專利名稱：：一種兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種疾病易感基因檢測產(chǎn)品，具體的說，涉及一種有關(guān)兒童精祌發(fā)育遲緩基因檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
：精神發(fā)育遲緩(mentalretardation)又稱為精神發(fā)育不全或弱智，可由多種原因引起。因為其主要癥狀是智力缺損，所以過去又稱為"智力不足"。這是兒童期最常見的精神障礙之一，并延續(xù)終生。主要表現(xiàn)是在發(fā)育期內(nèi)智力明顯低于平均水平，并伴有適應(yīng)行為的缺損。上述所謂發(fā)育期是指18歲以前，所謂智力明顯低于平均水平是指智商低于正常平均值的兩個標(biāo)準(zhǔn)差(即低于70)，所謂適應(yīng)行為缺損是指根據(jù)其年齡及文化背景，不能符合社交的和個人的要求標(biāo)準(zhǔn)。兒童精神發(fā)育遲緩有如下表現(xiàn)癥狀一、語言發(fā)展遲緩，發(fā)音不清二、心神不定，注意力分散三、不與同伴游戲，不參加集體活動四、動作遲緩、不活潑五、基本生活能力差六、運動機能發(fā)展遲緩七、體弱多病標(biāo)準(zhǔn)化的智商測驗可測定智力低下的智商水平。智商測定存在一定程度的偏倚，但它仍能合理地、準(zhǔn)確地評價兒童的智力，特別是對年長兒。智商(IQ)值為6984的兒童一般有學(xué)習(xí)困難，無精神發(fā)育遲緩。他們在入學(xué)前很少被檢查出來，當(dāng)教育和行為問題突出時才被診斷出來。對他們進行特殊的教育，他們一般能完成學(xué)業(yè)，自謀生計。教育對精神發(fā)育遲緩的兒童都是非常有益的。輕度精神發(fā)育遲緩的兒童(IQ值5268)可能達到46年級的認(rèn)知能力，雖然他們誦讀困難，但大多數(shù)精神發(fā)育遲緩的兒童能掌握曰常生活所需的基本教育機能。他們需要輔導(dǎo)、支持、特殊教育和訓(xùn)練設(shè)備，長大后他們需要安全的生活環(huán)境和工作場所。雖然他們沒有明顯的身體缺陷，但可能并發(fā)癲癇。輕度精神發(fā)育遲緩患者不成熟，不懂世故，社會交往能力差，他們的思維僅僅是形象思維，往往不能抽象思維，他們難以適應(yīng)新的環(huán)境，并且判斷力差，不能深謀遠慮。他們?nèi)菀资茯_，容易發(fā)生犯罪行為。但輕度患者常作為團伙的一員，參與團伙犯罪，有時為了充當(dāng)團伙的頭目，而犯下沖動性罪行。中度精神發(fā)育遲緩的兒童(IQ值3651)有明顯的語言和運動發(fā)育遲緩，給予大量的訓(xùn)練和支持，輕中度精祌發(fā)育遲緩的成年人可以在社會中過著不同程度的獨立生活，有些人通過重返社會訓(xùn)練所，接受最低限度的支持即可生活，而一些人則需要很好的監(jiān)督。重度精神發(fā)育遲緩的兒童(IQ值2035)接受訓(xùn)練的能力較中度患兒差。極重度兒童(IQ值19以下)一般不會走，不會說話，癡呆。精神發(fā)育遲緩的兒童預(yù)期壽命短，根據(jù)病因和病情嚴(yán)重程度不同，預(yù)期壽命長短不一，病情越嚴(yán)重的病人，預(yù)期壽命越短。由于各家調(diào)查統(tǒng)計方法不同，所以患病率的報道差異很大。診斷的確定常依據(jù)智力測驗，目前我國因為智力測驗尚未普遍開展，未能根據(jù)智商進行篩選，因此常常只注意到較重的患者。根據(jù)一些地區(qū)的調(diào)查資料，中度及重度患者的患病率略高于0.1%，男性多于女性。有人認(rèn)為，輕度的精神發(fā)育遲緩對社會影響不大，與正常的界線有時也不易劃清，因此其患病率很難準(zhǔn)確地獲得，它主要是一個教育問題，而不是臨床醫(yī)學(xué)問題。精神發(fā)育遲緩一般是不可逆的。因此早期診斷精神發(fā)育遲緩，及早提供制訂教育和訓(xùn)練方案的依據(jù)非常重要。對患病兒童，尤其是嬰幼兒，哪怕是早一兩個月都有極為重要的關(guān)系。而現(xiàn)有最常用的智力測驗方式通常僅針對較大的少兒，還受限于現(xiàn)有的統(tǒng)計水平，而且在我國還不普及，對一些輕度中度這類最易受教育培訓(xùn)影響的患者，十分不利，很可能失去可以具備基本生活自理能力，甚至過正常人生活的機會。既增加患者家庭的痛苦，又增加了社會的負(fù)擔(dān)。人們希望有一種簡便而客觀的方法可以進行兒童精神發(fā)育遲緩測試，對精神發(fā)育遲緩者及早做出診斷，及時提供制訂教育和訓(xùn)練方案的依據(jù)，使更多兒童患者具備基本生活自理能力，甚至可以過正常人的生活。
發(fā)明內(nèi)容為了可以簡便而客觀地對兒童精神發(fā)育遲緩進行測試，本發(fā)明提供一種兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，可以以兒童DNA樣本為測試樣本，對兒童精神發(fā)育遲緩的基因進行檢測，從而判斷其是否患有精神發(fā)育遲緩，有助于及時診斷和治療。該試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽性對照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對照品組成。使用時以被測兒童的DNA樣本為檢測對象，經(jīng)過樣本DNA抽提后，使用試劑盒在熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)結(jié)果進行診斷。