專利名稱：一種雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，特別是一種雞防御素-1基因 真核表達(dá)質(zhì)粒及其使用方法。
背景技術(shù)：
防御素是動物機(jī)體先天性內(nèi)源免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性 病原微生物的陽離子肽類活性物質(zhì)，是生物機(jī)體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的一個重 要組成部分。除抗菌活性外，防御素還可中和LPS (脂多糖)、促進(jìn)傷口 愈合，對單核細(xì)胞的趨化性，調(diào)理作用活性，免疫增強(qiáng)活性。
研究發(fā)現(xiàn)人防御素(HNP)能增強(qiáng)老鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用功能， 兔子防御素在肺泡巨噬細(xì)胞中作為具有調(diào)理素作用。兔子、豚鼠a-防 御素，與人HNP2 —樣，可以誘導(dǎo)激活肥大細(xì)胞脫粒作用，導(dǎo)致組氨與 前列腺素(PGD2)的釋放。人HNPl-3能刺激氣管上皮細(xì)胞增加IL-8基 因的轉(zhuǎn)錄與產(chǎn)生，增加單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF和IL-1，而降低IL-10的產(chǎn)生。 人、兔的a -防御素通過競爭促腎上腺皮質(zhì)激素的受體結(jié)合，具有抑制 免疫抑制物糖皮質(zhì)類固醇的產(chǎn)生能力。通過與固相或液相補(bǔ)體Clq的結(jié) 合，體外人a-防御素能提高或抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活。Tettito等 1989年及Murphy等1993年的研究還證明人HNP-1-3具有對單核細(xì)胞 的細(xì)胞趨化性與對上皮細(xì)胞和培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞促有絲分裂活性。Yang 等人1999年和2000年研究表明，人上皮防御素(hBD-1和hBD-2)通過與CCR6化學(xué)激動受體的結(jié)合對未成熟樹狀突細(xì)胞和記憶性T-細(xì)胞 具有趨化性；在毫摩爾濃度，hBD-1和hBD-2可以召集未成熟樹狀突細(xì) 胞和記憶性T-細(xì)胞到微生物侵入的皮膚或粘膜位點(diǎn)，因此在內(nèi)源免疫與 獲得性免疫反應(yīng)中起重要作用。Chaly等2000年的研究還表明人中性 粒細(xì)胞a防御素通過影響細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。 Biragyn et al (2001)對鼠0-防御素多肽-2， 3的研究也發(fā)現(xiàn)它們可 以與鼠CCR6化學(xué)激動受體的結(jié)合，類似于炎癥化學(xué)激動劑MIP3-d ，可 以化學(xué)吸引骨髓來源的未成熟細(xì)胞，但對成熟的樹突狀細(xì)胞無用。 Lillard等1999年在進(jìn)行防御素誘導(dǎo)增強(qiáng)機(jī)體獲得性免疫力機(jī)制研究 時發(fā)現(xiàn)，HNPs能顯著增加血清中抗原特異性IgG與IgM的水平；增強(qiáng)抗 原特異性CD4+T細(xì)胞的增值與IFN-Y、 IL-5、 IL-6、 IL-10的分泌；體 外研究發(fā)現(xiàn)CD4+T提高CD3 e刺激的脾臟與Peyer' s結(jié)CD4+T細(xì)胞的增 值與T輔助細(xì)胞因子分泌；調(diào)節(jié)LPS或CD3 e刺激的脾臟與Peyer， s 結(jié)B或T細(xì)胞群共刺激分子的表達(dá)。Tani et al (2000)體外用人a -防御素刺激鼠脾臟細(xì)胞可以促進(jìn)其增值和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；體內(nèi)喂給小 鼠可以提高IgGh IgG2a、 IgG2b抗體水平。
防御素還與內(nèi)源防御的其他方面作用如急性炎癥有關(guān)，包括初始 裂解細(xì)胞壁釋放炎癥刺激物，肥大細(xì)胞脫粒導(dǎo)致組胺釋放及隨后的血管 縮張；增加中性粒細(xì)胞和T-輔助性細(xì)胞的化學(xué)趨化作用，導(dǎo)致白細(xì)胞聚 集到感染位點(diǎn)；促進(jìn)非特異性吞噬作用；通過組織纖維蛋白溶原酶激活 劑抑制纖維蛋白溶解作用，這樣減少細(xì)菌的傳播；通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞 的趨化和生長使組織、傷口的修復(fù)；通過抑制某些蛋白酶如Furin和組織蛋白酶抑制組織的損傷。假如急性炎癥反應(yīng)不足產(chǎn)生細(xì)菌的清除，那 么長期炎癥和適應(yīng)性免疫反應(yīng)就啟動。有些防御素就在這個過程起作 用作為單核細(xì)胞的趨化因子；通過趨化因子招集T細(xì)胞；增強(qiáng)化學(xué)趨 化作用產(chǎn)生和T-輔助細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)，導(dǎo)致增加免疫球蛋白G，不是A的 產(chǎn)生；抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生與其它巨噬細(xì)胞對LPS， LTA和細(xì)菌CpGDNA 的反應(yīng)；打開特異性吞噬細(xì)胞基因；剌激吞噬細(xì)胞凋亡和激活淋巴細(xì)胞， 產(chǎn)生潛在的驅(qū)除感染細(xì)胞。
這些研究都表明防御素能直接調(diào)控內(nèi)源免疫防御體系對抗外源侵 病原微生物，在機(jī)體獲得性免疫體系與先天性免疫體系中具有重要。椐 研究，雞防御素-1就具有誘導(dǎo)機(jī)體增強(qiáng)特異性與非特異性免疫反應(yīng)能力 性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種具有防御素所特有的免疫 增強(qiáng)作用的、適合雞使用的雞防御素-l基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其使 用方法。
本發(fā)明的雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒是這樣實(shí)現(xiàn)的，由 pcDNA3. 