專利名稱：：假高粱及其近似種pcr鑒定方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢疫性雜草假高粱及其近似種的種間鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種用于快速鑒定假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的PCR方法及該方法所使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
：假高粱是世界十大惡性雜草之一，我國已將其列入有害生物名單。假高粱的種子特征與擬高粱、蘇丹草等Sorghum屬其他種十分相似，加之口岸截獲的假高粱種子由于小穗軸，穎殼等特征部位易被擠壓而折斷、破損，給以種子鑒定為主的口岸檢疫工作帶來更大困難，因此，檢疫工作中急需一種可靠而快速的方法來解決這一難題。目前針對假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定手段除了形態(tài)學(xué)之外，還有郭瓊霞(2006)等嘗試過rDNAITS區(qū)的RFLP分析，可將假高粱與擬高粱區(qū)分開來(郭瓊霞等，基于rDNAITS分析的假高粱鑒定方法[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報2006，21(1):32-34.)。此種鑒定方法的鑒定范圍僅限于假高粱、擬高粱兩個物種，比本發(fā)明的鑒定范圍窄，且耗時長l倍左右。方雪恩等(2007)嘗試用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)通過檢測其醇溶蛋白以區(qū)分高粱、蘇丹草、黑高粱、假高粱以及一種雜交蘇丹草(方雪恩等，高粱屬A-PAGE圖譜的建立及在種子鑒定中的應(yīng)用[J]，西北植物學(xué)報，2007，27(12):2399-2403)，該鑒定方法以醇溶蛋白提取為基礎(chǔ)，本發(fā)明以DNA提取為基礎(chǔ)，供PCR所消耗的樣品量遠(yuǎn)少于醇溶蛋白研究的所需樣品量，即本發(fā)明的樣品消耗量比前述方法少，且操作步驟更簡單，耗時更短。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確快速鑒定假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定方法及該方法所使用的PCR分子鑒定試劑盒，鑒定的方法包括1.鑒別PCR;2.電泳檢測。試劑盒中包括3對PCR反應(yīng)引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜。—種快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，包括提取種子DNA，普通PCR鑒別，PCR循環(huán)，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，其特征在于所述的普通PCR鑒別步驟采用的引物為引物JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'弓I物JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'引物SK-1:5，-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3，弓I物SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，引物HS-1:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3'引物HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3'。前述方法中，所述的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對包括如下步驟利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，與JH標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在250bp和280bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為假高粱或黑高粱；利用引物SK進(jìn)行PCR反應(yīng)，與SK標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在110bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為絲克高粱；利用引物HS進(jìn)行PCR反應(yīng)，與HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在250bp處有條帶，則受試物種為黑高粱；若在llObp和130bp處均有條帶，則受試物種為蘇丹草；利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，與JH及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在250bp、280bp兩處均有特異條帶，而此樣品利用HS引物進(jìn)行PCR反應(yīng)未在250bp處產(chǎn)生特異條帶，則受試樣品為假高粱；利用引物SK、HS、JH分別進(jìn)行PCR反應(yīng)后，并與JH、SK及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若都沒有出現(xiàn)特異性的條帶，則該受試物種為擬高粱?！N前述的快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法所使用的PCR分子鑒定試劑盒，該試劑盒至少含有用于前述PCR反應(yīng)的引物及標(biāo)準(zhǔn)圖譜。本發(fā)明的優(yōu)點在于可解決假高粱及其近似種鑒定的難題，能在8小時內(nèi)完成假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草這五個物種的鑒定工作。圖1是引物JHPCR電泳的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。