所述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBRgreenI，以及與兒童精神發(fā)育遲緩相關(guān)的P0U1F1和NSUN5基因突變位點的擴增引物；擴增P0U1F1基因的引物為包含突變位點的上游引物和正常的下游引物，擴增NSUN5基因的引物為包含突變位點的下游引物和正常的上游引物，序列分別如下-擴增P0U1F1基因的引物序列如下上游引物F1C5-GAATACAGAAATTCACTCTTGAACACC-327bp，上游引物FIT5-GGATACAGAAATTCACTCTTGAACACT-327bp，下游引物Rl5-CTTGCTCTGCCATTTCCACTTT-322bp;擴增NSUN5基因的引物序列如下上游引物R2T5-CGCAGGCAGCAGTTTACA-318bp，上游弓1物R2C5-CGCAGGCAGCAGTTTACG-318bp，下游引物F25-TTTATTTCTGCAGGCAACACTTTT-318bp。上述的兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，所述的陽性對照品有4個，分別包含如下的序列SEQ1:CGTGGAGGACGTTATTGGGTTGCCTGCAGATTATTCTTAASEQ2:CGTGGAGGACGTTATTGGGTTGCCTGCAGATTATTCTTAASEQ3:TTCAACATCACTCTGAATGCCTCTGCCATTAATACGCTGTSEQ4:TTCAACATCACTCTGAATGCCTCTGCCATTAATACACTGTCCTGGGCCCTCCCTTCCTCGAATAAAATGCTGTCACAAGCCCTGGGCCCTCCCTTCCTCGAATAAAATGCTGTCACAAGCAAATAAATAGAGTGAGATTTTCCACTTTGATCAAGAGTGACACCGCAGGCGGCTGTGTTCAGAACGTACTAGGAGAAAAACACCGCAGGCGGCTGTGTTCAGAACGTACTAGGAGAAAAAATCATATATTTTATGATTGTTGAAACAAATATTTCTGTATAAATAAATAGATCATATATTAGTGAGATTTTTATGATTGTTCCACTTTGATGAAACAAATTCAAGAGTGAATTTCTGTATAGCAGTTTGCTTGCTGGTGACTACGATAGATCTCACATTCAGCAGTTTGCTTGCTGGTGACTACGATAGATCTCACATTCGTTACAGGTTATCTAATAAATTGTTAGACATCATTCATACGTTACAGGTTATCTAATAAATTGTTAGACATCATTCATACGTTTTGAAAGGCAAAAGTGTTCACAGTTTTATACT;ATTTTGAAAGGCAAAAGTGTTCACAGTTTTATACT;TTTAATAGCAAGGCTACTTGAATAAGCAAAAGACTGCT;TTTAATAGCAAGGCTACTTGAATAAGCAAAAGACTGCT。上述的兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，所述的陰性對照品包含的序列為SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。本發(fā)明的使用不需要兒童本人到場，只需取其DNA樣本，比如口腔樣本，更有效保護對方隱私。不用問答形式，減輕患者的心理負(fù)擔(dān)，以及人為因素對診斷結(jié)果的影響?？梢詫和癜l(fā)育遲緩進行簡便而客觀地分析，便于推廣應(yīng)用，有助于對精神發(fā)育遲緩者及時做出診斷，及早提供制訂教育和訓(xùn)練方案的依據(jù)，使更多兒童患者具備基本生活自理能力，甚t至可以過正常人的生活。圖1，圖2，圖3，圖4，圖5，圖6為熒光定量PCR儀上的擴增曲線圖。各圖上方的DeltaRnvsCycle，是指ARn隨循環(huán)變化的對數(shù)擴增圖譜；ARn(DeltaRn)是指在給定的一組PCR條件下所生成熒光信號的對數(shù)值。該圖的橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)(CycleNumber),縱坐標(biāo)表示熒光值(DdtaRn)。橫線表示熒光域值，曲線與熒光域值線的交叉點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。圖l、圖2、圖3中橫線3表示熒光域值；曲線1表示為擴增NSUN5的引物對F+RC，擴增樣本所生成的擴增曲線；曲線2為擴增NSUN5的引物對F+RT，這對引物擴增樣本所生成的擴增曲線。圖1表示NSUN5基因CC純合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線1與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cl，曲線2與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C2。圖2表示NSUN5基因CT雜合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線1與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C3，曲線2與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C4。