專利名稱：一種大批量快速制備pcr模板的方法
一種大批量快速制備PCR模板的方法技術(shù)領域 本發(fā)明涉及一種PCR模板的制備方法，尤其是一種大批量快速制備PCR模 板的方法和試劑配方。植物組織通過裂解液裂解和中和液中和后，直接作為PCR反應模板進 行PCR擴增分析，為大批量進行植物基因組遺傳分析提供模板。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學的迅速發(fā)展，生物技術(shù)的研究領域逐漸拓展到生物科學的 各個方面，核酸水平的研究是分子生物學研究的重要內(nèi)容，PCR (polymerase chain reaction) 技術(shù)作為研究核酸的主要工具，在分子生物學領域扮演著越來越重要的角色。應用PCR技術(shù) 研究核酸的前提是制備PCR反應的模板，也就是將生物組織內(nèi)的遺傳物質(zhì)如DNA釋放出來， 供PCR分析之用。目前較常規(guī)提取植物基因組DNA的方法主要有CTAB (王麗，喬愛民，孫一銘，等.菜心基 因組DNA提取及RAPD反應體系的優(yōu)化[J].西南師范大學學報，2006,31(2) :124-128)和 SDS(聶珍素，賴鐘雄，潘東明，等.橄欖基因組DNA提取及RAPD擴增條件優(yōu)化[J].亞熱帶農(nóng) 業(yè)研究，2005， 1(2):6-8)法，這兩種方法各有優(yōu)缺點，但是都需要對植物組織進行低溫研磨、 高溫裂解、殘渣分離、去除蛋白、RNA、鹽類等雜質(zhì)、沉淀DNA并離心分離等步驟，程序復雜、 操作繁瑣、時間長、成本高、所需較多的植物材料，而且提取過稃中要用酚、氯仿等對人體 有害的有機試劑。另外，需要的藥品很多，尤其是需要提取大批量材料的DNA樣品時，山于 研磨和提取DNA過程中許多器皿不得不重復使用，往往對于污染高度敏感的PCR反應會產(chǎn)生 嚴重影響。本發(fā)明根據(jù)堿裂解原理[J ，薩姆布魯克，E F ，費里奇等.分子克隆實驗指南(第二版)]， 研制不改變PCR反應緩沖液成分的裂解液配方，提出增加酶穩(wěn)定劑以降低雜質(zhì)干擾的理念， 最終發(fā)明了 一種免除DNA抽提制備PCR反應模板的新方法，和已有DNA制備方法相比，該方 法具有簡便、快速和高效的突出優(yōu)點。以有代表性的單子葉和雙子葉植物的葉片為供試材料， 經(jīng)過對不同種類的植物組織、多種引物的PCR反應的反復驗證，證實了這種方法的可行性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量制備PCR模板的方法，簡便快速地制備 大批量適于PCR檢測的模板。該方法只需要微量的植物材料，且不需要抽提植物DNA，能應 用于大批量活體植物組織的快速分子檢測，為植物大批量活體分子檢測提供了一種新的方法。本發(fā)明是一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在于通過以下歩驟實現(xiàn)1) 量取等體積的Solution A和Solution B，添加滅菌雙蒸水并充分混勻后得裂解液， 備用；所述的Solution A為1 mol/L KOH的水溶液；Solution B為20% Tween-20的水溶液； 所述滅菌雙蒸水的添加量為Solution A使用量的8倍；2) 取50 uL裂解液于離心管中，然后置測試材料于離心管的裂解液中，短暫離心后， 在PCR儀上93 98。C保持10 15min;所述測試材料為供試作物的葉片，其使用量以能夠完 全浸入離心管的裂解液中為宜；3) 取出離心管并迅速放冰上；向離心管中加入50 uL的Solution C，混勻，即可直 接用作PCR反應模板；所述Solution C為TE緩沖液，TE緩沖液成分0. 1 M Tris-HC1和2 mM EDTA的水溶液。4) 模板的PCR檢測，在PCR反應體系配制的過程中，先添加Solution D 2. 5 uL / 每管；然后進行PCR反應和電泳成像；所述PCR反應和電泳成像為常規(guī)技術(shù)；Solution D 為WBSA水溶液。本發(fā)明的一種大批量快速制備PCR模板的方法，完全區(qū)別于傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法，可 直接跳過抽提基因組DNA這種繁瑣的步驟，通過KOH堿裂解析出的微量基因組DNA為模板進 行PCR分析，且沒有引進新的可能影響PCR反應的離子，是一重大的進歩。