專利名稱：一種節(jié)桿菌及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的應(yīng)用和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種節(jié)桿菌^^ra6a"wsp. XL2006及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶 的應(yīng)用和制備方法。
背景技術(shù)：
黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XOD， EC 1.2. 3. 22)是嘌呤核苷代謝途徑的限速酶。其催化次黃 嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸，與缺血性再灌注損傷、痛風(fēng)、高尿酸血癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、肝炎 等疾病密切相關(guān)。通過査閱資料和文獻(xiàn)檢索所知，黃嘌呤氧化酶可開發(fā)成一種醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)用酶，應(yīng)用于檢測(cè) 血清無機(jī)磷、血清超氧化物歧化酶活力、細(xì)胞損傷后胞外次黃嘌呤和黃嘌呤水平以及次黃嘌呤核苷(肌苷)、 鳥嘌呤、鳥苷、鳥嘌呤酶和核苷磷酸化酶的活性等?，F(xiàn)在所用的黃嘌呤氧化酶來源單一，主要是從牛奶黃 油中分離提取。原料奶受不同產(chǎn)地、不同種類奶牛的影響，使其中黃嘌呤氧化酶的含量和質(zhì)量不穩(wěn)定，導(dǎo) 致生產(chǎn)成本高，限制了其應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展。而產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的微生物種類不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種節(jié)桿菌及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的應(yīng)用和制備方法，該菌株節(jié)桿菌Jrt/wotocteA"
sp.XL2006為分離純化出的新菌種，具有一定產(chǎn)黃嘌呤氧化酶水平的安全、非致病性細(xì)菌；該菌種所產(chǎn)黃 嘌呤氧化酶具有產(chǎn)品活性高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短的特點(diǎn)，用于檢測(cè)病人血清中次黃嘌呤和黃嘌呤的水 平，具有操作簡(jiǎn)便、快捷、精確和穩(wěn)定的特點(diǎn)。
本發(fā)明的節(jié)桿菌JWAra6acte"p.XL2006，其特征在于所述菌株16S rRNA的序列如下所示
gg8tg咖gCtggcggcgtgcttaacacatgc犯gtcg肌cgatgatgccC8Cttgtggg60
tggattagtggcg咖gggtgagtaacacgtgagt犯cctgcccttgactCtggg3t肌g120
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本發(fā)明的節(jié)桿菌^"說ratocter sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的制備方法包括以下步驟
(1) 將菌種^Aro&crte/" sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩搖瓶培養(yǎng)， 搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為30'C,培養(yǎng)時(shí)間為20h，制備成一級(jí)種子液；
(2) 將一級(jí)種子液，按發(fā)酵液體積的5~10%接種量轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32'C培養(yǎng)42h達(dá)到產(chǎn)酶高 峰；
(3) 于500(K8000卬m離心收集(2)發(fā)酵液中的^wAratocte/"sp. XL2006細(xì)胞，采用超聲波法和溶菌酶法 破碎細(xì)胞壁，800(K10000rpm離心去除細(xì)胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；
(4) 根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同將(3)得到的粗酶液進(jìn)一步分離純化，制備成不同活性、純度和劑型 的酶制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明從自然土壤中分離純化出一株節(jié)桿菌^"說roto"er sp. XL2006，用該菌株作 為黃嘌呤氧化酶的生產(chǎn)菌，具有產(chǎn)品活性高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短的特點(diǎn)。以該菌種能以次黃嘌呤或黃 嘌呤為唯一碳氮源和能源，發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，容易培養(yǎng)和發(fā)酵時(shí)間短的特點(diǎn);所 產(chǎn)黃嘌呤氧化酶具有很高的活性，可以作為臨床檢驗(yàn)用酶，用于檢測(cè)病人血清中次黃嘌呤和黃嘌呤的水平， 具有操作簡(jiǎn)便、快捷、精確和穩(wěn)定的特點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明節(jié)桿菌Jr決wZ)acte/"sp. XL2006制備的黃嘌呤氧化酶的native-PAGE電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的節(jié)桿菌^"論ra^cto"sp.XL2006的分離純化為采集富含有核苷類物質(zhì)的土壤樣品，以黃嘌呤 和少量酵母粉作為微生物生長(zhǎng)的碳源、氮源及能源，通過分批搖瓶培養(yǎng)及恒化富集培養(yǎng)后，分別涂布于選 