圖3表示NSUN5基因TT純合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線2與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C5,曲線1與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C6。圖4、圖5、圖6中橫線4表示熒光域值；曲線5表示為擴增P0U1F1的引物對FC+R，擴增樣本所生成的擴增曲線；曲線6為擴增P0U1F1的引物對FT+R，這對引物擴增樣本所生成的擴增曲線。圖4表示POU1F1基因CC純合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C7，曲線6與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C8。圖5表示POU1F1基因CT雜合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C9，曲線6與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為CIO。圖6表示POU1F1基因TT純合型樣本的產(chǎn)物擴增曲線圖曲線6與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cll，曲線5與熒光域值線的交叉點表示達到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C12。具體實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。7應(yīng)當(dāng)理解，下面實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例h試劑盒的制備。包括(l)探針的準(zhǔn)備；(2)DNA抽提試劑；G)預(yù)混反應(yīng)液；(4)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照；(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對照。(1)探針的準(zhǔn)備；由通常的核苷酸引物合成儀合成。序列如下擴增P0U1F1基因的引物序列上游引物FlC5-GAATACAGAAATTCACTCTTGAACACC-327bp，上游引物F1T5-GGATACAGAAATTCACTCTTGAACACT-327bp，下游引物R15-CTTGCTCTGCCATTTCCACTTT-322bp;擴增NSUN5基因的引物序列下游引物R2T5-CGCAGGCAGCAGTTTACA-318bp'下游引物R2C5-CGCAGGCAGCAGTTTACG-318bp，上游引物F25-TTTATTTCTGCAGGCAACACTTTT-318bp。使用前按每OD引物稀釋為100pmol/L(即100pmol/pl)濃度的加水量，開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心l分鐘，防止開蓋時引物散失。使用前，將濃溶液稀釋成工作液10pmol/ml后進行實驗。(2)DNA抽提試劑:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)預(yù)混PCR反應(yīng)液預(yù)混反應(yīng)液包括6種，每種內(nèi)含一對上下游擴增引物，各對應(yīng)一個基因型。按lml配比量計算，共同的成分配制為..100|xM的dNTP，20^1;500U/plTaqDNAPolymerase20pl;2XQuantOneStepSYBR1300pi;10的上游引物50pi;10的下游引物50nl;脂ase-freeddH20860^1。管l的l對引物為上游引物F1C5-GAATACAGAAATTCACTCTTGAACACC-327bp，下游引物R15-CTTGCTCTGCCATTTCCACTTT-322bp;管2的1對引物為上游引物F1T5-GGATACAGAAATTCACTCTTGAACACT-327bp，下游引物Rl5陽CTTGCTCTGCCATTTCCACTTT-322bp;管3的1對引物為上游引物F25層TTTATTTCTGCAGGCAACACTTTT-318bp，下游引物R2T5-CGCAGGCAGCAGTTTACA-318bp;管4的1對引物為上游引物F25-TTTATTTCTGCAGGCAACACTTTT陽318bp，下游引物R2C5-CGCAGGCAGCAGTTTACG-318bp。(4)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是含有PPARG和PPARA基因中含突變核苷酸片段構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5(X增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋到109Copy/nI，.2(TC保存。貯存存為109CopyVl,使用濃度為105Copy/|al。標(biāo)準(zhǔn)陽性模板提供4種，每種濃度為105Copy/pl。