1 (+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達(dá)載體上的雞防御 素-1基因片段，該雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、 上游引物、下游引物的設(shè)置過程；2、雞防御素-l基因片段的PCR獲取過 程；3、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -Gal-1的構(gòu)建過程；4、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的制備過程； 1、上游引物、下游引物的設(shè)置過程引物的設(shè)計及合成是根據(jù)國內(nèi)外已在GenBank中登錄的雞防御素-1基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計，并在5，端 加入ATG啟動子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)上的酶切位點(diǎn)，上游引 物設(shè)計去掉了前導(dǎo)肽處開始，并加上歷V^ III酶切位點(diǎn)；下游引物設(shè)計 在基因末端，并加上萬a^ I酶切位點(diǎn)，所需要的引物序列為 上游引物5， -CGAAGCTT掘dGGGAAGGAAGTCAGATTG-3， 下游引物5， -TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3， 2、雞防御素-l基因的PCR擴(kuò)增過程以重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-l為模板， 加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為5uL的10XPCR buffer ( 10 X PCR buffer包含有 0.5mmol/L MgC12， 50mmol/LKCl， 10mmol/L Tris HC1， 0.001%明 膠)，2uL的4XdNTPs (4XdNTPs包含有濃度均為2.5mmol/L的dATP, dTTP, dCTP， dGTP), 0. 5uL的上游引物(20umol/L)， 0. 5uL的下游 引物(20ymol/L)， luL的pGEM-T-Gal-1質(zhì)粒，肌5uL的ddH20 (雙 蒸水)，0.5uL的ExTaq DNA聚合酶(5umol/L)，反應(yīng)過程是a、混合 物先在95。C處理3min; b、然后在94。C處理45s,再在55。C處理45s， 再在72。C處理lmin;反應(yīng)過程b循環(huán)30次；然后在72。C處理10min， 重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-l來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院家禽研究室所 克隆并保存的重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-l;所獲得的雞防御素-1基因片段核 苷酸序列為
ATGGGMGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCC CTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGCTGAPCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約130bp的擴(kuò)增條帶， 表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；
3、雞防御素-l基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-l的構(gòu)建過程將過 程2的雞防御素-1基因片段的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲 得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有10mmol/L Tris HC1， lmmol/LEDTA)溶解，TE溶解物用萬』I、進(jìn)行雙酶切處理， 膠回收約130bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切處理，膠回收5.4kb左右的DNA片斷，分別取5uL雙酶切后膠回收的 雞防御素-1基因片段和3 ii L雙酶切后膠回收的pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒，加入 1 ii L的10XT4 DNA連接Buffer (10XT4 DNA連接Buffer包含有 0.5mol/LTris'HC1, 0.1mol/LMgC12， 50mmol/LDTT， 5mmol/LATP, 0.25mg/mLBSA)， luLT4DNA連接酶，在16。C下連接處理18小時， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 ct感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C 培養(yǎng)18小時；pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品
a、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的雙酶切鑒定 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種于3ml含氨 節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA 進(jìn)行雙酶切鑒定；將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-1 分別用iSa/zHI、歷V^ni進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳 觀察，pcDNA3. 1 (+)-Gal-1雙酶切后產(chǎn)生約5. 4kb和130bp左右的兩條帶， 證明已經(jīng)成功構(gòu)建了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l; b、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的PCR鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個白色菌落，接種于3ml含氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行 PCR鑒定;以質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、 上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCRBuffer5 iiL， 4XdNTPs (2.5mmol/L) 2uL，上、下游引物(20pmol/L)各0.5 U L， pGEM-T-gal-1質(zhì)粒1 u L, ddH20 40. 5 u L, ExTaq DNA聚合酶(5umol/L) 0.5uL;反應(yīng)過程為a、 95。C處理3min; b、然后94°C 45s、 55°C 45s、 72°C lmin;反應(yīng)過程b循環(huán)30次，然后72t:延伸10min， PCR產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建 了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l; 4、雞防御素-l基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的制備過程從過 程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個白色菌落，接種于盛有10ml液體培 養(yǎng)基的三角瓶中，37。C震蕩過夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶 中加入100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在37°C，以200rpm/min 速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對500ml三角瓶 中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得雞防 御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l。