擇培養(yǎng)基瓊脂平板上進(jìn)行單菌落分離；然后挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤 氧化酶特性的一株細(xì)菌；該細(xì)菌通過形態(tài)觀察、生理生化分析和16S rRNA序列鑒定為節(jié)桿菌屬的一個(gè)新種； 節(jié)桿菌^^rato"e"p.XL2006的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少量樣品接種于100mL選擇培養(yǎng)基中于3(TC在180 rpm進(jìn)行恒溫振蕩搖瓶培養(yǎng)，每隔12h采用HPLC監(jiān)測(cè)黃嘌呤的降解 情況；待黃嘌呤消耗盡后，分別取200uL培養(yǎng)上清液涂布于選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分批篩選；同時(shí)各取2mL 培養(yǎng)上清液，混合接種于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續(xù)培養(yǎng)7d后取菌液進(jìn) 行平板涂布分離；然后挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤氧化酶特性的一株細(xì) 菌；所采用的選擇培養(yǎng)基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g, CaQ: 3.0mg， MgS(V 7H2O0.2mg， FeS04 7H2O0.5mg，酵母粉100mg,黃嘌呤1.52g，加水定容至1L, pH7.5。
該節(jié)桿菌A決ra6ac^sp.XL2006為革蘭氏陽(yáng)性、好氧球菌；接觸酶陽(yáng)性；菌體不運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞呈現(xiàn)成對(duì)、 四個(gè)或不規(guī)則簇狀排列；菌落為淺黃色；最適生長(zhǎng)溫度為3(TC;屬于化能異養(yǎng)菌，通常生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基 加生物素，進(jìn)行氧化代謝；代謝葡萄糖或其他糖產(chǎn)生少量酸或不產(chǎn)酸。
節(jié)桿菌Jrt/wotocteA" sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的制備方法包括以下步驟
(1) 將菌種^^ra6acter sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩搖瓶培養(yǎng)， 搖床轉(zhuǎn)速為200ipm,溫度為30'C，培養(yǎng)時(shí)間為20h，制備成一級(jí)種子液；
(2) 將一級(jí)種子液，按發(fā)酵液體積的5~10%接種量轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32'C培養(yǎng)42hii到產(chǎn)酶高 峰；
(3) 于500(K8000rpm離心收集(2)發(fā)酵液中的^^ra6ac欣sp. XL2006細(xì)胞，采用超聲波法和溶菌酶法 破碎細(xì)胞壁，8000M0000rpm離心去除細(xì)胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；
(4) 根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同將(3)得到的粗酶液進(jìn)一步分離純化，制備成不同活性、純度和劑型 的酶制劑。
所述步驟(4)進(jìn)一步提取純化黃嘌呤氧化酶的方法為采用40%^0%飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)鹽析 沉淀離心收集的粗酶液，再利用10%(w/v)PEG6000/15%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃取、Butyl-S印harose 4B 疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過濾和冷凍干燥的提純步 驟，制備檢測(cè)用試劑酶。
所述Butyl-Sepharose4B疏水層析為使用<|)1.6 cm x 25 cm層析柱，平衡緩沖液為0.5mol/L硫酸銨的 pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液；上樣后，用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L 和0mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min;
所述DEAE Sepharose CL-6BFF離子交換層析為疏水層析分離收集的活性組分，經(jīng)PEG6000濃縮、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液透析后，Tris-HCl緩沖液pH7.8， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液；加至 已用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE- Sepharose fast flow層析柱，(|)1.6 cm x 20 cm;上 樣后，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含Omol/L、 0.2 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/LNaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分；
所述S印haciyl S-200 HR凝膠過濾收集的活性組分經(jīng)冷凍干燥濃縮后，進(jìn)行Sephacryl S-200分子篩層析；用pH7.8、 20mmoI/LTris-HCl緩沖液平衡層析柱(M.6cmx 100cm，上樣量10mL，然后用相同的緩 沖液洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分。
所述斜面培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別為
