專利名稱：抑制tm4sf4表達的干擾分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種特異性抑制四跨膜蛋白TM4SF4表達的 siRNA，其重組腺病毒表達載體，及其在預防或治療四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病(如 肝癌)方面的應用。
背景技術：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，每年肝癌死亡人數占全世界肝癌死亡人數的 45%。隨著分子生物學和細胞生物學的發(fā)展，人們逐漸了解到各種基因及其與一些疾病之 間的關系，大量的腫瘤相關基因包括癌基因和抑癌基因等被鑒定出來，以腫瘤相關基因為 靶標的生物治療手段也得到了迅速發(fā)展。肝癌內腫瘤相關基因的表達不僅與其它腫瘤有著 相似性，也有著自身的特異性。通過基因組和蛋白質組水平分析肝癌基因表達譜，鑒定新的 肝癌相關基因，能進一步了解肝癌的發(fā)生機制，并為肝癌特異性的診斷和治療提供新的靶 標。 在本發(fā)明人以往的工作中，通過抑制差減雜交的方法在基因組水平篩選大鼠再生 肝得到了的一個新基因LRTM4(Biochimica et Biophysica Acata， (2001) ， 1518 :183-189， GenBank登錄號AF205717)，并且證明其與肝再生和肝損傷相關。進一步還發(fā)現LRTM4基 因是人的四跨膜蛋白TM4SF4基因在大鼠里的同源基因。TM4SF4基因的產物為四跨膜蛋白 家族成員，大小為202個氨基酸。四跨膜蛋白家族成員主要在免疫調節(jié)、細胞的黏附、遷移 和增殖等方面起重要作用，目前普遍認為四跨膜蛋白家族的作用機理是通過與其他膜蛋白 的相互作用影響膜上的信號通路，進而調節(jié)細胞的功能。四跨膜蛋白家族與腫瘤有著密切 的關系，已經發(fā)現多種四跨膜蛋白家族成員在腫瘤中高表達，并且有些特異性地在某些組 織的腫瘤細胞中高表達。本發(fā)明人研究發(fā)現TM4SF4特異性地在肝、腸、胃細胞系中表達，在 幾種肝癌細胞系中的表達量明顯高于正常肝癌細胞系，在多數肝癌組織中的表達量也高于 相應的癌旁組織；通過上調和下調TM4SF4的表達能影響肝癌細胞的生長。各種研究結果表 明TM4SF4可以被定義為肝癌相關基因，可為肝癌的診斷和治療提供新的耙標。
目前國際上對TM4SF4的研究不多，本發(fā)明人首先闡明了它與肝癌之間的密切關 系，確定了它與肝癌細胞生長的正相關性。以前的研究多數是通過針對四跨膜蛋白胞外區(qū) 的抗體抑制四跨膜蛋白的功能，進而影響細胞的生理功能。然而，蛋白水平上的抑制效果還 存在抑制效率低，易于受蛋白空間結構影響等問題，因此還需要進一步開發(fā)其它種類的抑 制TM4SF4表達的試劑，以開發(fā)有效的肝癌防治藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供抑制四跨膜蛋白TM4SF4 (簡稱TM4SF4)表達的干擾分子及 其應用。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性地與四 跨膜蛋白TM4SF4基因的mRNA序列(較佳地與TM4SF4基因編碼區(qū)對應的mRNA序列)互補，所述的寡核苷酸具有19-21個堿基，且GC含量是30-60% ;較佳的是45-55%。在另一優(yōu)選例中，所述的靶寡核苷酸序列特異性地與TM4SF4mRNA上第835-855
位、第395-413位、第487-505位的靶序列互補。更優(yōu)選地，所述的靶寡核苷酸序列特異性
地與TM4SF4mRNA上第487-505位的耙序列互補。 在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸選自 (i)序列如SEQ ID NO :1_3任一所示的寡核苷酸；或 (ii)與SEQ ID NO :1-3任一所示的寡核苷酸序列互補的寡核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸是序列如SEQ ID NO :3所示的寡核苷酸。 在本發(fā)明的第二方面，提供所述的寡核苷酸的用途，所述的寡核苷酸用于制備抑
制四跨膜蛋白TM4SF4表達的構建物。 在本發(fā)明的第三方面，提供一種構建物，所述的構建物具有以下式I結構
Seq正向-X-Seq反向 式I， 式I中，Seq正向為SEQ ID NO :1-3任一所示的序列或其互補序列，
Seq反向為與Seq正向基本上互補的序列， X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向 不互補。 在另一優(yōu)選例中，式I所示的結構在轉入細胞后，形成式II所示的二級結構
Seq正向一^"^
|| X Seq反向"^ 式n， 式II中，I I表示在Seq正向和Seq反向之間形成的氫鍵。 在另一優(yōu)選例中，式II所示的構建物在細胞內可生成雙鏈的小干擾RNA(siRNA)。
在另一優(yōu)選例中，所述的間隔序列具有SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種重組載體，所述的載體中含有所述的構建物。
在另一優(yōu)選例中，所述的重組載體是腺病毒載體。 在本發(fā)明的第五方面，提供一種重組腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重 組表達盒，所述的重組表達盒含有所述的構建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的重組腺病毒由所述的重組腺病毒載體包裝獲得。
在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒為Ad5型腺病毒。更優(yōu)選的，所述Ad5型腺病毒為 復制缺陷型病毒，缺失與病毒復制相關的基因El或E3。進一步優(yōu)選的，所述的Ad5型腺病 毒缺失與病毒復制相關的基因E1，必須由宿主細胞(如293細胞)提供E1蛋白，才能復制 出具有感染能力的病毒。 在本發(fā)明的第六方面，提供所述的重組腺病毒的用途，用于制備預防或治療四跨 膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病。 在另一優(yōu)選例中，所述的四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病是肝癌。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種預防或治療四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病 的組合物，所述的組合物含有有效量的所述的重組腺病毒；以及藥學上可接受的藥學載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒在藥物組合物中的含量為103-102°pfu/ml ;優(yōu)選的 為106-1015pfu/ml ;更優(yōu)選的為10110"pfu/ml。
