專利名稱：一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。屬食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鞣花斷2 ， 3 ， 7 ， 82tet rahydroxybenzopyrano[ 5 ， 4 ， 3cde ]benzopyran一5 ， lO—dione)，是廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的一種天然多酚組分，它是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯。它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花單寧、苷等)存在于自然界。純鞣花酸是一種黃色針狀晶體，熔點(diǎn)(妣啶)大于36(TC，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。鞣花酸分子式CmH60s，分子量為302，其結(jié)構(gòu)如下
、o
近十年來，由于發(fā)現(xiàn)了鞣花酸的抗突變、抗癌變效應(yīng)，以及對(duì)化學(xué)致癌物質(zhì)的抑制作用，引起了人們廣泛的關(guān)注。鞣花酸的制備方法主要有以下幾種方法
一種是從植物中提取鞣花酸。自然界中，紅木莓、草莓、石榴以及蕨類等植物中含有少量鞣花酸(1 %)。目前，國際上約有四五家工廠在以草莓、石榴為原料，可生產(chǎn)出含量為5 %左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加劑；用此工藝可生產(chǎn)高純度的鞭花酸，但由于原料成本較高、且原料中鞣花酸含量的限制而實(shí)際意義不大。
一種是通過倍酸(或其酯)的氧化聚合。沒食子酸在過氧化物酶的氧化作
用下，(見Nrusingha C.Mishra and Barry Gold. Synthesis of 13c-and 14c-labrleddllagic acid[J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1990，8: 927-94)其主要產(chǎn)物是鞣花酸。此工藝過程中，鞣花酸的產(chǎn)率為20% 30%。但沒食子酸(酯)的制備過程繁瑣復(fù)雜，酶也需要精制純化，而且產(chǎn)物中還有一種未知的醌類物質(zhì)，其與鞣花酸的比例為l : 2.4，給產(chǎn)品的分離純化帶來了一定的困難，目前較少用此法進(jìn)行鞣花酸的生產(chǎn)。
微生物法生產(chǎn)鞣花酸是利用橡碗單寧為原料，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生鞣花酸，由于鞣花酸不溶于水，發(fā)酵過程中有大量的菌絲體產(chǎn)生，并且這種方法反應(yīng)時(shí)間長，為后續(xù)的分離純化帶來了很大的困難。也不易于得到高純度的鞣花酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。通過發(fā)酵獲得含降解鞣花單寧的酶的菌體，經(jīng)過超聲破碎，得到粗的單寧酶，與石榴皮中提取的鞣花單寧發(fā)生酶促反應(yīng)，分離純化獲得純度較高的鞣花酸。實(shí)現(xiàn)降低成本，廢物利用，提高鞣花酸產(chǎn)量和純度的目的。
本發(fā)明的以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法，通過可降解鞣花單寧的單寧酶與輮花單寧進(jìn)行酶促反應(yīng)，得到鞣花酸粗產(chǎn)品，經(jīng)溶劑結(jié)晶純化獲得純鞣花酸，具體步驟和條件為
A鞣花單寧的提取
將烘干的石榴皮粉碎后，加入到體積濃度為20 60%的乙醇水溶液中，置于功率為80-100W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次25-40分鐘，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液；
B單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)
將黑曲霉Aspergillus niger3.316接種于發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，25-3(TC下培
5養(yǎng)20-24小時(shí)，移至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25-3(TC下培養(yǎng)4-6天，離心并用去離子 水洗滌，獲得含單寧酶的菌體，加入pH-5.0的檸檬酸緩沖液后得到菌懸液， 菌懸液于冰浴中在功率400-600W的超聲波作用下進(jìn)行20-30分鐘超聲破碎， 得到粗的單寧酶；
C酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)
將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至原來體積的1-2倍，用 NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5.0-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液 與稀釋后的鞣花單寧溶液的體積比為1: 2-3， 25-3(TC下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)40-48 小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)過濾，得到粗鞣花酸產(chǎn)品；
D溶劑結(jié)晶純化
將步驟C得到的鞣花酸粗產(chǎn)品加入甲醇，在70 80。C溫度下萃取3 9 小時(shí)后，將萃取液濃縮至飽和，降至室溫結(jié)晶，反應(yīng)液過濾后，濾餅經(jīng)水洗、 干燥，得到淡黃色鞣花酸產(chǎn)品，純度為95%以上。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和含量是NaN03 1.5-2.5 g/1 ， K2HP04 0.5-1.5g/l， MgS04-7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， FeS04 0,008-0.015 g/l， 蔗糖25-35 g/l，其余為水。
所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成和含量為鞣花單寧10-16g/l，KH2PO40.5-1.5 g/l， K2HPO40.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， MgS04'7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，乳糖5-15g/1，吐溫-80 1.5-3ml/l，用NaOH水溶液調(diào)節(jié) pH值為4-4.5。
為了提高產(chǎn)品的純度在步驟D的溶劑結(jié)晶純化中，萃取分二至三次完成， 每次1 3小時(shí)。