斜面培養(yǎng)基牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g， NaC15.0g，瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L， pH7.5， 121°C 高壓蒸汽滅菌20min;
液體種子培養(yǎng)基酵母膏2.0g，葡萄糖5g， Na2HPO46.0g， KH2P04 1.6g， CaCl23.0mg， MgS04'7H20 0.2mg, FeS04'7H20 0.5mg，加蒸餾水定容至1L， pH8.0， 121'C高壓蒸汽滅菌15min;
產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖葡萄糖為3 : 1的混合物12 g， (NH4>2SO44.0g，酵母粉2.13 g，黃嘌呤2.57 g， FeS04.7H20 0.5mg， Mg S04'7H20 0.2mg， CaCl2 5.33 mg， KH2P04 0.94， Na2HP04 5.92g,加蒸餾水定 容至1L， pH8.5， 12rC高壓蒸汽滅菌15min。
制備獲得的黃嘌呤氧化酶制劑作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)用酶，或用作缺血性再灌注損傷、痛風(fēng)、高尿酸血癥、風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、肝炎等疾病患者血清中次黃嘌呤和黃嘌呤水平的檢測(cè)。
下面通過具體實(shí)施例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此
實(shí)施例
采集富含有核苷類物質(zhì)的土壤樣品，以黃嘌呤和少量酵母粉作為微生物生長(zhǎng)的碳源、氮源及能源，通 過分批搖瓶培養(yǎng)及恒化富集培養(yǎng)后，分別涂布于選擇培養(yǎng)基瓊脂平板上進(jìn)行單菌落分離。然后挑取單菌落 進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤氧化酶特性的一株細(xì)菌。該細(xì)菌通過形態(tài)觀察、生理生 化分析和16S rRNA序列鑒定為節(jié)桿菌屬的一個(gè)新種。(選擇培養(yǎng)基為酵母膏2.0g，葡萄糖5g， NaCl 5.0g， 瓊脂15g ， H202 1L， pH8.0)
節(jié)桿菌A/;wo6ac^sp.XL2006的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少 量樣品接種于lOOmL選擇培養(yǎng)基中于30'C在180 rpm進(jìn)行恒溫振蕩搖瓶培養(yǎng)，每隔12h采用HPLC監(jiān)測(cè) 黃嘌呤的降解情況；待黃嘌呤消耗盡后，分別取200uL培養(yǎng)上清液涂布于選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分批篩選； 同時(shí)各取2mL培養(yǎng)上清液，混合接種于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續(xù)培 養(yǎng)7d后取菌液進(jìn)行平板涂布分離；然后挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤氧 化酶特性的一株細(xì)菌；所采用的選擇培養(yǎng)基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g， CaQ2 3.0mg， MgS(V 7H20 0.2mg, FeS04* 7H2O0.5mg，酵母粉100mg，黃嘌呤1.52g，加水定容至1L， pH7.5。
^^rotoctersp.XL2006菌體培養(yǎng)特征該菌種為革蘭氏陽(yáng)性、好氧球菌；接觸酶陽(yáng)性；菌體不運(yùn)動(dòng)， 細(xì)胞呈現(xiàn)成對(duì)、四個(gè)或不規(guī)則簇狀排列；菌落為淺黃色；最適生長(zhǎng)溫度為30'C。屬于化能異養(yǎng)菌，通常生 長(zhǎng)在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基加生物素，進(jìn)行氧化代謝。代謝葡萄糖或其他糖產(chǎn)生少量酸或不產(chǎn)酸。
將菌種用選擇培養(yǎng)基活化后，接種至裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500raL三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,溫度為30'C,培養(yǎng)20h作為種子液。然后按發(fā)酵液體積的8%接種量轉(zhuǎn)接入裝有100 mL產(chǎn)酶發(fā) 酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm，在32'C培養(yǎng)42h達(dá)到產(chǎn)酶高峰，結(jié)束發(fā)酵。 將培養(yǎng)液用冷凍高速離心機(jī)(10000rpm， 15min)離心收集菌體細(xì)胞，隨后重新懸浮于100mmoW/1 Tris-HCL (pH7.8)緩沖液中，采用Y92-II型超聲粉碎儀(400W， 15min)和2mg/mL的溶菌酶于37匸恒溫振蕩60min進(jìn) 行細(xì)胞破壁，離心后去除細(xì)胞碎片，收集上清液即為粗酶液。進(jìn)一步采用40%~60%飽和度的硫酸銨分級(jí)鹽析、10% (w/v)PEG6000與15%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃 取獲得粗酶夜。然后進(jìn)行精提，步驟如下第一步，將粗酶液的硫酸銨濃度調(diào)節(jié)至0.5mol/L,即為疏水層 析上樣液。用含0.5mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Butyl-Sepharose CL-4B疏水柱 層析柱(<|)1.6 cm x 25 cm);上樣后，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L和Omol/L 硫酸銨的pH7.8、 20mmol/LTris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min。