專利名稱：：一種?？刹《?0型pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及?？刹《?0型的核酸檢測方法，具體為?？刹《?0型RT-PCR快速檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
：?？刹《?Echovirus)屬于腸道病毒(Enteroviruses,EVs)，微小核糖核酸病毒科。微小核糖核酸病毒是正鏈RNA病毒，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒A組和B組、?？刹《?、腸病毒68-71型。臨床上，病毒的分型主要基于它們的基因特征，?？刹《緦儆谌四c道病毒HEVB種。腸道病毒共包括67種獨(dú)特的血清型，在64種可引起人類感染的血清型中，己知埃可病毒有28個(gè)血清型，而埃可病毒30型是最常見的型別之一。?？刹《绢w粒體積極小，呈球形，由簡單的衣殼和單正股RNA組成，裸露無膜，直徑小于30nm。病毒的衣殼含4種蛋白質(zhì)，分別為VP1、VP2、VP3和VP4。病毒的RNA為單一分子，長約7.44kb，是病毒翻譯和復(fù)制的模板。與其它腸道病毒一樣，?？刹《镜淖钸m生長溫度為35-37'C，能在猴腎細(xì)胞、人羊膜細(xì)胞、人喉癌細(xì)胞、橫紋肌肉瘤、人胚肺等細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于疑似感染的病人，根據(jù)不同的臨床癥狀和可能的病變部位而采集不同的標(biāo)本，如腦脊液、血液、尿液、糞便、直腸拭子和喉拭子。從組織培養(yǎng)中分離埃可病毒是檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，最常用的培養(yǎng)細(xì)胞是猴腎細(xì)胞。血清學(xué)試驗(yàn)包括中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)。但上述方法操作較繁瑣，存在靈敏度不高及試驗(yàn)結(jié)果差異大等缺點(diǎn)。用PCR檢測病毒的方法最有發(fā)展前途，但在操作上有一定的難度。?？刹《?0型衣殼蛋白VP暴露于病毒表面，VP基因編碼病毒主要的抗原位點(diǎn)，編碼型特異性中和抗原表位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測埃可病毒30型的方法，本發(fā)明針對(duì)VP基因設(shè)計(jì)了特異性引物用于檢測人血清或腦脊液中的埃可病毒30型的RNA，并建立了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)的檢測方法。具有操作簡便快速、檢測靈敏準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的上述目的是這樣實(shí)現(xiàn)的(1)特異性引物的設(shè)計(jì)上游弓l物5，〉cccaagggttatgaagac〈3，下游引物5，>cgggcgacactatttact<3，；(2)總RNA的抽提；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT):將步驟(2)抽提得到的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到互補(bǔ)DNA，即cDNA;(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR反應(yīng)以步驟(3)逆轉(zhuǎn)錄得到的互補(bǔ)DNA作為模板，采用步驟(1)設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增；(5)電泳分析將步驟(4)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。所述步驟(2)RNA的抽提過程Trizol抽提總RNA。所述步驟(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)步驟在冰上操作，依次加入下列試劑總瞧0.5ugOligo(dT)(寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸)lul混勻，70°C，5min，立刻置于冰上；5Xbuffer(5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液)4yl2.5mM的dNTPmixture(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)2u11.0U/"1的RNaseinhibitor(RNA酶抑制劑)1u1混勻，37°C，5min，200.0U/ul的逆轉(zhuǎn)錄酶lulddH20(無菌雙蒸水)加到20yl42'C水浴1小時(shí)；7(TC水浴10分鐘終止反應(yīng)，得到cDNA。所述步驟(4)聚合酶鏈反應(yīng)PCR過程ddH20(無菌雙蒸水)34.l叱10XBuffer(10XPCR緩沖液)5叱dNTPmixture(2.5mM)(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)4叱引物上(20pmol/叱)l叱引物下(20pmol/叱)lliLMgC12(25mM)4叱cDNA0.5PLDNAPolymerase(DNA聚合酶，購自promega)0.4叱總體積50PLPCR參數(shù)可設(shè)置為95。C變性處理3min后進(jìn)入循環(huán)，94°C30S、50°C30S、72°Clmin，30個(gè)循環(huán)后72'C延伸7min;反應(yīng)結(jié)束后，得PCR產(chǎn)物。所述步驟(5)反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1X瓊脂糖凝膠0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。更進(jìn)一步，所述cDNA可于-70。C保存，或-2(TC保存。可以是-7(TC冰箱保存幾個(gè)月，或-2(TC冰箱保存。本發(fā)明的?？刹《?0型PCR檢測方法，可用于檢測人血清或腦脊液中?？刹《?0型RNA。本發(fā)明所公開的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、針對(duì)?？刹《?0型VP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)果準(zhǔn)確;2、采用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)，靈敏度高；3、操作步驟簡便，耗時(shí)少，所需設(shè)備普通且種類少。圖1是本發(fā)明具體實(shí)施例1和2的結(jié)果電泳圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1?？刹《?0型PCR診斷方法檢測人腦脊液中的埃可病毒30型RNA實(shí)驗(yàn)步驟1、RNA提取過程Trizol(異硫氫酸胍混合物，購自Invitrogen公司)抽提總RNA:1)每50100yl腦脊液加入lmlTrizol，混勻；2)室溫靜置5min，以每毫升Trizol加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，蓋緊后用手劇烈振蕩15s，12000gX10min4。C離心；3)將上層水相取出，置于一新的離心管，按每毫升Trizol加入0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫靜置10min，12000gX10min4'C離心；4)棄上清，按每毫升Trizol加入lml75%乙醇的比例加入乙醇，渦漩混勻，7500gX5min4'C離心；5)小心棄上清，室溫干燥510min，不要干燥過分，以免RNA溶解度降低，然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可于55X:6(TC水浴10min。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70^乙醇并保存于-7(TC中。使用前，復(fù)溶，紫外定量。