另一方面，本發(fā)明還提供一種預防或治療四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病的
方法，所述方法包括給予需要預防或治療的對象有效量的所述的重組腺病毒。 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示構建質粒及插入抑制序列的示意圖。其中，N表示核苷酸堿基，可以是A、 T、C或G。 圖2顯示不同RNAi序列對外源TM4SF4的抑制結果圖，圖示為Wseternblot鑒定 TM4SF4的表達情況，以GFP的表達作為上樣量對照。 圖3顯示PCR檢驗重組腺病毒插入片段及是否有RCA污染的電泳結果圖。其中， 1，5，9泳道為陰性對照；2， 6， 10泳道為陽性對照；3， 7， 11泳道為對照病毒AdSiGFP ;4， 8， 12 泳道為AdSiTM4SF4。 圖4顯示PCR鑒定介導RNAi的重組腺病毒對內源TM4SF4的抑制情況的電泳結果 圖。MOCK表示不經任何處理空載體的試驗結果。 圖5顯示MTT實驗檢驗該重組腺病毒對肝癌細胞生長的抑制結果圖。
圖6顯示克隆形成實驗檢驗該重組腺病毒對肝癌細胞生長的抑制結果圖。
圖7顯示流式實驗檢驗該重組腺病毒影響肝癌細胞的細胞周期的結果圖。
圖8顯示該重組腺病毒影響肝癌細胞致瘤性的結果圖。
圖9顯示該重組腺病毒具有抑瘤性的結果圖。
具體實施例方式
為了開發(fā)有效的抑制TM4SF4基因表達的試劑，本發(fā)明人經過深入的研究，首次開 發(fā)了一種在TM4SF4mRNA水平上發(fā)揮干擾作用的分子，并基于此制備了誘導RNAi的腺病毒， 其在細胞水平上或動物水平上均具有很高的TM4SF4基因表達抑制效率，呈現明顯的抑癌 效果。 如本文所用，術語"RNA干擾(RNA interference, RNAi)"是指一些小的雙鏈RNA 可以高效、特異地阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失 的表型，其也被稱為RNA干預或者RNA干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因 沉默，它是體內抵御外在感染的重要保護機制之一。簡要地說，RNA干擾包含一個由小型 干擾RNA(siRNA)所激發(fā)的機制，造成耙mRNA的降解。RNA干擾(RNAi)現象廣泛發(fā)現于大 多數真核生物中，是一種具有高度的序列專一性，特異地使特定基因沉默，使其功能喪失或 降低的一種RNA誘導的轉錄后調節(jié)方式。RNAi的基本過程一般分為兩步首先進入細胞的 dsRNA被Dicer切割成19-23個核苷酸的siRNA， siRNA與一系列的蛋白形成RISC后，耙基 因的mRNA與siRNA的正義鏈置換，并在同樣的位置被切割，從而使目的基因沉默。RNAi技 術因其高度序列專一性和高效靶基因抑制效率的特點而成為抑制基因功能的有效工具，它 比同源共抑制和反義RNA技術更有效。 如本文所用，術語"小干擾RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一種短片段 雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為耙目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑(RNA interference pathway)。 如本文所用，術語"小發(fā)夾RNA (Small hairpin RNA， shRNA，或稱為hpRNA)"是指 能夠形成發(fā)夾結構的非編碼小RNA分子，小發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的 表達。 如本文所用，除非另外說明，術語"寡核苷酸"是指與本發(fā)明所述的siRNA相應的 DNA分子，所述的"寡核苷酸"也可以是與所述的siRNA的其中一條鏈互補的。所述的"寡 核苷酸"在被制成構建物并導入到細胞后，可使得細胞內形成雙鏈的siRNA。
如本文所用，術語"互補"指的是核苷酸之間的堿基配對，如通過氫鍵結合配對，胸 腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過2個氫鍵與腺嘌呤結合，胞嘧啶和鳥嘌呤殘基通過3個氫鍵結合。 總體來講，一條核酸含有一對與另一特定的核苷酸序列有"互補百分率"的核苷酸序列。例 如，一條核苷酸序列對于另一條特定的核苷酸序列可能有80%，90%或100%的互補性，提 示這個核苷酸序列的10個核苷酸中有8個，9個，或10個與另一個特定的核苷酸序列互補。 兩條互補的核苷酸序列含有一個正義鏈(sense)和一個反義鏈(antisense)。術語"基本 互補"或"基本上互補"指的是一條核苷酸序列對于另一條特定的核苷酸序列有至少80%， 較佳的90 % ，更佳的95 % ，最佳的100 %的互補性。 如本文所用和所述的"含有"、"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構
成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......構成"、"基本上
