專利名稱：：一種擴增高gc含量片段的pcr專用混合液及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于利用聚合酶鏈式反應(PCR)的核酸擴增領域的技術。技術背景利用聚合酶鏈式反應(PCR)的核酸擴增以及包括PCR擴增的分析眾所周知。參見美國專利第4683202、第4683195號和第4965188號，以及通常參見PCRPROTOCOLS,aguidetoMethodsandApplications,Irmis等人編輯，AcademicPress(SanDiego,CA(USA)1990)。通常，聚合酶鏈式反應必須保證擴增反應的特異性，保真度，擴增片段的長度，通過優(yōu)化退火溫度，引物設計和鎂離子濃度使用標準PCR反應體系足以對大多數(shù)模板進行高特異性的擴增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。為獲得最好的結果需要模板的完全變性。另外，二級結構會阻止引物結合和酶的延伸。有研究報告顯示調節(jié)離子濃度(Na+和K+)或反應組分的量能影響模板的二級結構(LeRudulier，D,etal，Science224;1064(1984);Buche，A，etal，J.Biomolec.Struct.Dyn.8(3);601(1990);Marquet，R,andHoussier，C,J，Biomolec.Struct.Dyn.9(1):159(1991);Buche，A，etal,J.Biomolec.Struct.Dyn.11(1):95(1993);Woodford,K.，etal.，Nucl，AcidsRes.23(3):539(1995);Flock,S.,etal.,Biophys.J.70:1456(1996);Flock，S.,etal.，Biophys..，71:1519(1996);EP0821059A2);還有研究報告顯示，在體外，核酸構象和穩(wěn)定性可以通過往緩沖液內添加一定量的化合物如多糖(Carninci,P.,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci,USA95:520-524(1998))，某些助溶劑如甘油和DMSO(Varadaraj，K.，andSkinner,D.M.，Gene140;1(1994))和其他含N化合物和氨基酸如脯氨酸和甜菜堿(Rees,W.A.,etal.，Biochemistry32:137-144(1993);WO95/20682;DE4411588CI;DE4411594CI;Mytelka,D.S.，etal.，NuclAcidsRes.24(14):2774(1996);Baskaran，N.,etal.，GenomeRes.6:633(1996);Weissensteiner，T.，andLanchbury，J.S.,BioTechniques21(6):1102(1996);Rajendrakumar,C.S.V.,etal，F(xiàn)EBSLetts.410:201-205(1997);Henke，W.，etal.,Nucl.AcidsRes.25(19):3957(1997);)。本發(fā)明在常規(guī)PCR反應液中添加了一定濃度的甜菜堿和脯氨酸組合，比添加單組分甜菜堿(0.5M)或脯氨酸(0.4M)(W09946400)的特異性，擴增效率高，并能獲得保真度較高的DNA及對一些有特殊結構如GC含量高(60%<GC%<74.8%)，有二級結構模板等進行很好地擴增。
發(fā)明內容在常規(guī)PCR反應液中，通過優(yōu)化退火溫度，引物設計和鎂離子濃度足以對大多數(shù)模板進行高特異性的擴增，但是，某些模板，包括高GC含量的或含有二級結構的，就很難擴增，因此在常規(guī)PCR反應液中添加了一定濃度的甜菜堿和脯氨酸，能獲得保真度較高的DNA并能對一些有特殊結構如GC含量高(60%〈GC%<74.8%),有二級結構模板等進行很好地擴增。本發(fā)明解決該技術問題所采用的技術方案是1、設計四對引物APOE(F/R)，JUNB(F/R)，TGF61(F/R)和TGF70(F/R)均以人基因組為模板基因產(chǎn)物大小GC含量引物序列APOE448bp74.8%APOE-F5'TCGGAACTGGAGGAACAACTGACC3'APOE-R5'TCCGGCTGCCCATCTCCTCCATCC3'JUN-B1090bp68.1%JUN-B-F5'GCCGCCCGGATGTGCACTAAAATG3'JUN-B-R5'CCAAGCGAGGGGGTGTCCGTAAAG3'BetalTGF1527bp61.5%TGF-61F5'CCGCGCCCAGCCAAGGTATTT3'TGF-61R5'CGGGGGTGGGGGAGAGTCGTAGAA3'BetalTGF皿5bp70.4%TGF-70F5'CCCCCTATTGCTTGTCTCCCTCTA3'TGF-70R5'AGCCTGACTCTCCTTCCGTTCTG3'2、配制擴增高GC含量片段的專用混合液2XGC-RICHmastermix，該混合液含有40mMTris-HClpH8.0，40mMKC1，3mMMgCl2，1—20%甘油(V/V)，1_2%Tween—20(V/V)，lmMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶，0.1-1M甜菜堿和0.1-1M脯氨酸。