專利名稱：一種腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，特別涉及一種腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在人體的腸道內(nèi)棲息著大約10"個約400 500種細(xì)菌，是人體細(xì)胞總數(shù)的 10 20倍。腸道內(nèi)的細(xì)菌對人體腸道的生長發(fā)育、免疫功能、消化吸收等功能 起著重要的作用。為了更好的研究腸道正常菌群的功能以及與機體的相互關(guān)系， 對腸道內(nèi)細(xì)菌的分離、鑒定和定量非常重要。到目前為止，人們對腸道正常菌 群的了解是通過對糞便標(biāo)本選擇性培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)而獲得的。隨著分子生物學(xué) 的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用，人們對微生態(tài)學(xué)的研究取得 了突破性的進展，如Suau A等用針對16SrRNA的細(xì)菌域通用引物采用PCR法對 糞便標(biāo)本的DNA進行特異性擴增，得到284個平均長度500bp的16SrDNA片段， 對這些片段進行測序和種系分析發(fā)現(xiàn)284個16SrDNA片段對應(yīng)于82個分子菌種 (1);變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一個遺傳指紋技術(shù)，根據(jù)PCR擴增16SrDNA 片段的電泳，它能檢測微生物的多樣性。但這些技術(shù)有明顯的不足，它們僅僅 只提供樣本中的細(xì)菌種類和數(shù)量，而對于每一細(xì)菌的特性，如生化特性、代謝 特性、遺傳特性等則不能反映。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方 法，取新鮮糞便于0.5小時內(nèi)放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器 上混勻3分鐘以上，按連續(xù)稀釋法，釋成10 —^10 —8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿 根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中， 涂布均勻，平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37-C孵育培養(yǎng)72小時; 所述培養(yǎng)基為雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，取胰蛋白胨10 g，植質(zhì)蛋白胨5 g，酵 母粉2. 5 g，吐溫-80 1 mL,葡萄糖5 g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g， K2HP04 2 g， MgCl,7H20 0.5 g， ZnS04, 7H20 0.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，瓊脂12 g，加入1L ddH20，調(diào)pH至6. 5， 121。C高壓15分鐘。
所述稀釋液A的組成及配比為在1000ml水中KH2P04 4. 5g， Na2HP046g， 鹽酸半胱氨酸0.5 g，吐溫-80 0.5 g，瓊脂lg。
取新鮮糞便2 5克于0. 5小時內(nèi)放入加有玻璃珠的9mL稀釋液A的試管中， 在混勻器上混勻3 30分鐘，按連續(xù)稀釋法，釋成10 —i 10 — 8個稀釋度，將培 養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各50uL的以上稀釋后的混合液分別加 到分區(qū)中，涂布均勻，平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37"C孵育培 養(yǎng)72小時。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的方法較為直觀地反映標(biāo)本中是否有雙 歧桿菌，及其數(shù)量，且對培養(yǎng)的細(xì)菌可以作進一步的研究和分析，生化特性、 代謝特性、遺傳特性等。目前，雖然分子生物學(xué)技術(shù)可以快速鑒定雙歧桿菌， 但此類技術(shù)主要依據(jù)細(xì)菌的RNA或DNA來鑒定，并不能區(qū)分活菌或死菌，也不能 反映出細(xì)菌的生理狀態(tài)。如在我們實驗室建立的雙歧桿菌凍干保存技術(shù)就要以 厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的，先用選擇性培養(yǎng)基將雙歧桿菌培養(yǎng)，分離出單個菌 落后擴大培養(yǎng)，再用凍干保存技術(shù)保存細(xì)菌。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖
與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述
本技術(shù)采用連續(xù)稀釋法，即留取觀察對象新鮮糞便標(biāo)本2 5g，于0.5小時 內(nèi)送檢。稱取0.5克糞便樣本放入加有玻璃珠的9mL稀釋A液的試管中，在混勻器 上混勻至少3分鐘，按連續(xù)稀釋法，釋成10 —' 10 — 8個稀釋度。根據(jù)不同細(xì)菌的 正常菌數(shù)范圍，選擇不同的稀釋度進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃 度分區(qū)，取各50iiL的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻；所用平 板放入?yún)捬鹾袃?nèi)，于恒溫箱37X:孵育培養(yǎng)72小時后，計數(shù)培養(yǎng)基上生長的菌落 數(shù)。用對數(shù)值表示其優(yōu)勢菌數(shù)量(LogN /g濕便)。 一、培養(yǎng)基配方
雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基(即表中的TPY培養(yǎng)基)
在1000mL中，胰蛋白胨10g，植質(zhì)蛋白胨5g，酵母粉2.5g，吐溫-80 1 mL, 葡萄糖5 g，鹽酸半胱氨酸0.5 g， K2HP04 2 g， MgC1.7H20 0. 5 g， ZnS04. 7H20 0.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，瓊脂12 g，加入1L ddH20，調(diào)pH至6. 5，12rc高壓15分鐘。