洗脫完畢，收集及合并活性組 分。第二步，疏水層析分離收集的活性組分，經(jīng)PEG6000濃縮、20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.8)透析后， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液。加至己用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE-Sepharosefastflow層析柱(命1.6cmx20cm)。上樣后，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0mol7L、 0.2mol/L、 0.3mol/L、 0.5mol/L NaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速1.0mL/min。收 集活性組分。第三步，收集的活性組分經(jīng)冷凍干燥濃縮后，進(jìn)行Sephaciyl S-200分子篩層析。用pH7.8、 20mmol/LTris-HCl緩沖液平衡層析柱((l)1.6cmx 100cm)，上樣量10mL，然后用相同的緩沖液洗脫，流速 1.0mL/min。收集活性組分。采用如上的Butyl-Sepharose 4B疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephaciyl S-200 HR凝膠過濾以及冷凍干燥的制備步驟，獲得電泳純級(jí)別的黃嘌呤氧化酶粉劑。采用間歇補(bǔ)料發(fā)酵，XOD酶產(chǎn)量達(dá)到409.6U*L-1。經(jīng)過分離純化，黃嘌呤氧化酶的比酶活達(dá)到 24.27U.mg-l,回收率為11.55%。經(jīng)過非變性凝膠電泳，獲得單一條帶，達(dá)到電泳純級(jí)別。核苷酸序列〈110〉集美大學(xué)<120> —株節(jié)桿菌及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的應(yīng)用和制備方法<160〉 1<210〉 1<211> 1120<212> RNA<213〉節(jié)桿菌〈220><223>〈400〉 1ggatgsacgctggcggcgtgCtt33C3C3tgcaagtcgsacgatgstgcccacttgtggg60tggattagtggcg33cgggtgsgt33C3cgtgsgtsscctgcccttgactctggg3tssg120cctgggsssctgggtctsstsccgg3t3tg3ctgsccgtcgcatggtggttggtggsssg180cttttgtggttttggstggsctcgcggcctstC3gcttgttggtggggtsstggcctscc240aaggcgacgacgggtsgccggcctgsgsgggtgsccggcc3csctggg3ctgsgscscgg300cccsgsctcctscgggsggc3gcsgtgggg513t3ttgC3Csatgggcgcs3gcctgatgc360agcgacgccgcgtgsgggstgscggccttcgggttgt333cctctttcag420gcgtaagtgacggtacctgcccggctssctscgtgccagcsgccgcggts4803tscgtsgggcgcssgcgttatccggsattsttgggcgt33agsgctcgtsggcggtttg540tcgcgtctgccgtg333gtccggggctcaactccggstctgcggtgggtscgggcsgsct600agagtgatgt3ggggsgsctggssttcctggtgtsgcggtgst3tc3cg3660gg33c3ccg3tggcggtcgascgstgstgcccaicttgtgggtggsttagtggcg333gcs720tgggg3gcgsstsccctggt3gtccstgccgtaaacgttgggcsctaggt780gtgggggscsttccscgttttccgcgccgtagctaacgcattssgtgccccgcctgggg3840gtscggccgcttgacgggggcccgcacasgcggcgg3gcs900tgcgg3tt33ttcg3tgc33cttaccasggcttcgscstggsccggsccg960gtggtttctccttttggggccggttcscsggtggtgcstggttgtcgtc31020gctcgtgtcgtgsgstgttgggtt33gtcccgcaacgsgcgcssccctcgttccstgttg1080ccsgcgcgtsstggcggggsctgcstgggagsctgccggg1120
權(quán)利要求
1.一種節(jié)桿菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于所述菌株16S rRNA的序列如下所示ggatgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgatgcc cacttgtggg 60tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccttgact ctgggataag 120cctgggaaac tgggtctaat accggatatg actgaccgtc gcatggtggt tggtggaaag 180cttttgtggt tttggatgga ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc 240aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg 300cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc 360agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag tagggaagaa 420gcgtaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg 540tcgcgtctgc cgtgaaagtc cggggctcaa ctccggatct gcggtgggta cgggcagact 600agagtgatgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcacga 660ggaacaccga tggcggtcga acgatgatgc ccacttgtgg gtggattagt ggcgaaagca 720tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttcgacatg gaccggaccg 960ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg 1080ccagcgcgta atggcgggga ctgcatggga gactgccggg 1120。