序列如下SE(J1:CGTGGAGGACCCTGGGCCCTCACCGCAGGCAGCAGTTTGCGTTTTGAAAGGTTATTGGGTCCCTTCCTCGGGCTGTGTTCTTGCTGGTGAGCAAAAGTGTTGCCTGCAGAAATAAAATGCAGAACGTACTCTACGATAGATCACAGTTTTTTATTCTTAATGTCACAAGCAGGAGAAAAATCTCACATTCATACT;SEQ2:CGTGGAGGACCCTGGGCCCTCACCGCAGGCAGCAGTTTGCATTTTGAAAGGTTATTGGGTCCCTTCCTCGGGCTGTGTTCTTGCTGGTGAGCAAAAGTGTTGCCTGCAGAAATAAAATGCAGAACGTACTCTACGATAGATCACAGTTTTTTATTCTTAATGTCACAAGCAGGAGAAAAATCTCACATTCATACT;SEQ3:TTCAACATCAAAATAAATAGATCATATATTGTTACAGGTTTTTAATAGCACTCTGAATGCAGTGAGATTTTTATGATTGTATCTAATAAAAGGCTACTTGCTCTGCCATTTCCACTTTGATGAAACAAATTTGTTAGACAAATAAGCAAAAATACGCTGTTCAAGAGTGAATTTCTGTATTCATTCATACAGACTGCT;SEQ4:TTCAACATCAAAATAAATAGATCATATATTGTTACAGGTTTTTAATAGCACTCTGAATGCAGTGAGATTTTTATGATTGTATCTAATAAAAGGCTACTTGCTCTGCCATTTCCACTTTGATGAAACAAATTTGTTAGACAAATAAGCAAAAATACACTGTTCAAGAGTGAATTTCTGTATTCATTCATACAGACTGCT。(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對照標(biāo)準(zhǔn)陰性模板是含有擬南芥基因片斷180個核苷酸構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋到109Copy/pl，-20°。保存。貯存存為109Copy/|^l，使用濃度為105Copy4U。序列如下SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。實施例2:試劑盒的使用(1)樣本的制備取樣方式使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭IO次。注意為了保證樣本不被食物或者飲料污染，取樣前30分鐘內(nèi)請勿進食和飲水。a)處理材料將在面頰內(nèi)擦拭過的棉簽轉(zhuǎn)置于2ml離心管中，用剪刀將棉簽部分從其桿上剪下，加入400m1緩沖液ga。b)加入20pl蛋白酶K溶液，渦旋IO秒混勻，56'C放置60分鐘，其間每15分鐘渦旋混勻數(shù)次。c)加入400^1緩沖液GB，充分顛倒混勻，7(TC放置10分鐘，此時溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。d)加200pl無水乙醇，充分顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。e)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。f)向吸附柱CR中加入500|xl緩沖液GD，12,000rpm(13,40()xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。g)向吸附柱CR中加入700pl漂洗液PW，12,000rpm(13，400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管。h)向吸附柱CR中加入500pl漂洗液PW，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。i)將吸附柱CR放回收集管中，12,000rpm(13,400xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CR室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗。j)將吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50W洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm(13,400xg)離心2分鐘。重復(fù)一次。(2)實驗過程a)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)二待測樣本數(shù)+陰性對照l個+陽性對照l個)取預(yù)混PCR反應(yīng)液每管23pl分裝于反應(yīng)管中。b)將上述處理好的待測樣本和陰性、陽性對照(務(wù)必振蕩混勻數(shù)秒)各取2pl分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，立即進行PCR擴增反應(yīng)。c)PCR條件1095°C10sec(95°C15sec,60°C60sec)X40個循環(huán)(3)結(jié)果分析與判斷a)定量檢測SNP的判斷標(biāo)準(zhǔn)兩曲線的Ct值之差的絕對值記為IACtl，當(dāng)IACtl《1，判斷為雜合型；當(dāng)IACtl^5，判斷為純合型。如圖，圖l中l(wèi)ACtl》5，表示該樣本為NSUN5基因CC純合型樣本。圖2中，|ACt|《l，表示該樣本為NSUN5基因CT雜合型樣本。圖3中，|ACt|》5，表示該樣本為NSUN5基因TT純合型樣本。圖4中|ACt|》5，表示該樣本為P0U1F1基因CC純合型樣本。圖5中，|△Ct|《l，表示該樣本為P0U1F1基因CT雜合型樣本。