EcoRI+Notl)，切出編碼成熟乳糖酶的基因片段與表達(dá)載體pPIC9連接，獲得含有Bisporasp.MEY-1乳糖酶的基因bgalA的重組質(zhì)粒pPIC-bgalA并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/bgalA。取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，接種于400mLBMGY培養(yǎng)液中，30°C250rpm振蕩培養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于200mLB匪Y培養(yǎng)基重懸，30°C250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)48h后，離心收集上清。測(cè)定乳糖酶的活力。重組乳糖酶的表達(dá)量為0.08U/mL。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，重組乳糖酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)。將培養(yǎng)液10000rpm離心10分鐘除去菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至80%，13000rpm離心20min，取沉淀，用緩沖液重新溶解，得到濃縮酶液，進(jìn)一步用HPLC(AKTAFPLC，Pharmacia公司)純化。經(jīng)硫酸銨沉淀后上HiTrap—Q—S印harose—XL(AmershamPharmaciaBiotech預(yù)裝柱)陰離子柱。力口樣2mL，先用pH8.O，O.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液洗脫平衡柱子，然后用相同緩沖液配制的00.6mol/LNaCl梯度洗脫10個(gè)柱床(約50mL)，流速為5mL/min，分部收集，每管lmL。然后對(duì)收集管中的溶液測(cè)酶活及蛋白電泳分析。圖l顯示得到了電泳純?nèi)樘敲?。所表達(dá)的乳糖酶經(jīng)過(guò)純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的90%以上。重組乳糖酶的分子量約為160kD，用EndoH酶脫糖基后，其分子量變?yōu)閘lOkD，與其理論分子量相符。實(shí)施例5乳糖酶的酶活性測(cè)定酶活性測(cè)定通過(guò)測(cè)定水解底物ONPG釋放硝基酚的量進(jìn)行。反應(yīng)混合物包括100ii1酶稀釋液，250ii10NPG(5mM)禾P150ii1glycine/HCl緩沖液(pH1.5)。混合物在37t:溫育5min，加入1.5ml碳酸鈉溶液(1M)終止反應(yīng)。釋放的硝基酚通過(guò)測(cè)定A42。光吸收值的方法定量。乳糖酶活性單位定義在一定條件下，每分鐘分解底物生成1Pmol硝基酚所需的酶量為1個(gè)活性單位(U)。實(shí)施例6重組乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析將實(shí)施例4所純化的乳糖酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。所用緩沖液為PHI.0-3.5的HCl-Gly緩沖液，pH2.28.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉系列緩沖液及pH8.010.OTris-HCl系列緩沖液。純化的乳糖酶在不同pH的緩沖體系，37。C下測(cè)定的pH適性結(jié)果(圖2)表明BGALA的最適pH為1.5。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37°C下處理30min，再測(cè)定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，在pHO.510.0之間保持最適pH下酶活的80%以上，這說(shuō)明此酶具有較好的pH穩(wěn)定性。最適溫度的測(cè)定在檸檬酸_磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為在不同溫度下處理30mm，再進(jìn)行酶活測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖4)表明，BGALA最適溫度為60°C。酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明(圖5)，在6(TC下保溫60min，活性沒(méi)有損失。在7(TC下保溫20min，剩余酶活性為80%左右。說(shuō)明此酶具有較好的耐熱性。在乳糖酶溶液中加入0.05mL胰蛋白酶(0.lmg/mL，用pH7.0、Tris-HCl緩沖液配制)，和胃蛋白酶(0.lmg/mL，用pH2.0、甘氨酸-HCl緩沖液配制)于37。C處理60min，稀釋后再測(cè)定酶活性。用蛋白酶分別處理60min后，剩余100%的酶活性(圖6)。說(shuō)明乳糖酶具有較好的抗蛋白酶水解的能力。重組乳糖酶對(duì)金屬離子和化學(xué)試劑的抗性測(cè)定通過(guò)在反應(yīng)體系中加入不同濃度的各種化學(xué)試劑，再檢測(cè)其活性的方法進(jìn)行。