由......構成"和"由......構成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 抑制TM4SF4的干擾分子 基于抑制TM4SF4的表達可抑制肝癌細胞的特點，可針對TM4SF4來設計干擾分子 (如siRNA)序列，從而用于抑制細胞內TM4SF4的表達。 本發(fā)明人經過長期研究，根據TM4SF4的序列，在該序列上找到了若干個對于抑制 TM4SF4mRNA轉錄有用的耙點，所述耙點對應TM4SF4mRNA (GenBank登錄號為NM_004617)上 的位置分別為第835-855位、第395-413位、第487-505位。本發(fā)明人在選擇靶序列時， 制定以下原則(1)從TM4SF4的mRNA的起始密碼開始，尋找"AA或者NA" 二連序列，記下 其3'端的19-21個堿基序列，作為潛在的siRNA耙位點。正義鏈和反義鏈都采用19-21個 堿基(不包括AA或者NA重復)來設計；(2) siRNA序列的GC含量應為30_60%左右，以GC 含量在45-55%左右的優(yōu)先；(3)在設計siRNA時盡量避開5'端和3'端的非編碼區(qū)，因為 這些區(qū)域可能會有調控蛋白的結合。此外，在篩選siRNA靶序列時，還需進行比對分析，從 而排除任何與TM4SF4以外的任何人類基因同源的靶序列，找出最佳的有效片段。任何經辨 認屬于非特異性的靶序列被排除在外。靶序列與核酸數據庫中其它序列對比可通過目前已 知的多種比較方法進行。 一種常用的比較方法如BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)分析。經過本發(fā)明人大量的分析和比較， 對應TM4SF4mRNA上的位置分別為第835-855位、第395-413位、第487-505位的靶序列與 其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的靶序列是對應于 TM4SF4mRNA上第487-505位的耙序列。 基于上述耙點，本發(fā)明提供了抑制TM4SF4表達的siRNA，所述的siRNA可特異性地 干擾TM4SF4基因的轉錄。所述的siRNA可以被制備成一種包含正義鏈和反義鏈的雙鏈核 酸，在其中正義鏈和反義鏈基本上互補?；パa的正義鏈和反義鏈隨意地包含l-2個核苷酸懸突在一條或兩條鏈上的3'末端。作為一種優(yōu)選方式，所述的雙鏈核酸包含正義鏈和反義 鏈，每條鏈有19-21個核苷酸。較佳地，所述的siRNA與選自TM4SF4mRNA上的第835-855 位、第395-413位、第487-505位的靶序列互補。 本發(fā)明對siRNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學合成法，體外轉 錄法、Rnase III (如Silencer siRNA Construction Kit, Ambion公司)或Dicer酶消化 dsRNA法等。應理解，本領域技術人員在得知了本發(fā)明所提供的TM4SF4上的靶序列以后，可 以以各種途徑方便地制備或表達所述的siRNA。例如，所述的siRNA是化學合成的。
siRNA通常制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅 在雜交的條件下形成雙鏈。 一個雙鏈RNA復合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制 備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產生合成 的雙鏈RNA復合物。 此外，siRNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個或多個編碼正義鏈和反義鏈的表 達盒來制備。當正義鏈和反義鏈由一個單獨的表達盒編碼時，它們可以從生成的轉錄物中 斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈siRNA。在Engelke， D.R.寫的RNA Interference (RNAi) :Nuts and Bolts of RNAiTechnology—書中，特別是第5和第6章， DNA Press LLC, Eagleville， PA， 2003可以讀到制備siRNA的合成和重組方法。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式， 一種雙鏈"短發(fā)夾"RNA復合物(稱作"shRNA" "hpRNA" 或"發(fā)夾siRNA")包含一條反義鏈和一條正義鏈，通過一個間隔序列相連。shRNA可以化學 合成，也可以通過一個重組核酸結構里的表達盒轉錄成單鏈RNA之后進行制備。shRNA有互 補結構區(qū)，在雜交條件下形成"發(fā)夾"構象，在其中互補的正義鏈和反義鏈相連接，例如，通 過一個l-20個核苷酸的核苷酸序列連接?？傮w來講，每一個互補的正義鏈和反義鏈有大約 14-30個核苷酸。 如上述，shRNA可以由編碼需要的轉錄物的雙鏈DNA模板來表達。編碼需要的轉 錄物的雙鏈DNA模板(本發(fā)明的寡核苷酸)被插進一個載體，例如質?；虿《据d體，然后在 體外或體內連接到一個啟動子進行表達。shRNA在真核細胞內DICER酶的作用下，可被切割 成小干擾RNA分子，從而進入RNAi途徑。"構建物"及"表達盒"在這里是指重組DNA分子，它包含預期的核酸編碼序列，這
個序列編碼一個siRNA或shRNA ;這個DNA分子還包含轉錄在體外或體內可操作的連接編
碼序列所必需的或預期的適合的調控元件。"調控元件"在這里指的是可一定程度上控制核
酸序列表達的核苷酸序列。一些常規(guī)的的調控元件包括增強子，內核糖體進入位點(IRES)，
復制起點，多腺苷酸化信號，啟動子，轉錄終止序列，以及上游調節(jié)區(qū)，這些調控元件有助于
核酸的復制、轉錄、轉錄后修飾等。 所述的構建物通常具有以下式I結構 Seq正向-X-Seq反向 式I， 式I中，Seq正向、Seq反向、X的定義同前所述。 式I所示的結構在轉入細胞后，形成式II所示的二級結構
Seq正向
<formula>formula see original document page 7</formula>
式II中，I I表示在Seq正向和Seq反向之間形成的氫鍵。 式II所示的構建物在細胞內可生成雙鏈的小干擾RNA(siRNA)。較佳的，所述的間 隔序列具有SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Seq^^或Seq^^具有SEQ ID NO :3所示的寡核苷 酸序列。 某因轉移 在獲得的可有效抑制TM4SF4表達的siRNA后，需要通過特定的方法來將所述的 siRNA特異性轉移或遞送到腫瘤細胞內或者使所述的siRNA在腫瘤細胞內被生成，從而使 腫瘤細胞與所述的siRNA接觸。這種特異性遞送可通過多種不同的遞送方法來完成，例如 直接在局部部位注射所述的siRNA。然而，研究遞送方法的同時還需要考慮對于人體的安全 性問題。 基因轉移的方法包括物理方法、化學方法和病毒載體生物學方法，這些方法均可 用于本發(fā)明。腺病毒、腺相關病毒和慢病毒都可以作為基因轉移的載體，它們都可被用于本 發(fā)明。 本發(fā)明人在研究中找到了一種特別有效的遞送方法，以腺病毒(Ad)作為載體，將 所述的siRNA或shRNA遞送到靶細胞中。以腺病毒作為遞送載體的優(yōu)點如下首先，大多數 的癌細胞都是上皮細胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細胞性，因此采用腺病毒具有很好的 選擇性；其次，腺病毒產生的滴度高，腺病毒DNA不整合到靶細胞基因組，對于人體有良好 的安全性；再次，腺病毒的理化性質穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。 腺病毒是一種直徑約80-110nm的雙鏈DNA病毒，雙鏈DNA長約36Kb，基因組由九 個區(qū)組成，四個表達較早(El-E4)稱作早區(qū)，五個表達較晚(Ll-L5)稱作晚區(qū)，表達受細胞 轉錄因子和El區(qū)控制，E2區(qū)主要調節(jié)DNA復制，E3區(qū)基因產物與病毒逃避宿主免疫系統(tǒng) 的清除有關，而E4區(qū)的產物參與病毒DNA復制、晚區(qū)基因表達和轉錄本拼接等活動。腺病