圖2是引物SKPCR電泳的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。圖3是引物HSPCR電泳的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。圖1至圖3中數(shù)字1到5分別表示假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草，ck為清水對照，M為lOObpDNALadder。具體實施例方式—種快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，其特征是采用下列步驟對受試樣品進(jìn)行位點特異性PCR鑒別①種子DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用雙蒸水將受試樣品模板DNA濃度調(diào)節(jié)至50ng/ul。②鑒別PCR:引物濃度用雙蒸水溶解調(diào)節(jié)至10pmol/ul。以反應(yīng)體積為20ul的劑量為參考點，各種物品的用量為IOXT叫DNA聚合酶緩沖液(15mMMgCl2)2uldNTP0.4ul引物各O.8ulTaqDNA聚合酶0.24UDNA模板0.8ul雙蒸水加到20ul混勻后，瞬時離心。引物共三對4引物JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'引物JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'引物SK-l:5'-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3'引物SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，引物HS-l:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，引物HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3，③PCR循環(huán)于PCR儀上，94。C3min，(94°C46s，52°Clmin，72min)40個循環(huán)，72°C60min，4。C結(jié)束。④非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳A.凝膠的灌制(1)玻璃板的清洗用洗潔精把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用蒸餾水沖洗干凈，放置干徹底干燥后，再進(jìn)行玻璃板組裝、灌膠。(2)玻璃板的組裝將玻璃板組裝好，有縫隙的一邊用2.0%的瓊脂糖(2g瓊脂糖+98ml水)封住，將封好的玻璃板組裝在電泳槽上待用。(3)6%非變性電泳凝膠的配置燥備用,<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>按照上述順序加入各組分(TEMED—定要最后加入)，充分搖勻后將配好的膠輕輕灌入兩玻璃板之間，當(dāng)膠加到上部時，在灌膠口插入梳子，并防止梳子底部產(chǎn)生氣泡。(要根據(jù)膠框選取合適的梳子，以防產(chǎn)生膠膜，影響點樣)，若有漏出應(yīng)及時補(bǔ)加聚丙烯酰胺溶液。置于氣溫讓其聚合30min以上。B.擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳(1)電泳緩沖液待凝膠聚合后，在電泳槽中加入1XTBE的電泳緩沖液。(2)預(yù)電泳將梳子輕輕拔出，200V預(yù)電泳10-30min。(3)上樣預(yù)電泳后，將PCR產(chǎn)物4ul和DNAloadingbuffer混合，用移液槍吸取混合液輕輕加入點樣孔，盡量縮短加樣時間。(4)電泳條件接上電源，電泳。參數(shù)為恒壓200V，電泳1.5h，視DNA分子量大小及帶型差異的可辨程度，調(diào)整電泳時間)。電泳結(jié)束后，切斷電源，倒去電泳緩沖液，卸去玻璃板，去掉瓊脂糖封膠，準(zhǔn)備染色。C.擴(kuò)增產(chǎn)物的快速銀染法(1)固定在容器中混合10%乙醇100ml和500ul冰乙酸，搖勻后加入凝膠，搖3-5min。(2)染色1ml20%AgN03后平行搖5_8min。(3)漂洗倒掉定影液，加入蒸餾水漂洗2-3次，洗凈后倒掉蒸餾水。(4)顯色混合100ml3%NaOH和500ul甲醛，迅速震蕩，使顯影液均勻作用，平行搖動，直至顯影。(5)洗滌顯影后，倒掉顯影液，加入蒸餾水洗凝膠1-2次，徹底去掉顯影液，以免保存時變色。(6)用蒸餾水沖洗干凈，吸干水，上面蓋上保鮮膜，照相或掃描。⑤電泳圖譜對比與JH標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物JH，假高粱和黑高粱在250bp、280bp兩處均有特異條帶，絲克高粱、擬高粱、蘇丹草均沒有這兩條條帶。因此，利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，若在250bp和280bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為假高粱或黑高粱。與SK標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物SK，絲克高粱在llObp處有特異條帶，假高粱、黑高粱、擬高粱、蘇丹草均無此帶。因此，利用引物SK進(jìn)行PCR反應(yīng)，若在110bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為絲克高粱。與HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物HS，黑高粱在250bp處有特異條帶，假高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草均無此帶；蘇丹草在110bp和130bp處均有特異條帶，假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱均無。因此，利用引物HS進(jìn)行PCR反應(yīng)，若在250bp處有條帶，則受試物種為黑高粱；若在110bp和130bp處均有條帶，則受試物種為蘇丹草。