結(jié)果表明(表2)，P-巰基乙醇，SDS，高濃度Mn2+強(qiáng)烈抑制該酶活性；EDTA和高濃度Pb2+—定程度抑制；然而牛奶中存在的各種離子如Ca2+，Cr3+，Cu2+，F(xiàn)e3+等對(duì)酶活性沒(méi)有影響，或輕微激活.表2.各種金屬離子對(duì)重組乳糖酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例7重組乳糖酶在人工胃液中的穩(wěn)定性重組乳糖酶在人工胃液(SGF，0.2Mglycine/HCl中包含2.Omgml—1NaCl和3.2mgml—1胃蛋白酶)中的穩(wěn)定性通過(guò)以下方法檢測(cè)純化的重組乳糖酶(1Uml—1)在不同pH(l.5，2.0，3.0，4.O，or5.0，用HC1或NaOH調(diào)整)的SGF中溫育37°C，60min。測(cè)定殘余乳糖酶活性。不添加胃蛋白酶的人工胃液(SGF-NPEP)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明(圖7)，重組乳糖酶BGALA在pHl-5的人工胃液中活性沒(méi)有損失，表現(xiàn)了較強(qiáng)的穩(wěn)定性。作為對(duì)照的米曲霉(A.oryzae)乳糖酶在pH1.5_3.0的SGF中沒(méi)有酶活性。實(shí)施例8重組乳糖酶在人工模擬消化道中對(duì)牛奶中乳糖的降解模擬消化道緩沖液是在10ml牛奶中加入2.Omgml—1NaCl，和O.2M甘氨酸及3.2mgm"胃蛋白酶。利用NaOH或HCl調(diào)整各步的pH。模擬的pH環(huán)境及時(shí)間變化如下pH1.9，20分鐘;pH5.5，10分鐘;pH4.6，10分鐘;pH3.8，10分鐘;pH2.8，20分鐘;pH1.9，40分鐘。初始溶液中(PH1.9)分別添加50U和100U重組乳糖酶，各步驟置于37t:震蕩(220rpm)溫育后，取500ii1反應(yīng)液轉(zhuǎn)入50ml試劑瓶中，添加250y120%醋酸鉛及250y1K2C204/Na2HP04(3g草酸鉀，7g磷酸氫二鈉溶于100ml水)，再置于黑暗環(huán)境30分鐘，使蛋白沉淀。稀釋20倍，其葡萄糖含量用試劑盒測(cè)定。乳糖水解率用生成的葡萄糖與牛奶中乳糖總量的比值來(lái)表示。結(jié)果表明(圖8)，添加100U乳糖酶處理后各步驟乳糖水解率分別是46.0X、36.8%、42.6%、46.1%、58.8%85.8%。商品化的米曲霉乳糖酶作為對(duì)照，其最終水解率為3.5%。重組BGALA在食糜消化過(guò)程中對(duì)牛奶乳糖的水解率最高達(dá)86X，具有較好的應(yīng)用前景。序列表〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所〈120〉一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因和應(yīng)用〈160>3〈210>1〈211>1002〈212>PRT〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>1MLLSRSFAAGVVGCLTISSLAASIGPKVTNLKIREQDRLQDIVTWDNYTLLVRGERILFY60SGEFHPFRLPVASLYLDVFQKIKALGYTGVSFYVDWALLEGTPGVYDDSGIFNLQPFFDA120ASEAGIYLVARPGPYI廳ASGGGFPGWLQLVNGTLRALDAPYLDATSLYTAKVGEAIAK180駆TEGGPIILLQPENEYIPPNNVLTQTDREYFAYVEKQFRDAGVVVPTIINDASGKGIF240APGSGLGAVDIYGFDQYPLGFDCANPYIWPAGDLQTDYREIHLDFSPTTPQAIPEFQGGS300FDPWGGPGFNACAILLNEEFERVFYKNNFAAGLTIFNIYMTYGGT麗GNLGHPGGYTSYD360YGAVIKEDRTVTREKYSEAKLEAVFVKTSLAYYTATPQNMSIAGQFVNTDEISVTQSVGE420YGTNFYFIRHTNYSSLASTSYMLTVPTSRGNVTIPQLGGTLTLNGRDSKISVTDYKLGRI■亂YSSSDIFTWQEFDGRTVVLLYGGAGETHELAFTGNLPPQPSCTGNPVVKDKDGYTII540HWSVTPERQMVDFGYLTIYLLWRNDAYNYWSIEMPAAAPLGNFTSLTKTSV頂KAGYLMR600TASVSGDILYLTGDVNATTPLEIISGASFEGTKAIYFNGKPLSFERTSYGTFISTVEFSP660PSISVPNLSKLDWKSIDSLPEIQPDYSDAAWPSCDKPYTNDTYRALTTPTSLYSSDYGFV720TGTLLYRGHFIATGKETTFFIETEGGFAFGHSVWLNSTYIGSWTGIAADQTYNQTFTLPS780LTAGKAYVFTIVIDTMGLSENYNIPDDAMKQPRGILDYQLAGRPQSAITWKMTGNLGGFN840YADKARGPLNEGGLYAERQGFYLPNPPSYSWPSSSPMTGFNSSGVRFYTASFTLDUHGY900DIPLSFTFTNASTTPYRAQLYVNGYQFGKYVNNIGPQKAFPVPEGILNYHGT麗VALTLW960AQDEGGAKVDGLALTVDLVALSGIETVVNSPMPGYSPRPGAY1002〈210>2〈211>3181〈212>DNA〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>2atgttettgtcacgctctttcgcggccggtgtegttggctgcctcacgatatccagcctt60gccgcctccatcggaccteactcaagattcg3g皿C3gg3tcgtctecag120gacattgteagccgcagcctccctcctcct3CC皿3CCCCtctttgatetggcatctg皿180ttttctccaggtg織tgggactcttggtgcg郷cgagcgcatcctctt240ctectctggtgaatttcaccccttccgcttgcccgttgcctcgctctetctcgacgtgtt300ccag皿皿tc皿ggctttgggctecaccggcgtgtccttctetgttgactgggctctcct360tg皿ggcacgcccggcgtgtacgatgactcaggcatcttcaaccttcaacccttcttcga420tgctgcatcgg郷ctgg皿tctecctcgtcgcgcgcccgggcccgtetetcaacgccga■ggcttcgggaggtggctttcctggatggctacagctcgtcaatggcaccctgcgcgcctt540agatgctccctecctcgacgccacaagcttatecaccgca皿3gtCgg3gaggccatcgc600C皿g皿CC3gatcacggagggtggacc皿taattttgctcC3gCC3g皿3acg皿tetet660tccgccteat皿cgtgttgatcgggagtectttgcatecg720gttccgcgatgccggagttgtggtgccgaccatcatcaacgacgcgagcgg咖ggggat780tttcgctccgggcagcggctteggcgragtagacatctecgggttcgatcaatetccgct840gggctttgattgtg卿gtttctgctttttatctetcatcteactcgcat■3C3ggCgCg3atccctecatatggcccgctggcgaccttcccgcgagatc960cacctggatttcagtccgac朋cgccgc皿gctettcctgagtttcaaggcggctcgttc1020gacccgtgggg郷gccggggttcaatgcgtgtgccatccttcte皿cgaggagtttgag1080agggttttctateag朋c皿tttcgctgctggactcaccattttcaatetctetetggte1140agtgctccgcteteaggtcatttecgaatctetgctgatgatttgttgatagacttetgg1200cgg皿c朋actggggc皿tcttggccatccgggcggctetacatcgtecgactecggcgc1260cgteatc^ag皿gaccggaccgtgacgcgcg皿朋gtec3gcgaggc皿agctggaggc1320ggtttttgtgaagacatccctagcgtactecacggcgactcctcagaacatgtcaattgc1380gggccagttcgtc皿tecggatga^tetcggtcacgc皿agcgtgggagagtecgggac1440caatttctectttetccggcctcctcattegcatctecgagttecatgct150011caccgtgccg3CC3gC3g3ggc皿tgtgacaatccctcaactcggcggtectcttecgct1560咖tgggcgggattcg朋gatttccgttecggactec皿3cttggccggatteacatgct1620ctactcctccagtgacatcttcacgtggcaggtcggactgtcgtattect1680ttetggcggcgcggggg腿cccacgagctcgcctttectggteatcttcC3CC3C皿CC1740ttcgtgcactgg朋3CCC3gtcgtg朋ggatecacgatcatccactggag1800tgtgacgccgtggtcgatttcggctacctcactetctecctgctctggag1860gaatgatgcatateactectggtcgattg3aatgcccgccgctgccccatteggcaactt1920cacctcgttg3CC朋朋Cgtcggtgatcatg皿ggctggttecctcatgcgcacggc皿g1980tgtttctggggacattttgttgatgtcaatgc皿c皿cccctctggaaat2040cattegcggagcttcctttgagctetetecttcaacggcaagcccctttc2100gttcgagcggacgagttecggcacttttetctcgacggtegaattctcaccaccttcaat2160atcggtgcca朋tttgagca朋ttggattggattcactec2220gccggattectctgatgcggcttggccgtcttgtgac皿gccgtatecca2280tcgagccctgcatccctttettcttccgattetggtttcgtgacgggtec2340cctctteteccgaggccactttetcgcgacaccacattcttcatcgagac2400卿郷tggttttgcgttcggccactccgtctggctcaatagcacctetettggctcctg2460gacgggtetcgctgctgatc3g3catec皿ccaaacgttcacccteccttctctcacggc2520cggcaaggcgtacgtcttcaccatcgtcatcgateccatgggcctgagcg2580cattcccgacg3CgCC3tg3agcaaccccgtggcatcctcgactaccaactcgcaggtcg2640tccccaatccgcaattacatgg皿gatgactggcaatcttggcggtttcaactacgccga2700C朋3gC3CgCggccctctca3tg皿ggCggcctetatgccg皿cgcc皿gggttttetct2760ccccaatccgccctcctectcttggccatccagtegcccctcaactcctc2820cggtgtgcgcttttetacggcttcttttecccttgattteccccacggctacgacattcc2880tctcagcttcacgtttacaaacgcttctecaacccctteccgtgcacagttgtecgtcaa2940cggcteccagttcgg朋agttetcggtccatccccgttcc3000tg朋gg朋ttctgaattetcatggtecg皿ttgggttgcgttgacgttetgggCgC3gg33060tg郷gcggtgc腿ggtggacgggttggcctteacagtggatttegtcgcgctgagtgg3120朋ttg3g3C3gtggte皿ctcacctetgcc郷gtetegcccacggcctggggcgtettg3180a3181〈210>3〈211>3009〈212>DNA〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>3atgttattgtcacgctctttcgcggccggtgtegttggctgcctcacgatatccagcctt60gccgcctccatcggaccteaagttecaaacctcaagattcgagaacaggatcgtctecag120gacattgtgacatgggacaactecacactcttggtgcgaggcgagcgcatcctcttctec180tctggtgaatttcaccccttccgcttgcccgttgcctcgctctetctcgacgtgttccag24012朋朋tc朋ggctttgggctecaccggcgtgtccttctetgttgactgggctctccttgaa300ggcacgcccggcgtgtecgatgactcaggcatcttcaaccttcaacccttcttcgatgct360gcatcggaggctggaatctecctcgtcgcgcgcccgggcccgtetetcaacgccgaggct420tcggg郷tggctttcctggatggctecagctcgtcaatggcaccctgcgcgccttegat■gctccctecctcgacgccacaagcttetecaccgc皿皿gtcgg卿ggccatcgccaag540朋CC3g3tC3cgg郷gtggttgctccagcatetettccg600ccteateacgtgttgacacagactgatcgggagtectttgcatecgttga660cgcgatgccggagttgtggtgccgaccatcatc^cgacgcgagcggc皿ggggattttc720gctccgggcagcggctteggcgcagtegacatctecgggttcgatcaatetccgctgggc780tttgattgcgcgaatccctecatetggcccgctggcgacctteccgcgag840atccacctggatttcagtccgac皿cgccgcaagctettcctgagtttcaaggcggctcg■ttcgacccgtgggg郷gccggggtt咖tgcgtgtgccatccttcteaa960g卿gggtttcaatttcgctgctggactcaccattttcaatetctetetg1020cttetggcggaacaaactggggcaatcttggccatccgggcggctetecatcgtacgac1080tecggcgccgteatc朋3ga3g3CCgg3CCgtgacgcgcgcgaggcaaag1140ctgg郷cggtttttgtgaagacatccctegcgtectecacggcgactcc1200tcaattgcgggccagttcgtc皿tecggatga皿tetcggtC3CgC皿3gcgtggg卿g1260tecgggaccaatttctactttatccggcataccaactectcctcattegcatctacgagt1320tecatgctcaccgtgccgacC3gC3g3ggCtccctcaactcggcggtect1380cttecgcteaatgggcgggattcgaagatttccgttecggtggccggatt1440aacatgctctactcctccagtgacatcttc3CgtggC皿g皿tttgacggtcggactgtc1500gtattectttatggcggcgcggggg咖cccacgagctcgcctttectggteatcttcca1560ccacaaccttcgtgcactggaaacccagtcgtg皿gg3C3皿gatggatecacgatcatc1620cactggagtgtgacgccggagtcgatttcggctecctcactetctecctg1680ctctggaggataactectggtcgattg^atgcccgccgctgccccatte1740ggcaacttcacctcgttgacc皿皿cgtcggtgatcatga郷ctggttecctcatgcgc1800acggcaagtgtttctggggacattttgtetctg織ggtgatgtcaatgc皿c朋cccct1860Ctgg3朋tC3ttegcggagcttcctttgaggggacte皿gctetatecttc皿cggc皿g1920cccctttcgttcgagcggacgagttecggcacttttetctcgacggtegaattctcacca1980ccttcaatetcggtgcca皿ttggattgga皿tccateg3ttcactecca2040gagattcagccggattactctgatgcggcttggccgtcttgtgac皿gccgtetaccaat2100gacacatatcgagccctgactccctttettcttccgattetggtttcgtg2160acgggteccctcttetaccgaggccactttatcgcgactgcacattcttc22203tCg3g3C3g朋ggtggttttgcgttcggccactccgtctggctc皿tegcacctetett2280ggctcctggacgggtetcgctgctgatcagaaacgttcacccteccttct2340ctcacggccggc皿ggcgtecgtcttcaccatcgtcatcgateccatgggcctgagcg朋2400ttcccgacgacgccatg皿gcaaccccgtggcatcctcgacteccaactc2460gcaggtcgtccccaatccgc朋ttecatgg皿gatgactggcaatcttggcggtttcaac2520tecgccgaca朋gcacgcggccctctcaatg皿ggcggcctetetgccgaacgcc皿ggg258013ttttetctccccaatccgccctcctectctaactcctccggtgtgcgcttttetecggctgacattcctctcagcttcacgtttecaaactecgtcaacggcteccagttcggaaagteccccgttcctgaaggaattctgaattetcatgcgraggatg郷gcggtgc朋aggtggacctgagtggaattgagacagtggteaactcagcgtattgatggccatccagtegccccatgacaggcttc2640tcttttecccttgattteccccacggctec2700gcttctecaacccctteccgtgcacagttg2760gtgaacaatetcggtccacaaaaggctttc2820ggtecgaattgggttgcgttgacgttetgg2880gggttggcctteacagtggatttegtcgcg2940cctetgccagggtetegcccacggcctggg30003009權(quán)利要求一種嗜酸乳糖酶BGALA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.—種嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，編碼權(quán)利要求l所述的嗜酸乳糖酶BGALA。3.如權(quán)利要求2所述的嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.2所示。4.如權(quán)利要求2所述的嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.3所示。5.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組載體。6.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組載體pPIC-bgalA。7.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組菌株。8.如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。9.一種制備嗜酸乳糖酶BGALA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求5的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳糖酶BGALA表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的乳糖酶BGALA。10.權(quán)利要求1所述乳糖酶BGALA的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來(lái)源于嗜酸雙孢菌屬Bisporasp.的乳糖酶BGALA，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述乳糖酶的基因組和cDNA編碼基因bgalA。本發(fā)明獲得一種嗜酸乳糖酶，其最適pH值為1.5，同時(shí)在酸性環(huán)境中均保持有高的酶活性，其具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，抗蛋白酶水解。且該酶在模擬消化道環(huán)境中可以高效水解牛奶中的乳糖。這些性質(zhì)使其能用來(lái)治療乳糖不耐受癥及用于乳品工業(yè)，處理加工牛乳、乳清等。文檔編號(hào)C12N15/56GK101768578SQ20081022478公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者史秀云,姚斌,孟昆,楊培龍,柏映國(guó),王亞茹,王慧,石鵬君,羅會(huì)穎,袁鐵錚申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所