毒宿主較廣，而且對增殖和非增殖的細胞都能感染，但是絕大部分腺病毒對人的致病性都 低。腺病毒通過衣殼上纖毛的頭節(jié)區(qū)與細胞上的CAR受體結合，黏附并進入細胞，然后開始
復制和病毒顆粒的釋放，在整個病毒周期中并不整合到染色體中。人腺病毒根據顆粒表面 表位的不同分為6個亞屬、50多個血清型，目前主要用于基因載體的是C亞屬的5型腺病 毒。腺病毒的E1區(qū)基因編碼的兩個蛋白能夠與人的RB和P53蛋白相互作用，所以被改造 成基因轉移和治療載體時都去掉了 El區(qū)，替換上需要轉移的外源基因。作為本發(fā)明的優(yōu)選 方式，采用復制缺陷型Ad5，缺失與病毒復制相關的基因El，必須由宿主細胞(如293細胞) 提供E1蛋白，才能復制出具有感染能力的病毒。 腺病毒可通過受體介導的細胞內攝途徑進入細胞，核內體酸化后破裂，胞漿內病 毒DNA于溶酶體降解之前釋出，然后進入細胞核而變成附著體狀態(tài)。 本發(fā)明提供一種重組的腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達盒，所
述的重組表達盒含有如式I結構的構建物 Seq正向-X-Seq反向 式I， 式I中，Seq正向、Seq反向、X的定義同前所述。 在重組表達盒中，除了所述構建物以外，還包括與所述構建物操作性相連的其它 元件，包括但不限于啟動子、終止子等。
在進入到細胞內后，所述的構建物在RNA聚合酶III啟動子(或RNA聚合酶III
改造的CMV啟動子)的作用下，形成式II所示的二級結構
Seq正向
ii X Seq反向"^ 式n。 式II的二級結構在細胞內被諸如Dicer酶加工后，形成可抑制TM4SF4轉錄的 siRNA。 所述的Seq正向或Seq反向選自下組(或與選自下組的序列互補)(a)具有SEQ IDNO :l所示的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO : 3所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述的Sec^^或Seq^^具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序 列。 此外，還可以使重組的腺病毒表達耙向元件或與耙向元件相結合，耙向元件例如 可以是增強所述重組腺病毒穿越細胞(特別是癌細胞)膜屏障的。例如蛋白質，肽類，抗 體，抗原結合抗體片段，激素，抗原，半抗原，碳水化物結合部分如凝集素，酶，酶底物，受體， 受體配體，運載體的底物等，以及其它能夠與結合配偶體分子特異性相互作用的分子。更 特別的，增強腺病毒到細胞內特定位置的遞送作用的靶向元件可以是不同的細胞器定位信 號，例如核定位信號。或者，靶向元件可與靶細胞的標記物(如特定的腫瘤標記物)發(fā)生相 互作用。 評估腺病毒將siRNA或shRNA引入細胞的有效量的適合方法是已知的，包括測定 TM4SF4蛋白和/或TM4SF4編碼mRNA的以下方法中的一種或多種RT-PCR， RNA印跡，免疫 印跡，免疫沉淀作用以及ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)。此外還包括對接觸所述抑制制劑
后誘導的細胞凋亡進行測定，例如對特異性凋亡指示物測定。
藥物組合物 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有效量的所述重組腺病 毒以及藥學上可接受的藥學載體，所述藥學載體是與所述腺病毒相容的。所述的藥學載體 本質上對于人和/或動物無過度不良副反應(如毒性、剌激和變態(tài)反應)的，即有合理的效 益/風險比的物質，并在本質上與腺病毒、任何所用到的靶向元件以及其它成分無作用。
所述"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所 接受的量。 所述"藥學上可接受的藥學載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀
釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分
的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington's Pharmaceutical
Sciences(Mack Pub. Co. ，N. J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在
組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可
能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。 本發(fā)明所述的重組腺病毒的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度
等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例
如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的siRNA的藥代動力學參數例如生