本發(fā)明的雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的使用 方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l 用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，就成為雞防御素-1基因分子佐劑 pcDNA3. 1(+)-Gal-1 。然后將該雞防御素-1基因分子佐劑 pcDNA3. 1 (+)-Gal-1與DNA疫苗混合就成為可進(jìn)行肌肉注射的雞防疫用疫本發(fā)明與已有技術(shù)相比，由于是選用了雞防御素-1基因片段與真核 表達(dá)載體連接來作為免疫增強(qiáng)劑，因此，具有雞防御素-1所特有的免疫
增強(qiáng)效果的、適合與雞DNA疫苗一起使用的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
本發(fā)明的雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒是這樣實(shí)現(xiàn)的，由
pcDNA3. 1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3. 1(+)真核表達(dá)載體上的雞防御 素-1基因片段，該雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、 上游引物、下游引物的設(shè)置過程；2、雞防御素-1基因片段的PCR獲取過 程；3、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的構(gòu)建過程；4、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的制備過程；
1、 上游引物、下游引物的設(shè)置過程引物的設(shè)計及合成是根據(jù)國內(nèi)外已 在GenBank中登錄的雞防御素-1基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計，并在5，端 加入ATG啟動子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)上的酶切位點(diǎn)，上游引 物設(shè)計去掉了前導(dǎo)肽處開始，并加上歷V^ III酶切位點(diǎn)；下游引物設(shè)計 在基因末端，并加上5』I酶切位點(diǎn)，所需要的引物序列為 上游引物5， -CGAAGCTLU4C6ATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3， 下游引物5， -TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3，
2、 雞防御素-l基因的PCR擴(kuò)增過程以重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-1為模板， 加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為5uL的10XPCR buffer (10 X PCR buffer包含有0.5mmol/L MgC12， 50mmol/L KC1， 10mmol/L Tris HC1， 0.001%明
膠)，2uL的4XdNTPs (4XdNTPs包含有濃度均為2.5mmol/L的dATP， dTTP， dCTP， dGTP)， 0.5uL的上游引物(20ymol/L)， 0. 5uL的下游 引物(20umol/L)， luL的pGEM-T-Gal-1質(zhì)粒，40,5"的ddH20 (雙 蒸水)，0.5uL的ExTaq DNA聚合酶(5umol/L)，反應(yīng)過程是a、混合 物先在95"C處理3min; b、然后在94。C處理45s，再在55。C處理45s， 再在72。C處理lmin;反應(yīng)過程b循環(huán)30次；然后在72。C處理10min， 重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-l來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院家禽研究室所 克隆并保存的重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-l;所獲得的雞防御素-1基因片段核 苷酸序列為
ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCC CTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAMGAATATGGGGCTGA
PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約130bp的擴(kuò)增條帶， 表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；
3、雞防御素-l基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的構(gòu)建過程將過 程2的雞防御素-1基因片段的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲 得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有10mmol/L Tris HC1， lmmol/LEDTA)溶解，TE溶解物用fe/dil、進(jìn)行雙酶切處理， 膠回收約130bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3， 1 (+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切處理，膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5uL雙酶切后膠回收的 雞防御素-1基因片段和L雙酶切后膠回收的pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒，加入1 u L的10XT4 DNA連接Buffer (10XT4 DNA連接Buffer包含有 0.5mol/LTris'HCl， 0.1mol/LMgC12， 50mmol/L DTT， 5mmol/L ATP， 0.25mg/mLBSA)， luLT4DNA連接酶，在16。C下連接處理18小時， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C 培養(yǎng)18小時；pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品
a、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的雙酶切鑒定 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種于3ml含氨 芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37r振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA 進(jìn)行雙酶切鑒定；將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -Gal-l 分別用泡WI、歷/^III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳 觀察，pcDNA3. 1(+)-Gal-1雙酶切后產(chǎn)生約5. 4kb和130bp左右的兩條帶， 證明已經(jīng)成功構(gòu)建了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l;
