專利名稱：一種用于細胞電融合的微電極陣列芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞電融合的芯片結構。具體涉及細胞電融合實驗細胞排隊、細胞電穿孔、 細胞電融合的電場梯度和電場強度的產(chǎn)生，細胞電融合實驗進樣、出樣。
背景技術：
生物細胞通過融合可以形成新的細胞，在現(xiàn)代生物醫(yī)學工程基礎領域有著重要的意義。 細胞融合有化學融合方法(如PEG)、物理融合方法，其中物理融合方法中，電場融合方 法因其便于精確控制、重復性好、融合率高等優(yōu)點而得到了廣泛的應用。生物細胞處于非均勻電場中時，被電場激化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用 力下發(fā)生運動，即介電電泳(dielectrophoresis)，利用電介質電泳可以控制細胞的運動，在 細胞電融合過程中，利用電介質電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細 胞電融合過程所需的排隊和融合后壓緊。細胞在強電場作用下，會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應 ,(electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，細 胞間進行膜內物質交換，使細胞質、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可 逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，致使細胞電融合過程的膜融合。根據(jù)上述分析，為了實現(xiàn)細胞電融合，關鍵是將細胞置于非均勻電場中，使細胞受到 電介質電泳力和強電場穿孔力。根據(jù)電場基本理論電場強度E-V/d，'為了獲得較強的電場 強度，必須靠增加電壓或縮短電極間距來實現(xiàn)，傳統(tǒng)設備的電極間距通常為mm量級，需 要達到102、 103級的外界電壓才能達到足夠電場強度實現(xiàn)細胞膜穿孔。在細胞電融合的芯 片結構的設計中，微電極陣列和平板電極間的間距為10(Him，僅需要10°或10'級的外界 電壓即可實現(xiàn)細胞融合，大大降低了外圍電路的設計、制造難度，降低了系統(tǒng)成本，提高 ,了系統(tǒng)的電氣安全性和細胞電融合后細胞的成活率，可以促進細胞電融合技術向集成化、 便攜式等方向發(fā)展。目前，目前國內在細胞電融合芯片研究開發(fā)較少，國外在此領域的專利相對較多，如 Pohl在1982年申請的美國專利(4326934)、 Chang在1994年的美國專利(5304486)等。 但目前的細胞電融合芯片普遍存在微電極數(shù)量上較少，不能實現(xiàn)高通量細胞電融合。中國專利200610054121.x提出了一種細胞電融合芯片，芯片由從上到下重疊在一起的電極層和 絕緣墊層構成，電極層有單個或多個交叉梳狀電極組、與該交叉梳狀電極組連接的引出導 .線以及位于該交叉梳狀電極組之間及其四周的流路通道。其中的交叉梳狀電極組由兩個互 不接觸的其梳齒間相互交叉插入的梳狀電極板構成，均為相互交叉插入的梳齒之間和梳齒 尖與梳脊之間是該交叉梳狀電極組與所述流路通道相通的工作段通道；在圍出工作段通道 的梳齒上排列有柱狀的陣列電極。其優(yōu)點在于集成電極數(shù)目多，在一定程度上實現(xiàn)了細胞 的大量融合，但其缺點在于流路通道較窄，不利于樣品液的進出樣及后期培養(yǎng)。同時，微 電極產(chǎn)生的電場強度和電場梯度比較弱，而且加工材料選擇方面抗腐蝕、抗氧化能力也較 弱。