物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發(fā)明的重組腺病毒制劑每天以約1(f-10、fu/kg(優(yōu)選的為 104-1012pfu/kg ;進一步優(yōu)選的為1()5-10 fu/kg)動物體重的劑量給予，能得到令人滿意的 效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥?？烧{節(jié)此劑量方案以提供 最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按 比例地減少。 任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于靜脈內注射、皮下注射、肌肉注 射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予、腫瘤內給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給 予的。 輛,銀優(yōu)益f : (1)首次揭示可高效和特異地抑制TM4SF4表達的干擾分子，并采用RNA干擾技術 驗證了 TM4SF4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。 (2)提供一種良好的抑腫瘤制劑，以腺病毒作為將所述siRNA或shRNA遞送到細胞 內的載體。由于大多數的癌細胞都是上皮細胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細胞性，因此具 有很好的選擇性；并且，本發(fā)明的腺病毒產生的滴度高，不整合宿主基因組，對于人體的安 全性高；此外，腺病毒的理化性質穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。 (3)本發(fā)明的產品在細胞水平上或動物水平上均具有很高的TM4SF4基因表達抑 制效率，呈現明顯的抑癌效果 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。 以下實驗例中涉及的實驗所用到的實驗材料和方法 對照細胞株選用不表達TM4SF4的正常肝細胞株L02 (購自中國科學院細胞庫)，實
驗細胞株選用表達TM4SF4的肝癌細胞株之一 BEL-7404 (購自中國科學院細胞庫)，但這并
不意味著本發(fā)明僅限于所列舉的細胞株。 實施例1.針對TM4SF4的RNAi靶序列的選擇 本發(fā)明人選擇靶序列的原則如下 1.從TM4SF4的mRNA的起始密碼開始，尋找"AA或者NA" 二連序列，并記下其3' 端的19-21個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用19-21個堿基 (不包括AA或者NA重復)來設計。 2. siRNA序列的GC含量應為30_60%左右，以GC含量在45_55%左右的優(yōu)先。
3.在設計siRNA時盡量避開5'端和3'端的非編碼區(qū)，因為這些區(qū)域可能會有調 控蛋白的結合。 4.將候選的序列與人的基因組數據庫做比較，排除那些和其它編碼序列同源的序 列。 5.選擇合適的序列，一般一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效 的siRNA序列。 發(fā)明人根據以上原則，選擇了 3條序列，對應TM4SF4的mRNA (GenBank登錄號為NM_004617)上的位置分別為第835-855位、第395-413位、第487-505位。序列如下:
S835—855 :5 ， -GTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3' (SEQ ID NO :1);
S395—413 : 5， -GCGGTGTCTTGATGATCTT-3' (SEQ ID NO :2);
S487—505 :5， -CGATTTGCGATGTTCACCT-3' (SEQ ID NO :3)。
實施例2.誘導RNAi的質粒的構建和抑制效率的檢驗 將上述的三條序列設計成發(fā)夾結構插入到pSpressorAdeno質粒(購自MGENEX Corporation)中，構建出能表達hpRNA，進而產生siRNA的質粒。對應每條耙序列，分別合 成兩條互補的寡核苷酸。再將兩條互補的寡核苷酸退火后配對形成帶有黏性末端的dsDNA 片段，然后連接到酶切后的質粒中。合成寡核苷酸的序列如下
對應S835—855的兩條寡核苷酸為 S835—855 (正向)5 ， -tcgaGCTCATCTCGGAGGTTTAAACaatcgataGTTTAAACCTCCGAGATGAG C-3， (SEQ ID NO :4); S835—855 :(反向)5 ， -ctagGCTCATCTCGGAGGTTTAAACtatcgattGTTTAAACCTCCGAGATGA
GC-3， (SEQ ID NO :5); 對應S395—413的兩條寡核苷酸為 S395—413 (正向)5 ， -tcgaGCGGTGTCTTGATGATCTTaatcgataAAGATCATCAAGACACCGC-3' (SEQ ID NO :6); S395—413 (反向)5 ， -ctagGCGGTGTCTTGATGATCTTtatcgattAAGATCATCAAGACACCGC-3 ， (SEQ ID NO :7); 對應S487—5。5的兩條寡核苷酸為 S478—505 (正向)5 ， -tcgaCGATTTGCGATGTTCACCTaatcgataAGGTGAACATCGCAAATCG-3 ， (SEQ ID NO :8); S478—505 (反向)5 ， -ctagCGATTTGCGATGTTCACCTtatcgattAGGTGAACATCGCAAATCG-3 ， (SEQ ID NO :9)。 退火操作如下在無菌管中加入正向和反向寡核苷酸各1 P g、退火緩沖液10 iU， 補無菌水到100 ill體系。95t:置10min，然后逐漸冷卻到室溫。退火得到的dsDNA片段表 示如下 dS835—855 :5 ' -tcgaGCTCATCTCGGAGGTTTAAACaatcgataGTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3' (S EQ ID NO :4); 3' -CGAGTAGAGCCTCCAAATTTGttagctatCAAATTTGGAGGCTCTACTCGgatc-5' (SEQ ID NO :5); dS395—413 :5 ' -tcgaGCGGTGTCTTGATGATCTTaatcgataAAGATCATCAAGACACCGC-3， (SEQ ID NO :6); 3' -CGCCACAGAACTACTAGAAttagctatTTCTAGTAGTTCTGTGGCGgatc-5' (SEQ ID NO: 7); dS478—5。5:5' -tcgaCGATTTGCGATGTTCACCTaatcgataAGGTGAACATCGCAAATCG-3， (SEQ ID NO :8); 3' -GCTAAACGCTACAAGTGGAttagctatTCCACTTGTAGCGTTTAGCgatc-5' (SEQ ID NO: 9)。