圖6中，|ACt|》5，表示該樣本為P0U1F1基因TT純合型樣本。b)結(jié)果分析基因型診斷結(jié)果NSUN5CC+POU1F1CC基因檢測結(jié)果顯示兒童精神發(fā)育遲緩發(fā)生的機率比較大。NSUN5TT+POU1F1TT基因檢測結(jié)果顯示兒童精神發(fā)育遲緩發(fā)生的機率較小。NSUN5+POU1F1的其他組基因檢測結(jié)果顯示可能發(fā)生兒童精神發(fā)育遲緩，需要結(jié)合合其他的檢查手段。序列表<110>上海裕隆生物科技有限公司<120>—種兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒<160>11<210>1<21>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢測POU1F1基因序列相關(guān)突變的DNA弓I物，命名為上游引物F1C。<400>1gaatacagaaattcactcttgaacacc27<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223〉根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢測P0U1F1基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為上游引物F1T。<400>2ggatacagaaattcactcttgaacact27<210>3<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢測P0U1F1基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為下游引物R1。<400>3cttgctctgccatttccacttt22<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223〉根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢領(lǐng)(JNSUN5基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為下游引物R2T。<400〉4cgc鄉(xiāng)cagcagtttaca18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢壩i]NSUN5基因序列相關(guān)突變的DNA弓I物，命名為下游引物R2C。<400>5cgcaggcagcagtttacg18<210>6<211〉18<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設(shè)計，以用作兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒中檢測NSUN5基因序列相關(guān)突變的DNA弓|物，命名為上游引物F2。<400〉6tttatttctgcaggcaacactttt18<210〉7<211>195<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>760120180195cgtggaggaccctgggccctcaccgcaggcagcagtttgcgttttgaaaggttattgggtcccttcctcgggctgtgttcttgctggtgagcaaaagtgttgcctgcagaaataaaatgcagaacgtactctacgatagatcacagttttttattcttaatgtcacaagcaggagaaaaatctcacattcatact<210>8<211>195<212>DNA<213〉人屬(Homo)<400>8cgtggaggaccctgggccctcaccgcaggcagcagtttgcattttgaaaggttattgggt60cccttcctcgggctgtgttcttgctggtgagcaaaagtgttgcctgcagaaataaaatgc120agaacgtactctacgatagatcacagttttttattcttaatgtcacaagcaggagaaaaa180tctcacattcatact195<210>9<211>198<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>9ttcaacatcaaaataaatagatcatatattgttacaggtttttaatagcactctgaatgc60agtgagatttttatgattgtatctaataaaaggctacttgctctgccatttccactttga12013tgaaacaaatttgttagacaaataagcaaaaatacgctgttcaagagtgaatttctgtat180tcattcatacagactgct198<210>10<211>198<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>10ttcaacatcaaaataaatagatcatatattgttacaggtttttaatagcactctgaatgc60agtgagatttttatgattgtatctaataaaaggctacttgctctgccatttccactttga120tgaaacaaatttgttagacaaataagcaaaaatacactgttcaagagtgaatttctgtat180tcattcatacagactgct198<210〉11<211>180<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400〉11ttcgttattgaatcttgttttggttctcttgtgtggaatgcattgttettgcttctctgg60aacttgggatatgatgacaaaaatacgatatctctaaggctaattgctgtgcggatgaaa120tatatttgcacgtcagtctgatcccattatgtatataacattaggagttggtgcatgctc180權(quán)利要求1.