與JH及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，在250bp、280bp兩處均有特異條帶，而此樣品利用HS引物進(jìn)行PCR反應(yīng)未在250bp處產(chǎn)生特異條帶，則受試樣品為假高粱。與JH、SK及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若都沒有出現(xiàn)特異性的條帶，則該受試物種為擬高粱。實施上述各步驟所使用的PCR分子鑒定試劑盒中包括有用于PCR反應(yīng)的引物以及標(biāo)準(zhǔn)圖譜。其中用于PCR反應(yīng)的3對引物的DNA序列為JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'SK-1:5'-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3，SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，HS-1:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3，。實施例11材料和方法1.1實驗材料假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草種子，由福建出入境檢驗檢疫局提供。1.2DNA提取取樣品0.05g，經(jīng)液氮速凍后研磨至粉末，加入500iilTES*，加50-100iig蛋白酶K，55-60。C溫育0.5-lh，期間輕輕搖動混勻；調(diào)節(jié)NaCl濃度至1.4mol/L，加1/10體積10%CTAB，65°C10min;加入1體積氯仿異戊醇(24:l)，輕搖混勻，于(TC30min，之后4°C12000rpm離心10min;取上清，加入225iU5molNH4AC，混勻，放在冰上30min以上，4°C12000rpm離心10min;取上清，加3ii1Rnase，于37°C15min，4。C12000離心10min;取上清，加0.55體積異丙醇沉淀DNA，立即12000rpm離心5min，若無DNA團(tuán)出現(xiàn)，立即置樣品于冰上15-30min;棄上清，70%乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于50iUTE中。(*注3:TES:100,1/LpH為8.0的Tris，1Ommol/LpH為8.0的EDTA以及2%SDS。)1.3PCR擴(kuò)增引物名稱正向引物反向引物退火溫度SK5，-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3'5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3'52°CHS5，-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，5，-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3'55°CJK5，-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3，5，-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'58°C1.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1.4.1凝膠的灌制(1)玻璃板的清洗用洗潔精把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用蒸餾水沖洗干凈，放置干燥備用。徹底干燥后，再進(jìn)行玻璃板組裝、灌膠。(2)玻璃板的組裝將玻璃板組裝好，有縫隙的一邊用2.0%的瓊脂糖(2g瓊脂糖+98ml水)封住，將封好的玻璃板組裝在電泳槽上待用。(3)6%非變性電泳凝膠的配置組分用量30%丙烯酰胺6ml1XTBE24ml10%過硫酸銨200ulTEMED18ul終體積30ml7按照上述順序加入各組分(TEMED—定要最后加入)，充分搖勻后將配好的膠輕輕灌入兩玻璃板之間，當(dāng)膠加到上部時，在灌膠口插入梳子，并防止梳子底部產(chǎn)生氣泡。(要根據(jù)膠框選取合適的梳子，以防產(chǎn)生膠膜，影響點樣)，若有漏出應(yīng)及時補(bǔ)加聚丙烯酰胺溶液。置于氣溫讓其聚合30min以上。1.4.2擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳(1)電泳緩沖液待凝膠聚合后，在電泳槽中加入1XTBE的電泳緩沖液。(2)預(yù)電泳將梳子輕輕拔出，200V預(yù)電泳10-30min。(3)上樣預(yù)電泳后，將PCR產(chǎn)物4ul和DNAloadingbuffer混合，用移液槍吸取混合液輕輕加入點樣孔，盡量縮短加樣時間。(4)電泳條件接上電源，電泳。參數(shù)為恒壓200V，電泳1.5h，視DNA分子量大小及帶型差異的可辨程度，調(diào)整電泳時間)。電泳結(jié)束后，切斷電源，倒去電泳緩沖液，卸去玻璃板，去掉瓊脂糖封膠，準(zhǔn)備染色。1.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的快速銀染(1)固定在容器中混合10%乙醇100ml和500ul冰乙酸，搖勻后加入凝膠，搖3-5min。(2)染色1ml20%AgN03后平行搖5_8min。(3)漂洗倒掉定影液，加入蒸餾水漂洗2-3次，洗凈后倒掉蒸餾水。(4)顯色混合100ml3%NaOH和500ul甲醛，迅速震蕩，使顯影液均勻作用，平行搖動，直至顯影。(5)洗滌顯影后，倒掉顯影液，加入蒸餾水洗凝膠1-2次，徹底去掉顯影液，以免保存時變色。(6)用蒸餾水沖洗干凈，吸干水，上面蓋上保鮮膜，照相或掃描。1.5電泳結(jié)果比對與JH標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物JH，若在250bp和280bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為假高粱或黑高粱。與SK標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物SK，若在llObp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為絲克高粱。與HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，使用引物HS進(jìn)行PCR反應(yīng)，若在250bp處有條帶，則受試物種為黑高粱；若在llObp和130bp處均有條帶，則受試物種為蘇丹草。