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的節(jié)桿菌Jrt/jTO6actersp.XL2006，其特征在于所述的節(jié)桿菌A說ra6acter sp. XL2006的分離純化為采集富含有核苷類物質(zhì)的土壤樣品，以黃嘌呤和少量酵母粉作為微生物生長(zhǎng)的 碳源、氮源及能源，通過分批搖瓶培養(yǎng)及恒化富集培養(yǎng)后，分別涂布于選擇培養(yǎng)基瓊脂平板上進(jìn)行單 菌落分離；然后挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤氧化酶特性的一株細(xì)菌; 該細(xì)菌通過形態(tài)觀察、生理生化分析和16S rRNA序列鑒定為節(jié)桿菌屬的一個(gè)新種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的節(jié)桿菌Jw/jra6acter sp. XL2006，其特征在于所述節(jié)桿菌JrtAra6acter sp. XL2006 的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少量樣品接種于100mL選擇培養(yǎng)基中 于3(TC在180 rpm進(jìn)行恒溫振蕩搖瓶培養(yǎng)，每隔12h采用HPLC監(jiān)測(cè)黃嘌呤的降解情況；待黃嘌呤消耗盡后， 分別取200uL培養(yǎng)上清液涂布于選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分批篩選；同時(shí)各取2mL培養(yǎng)上清液，混合接種 于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續(xù)培養(yǎng)7d后取菌液進(jìn)行平板涂布分離；然 后挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活力復(fù)篩獲得具有高產(chǎn)黃嘌呤氧化酶特性的一株細(xì)菌；所采用的選擇培養(yǎng)基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g， CaCl2 3.0mg， MgS04'7H20 0.2mg， FeS04-7H20 0.5mg， 酵母粉100mg，黃嘌呤1.52g，加水定容至IL， pH7.5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的節(jié)桿菌A/Aro6ac妙sp.XL2006，其特征在于所^r/Aro6acter XL2006菌體培養(yǎng) 特征該菌種為革蘭氏陽(yáng)性、好氧球菌；接觸酶陽(yáng)性；菌體不運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞呈現(xiàn)成對(duì)、'四個(gè)或不規(guī)則簇 狀排列；菌落為淺黃色；最適生長(zhǎng)溫度為3(TC:屬于化能異養(yǎng)菌，通常生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基加生物素， 進(jìn)行氧化代謝代謝葡萄糖或其他糖產(chǎn)生少量酸或不產(chǎn)酸。
5. —種如權(quán)利要l、 2、 3或4所述的節(jié)桿菌A/AroZ^tersp.XL2006的應(yīng)用，其特征在于-所述的節(jié)桿菌 J7^ro6acte/" sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶。
6. —種如權(quán)利要求5所述的節(jié)桿菌Jrt/wo/wcter sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌吟氧化酶的方法，其特征在 于所述制備方法包括以下步驟(1) 將菌種^rt/jro6flcter sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩搖瓶培 養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為30'C,培養(yǎng)時(shí)間為20h，制備成一級(jí)種子液；(2) 將一級(jí)種子液，按發(fā)酵液體積的5~10%接種量轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32r培養(yǎng)42hii到產(chǎn) 酶高峰；(3) 于5000"8000rpm離心收集(2)發(fā)酵液中的Jrt/wo6acter sp. XL2006細(xì)胞，采用超聲波法和溶菌 酶法破碎細(xì)胞壁，800(^10000rpm離心去除細(xì)胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；(4) 根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同將(3)得到的粗酶液進(jìn)一步分離純化，制備成不同活性、純度和 劑型的酶制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的節(jié)桿菌JrtAro6acto" sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的方法，其特征在 于所述步驟(4)進(jìn)一步提取純化黃嘌呤氧化酶的方法為采用40°/0~60%飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí) 