國內外相關專利如下2006畫54121.x， 2006年，重慶大學；CN1482234, 2003年，中國科學院上海技術物理研究所；4326934， April 27， 1982， Pohl;441972， April 10， 1982， Pohl;4578168， March 25， 1986， Hofman ;4695547， September 22， 1987， Hillard;4699881， October13， 1987， Matschke et. al;5007995， April.16, 1991， Takahizuki 。發(fā)明內容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的不足，提出了一種用于細胞電融合的微電極陣列芯片，提 .高細胞電融合效率，降低外圍電路的設計、制造難度，降低系統(tǒng)成本，提高系統(tǒng)的電氣安 全性和細胞電融合后細胞的成活率。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提出的細胞電融合的微電極陣列芯片分為兩個獨立的模塊微電極陣列模塊和 融合池及平板電極模塊。
所述微電極陣列模塊分為3層，分別是硬質絕緣基底層，電極陣列層和金屬層。層與 層之間的連接通過鍵合或金屬濺射、沉積或粘接實現(xiàn)。所述硬質絕緣基底層采用玻璃、有機玻璃等硬質絕緣類芯片加工材料。在基底層上加 工一過孔，以讓金屬引線穿過與電極陣列層鍵合或焊接工藝連接，引入外圍電信號。所述電極陣列層采用硅材料通過MEMS加工工藝，在50pm厚度的硅片材料上刻蝕 10 40pm的凹槽以形成陣列化的微電極，微電極間相互連接，可以實現(xiàn)各微電極間空間結 構相互獨立，而電氣結構上相互連接；微電極的形狀根據(jù)對象細胞確定，可以為圓形柱狀、 矩形柱狀、多邊形柱狀結構，或者為圓形錐狀、矩形錐狀、多邊形錐狀結構。所述融合池及平板電極模塊由硬質導電類材料加工的基座和在基座上加工出的融合池 構成。融合池為在金屬等硬質導電類芯片材料上加工刻蝕出一個矩形凹槽而成，功能在于 容納樣品液，實現(xiàn)樣品進樣出樣，內凹槽平整底面作為平面電極使用。在基座上加工有多 個進、出樣孔，分別與融合池底部同方位上的進、出樣孔相連，通過外部流體控制裝置實 現(xiàn)樣品液的自動進樣與出樣，減小對融合后細胞的物理損傷，提高其存活能力。通過選擇 不同的進樣和出樣孔，可以控制整個芯片結構內樣品的流動及進出樣。所述微電極陣列模塊上的電極陣列層的尺寸小于融合池及平板電極模塊上的融合池的 尺寸，微電極陣列模塊覆蓋于融合池及平板電極模塊上，電極陣列層浸入融合池的細胞融 合樣品液中，當施加外界電刺激信號，即在微電極陣列與融合池中的平板電極間的微小間 距中產(chǎn)生高強度的非均勻梯度電場，促進細胞的聚集排隊和電穿孔的能力，實現(xiàn)細胞電融 合過程，提高細胞電融合效率。本發(fā)明提出的細胞電融合的微電極陣列芯片結構具有以下優(yōu)點本發(fā)明結構簡單，加工工藝成熟，容易推廣；采用MEMS加工技術可以實現(xiàn)微電極的 精密加工，保證細胞電融合過程的精確實施與控制；陣列化電極結構提供了大量的微電極， 可以保證細胞電融合的通量；針對對象細胞的多樣化實現(xiàn)微電極結構的多樣化，以獲取更 好的融合效果；微電極上濺射鉑等金屬材料，可以提高微電極的電氣性能，改善內部電場 分布，同時，鉑等金屬材料良好的生物相容性保證了融合細胞的活力與安全性；融合池及 平板電極模塊實現(xiàn)了功能的多樣化；自動進樣和自動出樣減小對融合后細胞的物理損傷， 提高其存活能力。


圖1是本微電極陣列芯片結構2是本微電極陣列芯片中融合池及平板電極模塊結構 圖3是本微電極陣列芯片中微電極陣列模塊結構 圖4是本微電極陣列芯片中微電極結構具體實施方式