特別適用于受試 材料量極少或活體的大批量快速檢測，更能充分顯示其優(yōu)點。該方法經(jīng)過對不同種類的作物 組織、多對引物的PCR反應的反復驗證，證明是一種具有廣泛應用價值的PCR檢測模板的制 備方法。Solution A主要是為了溶解細胞，釋放基因組DNA;Solution B是一種非離子型去污劑，在乳化蛋白時不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對蛋白 質(zhì)之間原有的相互作用的破壞；Solution C是進行中和Solution A溶液的緩沖液；Solution D在PCR體系中有助于Taq酶的穩(wěn)定性及活性，降低雜質(zhì)干擾，從而提高PCR 的擴增效率。本發(fā)明具有的特點為利用一種新鮮配制的對PCR反應影響很小的堿混合液，在加熱條 件下對作物組織進行消化裂解，釋放出基因組DNA，然后中和。中和反應液可直接作為PCR 反應模板進行PCR擴增分析。這種方法在單子葉和雙子葉作物中經(jīng)過驗證，具有廣泛的適用 性。該方法具有簡單、快速、成本低等特點。該方法對于大批量PCR分析具有特殊的意義。本發(fā)明具有的優(yōu)點為1) 快速高效，特別適用于大批量PCR檢測分析樣品從植物組織到PCR反應的模板，耗 時不足半小時，并且隨樣品數(shù)的增加，制備單個樣品的時間就越短。裂解液可直接作為PCR 反應模板使用，不用沉淀分離DNA，進一步提高了效率。2) 取樣量少 一次取樣量在毫克(mg)級水平，但可供近百次的PCR分析。對受試材料 幾乎沒有傷害，不會對其生長造成影響，完全可以滿足受試材料活體分析的需要。3) 通用性強本發(fā)明方法可應用于多種作物組織制備PCR反應的模板，無論單子葉還是 雙子葉植物，方法具有通用性。4) 操作簡便易行不需要昂貴的儀器，特別是不用高速離心設備，樣品制備簡單，不需 要復雜DNA抽提和預擴增；操作過程簡便易行，沒有復雜和要求苛刻的分子生物學實驗操作 歩驟。5)穩(wěn)定性強該方法對于多種作物和多次重復試驗，結(jié)果重復性好，顯示該方法具有很 強的穩(wěn)定性。


圖1為玉米IVR內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子量 (TIANGEN BIOTECH);1，2，3，4,5,6:玉米鄭單958葉片裂解液；7:陰性對照(以水替代裂解液)；8:陽性對照(鄭單958DNA); 9:提取空白對照；10:試劑空白對照。圖2為水稻SPS內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1,2，3，4，5，6:水稻秈優(yōu)63葉片裂解液；7:陰性對照(以水替代裂 解液)；8:陽性對照(秈優(yōu)63DNA); 9:提取空白對照；10:試劑空白對照。圖3為甘蔗5SrDNA-ITS內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子 量(TIANGEN BIOTECH); 1,2，3,4,5，6:甘蔗福農(nóng)95-1702葉片裂解液；7:陰性對照(以水 替代裂解液)；8:陽性對照(福農(nóng)95-1702 DNA);9:提取空白對照；10:試劑空白對照。 圖4為大豆lectin內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1,2,3,4,5,6:大豆葉片裂解液；7:陰性對照(以水替代裂解液)；8:陽性對照(魯豆4號DNA) ; 9:提取空白對照；10:試劑空白對照。圖5為棉花18S內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1,2,3,4,5,6:棉花品種中棉41葉片裂解液；7:陰性對照(以水替 代裂解液)；8:陽性對照(棉花葉片中棉41DNA); 9:提取空白對照；10:試劑空白對照。 圖6為煙草18S內(nèi)源基因PCR反應產(chǎn)物電泳分析圖；圖中M: DNA標準分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1，2,3，4，5,6:煙草品種K326葉片裂解液；7:陰性對照(以水替代裂解液)；8:陽性對照(煙草品種葉片DNA) ; 9:提取空白對照；10:試劑空白對照.具體實施方式