稀釋液A:
在1000mL中，加入KH2P044. 5g， N&跳6g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g,吐溫-80 0. 5 g，瓊脂lg，加入1000mL水，將混合液煮沸，按每支試管9mL分裝(每8支試 管中，有一支加入10粒左右的琉璃珠)，在分裝后，用氮氣將試管的空氣部分 替換，加上塞子，12rC高壓15分鐘。
二、 菌落形態(tài)及細(xì)菌鏡下形態(tài)如下表。_
細(xì)菌名生長的涂布濃度菌落形態(tài) 耐氧革蘭染色及形態(tài)
稱 培養(yǎng)基(注3)_^_
雙歧桿TPY培10 —'、 10—菌落呈圓形、光滑、P(S1) G'菌體著色不均 菌屬細(xì)養(yǎng)基 3、 10 — 5、不透明、直徑在 勻，形態(tài)具多形性， 菌 10 — 7 0. 5 1.5腿 呈直、彎、分叉、
棒狀或V、 Y字排 歹U，無鞭毛、芽胞、
_§n_
注l: P表示耐氧試驗陽性，即細(xì)菌未見有生長
三、 具體實例
雙歧桿菌培養(yǎng)方法留取觀察對象新鮮糞便標(biāo)本3g，于0.5小時內(nèi)送檢。
稱取0.5克糞便樣本放入加有玻璃珠的9mL稀釋A液的試管中(記作10 —')，在 混勻器上混勻至少3分鐘，用滅菌的移液管取lmL上已混勻液加到另一未加玻 璃珠的9mL稀釋A液的試管中(記作10 —2)，在混勻器上混勻，用此法連續(xù)稀釋 至濃度為10 —8。將各培養(yǎng)基平皿作四區(qū)標(biāo)志，按上表中的涂布濃度，取各50u L的稀釋后的混合液分別加到四區(qū)中，用涂布棒將混合液在各自的區(qū)內(nèi)涂布均 勻。
把和雙歧桿菌平皿放入?yún)捬鹾袃?nèi)，于恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)72小時后觀察 結(jié)果。計數(shù)時，挑取典型細(xì)菌菌落，作下菌落形態(tài)的文字描述記錄，同時將細(xì) 菌作革蘭染色并鏡檢，觀察和記錄革蘭染色結(jié)果。記錄各種培養(yǎng)基中細(xì)菌的數(shù) 量，如在濃度為10 —7的區(qū)域內(nèi)計數(shù)所得57個菌落即記作57X10 — 7。
菌數(shù)量(LogM/g濕便)，M=20XNX107m (CFU/g)N為最小稀釋濃度的菌落數(shù)
n為最小稀釋濃度指數(shù)的絕對值 m為標(biāo)本稱重的質(zhì)量
例如上在濃度為10-7的區(qū)域內(nèi)計數(shù)所得57個菌落即記作57X10 — 7，原標(biāo) 本的稱量為0. 5g， M二20 X 57X 107/0 . 5 (CFU/g) =22 . 8X 109，那么該細(xì)菌在 標(biāo)本中的菌數(shù)量(LogM/g濕便)為Log (22.8X 109) /g，即10. 358。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范 圍。
權(quán)利要求
1、一種腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法，其特征在于取新鮮糞便于0.5小時內(nèi)放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻3分鐘以上，按連續(xù)稀釋法，釋成10-1～10-8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37℃孵育培養(yǎng)72小時；所述培養(yǎng)基為雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，取胰蛋白胨10g，植質(zhì)蛋白胨5g，酵母粉2.5g，吐溫-801mL，葡萄糖5g，鹽酸半胱氨酸0.5g，K2HPO4 2g，MgCl.7H2O 0.5g，ZnSO4.7H2O 0.25g，CaCl2 0.15g，F(xiàn)eCl3微量，瓊脂12g，加入1L ddH2O，調(diào)pH至6.5，121℃高壓15分鐘。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述稀釋液 A的組成及配比為在1000ml水中KH2P04 4. 5g， Na2HP046g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g， 吐溫-80 0. 5 g，瓊脂lg。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法，其特征在于取新鮮糞便 2 5克于0. 5小時內(nèi)放入加有玻璃珠的9mL稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻 3 30分鐘，按連續(xù)稀釋法，釋成10 — 1 10 —8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的 涂布濃度分區(qū)，取各50y L的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻， 平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37。C孵育培養(yǎng)72小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道雙歧桿菌培養(yǎng)方法，取新鮮糞便于0.5小時內(nèi)放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻3分鐘以上，按連續(xù)稀釋法，釋成10^-1～10^-8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37℃孵育培養(yǎng)72小時；所述培養(yǎng)基為雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明的方法較為直觀地反映標(biāo)本中是否有雙歧桿菌，及其數(shù)量，且對培養(yǎng)的細(xì)菌可以作進一步的研究和分析，生化特性、代謝特性、遺傳特性等。
文檔編號C12Q1/06GK101440394SQ20081016305
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者吳仲文, 健 左, 徐凱進, 李蘭娟, 王建國, 肖黨生, 瑜 陳, 陳云波, 陳春雷 申請人:浙江大學(xué)