2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT):在冰上操作，依次加入下列試劑總RNA0.5&gOligo(dT)(寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸，購自promega)1"混勻，70°C，5min，立刻置于冰上5XRTbuffer(5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，購自promega)4u1dNTPmixture(2.5mM)(四種脫氧核糖核苷酸的混合物，購自promega)2ul(10mM)RNaseinhibitor(l.OU/ul)(RNA酶抑制劑，購自promega)lu1混勻，37。C，5min，逆轉(zhuǎn)錄酶(200.0U/ul)(購自promega)lulddH20(無菌雙蒸水)加至20ul42"C水浴1小時(shí)；7(TC水浴10分鐘終止反應(yīng)。cDNA可于-70。C冰箱保存幾個(gè)月，或-20。C冰箱保存l周。3、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):ddH20(無菌雙蒸水)34.l叱10XBuffer(IOXPCR緩沖液)5叱dNTPmixture(2.5mM)(四種脫氧核糖核苷酸的混合物，購自promega)機(jī)上游引物(20pmol/叱)l叱下游引物(20pmol/叱)l叱MgCl2(25mM)4MLcDNA(102-105拷貝)0.5PL腿Polymerase(DNA聚合酶，購自promega)0.帆總體積50叱PCR參數(shù)可設(shè)置為95。C變性處理3min后進(jìn)入循環(huán)，94°C30S、50°C30S、72°Clmin，30個(gè)循環(huán)后72。C延伸7min。4、電泳分析反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1X瓊脂糖凝膠0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為251bp(圖l)。實(shí)施例2?？刹《?0型PCR診斷方法檢測人糞便中的?？刹《?0型RNA1、RNA提取過程Trizol(異硫氫酸胍混合物，購自Invitrogen公司)抽提總RNA:1)大便樣本l:10(g:v)用無菌水稀釋，室溫，16000Xg，60s，取140Pl上清，加入lmlTrizol，混勻；2)室溫靜置5min，以每毫升Trizol加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，蓋緊后用手劇烈振蕩15s，12000gX10min4'C離心；3)將上層水相取出，置于一新的離心管，按每毫升Trizol加入0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫靜置10min，12000gX10min4'C離心；4)棄上清，按每毫升Trizol加入lml75%乙醇的比例加入乙醇，渦漩混勻，7500gX5min4。C離心；5)小心棄上清，室溫干燥510min，不要干燥過分，以免RNA溶解度降低，然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可于55""C6CrC水浴10min。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-7CTC中。使用前，復(fù)溶，紫外定量。2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及電泳分析均按照實(shí)施例1步驟進(jìn)行。附圖l說明泳道l為陰性對(duì)照，泳道2是EV71為模板的目的產(chǎn)物，泳道3是CoxA16為模板的目的產(chǎn)物，泳道5和6為血清樣本結(jié)果，泳道7和8為糞便樣本結(jié)果，泳道9是DNA分子量marker,各條帶大小依次為100bp，200bp，300bp，400bp,500bp，600bp，800bp，1000bp，1500bp。從電泳圖中可以看出，采用本發(fā)明提供的方法可以特異性檢測出?？刹《?0型RNA，而不會(huì)檢出其它腸道病毒如EV71和CoxA16。本發(fā)明準(zhǔn)確性高、靈敏度高。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>權(quán)利要求1、一種埃可病毒30型PCR檢測方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行?？刹《?0型的PCR檢測(1)特異性引物的設(shè)計(jì)上游引物5’>cccaagggttatgaagac<3’下游引物5’>cgggcgacactatttact<3’；(2)總RNA的抽提；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將步驟(2)抽提得到的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到互補(bǔ)DNA，即cDNA；(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR反應(yīng)以步驟(3)逆轉(zhuǎn)錄得到的互補(bǔ)DNA作為模板，采用步驟(1)設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增；(5)電泳分析將步驟(4)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)RNA的抽提過程Trizol抽提總RNA。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟在冰上操作，依次加入下列試劑總腿0.5ug寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸1u1混勻，70°C，5min，立刻置于冰上；5Xbuffer4lil2.5mM的d證mixture2u1l.OU/ul的RNA酶抑制劑lul混勻，37°C，5min;200.0U/u1的逆轉(zhuǎn)錄酶1u1ddH20加到20ul42t:水浴1小時(shí)；7(TC水浴10分鐘終止反應(yīng)，得到cDNA。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)聚合酶鏈反應(yīng)PCR過程:<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>PCR參數(shù)可設(shè)置為95。C變性處理3min后進(jìn)入循環(huán)，94°C30S、50°C30S、72°Clmin，30個(gè)循環(huán)后72。C延伸7min。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(5)反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。6、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的檢測方法，其特征在于，所述cDNA可于-70"C保存，或-2(TC保存。7、如權(quán)利要求1所述埃可病毒30型PCR檢測方法，用于檢測人血清或腦脊液中?？刹《?0型RNA。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測?？刹《?0型的方法，包括以下步驟(1)特異性引物的設(shè)計(jì)；(2)總RNA的抽提；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)將總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA；(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR反應(yīng)以cDNA作為模板，采用特異性引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增；(5)電泳分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。本發(fā)明的有益之處在于1.針對(duì)埃可病毒30型VP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)果準(zhǔn)確；2.采用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)，靈敏度高；3.操作步驟簡便，耗時(shí)少，所需設(shè)備普通且種類少。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101429565SQ200810163049公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日發(fā)明者朱堅(jiān)勝,阮仙利,顏衛(wèi)華申請(qǐng)人:浙江省臺(tái)州醫(yī)院