在一個優(yōu)選的實施例中，所述混合液含有10%甘油(V/V)，1.4%Tween_20(V/V),0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸。在另一個優(yōu)選的實施例中，所述混合液含有20%甘油(V/V)，2XTween—20(V/V)，0.5M甜菜堿和0.5M脯氨酸。3、PCR反應循環(huán)的設置<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>72°C5min本發(fā)明還涉及上述混合液在擴增高GC含量片段中的應用。圖1、瓊脂糖凝膠電泳圖顯示單組分的甜菜堿和脯氨酸終濃度對AP0E和JUNB的擴增1、DNAMARKER;2、1.5M甜菜堿；3、1XCES;4、0,4M脯氨酸5、0.6M薩0;6、1XGCII;7、1XGCI;8、無添加劑9、無添加劑和模板圖2、瓊脂糖凝膠電泳圖顯示不同組合的甜菜堿和脯氨酸終濃度對AP0E和JUNB的擴增I、無甜菜堿和脯氨酸；2、0.5M甜菜堿；3、l.OM甜菜堿4、l.函甜菜堿；5、0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸6、1.0M甜菜堿和0.3M脯氨酸;7、1.5M甜菜堿和0.2M脯氨酸8、DNAMARKER;9、無甜菜堿和脯氨酸；10、0.5M甜菜堿；II、l.OM甜菜堿；12、1.5M甜菜堿；13、0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸;14、1.OM甜菜堿和0.3M脯氮酸;15、1.5M甜菜堿和0.2M脯氨酸;A、JUNB;B、APOE圖3、瓊脂糖凝膠電泳圖顯示甜菜堿和脯氨酸組合后終濃度對APOE的擴增1、0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸；2、0.5M甜菜堿和0.3M脯氨酸3、0.5M甜菜堿和0.2M脯氨酸；4、0.5M甜菜堿和0.1M脯氨酸5、0.5M甜菜堿和0M脯氨酸；6、DNAMARKER圖4、瓊脂糖凝膠電泳圖顯示0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸組合濃度對TGF61和TGF70的擴增1、0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸；2、無甜菜堿和脯氨酸3、DNAMARKER;4、0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸5、無甜菜堿和脯氨酸；A、TGF70;B、TGF61圖5瓊脂糖凝膠電泳圖顯示0.5M甜菜堿和0.5M脯氨酸組合濃度對APOE，JUNB，TGF61和TGF70的擴增1、TGF70;2、TGF61;3、J腦；4、APOE;5、DNAMARKER具體實施例方式實施例1:1、以人基因組DNA為模板(Template),在不同的助熔劑(甜菜堿、CES、脯氨酸、顧N0、GCII、GCI)下擴增APOE(448bp,GC74.8%)片段，反應體系為20Ml(如反應體系不同，可按此比例增加或減少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HC1pH8.0,40mMKC1，3mMMgCl2，1%甘油(V/V)，l%Tween—20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表濃度的甜菜堿和脯氨酸。反應組分甜菜堿(1.5M)IXCES脯氨酸(0.4M)MMNO(0.6M)IXGCIIIXGCI無添加劑無添加劑和模板2XGC-RICHmastermix10W10W10Ml1110Wio1014Pri匿1(10MM)0.4W0.4(40.4W0.4W0.4W0.4>40.4W0.4WPrimer2(10PM)0.4Ml0.4W0.4W0.4W0,4W0.4W0.4W0.4HiTemplate<1<1<1<1M<1化<1化<1化<1鵬O補水辛:20|xl補水至20|ul補水至20|xl補水至2(^1補水至20^1補水至20nl補水至20nl補水至20nl2、PCR反應循環(huán)的設置:94°C3min94°C30sec，50°C30sec>30cycles72°C30sec-72°C5min3、結果檢測反應結束后取5反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見圖1)。實施例2:1、以人基因組DNA為模板，不同組合的甜菜堿(Betaine)和脯氨酸(Proline)終濃度對APOE和JUNB的擴增，反應體系為20pl(如反應體系不同，可按此比例增加或減少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HC1pH8.0，40mMKC1，3mMMgCl2，5%甘油(V/V)，1.2%Tween_20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表濃度的甜菜堿和脯氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、結果檢測反應結束后取5pi反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見圖2)。