本發(fā)明的方法實(shí)質(zhì)是利用酶的催化效率高，選擇性強(qiáng)，作用條件溫和等 特點(diǎn)，通過發(fā)酵并提取可降解鞣花單寧的單寧酶后，與鞣花單寧發(fā)生酶促反 應(yīng)生成鞣花酸，經(jīng)分離純化后獲得高純度的鞣花酸。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單，制備過程綠色化，三廢排放少，適合大規(guī)模的生產(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)好。我國是石榴種植大國，其果皮除被部分用于中藥材 以外，大部分都被人們拋棄，造成了很大的浪費(fèi)。本發(fā)明以石榴皮為原料， 原材料成本低，可提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值。本發(fā)明采用酶法生產(chǎn)鞣花酸，由于 酶的反應(yīng)條件溫和，無需高溫，高壓等操作，改善了生產(chǎn)環(huán)境，大大節(jié)約化 學(xué)物質(zhì)的消耗量，且三廢污染小，容易治理。采用酶促反應(yīng)，其特異性高， 專一性的降解鞣花單寧中的酯鍵，具有轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)時(shí)間短，副產(chǎn)物少 的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為40%的乙醇的 水溶液中，于功率80W的超聲波作用下，超聲處理25分鐘，取出收集濾液， 剩余的殘?jiān)僦貜?fù)上述超聲處理二次，得到的鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮 回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液240L。 B單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組份和含量為NaN03 2 g/l， K2HP04 lg/1 ， MgS04.7H20 0.6 g/l， KC10.6g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖30g/l，其余為水。滅 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在30。C， 165rpm下?lián)u床培養(yǎng) 24小時(shí)，以5%接種量移至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量含量 鞣花單寧I6g/1， KH2P04 1 g/l， K2HP04 1 g/l， NaN03 2 g/l， KC1 0.6 g/l， MgS04'7H20 0.6g/l， FeS04 0.01 g/l，乳糖10g/l，吐溫-80 2ml，用5mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4。在28。C， 165rpm下?lián)u床培養(yǎng)4天，離心并用 去離子水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入 0.01mol/L檸檬酸緩沖液(pH=5.0)后得到菌懸液，菌懸液于400w的功率下 于冰浴中進(jìn)行破碎，破碎時(shí)間為30分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至350L，用5mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)pH:5.2，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 3。在3(TC， 90rpm下用搖床轉(zhuǎn)化反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)液 經(jīng)過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結(jié)晶
將得到的粗產(chǎn)品用甲醇75t:萃取，萃取次數(shù)為3次，每次1小時(shí)，固液 分離，合并液體，蒸發(fā)濃縮，冷卻結(jié)晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末。原料含鞣花單寧為10.13%，得率為原料的4.1% ，純度為96.5%。
實(shí)施例2:
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為60%的乙醇水 溶液中，功率100W的超聲波作用下，超聲處理30分鐘，取出收集濾液，剩 余的殘?jiān)僦貜?fù)上述超聲處理二次，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收 乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液200L。 B單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)
所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組份和含量為NaN03 1.5g/l， K2HP04 0.5g/l， MgSO4.7H2O0.5g/l， KC10.5g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖25 g/l，其余為水。滅 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在28。C， 165rpm下?lián)u床培養(yǎng) 22小時(shí)，以5%接種量移至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組份和含量鞣花 單寧10g/l， KH2PO40,5g/l， K2HPO40.5g/l， NaN03 1.5 g/l， KC1 0.4 g/l， MgSO4.7H2O0.4g/l， FeS04 0.008 g/l，乳糖5g/l，吐溫-80 3ml/l，用5mol/L的 NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.3。在28。C， 165rpm下?lián)u床培養(yǎng)6天，離心并用生理 鹽水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入O.lmol/L 檸檬酸緩沖液后(pH=5.0)得到菌懸液，菌懸液于500W的功率下于冰浴中 進(jìn)行破碎，破碎時(shí)間為25分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉(zhuǎn)化反應(yīng)
8將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至300L,用5mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)pH-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 2.5。在28r， 100rpm下用搖床轉(zhuǎn)化反應(yīng)40小時(shí)。反應(yīng) 液經(jīng)過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結(jié)晶
將得到的粗產(chǎn)品用甲醇75'C萃取，萃取次數(shù)為2次，每次2小時(shí)，固液 分離，合并液體，蒸發(fā)濃縮，冷卻結(jié)晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末，原料含鞣花單寧為11.5%，得率為原料的4.3%，純度為98%。
實(shí)施例3:
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為50%的乙醇水 溶液中，于功率90W的超聲波作用下，超聲處理40分鐘，取出收集濾液， 剩余的殘?jiān)僦貜?fù)上述超聲處理一次，得到的單寧酸的乙醇水溶液濃縮回收 乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液200L。 B單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組份和含量為NaN03 2.5 g/l， K2HP041.5g/l， MgS04.7H20 0.8g/l， KCL0.8g/1， FeSO40.015g/l，蔗糖35 g/l， 其余為水。 滅菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在25。C， 165rpm下?lián)u床培 養(yǎng)24小時(shí)，以5%接種量移至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組份和含量:鞣花 單寧13g/l， KH2P04 1.5g/l， K2HP04 1.5 g/l， NaN032.5 g/l， KC1 0.8 g/l， MgSO4.7H2O0.8g/l， FeSO40.015g/l，乳糖15g/l，吐》顯-80 1.5ml/l，用5mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.5。在25。C， 165rpm下?lián)u床培養(yǎng)5天，離心并用生 理鹽水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入 0.05mol/L擰檬酸緩沖液(pH=5.0)后得到菌懸液，菌懸液于600W的功率下 于冰浴中進(jìn)行破碎，破碎時(shí)間為20分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉(zhuǎn)化反應(yīng)
9將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至400L，用5mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)pH-5.0，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 2。在25'C， 110rpm下用搖床轉(zhuǎn)化反應(yīng)44小時(shí)。反應(yīng)液 經(jīng)過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結(jié)晶
將得到的粗產(chǎn)品用甲醇75。C萃取，萃取次數(shù)為3次，每次2小時(shí)，固液 分離，合并液體，蒸發(fā)濃縮，冷卻結(jié)晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末，原料含鞣花單寧為9.1%，得率為原料的3.9%，純度為98.8%。
權(quán)利要求
1. 一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法，通過單寧酶與鞣花單寧的酶促反應(yīng)，得到鞣花酸粗產(chǎn)品，經(jīng)溶劑結(jié)晶純化獲得純鞣花酸，具體步驟和條件為A鞣花單寧的提取將烘干的石榴皮粉碎后，加入到體積濃度為20～60％的乙醇水溶液中，置于功率為80-100W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次25-40分鐘，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液；B單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)將黑曲霉Aspergillus niger3.316接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-30℃下培養(yǎng)20-24小時(shí)，移至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在25-30℃下培養(yǎng)4-6天，離心并用去離子水洗滌，獲得含單寧酶的菌體，加入pH＝5.0的檸檬酸緩沖液得到菌懸液，菌懸液于冰浴中在功率400-600W的超聲波作用下進(jìn)行超聲破碎，破碎時(shí)間為20-30分鐘，得到單寧酶的粗酶液；C酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至原來體積的1-2倍，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5.0-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧溶液的體積比為1∶2-3，在25-30℃下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)40-48小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)過濾，得到鞣花酸粗產(chǎn)品；D溶劑結(jié)晶純化將步驟C得到的鞣花酸粗產(chǎn)品加入甲醇，在70～80℃溫度下萃取3～9小時(shí)后，將萃取液濃縮至飽和，降至室溫結(jié)晶，反應(yīng)液過濾后，濾餅經(jīng)水洗、干燥，得到淡黃色鞣花酸產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組成和含量 是NaN03 1.5-2.5 g/l， K2HP04 0.5畫1.5g/1， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，蔗糖25-35 g/1 ，其余為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成和含量為鞣花單寧10-16g/l， KH2P04 0.5-1.5 g/l， K2HP04 0.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KCI 0.4-0.8 g/l， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/l，乳糖5畫15g/1， 吐溫-80 1.5-3ml/l,用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為4-4.5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征是步驟D的溶劑結(jié)晶純化中，萃 取分二至三次完成，每次1 3小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。屬食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域。本發(fā)明以我國大量被人們廢棄的石榴皮為原料提取鞣花單寧，利用酶的催化效率高，選擇性強(qiáng)，作用條件溫和等特點(diǎn)，通過發(fā)酵，獲得含降解鞣花單寧的單寧酶，與鞣花單寧發(fā)生酶促反應(yīng)，生成鞣花酸，經(jīng)過溶劑結(jié)晶純化，獲得價(jià)格昂貴的醫(yī)用高純度的鞣花酸。本發(fā)明可降低原料成本，廢物利用，并提高鞣花酸產(chǎn)量和純度，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P17/18GK101481714SQ20081005600
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者倩 張, 艷 程, 袁其朋 申請人:北京化工大學(xué)