為了充分公開本發(fā)明一種高通量制備PCR模板的方法，以下結(jié)合實施例加以說明。實施例 一種大批量快速制備PCR模板的方法，依序包括如下歩驟1、試劑配制分別配制試劑Solution A; Solution B; Solution C; Solution D; Solution D宜先用20-25pm孔徑的微孔濾膜過濾后使用。2、 PCR模板的制備(1) 取Solution A 100 uL，放入1. 5 mL離心管A中，然后加入Solution B 100 uL， 再加滅菌雙蒸水800 uL，充分混勻；取50 uL混合液放入0.5 mL離心管B中；(2) 用一次性刀片切取供試作物的鮮嫩葉片10 mm2,放入0. 5 mL離心管B的混合液 中，短暫離心后，在PCR儀上95'C保持10 15min;所述的短暫離心以8000轉(zhuǎn)/分離心， 時間一般不超過10秒；所述切取供試作物的刀片，為一次性使用；由于PCR反應對污染的 敏感性，所以要求每只刀片僅使用一次，不重復使用。所述供試作物，如玉米、水稻、甘蔗、 大豆、棉花、煙草……。(3) 取出離心管B并迅速放冰上；向離心管B中加入Solution C 50uL，混勻，即可 直接用作PCR反應模板。3、 模板的PCR檢測(1) 在PCR反應體系配制的過程中，先添加Solution D 2.5 uL/每管；(2) PCR反應:采用TaKaRa Ex Taq code NO:DRR001A的PCR反應體系。首先進行PCR反應體系配制，加樣成分如下所加入的PCR反應成分混合液一般由1 X PCR 反應緩沖液，各2. 5mMdATP、 dTTP、 dGTP和dCTP， MgCl2，引物，模板DNA， Taq DNA聚合酶 和&0組成。所述引物以選用國家標準引物為主，無國家標準引物時可參考部頒標準引物。PCR反應體系配置試劑名稱貯備液濃度加入PCR反應體系的體積(uL)10XPCR Buffer10X2.5dNTP各2.5mmol / L2Primer 110pmo1/ L1Primer210pmo1/ L1Taq酶5U/uL0.125DNA模板1ddH20加ddH2 0至終體積25 uL(3)電泳成像，將獲得的PCR產(chǎn)物用含0. 5 jxg/ml溴化乙啶的1. 5%瓊脂糖進行電泳 分離并在成像系統(tǒng)上進行掃描拍照，結(jié)果見圖l、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。歩驟2中(1)所述的裂解液的制備方法為吸取終體積80% (V: V)的滅菌雙蒸水于 離心管中，各加入終體積10% (V: V)的Solution A和Solution B,渦旋片刻即制成裂解 液，Solution A和Solution B要在使用前混合配制裂解液；所述的裂解液體積可依反應個 數(shù)多少增減，但裂解液中K0H的終濃度為0. 1M, Tween-20終濃度為2%。所述渦旋片刻即置試驗材料于渦旋混合儀上震蕩混勻10秒。本實施例引用具有國家標準的引物，部分引物具有物種特異性，且為單拷貝基因，這 些引物分別都得到了各自大小的目的條帶，從而證明按照本發(fā)明的方法制備的PCR模板完全 滿足PCR反應的需要，適用于對該生物DNA的PCR分析，且有足夠量的DNA進行進一歩的遺 傳分析。實施例選用在生產(chǎn)實踐中具有代表性的單子葉和雙子葉植物進行分析，結(jié)果表明該 法對上述的6種主要農(nóng)作物都有通用性，從而說明本法的應用具有普遍性。如圖1所示玉米IVR內(nèi)源基因的引物選用國標GB/T19495.4-2004中規(guī)定的引物序列， 擴增出大小為226bp目的片段。該基因編碼玉米的轉(zhuǎn)化酶I基因，且為玉米內(nèi)源單拷貝基因。如圖2所示水稻SPS內(nèi)源基因的引物選用行標農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007中規(guī)定的引 物序列，擴增出大小277bp目的片段，該基因編碼蔗糖磷酸合酶基因，且為水稻內(nèi)源單拷貝 基因。如圖3所示甘蔗5SrDNA-ITS內(nèi)源基因的引物選用Cox AV, Bennett MD， Dyer TA(1992) 設計的弓l物。