這三條dsDNA中間引入的環(huán)(Loop)序列為5， -aatcgata-3' (SEQ ID NO :16)，其 中含有Cla I的酶切位點。兩端引入的黏性末端分別為Xho I和Xba I切后的黏性末端。
用Sail和Xba I將pSpressorAdeno質粒進行酶切線性化，將退火的dsDNA片段 分別和經酶切線性化的質粒連接起來。連接體系為10 :線性化的質粒liU，退火片段 2iU， T4DNA連接酶liU，2X連接酶緩沖液5 yl，滅菌水1 。室溫連接30min后，轉化 到DH5a中，挑取單克隆菌落，抽取質粒，酶切驗證。陽性克隆不能被Sal I切開，但是能被 Cla I切開。取酶切驗證呈陽性的克隆再進一步測序驗證。 將插入了片段dS835—855、 dS395—413和dS478—s。5后構建的重組質粒分別命名為pSil， pSi2和pSi3。質粒的結構和插入序列的示意圖見圖1。 用Lipofectamine2000共轉染pCDNA3 (購自Invitrogen Corporation)、 pCDNA3-flag-TM4SF4、pEGFP-C2(購自BD Biosciences Clontech)和腺病毒質粒(pSil或 pSi2或pSi3質粒)到293T細胞(購自ATCC)，檢驗針對3條耙序列的RNAi質粒對外源 TM4SF4表達的抑制效果。接種293T細胞到24孔板，每孔6 X 105個細胞，37°C 、5 % C02條 件下貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后轉染，每孔轉染pEGFP-C2為0. 2 ii g， pCDNA3-f lag-TM4SF4為 0. 5 ii g，腺病毒質粒為0. 5 ii g或1 ii g，用pCDNA3將轉染DNA的總量補齊到1. 7 y g。轉染 48h后加SDS-PAGE電泳上樣緩沖液收細胞，western blot檢驗flag-TM4SF4的蛋白水平。 其中針對于S487—5。5位點的質粒pSi3抑制外源TM4SF4表達的效率最高，結果見圖2。
其中，pCDNA3-flag-TM4SF4質粒如下構建通過常規(guī)方法反轉錄獲得TM4SF4基 因。TM4SF4基因通過PCR的方法獲取，并插入到pCDNA3-f lag質粒多克隆位點處的Xbal和 EcoRI位點之間。 實施例3.誘導RNAi的重組腺病毒(AdSiTM4SF4)的制備和檢測
1.將重組的pSi3質粒線性化。體系為50iU :pSi3質粒15ii g，Nhe I 5iU，10X 酶切緩沖液5iil，無菌水補到50ia。 37t:酶切3h，然后7(TC置15min使酶失活。加入1/10 體積的3M NaAc和2體積的無水乙醇沉淀純化線性化的質粒。 2.用Lipofectamine2000共轉染線性化的pSi3質粒15ii g和線性化(以Pacl線 性化)的pacAd5 (購自IMGENEX Corporation) 4 ii g到6cm皿的HEK293細胞中。轉染5h 后換10% FBS的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。 3.第7天左右觀察病毒空斑的形成，如果有60%以上的細胞飄起，則收集細胞和上清。 4.取收集的細胞和上清反復凍融(-80°C /37°C )3次后，感染大量擴增的細胞，大
量制備重組病毒。 5.收集感染后飄起的細胞，PBS洗一遍，用10mM Tris(pH 8. 1)重懸。然后反復凍 融(-80。C /37。C ) 3次，12000rpm離心20min，收集上清。 6.取收集的上清，CsCl密度梯度離心，收集離心后的病毒帶，在3X蔗糖/PBS溶 液中透析。收集純化透析后的病毒，保存于-8(TC。 由于在重組腺病毒的產生過程中可能會與HEK293細胞基因組中的一段序列發(fā)生 同源重組，進而重新獲得E1基因，產生復制型的病毒(RCA)。本發(fā)明人通過PCR的方法檢驗 RCA的污染。取純化后的重組腺病毒，加入含100 ii g/ml蛋白酶K的TNE溶液，55t:置2h， 抽取重組腺病毒的基因組。PCR驗證未見有E1基因的摻入，結果見圖3。
檢驗RCA的引物用兩條，如下E1F(正向):5， -GGAGCGAAGAAACCCATCTGAG-3' (SEQ ID NO :10);
EIR(反向):5， -CCTATCCTCCGTATCTATCTCCAC-3' (SEQ ID NO :11);
E1AF(正向):5， -ATCGAAGAGGTACTGGCTGA-3' (SEQ ID NO :12);
E1AR(反向):5， -CCTCCGGTGATAATGACAAG-3' (SEQ ID NO :13)。
檢驗插入序列的引物如下，并取PCR后的片段測序驗證。
PF(正向):5， -GTGGATAGCGGTTTGACT-3' (SEQ ID NO :14);
PR(反向)5， -CTCATCGTACCTCAGCAC-3' (SEQ ID NO :15)。 純化后的重組腺病毒通過0D260值和50%組織培養(yǎng)感染計量法測定滴度。 一個 0D260的值相當于lX1012pt/ml左右的病毒顆粒數，但是它不能區(qū)分感染性和缺陷性的病 毒顆粒。50%組織培養(yǎng)感染計量法能夠測定含有感染性病毒的量，其得到的單位為TCID5。/ ml，最后換算成以pfu/ml為單位。最后得到純化的重組腺病毒的滴度數量級為1012pt/ml 和1010pfu/ml。 制備對照病毒AdSiGFP如下AdSiGFP的制備過程與AdSiTM4SF4的制備過程相 同。在HEK293細胞中共轉Nhe I線性化的AdenosiGFP質粒(購自IMGENEX Corporation) 和Pad線性化的pacAd5，經同源重組獲得AdSiGFP。 實施例4.重組腺病毒誘導的RNAi能有效抑制內源TM4SF4的表達 純化的重組腺病毒直接感染高表達TM4SF4的BEL-7404細胞株，誘導的RNAi能有
效的抑制內源TM4SF4的表達，TM4SF4的mRNA水平顯著降低。 1.取BEL-7404細胞，以4X 105細胞/孔接種6孔板。 2.第2天取AdSiTM4SF4和對照病毒AdSiGFP，按合適的病毒量感染細胞。感染時， 每孔換無血清的培養(yǎng)基800iU，加入病毒。感染后的2小時內，每隔15min搖晃孔板一次， 感染9小時后換新鮮的含10% FBS的培養(yǎng)基。 3.收取感染病毒2天后的細胞，檢測TM4SF4的RNA水平。具體方法如下棄去培 養(yǎng)基，PBS洗一遍細胞，每孔加入500 ii 1 Trizol (Invitrogen)收取細胞，抽提RNA， RT-PCR 檢驗TM4SF4的RNA水平。 感染AdSiTM4SF4后2天即能檢測到TM4SF4的RNA水平明顯降低。結果見圖4。 實施例5. AdSiTM4SF4具有抑制肝癌細胞生長的活性(MTT法) 1.接種L02細胞和BEL-7404細胞到96孔板，每孔1000個細胞。 2.第2天感染重組腺病毒。分3組空白對照組，AdSiGFP處理組和AdSiTM4SF4