與JH及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，在250bp、280bp兩處均有特異條帶，而此樣品利用HS引物進(jìn)行PCR反應(yīng)未在250bp處產(chǎn)生特異條帶，則受試樣品為假高粱。與JH、SK及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若都沒有出現(xiàn)特異性的條帶，則該受試物種為擬高粱。序列表〈110〉福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心〈120〉假高粱及其近似種PCR鑒定方法及其試劑盒〈140>200810072360.7〈141>2008-12-12〈160〉6<210>1〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>JH-1ggaaggtcacaacctgcatc<210>2〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>JH-2ccatctgttccttcccatct<210>3〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400〉SK-1肪肌gc朋gcaacggg朋c<210>4〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>SK-2ttttggccttcctcttggta〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA9〈400>HS-1gcagctcagggac3朋tec〈210〉6<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述::人工合成的DNA〈400>HS-2ctgcttcaggtaaggatcg10權(quán)利要求一種快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，包括提取種子DNA，普通PCR鑒別，PCR循環(huán)，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，其特征在于所述的普通PCR鑒別步驟采用的引物為，引物JH-15’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’引物JH-25’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’引物SK-15’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’引物SK-25’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’引物HS-15’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’引物HS-25’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’。2.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對包括如下步驟，利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，與JH標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在250bp和280bp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為假高粱或黑高粱；利用引物SK進(jìn)行PCR反應(yīng)，與SK標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在llObp處產(chǎn)生條帶，則受試樣品為絲克高粱；利用引物HS進(jìn)行PCR反應(yīng)，與HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若在250bp處有條帶，則受試物種為黑高粱；若在llObp和130bp處均有條帶，則受試物種為蘇丹草；利用引物JH進(jìn)行PCR反應(yīng)，與JH及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，在250bp、280bp兩處均有特異條帶，而此樣品利用HS引物進(jìn)行PCR反應(yīng)未在250bp處產(chǎn)生特異條帶，則受試樣品為假高粱；分別利用JH、SK及HS進(jìn)行PCR反應(yīng)，并與JH、SK及HS標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，若都沒有出現(xiàn)特異性的條帶，則該受試物種為擬高粱。3.—種權(quán)利要求書1或2所述的快速鑒定假高梁、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草的方法所使用的PCR分子鑒定試劑盒，其特征在于該試劑盒至少含有用于權(quán)利要求1或2中所述的PCR反應(yīng)的引物及標(biāo)準(zhǔn)圖譜。全文摘要本發(fā)明涉及進(jìn)境檢疫性雜草種水平鑒定領(lǐng)域，是一種用于鑒定假高粱、黑高粱、絲克高粱、擬高粱、蘇丹草五個物種的鑒定方法及該方法所使用的試劑盒。鑒定的方法包括1.鑒別PCR；2.電泳檢測。試劑盒中包括3對PCR反應(yīng)引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明可解決假高粱及其近似種鑒定的難題，提供一種在8小時內(nèi)完成假高粱及其近似種的分子鑒定的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101748191SQ200810072360公開日2010年6月23日申請日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者沈建國,王念武,虞赟,郭瓊霞,黃可輝,黃嫻,黃振申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心