b、 雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l的PCR鑒定 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個白色菌落，接種于3ml含氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37t振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行 PCR鑒定；以質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、 上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCRBuffer5 UL， 4XdNTPs (2.5咖ol/L) 2uL，上、下游引物(20umol/L)各0.5 P L， pGEM-T-gal-l質(zhì)粒1 u L， ddH20 40. 5 u L， ExTaq隠聚合酶(5umol/L) 0.5uL;反應(yīng)過程為a、 95。C處理3min; b、然后94°C 45s、 55°C 45s、 72°C lmin;反應(yīng)過程b循環(huán)30次，然后72。C延伸10min， PCR產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，證明己經(jīng)成功構(gòu)建了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l; 4、雞防御素-l基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的制備過程從過 程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個白色菌落，接種于盛有10ml液體培 養(yǎng)基的三角瓶中，37。C震蕩過夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶 中加入100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在37°C，以200rpm/min 速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對500ml三角瓶 中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得雞防 御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l。
使用的限制性內(nèi)切酶S"wHI、歷^/in、 T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。
本發(fā)明的雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的使用 方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l 用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，就成為雞防御素-1基因分子佐劑 pcDNA3. 1(+)-Gal-1 。然后將該雞防御素-1基因分子佐劑 pcDNA3. 1 (+)-Gal-l與DNA疫苗混合就成為可進(jìn)行肌肉注射的雞防疫用疫 苗。
用該分子佐劑pcDNA3.1(+)-Gal-l與雞法氏囊病DNA疫苗(IBD VP2DNA疫苗)聯(lián)合應(yīng)用，免疫IBDVP2血清抗體陰性雞只，通過 檢測血清IBDVP2特異性抗體值、CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量 來檢測其對雞法氏囊病DNA疫苗(IBD VP2 DNA疫苗)的免疫增強(qiáng) 作用。60只14日齡的健康小雞，隨機(jī)分成3組，每組20只，免疫 兩次，第一次免疫后15天進(jìn)行二免。第一組為PBS組(免疫劑量為0.2ml)，第二組為IBDVP2DNA疫苗組(免疫劑量為150 y g)，第 三組為IBD VP2 DNA疫苗組(免疫劑量為150ug) + pcDNA3.1(+)-Gal-l (免疫劑量為150u g)。分別于免疫后7、 14、 21、 28、 35d隨機(jī)取5只雞頸靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法檢 測血清中VP2特異性抗體效價。同時采抗凝血分離淋巴細(xì)胞，用流式 細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞類CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量的測定。測 定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從免疫后第7天開始，IBDVP2特異性抗體值、CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量在第二組和第三組隨時間增加而增加，在21 天達(dá)到最高值，然后開始下降至最低值，慢慢又恢復(fù)上升。但是加入 pcDNA3.1(+)-Gal-l佐劑組即第三組雞血清特異性VP2抗體值、 CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量就一直高于IBD VP2 DNA疫苗即第二組 單獨(dú)注射組，免疫后21天出現(xiàn)顯著性差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分 子佐劑pcDNA3.1(+)-Gal-l對IBD VP2 DNA疫苗具有很好的免疫增 強(qiáng)作用。
權(quán)利要求
1、一種雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上的雞防御素-1基因片段構(gòu)成，該雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、上游引物、下游引物的設(shè)置過程；2、雞防御素-1基因片段的PCR獲取過程；3、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的構(gòu)建過程；4、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制備過程；(1)、上游引物、下游引物的設(shè)置過程引物的設(shè)計及合成是根據(jù)國內(nèi)外已在GenBank中登錄的雞防御素-1基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計，并在5’端加入ATG啟動子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計去掉了前導(dǎo)肽處開始，并加上Hind III酶切位點(diǎn)；下游引物設(shè)計在基因末端，并加上BamH