實施例1:首先，在玻璃等硬質絕緣類芯片加工材料表面鍵合一層硅片材料，采用MEMS加 工技術在硅片上刻蝕一定深度的凹槽，形成硅質微電極陣列，并在電極表面沉積鉑等惰性 金屬材料提高耐腐蝕能力和生物相容性，并通過金屬引線將微電極陣列與外圍電路相連以 引入電信號。容納樣品液的融合池為金屬等硬質導電類芯片加工刻蝕出一個矩形凹槽而成。 實驗中，將微電極陣列浸入樣品液中，參見圖1，微電極陣列芯片由兩塊相互獨立的模塊組合而成，分別為微電極陣列模塊 A和融合池及平板電極模塊B。 .結合參見圖2，融合池及平板電極模塊B采用不銹鋼為材料，先加工出基座2，然后 在基座2上加工出凹槽形融合池3。融合池3的底部同時作為平板電極1使用。在基座2 的四個角上加工了四個通孔4，用于通過螺釘?shù)裙潭ㄈ诤铣丶捌桨咫姌O模塊。在基座2上 還加工有進樣孔5-1和出樣孔6-1，分別與融合池3底部同方位上的進樣孔5-2和出樣孔6-2 相通(在融合池3內進樣孔5-2和出樣孔6-2對應的一側也有進樣孔和出樣孔，圖中被遮 '擋，未示出)，出于方便進出樣的考慮，采用細管15分別插入基座2上各孔中。進樣孔5-1、 進樣孔5-2和細管15構成進樣通道，出樣？L6-1、出樣孔6-2和細管15構成出樣通道，樣 品經(jīng)過進樣通道注入融合池3，融合后樣品經(jīng)過出樣通道流出融合池3。再結合參見圖3，微電極陣列模塊A采用玻璃為硬質絕緣基底層8，上面鍵合5(Hrni厚 度的硅片9，在硅片材料上刻蝕10 4(Vm的凹槽以形成陣列化的微電極，微電極間相互連 接，通過導線引入相同的控制電信號。如圖4所示，微電極的表面13形狀和微電極角度 14可根據(jù)應用目的的不同有所差異，在微電極表面13通過濺射形成Pt膜，厚度為l~2pm。 微電極的結構一致，可以是圖5所示的矩形錐狀，也可使其它如圓形柱狀、矩形柱狀、多 邊形柱狀結構，或者為圓形錐狀、多邊形錐狀等結構。在微電極陣列模塊基底層8上加工 -一個通孔ll，導線12經(jīng)過此孔連接到硅片9上，以引入外圍電路信號。微電極的表面13 形狀、微電極角度14以及微電極表面13和平板電極1之間距離對于兩電極間形成的電場 具有很大的影響，通過對形狀和尺寸的改變可以進行調整。融合池及平板電極模塊基座2和微電極陣列模塊基底層8的尺寸均為50 (長)X 40 (寬)X 5 (高)mm;融合池外圍尺寸為36 (長)X 26 (寬)X 5'(高)mm，內部尺寸 為30 (長)X 20 (寬)X 1 (高)mm;通孔4尺寸為①4mm，基座上的進/出樣孔尺寸為 0 3mm;融合池內的進/出樣孔尺寸為①lmm;細管尺寸為外徑O 3mm內徑0> 2mm;微電極陣列尺寸為30 (長)X 20 (寬)X 0.6 (高)mm;微電極的尺度根據(jù)實驗對象細胞確定。微電極陣列10的加工方法如下-(1) 在硅片材料上濺射Pt;(2) 刻蝕Pt，以形成頂端金屬電極層；(3) 刻蝕一定深度的Si，以形成微電極陣列；(4) 在硬質絕緣基底層上牢固固定硅片材料。實驗中，樣品可以通過設定的進樣通道注入融合池3，將微電極陣列模塊A朝下覆蓋 于融合池及平板電極模塊B上，使微電極陣列IO浸入融合池的樣品液中，在微電極陣列 和融合池上施加電刺激信號，外圍電信號通過導線12在平板電極1和微電極陣列之間形成足夠梯度和強度的非均勻電場，產(chǎn)生細胞電融合需要的電場，完成細胞電融合實驗，完成融合后，再通過設定的出樣通道流出融合池3，進行后期篩選、培養(yǎng)等工作。
權利要求
1. 一種用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于該芯片由微電極陣列模塊和融合池及平板電極模塊組成；所述微電極陣列模塊由硬質絕緣基底層與鍵合或用粘和劑固定在基底層上的電極陣列層構成，電極陣列層通過金屬引線與外部信號發(fā)生電路連接，引入電信號；所述融合池及平板電極模塊由硬質導電類材料加工的基座和在基座上加工出的融合池構成，融合池底部同時作為平板電極使用，在基座上加工有進、出樣孔，分別與融合池底部同方位上的進、出樣孔相連；所述微電極陣列模塊上的電極陣列層的尺寸小于融合池的尺寸，微電極陣列模塊覆蓋于融合池及平板電極模塊上，電極陣列層浸入融合池的細胞融合樣品液中，當施加外界電刺激信號，即在電極陣列層的微電極陣列與融合池中平板電極的微小間距間形成高強度的非均勻梯度電場，實現(xiàn)細胞電融合過程。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于所述電極 陣列層采用硅材料通過MEMS加工工藝實現(xiàn)；所述硬質絕緣基底層釆用玻璃或有機玻璃。