處理組。每組6個復孔。感染時，每孔用70iU無血清的培養(yǎng)基。病毒處理9小時后，每孔
換含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基100 iU持續(xù)培養(yǎng)。 3.每2天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。每天MTT比色法檢測一次。具體如下每孔培 養(yǎng)液中加入10 y 1 5mg/ml的MTT溶液，37。C培養(yǎng)箱中孵育4小時。吸掉反應混合液，每孔加 入200 iil的DMSO，混勻后，在酶標儀上檢測490nm的吸光度。以培養(yǎng)天數為橫坐標，0D490 為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。AdSiTM4SF4感染BEL-7404后，細胞的生長速度被明顯抑制；而不表達TM4SF4的 L02細胞經過同樣的處理后，生長狀況未見有明顯的變化。結果見說明書附圖中的圖5。
實施例6. AdSiTM4SF4具有抑制肝癌細胞克隆形成能力的活性
13
1.接種L02和BEL-7404細胞到6孔板，每孔1000個細胞。 2.接種后的第2天取重組腺病毒按適當的病毒量感染細胞。感染時，每孔用 800iU無血清的培養(yǎng)基。感染后的2小時內，每隔15分鐘搖晃孔板一次。感染9小時后， 每孔換含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基1. 5ml，持續(xù)培養(yǎng)，每2天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。
3.培養(yǎng)2周后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗一遍細胞，甲醇固定20min。 PBS洗2次，加入 0. 1 %的結晶紫染色，水洗2次，晾干。拍照并記取細胞克隆數目。 結果表明，誘導針對TM4SF4RNAi的重組腺病毒能有效抑制肝癌細胞株BEL-7404 的克隆形成能力，見圖6。 實施例7. AdSiTM4SF4影響肝癌細胞的細胞周期的檢測(FCM)
1.接種L02和BEL-7404細胞到24孔板，每孔4X 104個細胞。
2.接種后的第2天取重組腺病毒按適當的病毒量感染細胞。感染時，每孔用 300iU無血清的培養(yǎng)基。感染后的2小時內，每隔15分鐘搖晃孔板一次。感染9小時后， 每孔換含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基500ia，持續(xù)培養(yǎng)，每2天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。
3.病毒感染4天后，收細胞，FCM檢測。收集所有的細胞，2000rpm離心5min，棄去 上清，PBS洗一次。加入500 iil 70%的乙醇吹勻，冰上固定30min。離心去掉乙醇，PBS洗 2遍。加入含500 ii g/ml RNaseA的PBS溶液重懸，37°C消化RNA至少2h，其間每半小時混 勻一次。加入30iig/ml的PI，4。C染色30min。上機檢測。 BEL-7404經過該能抑制TM4SF4表達的重組腺病毒感染后，sub-Gl期的細胞明顯 增多；而對L02細胞基本沒有影響，見圖7。 實施例8. AdSiTM4SF4具有抑制肝癌細胞成瘤性的活性
1.接種3X 106的BEL-7404細胞到10cm的培養(yǎng)皿。 2.第2天按適當的病毒量感染病毒。分3組空白對照組，AdSiGFP感染組，
AdSiTM4SF4感染組。感染時，每皿用6ml無血清的培養(yǎng)基。感染后的2小時內，每隔15分
鐘搖晃孔板一次。感染9小時后，換10ml含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基。 3.培養(yǎng)24小時后，消化細胞，調細胞數，注射到小鼠右側背部皮下。每只小鼠注射
量為lOOiU，注射細胞數為5Xl(f個。 4. 4周后觀察成瘤狀況并記錄荷瘤的大小。 結果見圖8，可見該能抑制TM4SF4表達的重組腺病毒感染后，可顯著抑制肝癌細 胞成瘤性。 實施例9. AdSiTM4SF4對肝癌細胞的裸鼠荷瘤具有抑瘤能力
1.接種BEL-7404細胞到裸鼠皮下，每只劑量100 iU，細胞數為5X106。
2.待瘤的直徑達到4mm后，按成瘤的大小將裸鼠平均分為2組，每組5只。
3.每只裸鼠注射2X 108pfu的重組腺病毒，每2天注射一次，給藥4次。
4.每周觀察成瘤狀況并記錄荷瘤的大小。 結果見圖9。可見該能抑制TM4SF4表達的重組腺病毒感染后，可顯著抑制腫瘤的 生長。 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
0183]序列表
0184]〈110〉中國科學院上海生命科學研究院
0185]〈120〉抑制TM4SF4表達的干擾分子及其應用0186]〈130>087841
0187]〈160>16
0188]〈170>PatentIn version3. 3
0189]〈210>1
0190]〈211>21
0191]〈212>DNA
0192]〈213〉人工序列
0193]〈22l>misc—feature
0194]<223>寡核苷酸
0195]<400>1
0196]gttte朋cct ccg3gatgagc 21
0197]〈210>2
0198]〈211>19
0199]〈212>DNA
0200]〈213〉人工序列
0201]〈22l>misc—feature
:0202]<223>寡核苷酸
:0203]〈400〉2
:0204]gcggtgtctt gatgatctt19
:0205]〈210>3
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:0207]〈212>DNA
:0208]〈213〉人工序列
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:0212]cgatttgcga tgttcacct19