一種兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，其特征在于由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽性對照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對照品組成；所述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBRgreenI，以及與兒童精神發(fā)育遲緩相關(guān)的POU1F1和NSUN5基因突變位點的擴增引物；擴增POU1F1基因的引物為包含突變位點的上游引物和正常的下游引物，擴增NSUN5基因的引物為包含突變位點的下游引物和正常的上游引物，序列分別如下擴增POU1F1基因的引物序列如下上游引物F1C5-GAATACAGAAATTCACTCTTGAACACC-327bp，上游引物F1T5-GGATACAGAAATTCACTCTTGAACACT-327bp，下游引物R15-CTTGCTCTGCCATTTCCACTTT-322bp；擴增NSUN5基因的引物序列如下下游引物R2T5-CGCAGGCAGCAGTTTACA-318bp，下游引物R2C5-CGCAGGCAGCAGTTTACG-318bp，上游引物F25-TTTATTTCTGCAGGCAACACTTTT-318bp。2.如權(quán)利要求1所述的兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性對照品有4個，分別包含如下的序列SEQ1:CGTGGAGGACGTTATTGGGTTGCCTGCAGATTATTCTTAASEQ2:CGTGGAGGACGTTATTGGGTTGCCTGCAGATTATTCTTAASEQ3:TTCAACATCACTCTGAATGCCTCTGCCATTAATACGCTGTSEQ4:TTCAACATCACTCTGAATGCCTCTGCCATTAATACACTGTCCTGGGCCCTCCCTTCCTCGAATAAAATGCTGTCACAAGCCCTGGGCCCTCCCTTCCTCGAATAAAATGCTGTCACAAGCAAATAAATAGAGTGAGATTTTCCACTTTGATCAAGAGTGAAAATAAATAGAGTGAGATTTTCCACTTTGATCAAGAGTGACACCGCAGGCAGCAGTTTGCGGCTGTGTTCTTGCTGGTGAAGAACGTACTCTACGATAGAAGGAGAAAAATCTCACATTCCACCGCAGGCGGCTGTGTTCAGAACGTACTAGGAGAAAAAAGCAGTTTGCTTGCTGGTGACTACGATAGATCTCACATTCATCATATATTTTATGATTGTGTTACAGGTTATCTAATAAATGAAACAAATTTGTTAGACAATTTCTGTATTCATTCATACATCATATATTTTATGATTGTTGAAACAAATATTTCTGTATGTTACAGGTTATCTAATAAATTGTTAGACATCATTCATACGTTTTGAAAGGCAAAAGTGTTCACAGTTTTATACT;ATTTTGAAAGGCAAAAGTGTTCACAGTTTTATACT;TTTAATAGCAAGGCTACTTGAATAAGCAAAAGACTGCT;TTTAATAGCAAGGCTACTTGAATAAGCAAAAGACTGCT。3.如權(quán)利要求1或2所述的兒童精神發(fā)育遲緩基因檢測試劑盒，其特征在于所述的陰性對照品包含的序列為SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。全文摘要本發(fā)明提供一種兒童精神發(fā)育遲緩基因分析檢測試劑盒。該試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽性對照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對照品組成。預(yù)混PCR反應(yīng)液中含有擴增兒童精神發(fā)育遲緩分析POU1F1-1和NSUN5基因突變位點的擴增引物。本發(fā)明克服了通常采用的智力測驗方式診斷兒童精神發(fā)育遲緩的不足該方法存在一定程度的偏倚，并且較適宜對年長兒童作檢查，不適于對嬰幼兒檢測；且受限于各國分析水平，在我國推行不廣。本發(fā)明提供一種簡便而客觀的方法，以兒童DNA基因樣本為測試對象樣本，對兒童精神發(fā)育遲緩及早做出診斷，及時提供制訂教育和訓(xùn)練方案的依據(jù)，使更多兒童患者具備基本生活自理能力，甚至可以過正常人的生活。文檔編號C12Q1/68GK101684491SQ20081020058公開日2010年3月31日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者汪寧梅,穆海東,颯黎申請人:上海裕隆生物科技有限公司