I酶切位點(diǎn)，所需要的引物序列為上游引物5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’下游引物5’-TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3’(2)、雞防御素-1基因片段的PCR擴(kuò)增過程以重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-1為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為5μL的10×PCR buffer，2μL的4×dNTPs，0.5μL的濃度為20μmol/L的上游引物，0.5μL的濃度為20μmol/L的下游引物，1μL的pGEM-T-Gal-1質(zhì)粒，40.5μL的ddH2O，0.5μL的濃度為5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶，反應(yīng)過程是a、混合物先在95℃處理3min；b、然后在94℃處理45s，再在55℃處理45s，再在72℃處理1min；反應(yīng)過程b循環(huán)30次；然后在72℃處理10min，重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-1來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院家禽研究室所克隆并保存的重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-1；所獲得的雞防御素-1基因片段核苷酸序列為ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCCCTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGCTGA；PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約130bp的擴(kuò)增條帶，表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；(3)、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的構(gòu)建過程將過程2的雞防御素-1基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE溶解，TE溶解物用BamH I、HindIII進(jìn)行雙酶切處理，膠回收約130bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收5.4kb左右的DNA片斷，分別取5μL雙酶切后膠回收的雞防御素-1基因片段和3μL雙酶切后膠回收的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，加入1μL的10×T4 DNA連接Buffer，1μL T4DNA連接酶，在16℃下連接處理18小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)18小時；pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品a、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的雙酶切鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定；將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分別用BamH I、Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3.1(+)-Gal-1雙酶切后產(chǎn)生約5.4kb和130bp左右的兩條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；b、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)18小時，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定；以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為5μL的10×PCRBuffer，2μL的4×dNTPs，濃度均為20μmol/L的上、下游引物各0.5μL，pGEM-T-gal-1質(zhì)粒1μL，ddH2O 40.5μL，濃度為5μmol/L的ExTaqDNA聚合酶0.5μL；反應(yīng)過程為a、95℃處理3min；b、然后94℃45s、55℃45s、72℃1min；反應(yīng)過程b循環(huán)30次，然后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；(4)、雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制備過程從過程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個白色菌落，接種于盛有10ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃震蕩過夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在37℃，以200rpm/min速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對500ml三角瓶中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。
2、 一種雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的使用方法，其特征在于將雞 防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，就成為雞防御 素-l基因分子佐劑pcDNA3.1 (+)-Gal-l。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的使用方法， 其特征在于將雞防御素-1基因分子佐劑pcDNA3.1 (+) -Gal-l與DNA疫苗混 合就成為可進(jìn)行肌肉注射的雞防疫用疫苗。
全文摘要
一種雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其使用方法，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上的雞防御素-1基因片段構(gòu)成，將雞防御素-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒用PBS緩沖液稀釋到1mg/ml，就成為雞防御素-1基因分子佐劑pcDNA3.1(+)-Gal-1。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有雞防御素-1所特有的免疫增強(qiáng)效果的、適合與雞DNA疫苗一起使用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/79GK101629182SQ20081021977
公開日2010年1月20日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者張輝華, 曹永長, 楊小梅, 畢英佐, 謝青梅, 馬保華, 馬靜云 申請人:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院