:0213]〈210>4
:0214]〈211>54
:0215]〈212>DNA
:0216]〈213〉人工序列
:0217]〈221〉misc一feature
:0218]〈223〉寡核苷酸
:0219]〈400>4
:0220]tcgagctcat ctcggaggttte朋c朋tcg ategttte朋cctccgagat gage
〈210>5 〈211>54 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>5 ctaggctcat ctcggaggtt taaactatcg attgtttaaa cctccgagat gage 54 〈210>6 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>6 tegageggtg tcttgatgat cttaatcgat aaagatcatc aagacaccgc 50 〈210>7 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>7 etaggeggtg tcttgatgat ctttatcgat taagatcatc aagacaccgc 50 〈210>8 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>8 tcgacgattt gcgatgttca cctaatcgat aaggtgaaca tegcaaateg 50 〈210>9 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸
16
〈400>9ctagcgattt gcgatgttcaccttatcgat taggtgaaca tcgcaaatcg〈210〉10〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400〉10ggagcg朋g3朋cccatctgag 22〈210>11〈211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列<221>misc_feature〈223〉引物〈400>11cctatcctcc gt.atctatctccac 24〈210〉12〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223>引物<400>12atcgaagagg tactggctga20〈210〉13〈211〉20〈212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature〈223〉引物〈400〉13cctccggtga t朋tgac朋g20〈210>14〈211>18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>14gtggatagcg gtttgact〈210〉15〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400〉15ctcatcgtac ctcagcac〈210>16〈211〉8<212>DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc—feature<223>寡核苷酸〈400>1權利要求
一種分離的寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸特異性地與四跨膜蛋白TM4SF4基因的mRNA序列互補，所述的寡核苷酸具有19-21個堿基，且GC含量是30-60％。
2. 如權利要求l所述的寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸選自(i) 序列如SEQ ID NO :1-3任一所示的寡核苷酸；或(ii) 與SEQ ID N0:l-3任一所示的寡核苷酸序列互補的寡核苷酸。
3. 權利要求1所述的寡核苷酸的用途，其特征在于，所述的寡核苷酸用于制備抑制四 跨膜蛋白TM4SF4表達的構建物。
4. 一種構建物，其特征在于，所述的構建物具有以下式I結構<formula>formula see original document page 2</formula>式I式I中，Seq正向為SEQ ID NO :1-3任一所示的序列或其互補序列，Seq反^為與Seq正^j基本上互補的序列， X為位于Seq^和Seq^之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq^和Seq反^不互補。
5. —種重組載體，其特征在于，所述的載體中含有權利要求4所述的構建物。
6. 如權利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體是腺病毒載體。
7. —種重組腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達盒，所述的 重組表達盒含有所述的構建物。
8. 權利要求7所述的重組腺病毒的用途，用于制備預防或治療四跨膜蛋白TM4SF4高表 達相關疾病。
9. 如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病 是肝癌。
10. —種預防或治療四跨膜蛋白TM4SF4高表達相關疾病的組合物，其特征在于，所述 的組合物含有有效量的權利要求7所述的重組腺病毒；以及藥學上可接受的藥學載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制TM4SF4表達的干擾分子及其應用。本發(fā)明還公開了一類可抑制TM4SF4表達的小干擾RNA。本發(fā)明還公開了一種分離的寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性地與四跨膜蛋白TM4SF4基因編碼區(qū)對應的mRNA序列互補。本發(fā)明還公開了一種在導入細胞后可抑制TM4SF4表達的重組腺病毒。本發(fā)明首次揭示可高效和特異地抑制TM4SF4表達的干擾分子，并提供有效的抑制癌癥的腺病毒制劑。
文檔編號C12N15/861GK101748122SQ20081020723
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者唐欣, 李載平, 李穎, 王雷鳴, 答亮, 許穎, 趙慕鈞, 陳光明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院