3、 根據(jù)權利要求2所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于所述微電 極陣列是在50pm厚度的硅片材料上刻蝕10~40nm的凹槽以形成陣列化的微電極，微電極 間相互連接，通過導線引入相同的控制電信號。
4. 根據(jù)權利要求3所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于所述微電 極陣列中的微電極結構一致，均為圓形柱狀、矩形柱狀、多邊形柱狀結構，或者為圓形錐 狀、矩形錐狀、多邊形錐狀結構，微電極的尺度根據(jù)實驗對象細胞確定。
5、 根據(jù)權利要求4所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，萁特征在于所述微電 極的頂端有鉑濺射層，厚度為l 2pm，硅電極層厚度為50iLim。
6、 根據(jù)權利要求l、 2、 3、 4或5所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征 在于所述微電極陣列模塊的導線經(jīng)由硬質絕緣基底層上的過孔，采用鍵合或焊接工藝與 微電極陣列相連。
7、根據(jù)權利要求l所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于:所述的融 合池及平板電極模塊采用硅或金屬類硬質導電類芯片加工材料通過緊密加工工藝實現(xiàn)。
8、根據(jù)權利要求7所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于在所述融 合池及平板電極模塊的基座的進、出樣孔分別插入細管。
9、根據(jù)權利要求7或8所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片結構，其特征在于所述融合池及平板電極模塊通過基底上加工有固定模塊的孔進行固定。
10、根據(jù)權利要求5所述的用于細胞電融合的微電極陣列芯片，其特征在于所述微 電極陣列的加工方法如下-(1) 在硅片材料上濺射Pt;(2) 刻蝕Pt，以形成頂端金屬電極層；(3) 刻蝕一定深度的Si，以形成微電極陣列；(4) 在硬質絕緣基底層上牢固固定微電極陣列。
全文摘要
本發(fā)明提出一種用于細胞電融合的微電極陣列芯片，由微電極陣列模塊和融合池及平板電極模塊組成。微電極陣列模塊由硬質絕緣基底層與電極陣列層構成，電極陣列層通過金屬引線引入電信號；融合池及平板電極模塊由基座和在基座上的融合池構成，融合池底部同時作為平板電極使用；微電極陣列模塊上的電極陣列層的尺寸小于融合池及平板電極模塊上的融合池的尺寸，微電極陣列模塊覆蓋于融合池及平板電極模塊上，電極陣列層浸入融合池的樣品液中，當施加外界電刺激信號，即在微電極陣列與融合池中的平板電極電極微小間距間形成高強度的非均勻梯度電場，實現(xiàn)細胞電融合過程。該芯片可提高細胞融合效率和芯片的耐腐蝕性，改善微電極陣列芯片的生物相容性，保證融合細胞的安全性和細胞活力。
文檔編號C12N15/02GK101250482SQ20081006951
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權日2008年3月28日
發(fā)明者侯文生, 侯長軍, 斌 夏, 張瑞強, 毅 曹, 軍 楊, 靜 楊, 寧 胡, 蓉 許, 鄭小林, 陰正勤, 霍丹群 申請人:重慶大學