詳見Use of the polymerase chain reaction to detect spacer size heterogeneity in plant 5S-rRNA gene clusters and to locate such clusters in wheat (Triticum aestivum L.). 772eor Jpp/ 83, 684-690。擴增出大小為230bp目的片段。如圖4所示大豆lectin內(nèi)源基因的引物選用國標GB/T19495.4-2004中規(guī)定的引物序列， 擴增出大小為118bp目的片段。該基因編碼大豆的植物凝集素基因，且為大豆內(nèi)源單拷貝基 因。如圖5所示棉花18S內(nèi)源基因的引物選用國標GB/T19495.4-2004中規(guī)定的引物序列， 擴增出大小為137bp目的片段。該基因編碼18S核糖體DNA基因，本方法適用于評估真核 生物DNA的質(zhì)量，并確定是否存在足夠的DNA進行遺傳分析。如圖6所示煙草18S內(nèi)源基因的引物選用國標GB/T19495.4-2004中規(guī)定的引物序列， 擴增出大小為137bp目的片段。該基因編碼18S核糖體DNA基因，本方法適用于評估真核 生物DNA的質(zhì)量，并確定是否存在足夠的DNA進行遺傳分析。
權(quán)利要求
1、一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)(1)量取等體積的Solution A和Solution B，添加滅菌雙蒸水并充分混勻后得裂解液，備用；所述的Solution A為1mol/L KOH的水溶液；Solution B為20％Tween-20的水溶液；所述滅菌雙蒸水的添加量為Solution A使用量的8倍；(2)取50uL裂解液于離心管中，然后置測試材料于離心管的裂解液中，短暫離心后，在PCR儀上93～98℃保持10～15min；(3)取出離心管并迅速放冰上；向離心管中加入50uL的Solution C，混勻，即可直接用作PCR反應模板；所述Solution C為TE緩沖液，組成成分為0.1M Tris-HCl和2mM EDTA的水溶液；(4)模板的PCR檢測，在PCR反應體系配制的過程中，先添加Solution D2.5uL/每管；然后進行PCR反應和電泳成像；所述Solution D為1％BSA水溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在 于測試材料為供試作物的葉片，其使用量以能夠完全浸入離心管的裂解液中為 宜。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在于供試作物的葉片為10 mm2。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在 于所述的短暫離心為8000轉(zhuǎn)/分離心，時間不超過10秒。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特征在 于Solution D先用20-25|iim孔徑的微孔濾膜過濾后使用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種大批量快速制備PCR模板的方法，其特 征在于切取供試作物葉片的刀片，為一次性使用。
全文摘要
一種大批量快速制備PCR模板的方法，屬植物分子檢測技術(shù)領域，具體涉及植物組織在裂解液中加熱裂解和裂解液中和。本發(fā)明的技術(shù)方案是將微量植物葉片放入一定體積的裂解液中加熱裂解，然后中和，反應混合液可直接作為PCR反應的模板，在添加適量聚合酶穩(wěn)定劑的情況下，PCR反應穩(wěn)定，重復性強。該方法特別適宜大批量PCR反應模板的快速制備，可以大幅度提高分子檢測和遺傳分析的效率，極顯著地降低成本。
文檔編號C12N15/10GK101294221SQ20081007126
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者徐景升, 潘永保, 王恒波, 蔡瀾峰, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 陳由強 申請人:福建農(nóng)林大學