鹽析沉淀離心收集的粗酶液，再利用10 % (w/v)PEG6000/l 5%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃取、 Butyl-Sepharose 4B疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過 濾和冷凍干燥的提純步驟，制備檢測(cè)用試劑酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的節(jié)桿菌^"說ra&cfe/" sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的制備方法，其特 征在于(1) 所述Butyl-Sepharose 4B疏水層析為使用令1.6 cm x 25 cm層析柱，平衡緩沖液為O.5mol/L硫酸銨 的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液；上樣后，用平衡緩沖液沖洗層析柱然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L和0mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min;(2) 所述DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析為疏水層析分離收集的活性組分，經(jīng)PEG6000濃縮、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液透析后，Tris-HCl緩沖液pH7.8， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液； 加至已用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE- Sepharose fast flow層析柱，小1.6 cm x 20cm;上樣后，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0mol/L、 0.2mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/LNaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速l.OmL/min;收集活性組分； (3)所述SephacrylS-200HR凝膠過濾收集的活性組分經(jīng)冷凍干燥濃縮后，進(jìn)行Sephacryl S-200分子篩層析；用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡層析柱(M.6 cm x 100 cm，上樣量lOmL,然后用相同的緩沖液洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分。 9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的節(jié)桿菌^A^ra6ac/er sp. XL2006應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的制備方法，其特 征在于所述斜面培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別為(1) 斜面培養(yǎng)基牛肉膏3.0g,蛋白胨lO.Og, NaC15.0g,瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L, pH7.5， 121°C 高壓蒸汽滅菌20min;(2) 液體種子培養(yǎng)基酵母膏2.0g，葡萄糖5g， Na2HP04 6.0g， KH2P04 1.6g， CaCl2 3.0mg， MgS04'7H20 0.2mg, FeS04'7H20 0.5mg，加蒸餾水定容至1L， pH8.0, 121i:高壓蒸汽滅菌15min;(3) 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖葡萄糖為3 : 1的混合物12 g， (NH4>2SO44.0g，酵母粉2.13 g，黃嘌呤 2.57 g, FeS04.7H20 0.5mg， Mg S047H20 0.2mg, CaCl2 5.33 mg, KH2PO40.94， Na2HP04 5.92g, 加蒸餾水定容至1L, pH8.5, 121'C高壓蒸汽滅菌15min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種節(jié)桿菌及其產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的應(yīng)用和制備方法，該節(jié)桿菌Arthrobacter XL2006來源于自然界，其16S rRNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，以該節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)黃嘌呤氧化酶，提取純化該酶，制備檢驗(yàn)試劑盒。本發(fā)明的節(jié)桿菌Arthrobacter XL2006具有產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶特性，能以次黃嘌呤或黃嘌呤為唯一碳氮源和能源，發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，容易培養(yǎng)和發(fā)酵時(shí)間短的特點(diǎn)；所產(chǎn)黃嘌呤氧化酶具有很高的活性，利用本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵提取黃嘌呤氧化酶，制備的檢驗(yàn)試劑盒，可用于臨床上檢測(cè)病人血清中的次黃嘌呤和黃嘌呤的水平。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101402922SQ20081007208
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者關(guān)瑞章, 李忠琴, 楊海麟, 武 王 申請(qǐng)人:集美大學(xué)