實施例3:1、以甜菜堿和脯氨酸組合后終濃度對AP0E的擴增AP0E(448bp,GC74.8%)片段，反應體系為20pi(如反應體系不同，可按此比例增加或減少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HClpH8,0，40raMKCl，3mMMgCl2，10%甘油(V/V)，1.4%Tween—20(V/V)'ImMdNTP'0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表濃度的甜菜堿和脯氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>>30cycles2、PCR反應循環(huán)的設置94°C3min94。C20sec50°C20sec72°C2min.72°C5min3、結果檢測反應結束后取5pi反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見圖3)。實施例4:1、以人基因組DNA為模板，0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸組合濃度對TGF61和TGF70的擴增TGF61和TGF70片段，反應體系為20pi(如反應體系不同，可按此比例增加或減少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HClpH8,0，40mMKC1，3rnMMgCl2,15%甘油(V/V)，1.8%Tween_20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表濃度的甜菜堿和脯氨酸。反應組分0.5Mbetaine0Mbetaine0.4Mproline0Mproline2XGORICHmastermix10Wl(MTGF61VTGF70Pri匿FR(IO贈0,8W0.8WTemplate<1<1ddH20補水至20)il補水至20^12、PCR反應循環(huán)的設置94°C3min>30cycles3、結果檢效果(見圖4)。實施例5:94。C30sec50°C30sec72°C30sec72°C5minJ:反應結束后取5pi反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結1以人基因組DNA為模板，0.5M甜菜堿和0.5M脯氨酸組合濃度對APOE，JUNB，TGF61和TGF70片段，反應體系為20pl(如反應體系不同，可按此比例增加或減少用量)。酉己制的2XGC—RICHmastermix含有40mMTris—HClpH8.0，40mMKCl，3mMMgCl2，20%甘油(V/V)，2%Tween—20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表濃度的甜菜堿和脯氨酸。反應組分0.5Mbetaine0.5Mproline2XGC-RICHmastermix10WAPOE，JUNB,TGF61和TGF70PrimerFR(IO剛)0.8WTemplate<1Mdd恥補水至20nl2、PCR反應循環(huán)的設置94。C3min30cycles94°C30sec50°C30sec72°C30sec72°C5min反應結束后取5^反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見3、結果檢效圖5)。根據(jù)上述實施例的結果可以看出，本發(fā)明的擴增高GC含量片段的專用混合液能協(xié)助高GC含量的DNA模板解鏈，提高引物結合的特異性，從而有助于DNA聚合酶延伸通過二級結構區(qū)。應用該緩沖液可以提高核酸擴增保真度，復雜模板的擴增。權利要求1、一種擴增高GC含量片段的專用混合液2×GC-RICHmastermix，其特征在于該混合液含有40mMTris-HClpH8.0，40mMKCl，3mMMgCl2，1—20％甘油，1—2％Tween—20，1mMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶，0.1-1M甜菜堿和0.1-1M脯氨酸。2、根據(jù)權利要求1的混合液，其特征在于所述混合液含有10%甘油，1.4XTween—20，0.5M甜菜堿和0.4M脯氨酸。3、根據(jù)權利要求1或2的混合液，其特征在于所述混合液含有20%甘油，2%Tween—20,0.5M甜菜堿和0.5M脯氨酸。4、一種權利要求1或2或3的混合液在擴增高GC含量片段中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于核酸擴增領域的技術。優(yōu)化的擴增高GC含量片段的專用緩沖液，用于一般PCR方法無法實現(xiàn)的高GC含量和具有復雜二級結構DNA模板的擴增。優(yōu)化的高GCPCR緩沖液系統(tǒng)能協(xié)助高GC含量和具有復雜二級結構DNA模板解鏈，提高引物結合的特異性，從而有助于DNA聚合酶延伸通過二級結構區(qū)。應用該緩沖液可以提高核酸擴增保真度，復雜模板的擴增。文檔編號C12P19/00GK101392282SQ20081016757公開日2009年3月25日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權日2008年10月13日發(fā)明者萍俞,李曉晨申請人:天根生化科技(北京)有限公司